DE3887528T2 - Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes. - Google Patents
Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von molekularem Sauerstoff in einer Probe und auf Systeme zum Bestimmen der Konzentration.
- Seit einigen Jahren ist es möglich, die Konzentration von molekularem Sauerstoff in einer Probe durch die Verwendung von optischen Verfahren zu bestimmen, die auf einer Lumineszenzlöschung beruhen. Diese Verfahren umfassen im allgemeinen die Messung der Lumineszenzintensität und/oder der Lumineszenzlebensdauer eines geeigneten Luminophors, wobei das Luminophor in Kontakt mit einer Sauerstoff enthaltenden Probe steht und einer Bestrahlung ausgesetzt ist.
- Das Grundmerkmal der Lumineszenzlöschung besteht in der Deaktivierung des lumineszent angeregten elektronischen Zustandes des Luminophors, welche bei Kollision mit Sauerstoffmolekülen stattfindet. Da die durchschnittliche Zahl der Luminophormoleküle in dem angeregten elektronischen Zustand durch die Wechselwirkung mit den Sauerstoffmolekülen vermindert wird, wird die Lumineszenzintensität und die Lebensdauer des Luminophors im angeregten Zustand reduziert. Die Höhe der Reduktion ist über die Stern-Volmer Gleichung
- Mº/M = 1 + Ksv [O&sub2;]
- mit der Zahl der Sauerstoffmoleküle, die in Kontakt mit dem Luminophor stehen, verbunden, siehe z. B. IUPAC Commission on Photochemistry und "Glossary of Terms used in Photochemistry, Teil III", EPA Newsletter, Juli 1986. Mº und M der obigen Gleichung bezeichnen die Lumineszenzintensität bzw. die Lebensdauer des Luminophors im angeregten Zustand in der Abwesenheit und Gegenwart von Sauerstoff. [O&sub2;] bezeichnet die Konzentration des molekularen Sauerstoffs entsprechend dem gemessenen M-Wert. Ksv ist die sogenannte Stern-Volmer Konstante, die in der obigen Druckschrift erläutert wird. Durch Verwendung dieser Gleichung und deren Korrelation mit Proben von bekannter Sauerstoffkonzentration ist es möglich, die Sauerstoffkonzentration einer Probe zu bestimmen.
- In den vergangenen Jahren war es eine große Aufgabe in der Forschung, die Lumineszenzlöschungsmethode zur Bestimmung von Sauerstoffkonzentrationen zu entwickeln und zu verbessern. Das Ziel dieser Forschung war unter anderem, nützliche Luminophorsubstanzen aufzufinden, den Kontakt zwischen dem Luminophor und den Sauerstoffmolekülen zu verbessern und verbesserte Vorrichtungen, die für spezifische Verwendungen geeignet sind, zu entwickeln.
- Von verschiedenen Forschern wurde herausgefunden, daß aromatische Moleküle geeignete Luminophorsubstanzen sind (Stevens in dem US-Patent Nr. 3 612 866; Stanley et al. in dem US-Patent Nr. 3 725 658). Spezifische Beispiele für nützliche Luminophore sind Pyrenbuttersäure (Longmuir, I.S. und Knopp J.A., "Measurement of tissue oxygen with a fluorescent probe", Journal of applied physiology, 41, 4, USA 1976), Porphyrine und deren Derivate (Kahil in der internationalen Publikation Nr. