DE3888718T2

DE3888718T2 - Chemische Derivate von GHL-Cu.

Info

Publication number: DE3888718T2
Application number: DE3888718T
Authority: DE
Inventors: Loren Ralph Pickart
Original assignee: Procyte Corp
Current assignee: Procyte Corp
Priority date: 1987-04-20
Filing date: 1988-04-20
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2008-04-21
Also published as: EP0288278A2; DE3888718D1; ATE103608T1; EP0288278B1; EP0288278A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chemische Derivate von Glycyl-L-histidyl-L-lysln:Kupfer(II) (GHL-cu) im allgemeinen und insbesondere GHL-Cu-Derivate, die besonders nützliche biologische Aktivitäten zeigen

Hintergrundtechnik

GHL-Cu ist ein menschlicher Blutfaktor, der in Spurenmenger; vorhanden ist und von dem man glaubt, daß er bei Transport und zellulärer Aufnahme von Kupfer involviert ist (Pickart, L., Lymnhokines 8: 425-446, 1983) Vor kurzem haben die Ahmelder entdeckt daß GHL-Cu verwendet werden kann, um bei verletzten Tieren den Wundheilungsprozeß zu beschleunigen und Entzündung zu verringern Diese Erkenntnis ist Gegenstand der U.S.-Patentanmeldung der Anmelderin, die am 24. Januar 1985 eingereicht worden ist.
Die Heilung vieler Arten von traumatischer Gewebeschädigung und von mit degenerativen Bedingungen zusammenhängender Alterung wird durch die übermäßige Produktion von Superoxid-Anion verzögert. Nach Verwundung oder traumatischer Gewebeschädigung dringen Zellen des Immunsystems in den geschädigten Bereich ein und sekretieren reichliche Mengen an toxischen Sauerstoffradikalen, um eindringende Bakterien abzutöten. Oft, in Fällen beeinträchtigter Heilung, schädigt die Produktion von Super oxid-Anion Gewebe weiter und bringt einen neuen Zustrom immunologischer Zellen hinein, wodurch ein Circulus vitiosus schädigender Ereignisse geschaffen wird, was die Abfolge im normalen Heilungsprozeß in großem Maße verzögern kann. Um einwandfreie Heilung von geschädigtem Gewebe zu erhalten, ist es im allgemeinen notwendig, die Produktion von Superoxid-Anion in befallenen Bereich zu beenden.
GHL-Cu besitzt beträchtliche Superoxid-Dismutase-Aktivität, was ihm erlaubt, das gewebeschädigende Superoxid-Anion zu entgiften. Außerdem inhibiert GHL-Cu auch die Blutplättchen-Aggregation und die Produktion des gefäßverengenden und Thrombose-induzierenden Hormons, Thromboxan. GHL-Cu beschleunigt die Heilung von Wunden bei Ratten, Mäusen und Schweinen und besitzt entzündungshemmende Wirkungen in Standard-Ratten-Entzündungsmodellen.
EP-A-0190736 betrifft GHL-Cu-Derivate mit signifikanter Superoxid-Dismutase-Aktivität. Obgleich wertvoll, ist GHL-Cu jedoch anfällig dafür, durch Carboxypeptidasen genannte proteolytische Enzyme zu zerfallen, und ist in Fettgeweben schlecht löslich.
Demgemäß ist es ein primäres Objekt der vorliegenden Erfindung, die Widerstandsfähigkeit von GHL-Cu gegen Zerfall zu verbessern und außerdem die Fettgewebelöslichkeit von GHL-Cu zu erhöhen, was zu einer nützlicheren Form des Moleküls führt.

Offenbarung der Erfindung

Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung verschiedene Derivate von GHL-Cu, die größere Widerstandsfähigkeit gegen Zerfall durch proteolytische Enzyme besitzen und die maßgeschneidert werden können, um ihre Fettlöslichkeit zu erhöhen. Die Derivate haben die allgemeine Formel Glycyl-L-histidyl-L- lysin-R:Kupfer(II), wobei R eine Alkoxyeinheit mit von 16 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Die Alkoxyeinheit kann eine unverzweigte Kette sein. Die unverzweigte Kette kann ein n-Palmityl-Rest oder ein n-Stearyl- Rest sein. Die Bindungsaffinität für Kupfer(II) der Imidazolgruppe im Histidyl-Rest kann durch Ersetzen von Histidin durch 3-Methylhistidin oder durch Verlängern der Lysyl-Seitenkette durch Hinzufügen zusätzlicher Kohlenstoffatome zur Kette modifiziert werden.
Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses bei einem Tier, welches umfaßt, daß dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Derivat von GHL-Cu enthält. Die Derivate haben die allgemeine Formel Glycyl-L-histidyl-L-lysin-R:Kupfer(II), wobei R eine Alkoxyeinheit mit von 16 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Verfahren zum Inhibieren der Produktion von Thromboxan durch Blutplättchen bei Tieren, welches umfaßt daß dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die ein Derivat von GHL- Cu enthält, verabreicht wird. Die Derivate haben die allgemeine Formel Glycyl-L-histidyl-L-lysin-R:Kupfer(II) , wobei R eine Alkoxyeinheit mit von 16 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung deutlich werden.

Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung

Wie oben angegeben, besitzt GHL-Cu signifikante Superoxid-Dismutase-Aktivität, was ihm erlaubt, gewebeschädigendes Superoxid-Anion zu entgiften. GHL-Cu ist jedoch dafür anfällig, durch proteolytische Enzyme zu zerfallen, und ist in Fettgeweben schlecht löslich. Wie hierin beschrieben, behalten verschiedene Derivate von GHL-Cu jedoch ihre Superoxid-Dismutase- Aktivität, während sie größere Widerstandsfähigkeit gegen proteolytischen Zerfall zeigen. Außerdem erhöhen diese Derivate die Fettgewebelöslichkeit von GHL-Cu, was zu einer Form des Moleküls führt, die bei der Bildung pharmazeutischer Cremes und Gele nützlicher ist
Die Derivate der vorliegenden Erfindung können durch Veresterung, durch die Entfernung eines Wassermoleküls oder die Addition einer Gruppe (entweder eines Alkohols, wie etwa Octanol, Methanol oder Benzylalkohol, oder NH&sub3;) am Carbonsäure-Ende von GHL hergestellt werden, was zur Bildung des lipophileren Derivates führt. Dies erhöht die Fettlöslichkeit durch (1) Entfernung der elektrischen Ladung, die mit der Carbonsäuregruppe zusammenhängt, und (2) die Einführung hydrophiler Gruppen in das Molekül.
Die chemische Gesamtreaktion dieser Umwandlung kann charakterisiert werden als:
GHL-OH+R-H -T GHL-R+H&sub2;O
In der Praxis wird die Reaktion am einfachsten durchgeführt, indem die R-Gruppe zur Aminosäure Lysin vor der Kombination von Lysin mit den anderen zwei Aminosäuren von GHL zugefügt wird. Nach Bildung und Isolierung von GHL-R, wird das Kupfer(II) an das Molekül chelatisiert, um den bioaktiven Komplex zu bilden
Die Gesamtreaktion, um die lipophileren Derivate von GHL-Cu zu bilden, können charakterisiert werden:
1) Lysin-OH + R-H -T Lysin-R + H&sub2;O
2) Lysin-R + blockiertes L-Histidin -T blockiertes L- Histidin-L-lysin-R
3) blockiertes L-Histidin-L-lysin-R + blockiertes Glycin -T blockiertes Glycyl-L-histidin-L-lycin-R
4) blockiertes Glycyl-L-histidin-L-lysin-R -T Glycyl- L-histidin-L-lysin-R
5) Glycyl-L-histidin-L-lysin-R + Kupfer(II) -T Glycyl-L-histidin-L-lysin-R:Kupfer (II)
Die Derivate der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Beschleunigung des Wundheilungsprozesses bei Tieren. Kurz gesagt ist Wundheilung eine hochspezifische biologische Reaktion, die viele eng koordinierte Ereignisse umfaßt, die für einwandfreie Heilung im Gleichgewicht gehalten werden müssen. Immunologische Zellen müssen Bakterien und geschädigtes Gewebe aus der Wunde beseitigen und dann ermöglichen, daß andere Prozesse eintreten, wie etwa die Re-Epithelialisierung der verlorenen Haut, Ablagerung fibroblastischer Zellen des Strukturproteins Collagen, um vorübergehende Wundfestigkeit bereitzustellen, das erneute Wachstum von Blutgefäß-, Lymph- und Nervennetzwerken, die Kontraktion des Wundbereiches und der erneute Aufbau von Haarfollikeln in der neugebildeten Haut. Wenn irgendein Prozeß unpassend vorherrscht, ist die Heilung unvollständig und unzulänglich. Zum Beispiel führt übermäßige Collagenablagerung zu Dauervernarbung, während übermäßiges Blutgefäßwachstum zu einem Hämangiom führen kann.
Wegen der komplexen Wechselwirkung verschiedener Prozesse bei der Heilung von Wunden sollte ein überlegenes Verfahren zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses das richtige Aufrechterhalten von jedem dieser Prozesse ohne Hervorrufen einer antigenischen Reaktion einschließen. Die vorliegende Erfindung belegt beispielhaft solch ein Verfahren und stellt außerdem andere verwandte Vorteile zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung verwendet eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Derivaten von GHL-Cu besteht, um den Wundheilungsprozeß bei Tieren zu beschleunigen. Die Derivate von GHL-Cu, die hierin beschrieben sind, besitzen signifikante Superoxid-Dismutase-Aktivität bei physiologischem pH und haben wie andere Superoxid- Dismutasen entzündungshemmende und Wundheilungseigenschaften. Die Derivate von GHL-Cu inhibieren auch die Produktion des gefäßverengenden und Thiombose-induzierenden Hormons, Thromboxan
Überdies haben die Derivate von GHL-Cu, die hierin beschrieben sind, Vorteile gegenüber GHL-Cu. Insbesondere sind die Derivate lipophiler als GHL-Cu, was zu größerer Löslichkeit in Cremes und Gelen führt, die bei der Behandlung von Wunden nützlich sind. Außerdem zeigen die Derivate der vorliegenden Erfindung eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber proteolytischen Zerfall durch das Enzym Carboxypeptidase, was anhaltende Aktivität der Derivate für wirkungsvollere Wundheilung ermöglicht.
Um die Beispiele, die folgen, zusammenzufassen, veranschaulicht Beispiel I die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin- benzylester:Kupfer(II). Beispiel II beschreibt die Herstellung von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid:Kupfer(II). Beispiel III belegt die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-Octylester:Kupfer(II). Beispiel IV beschreibt die Herstellung von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester Kupfer (II). Beispiel V veranschaulicht (A) die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester:Kupfer(II) und (B) seine Synthese mit einem alternativen Verfahren. Basierend auf jedem der beiden Verfahren könnte ein Fachmann auf diesem Gebiet n-Stearylalkohol (18 Kohlenstoffatome) durch n-Palmitylalkohol (16 Kohlenstoffatonie) ersetzen, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylester: Kupfer(II) zu liefern. Beispiel VI belegt die Superoxid-Dismutase-Aktivität von GHL-Cu-Derivaten. Beispiel VII veranschaulicht (A) die Wundheilungsaktivität und (B) die Anti-Thromboxan-Aktivität von GHL-Cu-Derivaten. Beispiel VIII belegt die Widerstandsfähigkeit von GHL-Cu-Derivaten gegen Zerfall durch proteolytische Enzyme.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.

BEISPIELE

Herkunft der Chemikalien.

Chemikalien und Peptid-Zwischenstufen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, können bezogen werden von den folgenden Lieferanten: Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); Peninsula Laboratories (San Carlos, CA); Aldridge Chemical Co. (Milwaukee, WI); Vega Biochemicals (Tucson, AZ) ; Pierce Chemical Co. (Rockford, IL); Research Biochemicals (Cleveland, OH); Van Waters and Rogers (South San Francisco, CA) ; Bachem, Inc. (Torrance, CA)

VERGLEICHSBEISPIEL I

Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysinbenzylester:Kupfer(II)

Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin-benzylester wurde in 1:1 Hexan- Ethylacetat gelöst und an Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als einem Kopplungsmittel gekoppelt. Natriumbicarbonat (10%) wurde zugegeben und das Produkt in die organische Schicht extrahiert. Das Produkt Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim- benzyloxycatbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin-benzylester, wurde aus der Lösung auskristallisiert. Die N-terminale Gruppe des blockierten Dipeptids wurde durch Rühren in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten enfernt, dann im Vakuum eingedampft. Das Produkt, Nim-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-Benzoylcarbonyl-L-lysin-benzylester, wurde an Benzyloxycarbonylglycin mit Dicyclohexylcarbodiimid als einem Kopplungsmittel gekoppelt. Blockierende Gruppen wurden durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von 10% Palladium auf Kohle in Eisessig entfernt. Nach Lyophilisation wurde das Produkt, Glycyl-histidyl-L-lysin-benzylester, in Wasser gelöst und durch Ionenaustauschchromatographie auf Kationenaustauschharz Dowex 50 X-4 und Elution mit 0,1 M Ammoniumhydroxid gereinigt wobei das Eluat unmittelbar mit Essigsäure neutralisiert wurde. Ein weiterer Durchgang durch ein Anionenaustauschsäule BioRex 63 bei neutralem pH entfernte Zerfallsprodukte mit freien Carbonsäuregruppen.
Der Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester wurde in Wasser gelöst, wobei äquimolares Kupferacetat zugesetzt wurde. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde bei 20.000 g für 1 Stunde bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde lyophilisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester: Kupfer(II) zu erhalten.

VERGLEICHSBEISPIEL II

Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid:Kupfer (II)

Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin wurde in Ethylacetat gelöst und mit p-Nitrophenol unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als einem Kopplungsmittel verestert. Natriumbicarbonat (10%) wurde zugegeben und das Produkt in die organische Schicht extrahiert und aus Lösung auskristallisiert, dann zu wäßrigem Ammoniumhydroxid zugegeben, um Na- tert.-Butyloxycarbonyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin-amid zu bilden.
Das Amid wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten gelöst, um Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin-amid zu bilden, das nach Flash-Verdampfung der Lösungsmittel isoliert wurde. Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin-amid wurde in N,N-Dimethylformamid und N-Methylmorpholin gelöst, dann tropfenweise zu Natert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin in N- Methylmorpholin und Isobutylchlorformiat in Tetrahydrofuran zugegeben. Nach Rühren für eine Stunde und Zugabe von 5% Na triumbicarbonat wurde das Produkt, Na-tert-Butylexycarbonyl- Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin- amid, in Ethylacetat extrahiert. Das Amino-Ende des blockierten Dipeptids wurde mit 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten deblockiert und flash-verdampft, um das Produkt zu erhalten, das dann an Benzyloxycarbonylglycin unten Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt wurde, um das blockierte Tripeptid zu ergeben. Blockierende Gruppen wurden durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von 10% Palladium auf Kohle in Eisessig entfernt. Nach Lyophilisation wurde das Produkt Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid, in Wasser gelöst und durch Ionenaustauschchromatographie auf Kationenaustauschharz Dowex 50 X-4 und Elution mit 0,1 M Ammoniumhydroxid gereinigt wobei das Eluat unmittelbar mit Essigsäure neutralisiert wurde. Ein weiterer Durchgang durch eine Anionenaustauschsäule BioRex 63 bei neutralem pH entfernte Zerfallsprodukt.
Das Endprodukt, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid, wurde in Wasser gelöst und eine äquimolare Menge Kupferacetat zugegeben Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde bei 20.000 g für 1 Stunde bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde lyophilisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin- amid:Kupfer(II) zu erhalten.

VERGLEICHSBEISPIEL III

Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester: Kupfer (II)

Eine Mischung von Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Octanol, Benzol und P-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde über Nacht unter Rückfluß gekocht unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle, um wasser zu entfernen. Nach Abkühlung wurde trockener Ethylether zugegeben. Die Lösung ließ man dann bei 0ºC über Nacht ausfällen. Ein Teil des ausgefällten Feststoffes wurde zu 50 ml Kaliumcarbonatlösung und 50 ml Dichlormethan zugegeben. Nach Extraktion wurden die Schichten getrennt und die organische Phase mit Wasser und Salzlösung gewaschen, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie ergab n-Octyl-Nebenzyloxycarbonyl-L-lysinat. Das Produkt wurde in Tetrahydrofuran gelöst und mit Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyl oxycarbonyl-L-histidin, Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin vermischt. Nach Eindampfen wurden Wasser und Ethylacetat zugegeben. Das Produkt wurde in die organische Phase extrahiert, die mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wurde. Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie ergab n-Octyl-Na-tert.-butyloxycarbonyl-Nimbenzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat
Das Produkt wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n-Octyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat gebildet wurde. Dieses wurde in Tetrahydrofuran gelöst und Isobutylchlorformiat, N-Methylmorpholin und Benzyloxycarbonylglycin wurden zugegeben, um n-Octyl-benzyloxycarbonylglycyl-Nim-benzyloxycarbony-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat zu bilden Dieses wurde in Eisessig gelöst und über Nacht hydriert.
Das resultierende n-Octylester von Glycyl-L-histidyl-L-lysin wurde durch die Zugabe einer äguimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde bei 20.000 g für 1 Stunde bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde lyophilisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester:Kupfer(II) zu erhalten

VERGLEICHSBEISPIEL IV

Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester:Kupfer(II)

Ne-Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester-Hydrochlorid wurde mit einem Äquivalent N-Methylmorpholin neutralisiert. Es wurde dann mit Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxymethyl-L-histidin unter Verwendung einer Mischung aus Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol als einem Kopplungsmittel in Tetrahydrofuran gekoppelt. Die Reaktion ließ man über Nacht fortschreiten, filtrierte und dampfte das Lösungsmittel ab. Ethylacetat wurde zugegeben und die Mischung wurde erneut filtriert. Wäßrige Aufarbeitung des Filtrats, gefolgt von Eindampfen und Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie, unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol als Elutionsmittel, führte zu Methyl-Na-tert.-butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxymethyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat. Die N-terminale blockierende Gruppe des Dipeptids wurde durch Rühren in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten entfernt, dann im Vakuum eingedampft. Das Produkt, Methyl-Nim-benzyloxymethyl- L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat wurde mit trockenem N-Methylmorpholin neutralisiert und mit Benzyloxycarbonylglycin unter Verwendung von Isobutylchlorformiat gekoppelt. Die Reaktion ließ man für zwei Stunden fortschreiten, dampfte ein und löste erneut in Ethylacetat. Nach wäßriger Aufarbeitung, Filtration und Eindampfen wurde das Produkt durch Säulenchromatographie gereinigt. Die blockierenden Gruppen wurden aus dem Benzyloxycarbonylglycyl-Nim-benzyloxymethyl-L-histidyl-Nebenzyloxycarbonyl-L-lysin-methylester durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Pd-C in Methanol/Essigsäure entfernt. Nach Lyophilisation wurde das Produkt, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester, in Propanol/Essigsäure/Wasser gelöst und durch Säulenchromatographie auf einer Zellulosesäule gereinigt Das Endprodukt Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester, wurde in Wasser gelöst, wobei eine äquimolare Menge Kupferacetat zugegeben wurde. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde dann bei 20.000 g für 1 Stunde bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlöliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde neutralisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester:Kupfer(II) zu erhalten.

BEISPIEL V

A. Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-stearylester: Kupfer(II)

Eine Mischung aus Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Stearylalkohol, Benzol und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde über Nacht unter Rückfluß gekocht unter Verwendung einer Dean- Stark-Falle, um Wasser zu entfernen. Nach Abkühlung wurde trockener Propylether zugegeben, um das Gesamtvolumen auf das Sechsfache zu erhöhen. Das Produkt ließ man bei 0ºC über Nacht ausfallen und filtrierte. Ein Teil des Filtrats wurde zu 50 ml Kaliumcarbonat und 50 ml Dichlormethan zugegeben. Nach Extraktion wurden die Schichten getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie ergab n-Stearyl-Nebenzyloxycarbonyl-L-lysinat. Das Produkt wurde in Tetrahydrofuran gelöst und mit Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin und Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin vermischt. Nach Eindampfen wurden Wasser und Propylacetat zugegeben und das Produkt wurde in die organische Phase extrahiert, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie ergab n-Stearyl-Na-tert.-butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat.
Das Produkt wurde mit 50%iger Trifluoressigsäure in Dichiormethan für 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n-Stearyl Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L- lysinat gebildet wurde, das in Tetrahydrofuran, Isobutylchlorformiat, N-Methylmorpholin und Benzyloxycarbonylglycin gelöst wurde, um n-Stearyl-benzyloxycarbonylglycyl-Nim-bezyloxycarbnyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat zu bilden. Das Produkt wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethanfür 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n-Stearylester-glycyl-L-histidyl-L-lysin gebildet wurde.
Das resultierende Molekül, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-Stearylester, wurde durch die Zugabe einer äquimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben, um ein für Tierstudien brauchbares Produkt zu erhalten.
Durch Ersetzen des n-Stearylalkohols durch n-Palmitylalkohol kann in ähnlicher Weise Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylester synthetisiert werden.

B. Alternative Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester: Kupfer (II)

N (&epsi;)-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Stearylalkohol, p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat und Benzol werden zusammen unter Rückfluß gekocht unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle, um das entstehende Wasser azeotrop zu entfernen. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und anschließender Zugabe von trockenem Ethylether wird n-Stearyl-N(&epsi;)-benzyloxycarbonyl-L-lysinat-p-Toluolsulfonatsalz durch Filtration gesammelt, mit 2 M wäßriger Kaliumbicarbonatlösung behandelt und in Dichlormethan extrahiert. Eindampfen ergibt das freie Amin, das in trockenem Tetrahydrofuran (THF) erneut gelöst und zu einer rührenden Lösung von N(α)-tert.-Butyloxycarbonyl-N(im)-benzyloxycarbonyl- L-histidin, N-Methylmorpholin und Isobutylchlorformiat in trockenem THF bei -15ºC zugegeben wird. Der resultierende, vollständig geschützte Dipeptidester wird mit 1/1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan bei Raumtemperatur behandelt, mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung neutralisiert und in Ethylacetat extrahiert. Eindampfen ergibt das teilweise deblockierte Dipeptid, das in trockenem THF erneut gelöst urd zu einer rührenden Lösung von Benzyloxycarbonylglycin, N-Methylmorpholin und Isobutylchlorformiat in trockenem THF bei-15ºC zugegeben wird. Der gebildete, vollständig geschützte Tripeptidester wird vollständig deblockiert durch Behandlung mit Wasserstoffgas in Eisessig bei Raumtemperatur in der Gegenwart von Pd-C-Katalysator. Filtration, Eindampfen und Reinigung auf einer mikrokristallinen Zellulosesäule, gefolgt von Lyophilisation, ergibt den gewünschten Tripeptidester als sein Triacetatsalz.
Das resultierende Molekül, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester, wurde durch die Zugabe einer äquimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben, um ein für Tierstudien brauchbares Produkt zu erhalten.
Durch Ersetzen des n-Stearylalkohols durch n-Palmitylalkohol kann in ähnlicher Weise Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylestet synthetisiert werden.

BEISPIEL VI

Superoxid-Dismutase-Aktivität in GHL-Cu-Derivaten

Vergleichsbeispiel A.

Alle der lipophileren Derivate von GHL- Cu, von denen einige unten dargestellt sind, besaßen zu biologischem GHL-Cu ähnliche Superoxid-Dismutase-Aktivitäten, wenn untersucht unter Verwendung des Verfahrens der Auto-Oxidation von 6-Hydroxydopamin vorm Heikkla und Cabbat (Anal. Biochem. 75: 356-362, 1972). Getestete Verbindung Prozent GHL-Cu-Aktivität auf einer molaren Basis GHL-Cu (Kontrolle) Glycyl-L-histidyl-L-lysinbenzylester: Kupfer (II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester:Kupfer (II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid: Kupfer (II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-methylester:Kupfer (II)
B. Bestimmte der Derivate von GHL-Cu, die langkettige aliphatische Ester enthalten, besitzen unerwartet hohe SOD-Aktivität, wenn verglichen mit GHL-Cu. In diesem Beispiel wurde Superoxid-Dismutase mit dem Xanthin-Oxidase/NBT-Verfahren (1-3) gemessen. Reaktionen enthielten folgendes: 100 µM Xanthin, 56 µM NBT (Nitroblau-Tetrazolium), 1 Einheit Katalase, 50 mM Kaliumphosphatpuffer , pH 7,8. Die Reaktion wurde initiiert durch die Zugabe von Xanthin-Oxidase in genügender Menge, um einen Anstieg in der Extinktion bei 560 nm von ungefähr 0,025/min in einem Gesamtvolumen von 1,7 ml zu erhalten. Die Xanthin-Oxidase wurde täglich frisch hergestellt und bis zum Gebrauch auf Eis gelagert. Alle Komponenten der Reaktion wurden zugegeben, mit Ausnahme der Xanthin-Oxidase, und das Spektrophotometer wurde bei 560 nm auf Null eingestellt. Die Reaktion wurde initiiert durch die Zugabe der Xanthin-Oxidase. Alle Reagenzien wurden von Sigma Chemical Co. erhalten.
Eine Aktivitätseinheit wurde genommen als die Probenmenge, die die Reaktion um 50% inhibiert. Die spezifische Aktivität wurde berechnet als die Anzahl SOD-Einheiten pro Milligramm GHL-Cu oder Derivat. Messungen der Extinktion bei 560 nm wurden in 2- Minuten-Intervallen für wenigstens 16 Minuten vorgenommen. Das GHL-Cu und der GHL-Palmitatester wurden sowohl als der 2:1 als auch als der 1:1-molare Komplex mit Kupfer im SOD-Test untersucht. TABELLE Getestete Verbindung SOD Spezifische Aktivität 1:1-Komplex 2:1-Komplex Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu Glycyl-L-histidyl-L-lysinoctylester:Cu Glycyl-L-histidyl-(3-methyl)-L-lysin: Cu Glycyl-L-histidyl-L-lysinpalmitylester:Cu NT=nicht getestet spezifische Aktivität=Einheiten SOD/Milligramm

BEISPIEL VII

Beispiele nützlicher Wirkungen von GHL-Cu-Derivaten

A) Wundheilung
Bei Mäusen wurden Einschnittwunden auf den Körperflanken (sechs 1,5 cm-Wunden pro Tier) taglich mit entweder einer Lösung, die GHL-Cu (100 Mikrogramm pro ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthielt, oder mit PBS allein abgetupft (6 Tiere in jeder Gruppe). Nach 5 Tagen wurden die Wunden mit 1,0 für vollständigen Verschluß 0,5 für teilweisen Verschluß und 0,0 für Nicht-Verschluß bewertet. Wirkung von GHL-Cu und ausgewählten Derivaten auf die Heilung von Wunden bei Mäusen Bewertung pro Wunde Kontrolle GHL-Cu Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester:Kupfer(II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester:Kupfer(II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid:Kupfer(II)
Diese Ergebnisse belegen, daß die Anwendung der GHL-Cu-Derivate der vorliegenden Erfindung (einschließlich Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester Kupfer (II) und Glycyl-L-histidyl-L- lysin-n-palmitylester:Kupfer(II)) auf eine Wunde den Wundheilungsprozeß signifikant beschleunigt.

Vergleichsbeispiel B) Anti-Thromboxan-Aktivitäten von GHL-Cu und Derivaten

Hunde-Blutplättchen in Plasma wurden mit ADP und Collagen aggregiert. Produktion von Thromboxan B&sub2; wurde mit Radioimmunoassay gemessen (New England Nuclear Thromboxane Assay Kit, Boston, MA) Getestete Verbindung Inhibition von Blutplättchen-Thromboxanproduktion, induziert durch 1 Mikrogramm pro Millimeter GHL-Cu Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester:Kupfer(II) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester:Kupfer(II) Glycyl-L-histidyl-L-lysinamid:Kupfer(II)
Diese Ergebnisse belegen, daß GHL-Cu-Derivate, von denen einige oben beschrieben sind, die Produktion von Thromboxan durch Blutplättchen signifikant inhibieren, wodurch ein optimaler Blutstrom zum verwundeten Bereich ermöglicht wird.

VERGLEICHSBEISPIEL VIII

Widerstandsfähiakeit gegen Zerfall durch Carboxypeptidase von GHL-Cu und Derivaten

Alle lipophileren Peptid-Analoge von GHL von denen einige unten dargestellt sind, besaßen größere Widerstandsfähigkeit gegen proteolytischen Zerfall durch das Enzym Carboxypeptidaso, wenn untersucht unter Verwendung des Verfahrens von Schlesinger et al., Experientia 33: 324-324 (1977) Getestete Verbindung Prozent Zerfall nach 1 Minute Glycyl-L-histidyl-L-lysin (Kontrolle) Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester Glycyl-L-histidyl-L-lysin-amid Glycyl-L-histidyl-L-lysin-methylester
Beispiel VIII belegt die Widerstandsfähigkeit von GHL und GHLDerivaten gegen proteolytischem Zerfall in vitro.
Im Körper steht GHL mit GHL-Cu aufgrund dynamischer Kupferbindung und Austauschreaktionen im Gleichgewicht. In seiner metallfrelen Form wird GHL anfällig gegen proteolytischen Zerfaul und Inaktivierung durch das Enzym Carboxypeptidase. Wenn GHL abgebaut wird, wird die Menge an GHL-Cu gesenkt.
Die Derivate von GHL binden ebenfalls Kupfer und im Körper würden die metallfreien Formen im Gleichgewicht mit den kupferkomplexierten Formen existieren. Abbau der metallfreien Formen würde die verfügbare Menge komplexierter Formen senken. Beispiel VIII belegt, daß die metallfreien Derivate von GHL weniger anfällig gegen proteolytischen Zerfall als metallfreies GHL sind. Eine Erklärung für dieses Phänomen ist, daß die "R"-Gruppe, die an den Carboxy-Terminus von GHL gebunden ist, die molekulare Konformation verändert, wodurch die richtige enzymatische Erkennung der GHL-Derivate durch proteolytische Enzyme verhindert wird.
Demgemäß sollte der in-vivo-Abbau der Derivate von GHL-Cu merkbar verringert sein. Diese Eigenschaft würde ermöglichen, daß die Derivate von GHL-Cu in einer bioaktiven Umgebung, die Abbaumechanismen enthält, wirkungsvoller als GHL-Cu sind.

Claims

Derivate von GHL-Cu, die Wundheilungs-Aktivität besitzen und die allgemeine Formel haben:

[Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R]:Kupfer (II),

wobei R ausgewählt ist aus Alkoxyeinheiten, die von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten.
2. Das Derivat nach Anspruch 1, wobei die Alkoxyeinheit eine n-Stearoxyeinheit ist.
3. Das Derivat nach Anspruch 1, wobei die Alkoxyeinheit eine n-Palmitoxyeinheit ist.
4. Eine Zusammensetzung, die ein Derivat von GHL-Cu enthält, wobei besagtes Derivat von GHL-Cu die allgemeine Formel hat:

[Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R] : Kupfer (II),

wobei R ausgewählt ist aus Alkoxyeinheiten, die von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, zur Verwendung als eine aktive therapeutische Substanz.
5. Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Alkoxyeinheit eine n-Stearoxyeinheit ist.
6. Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Alkoxyeinheit eine n-Palmitoxyeinheit ist.
7. Eine Zusammensetzung, die ein Derivat von GHL-Cu enthält, wobei besagtes Derivat die allgemeine Formel hat:

[Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R] : Kupfer (II)

wobei R ausgewählt ist aus Alkoxyeinheiten, die von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, zur Verwendung bei der Beschleunigung des Wundheilungsprozesses.
8. Eine Zusammensetzung, die ein Derivat von SEL-Du enthält, wobei besagtes Derivat die allgemeine Formel hat:

[Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R] :Kupfer (II),

wobei R ausgewählt ist aus Alkoxyeinheiten, die von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, zur Verwendung bei der Inhibierung der Produktion von Thromboxan durch Blutplättchen.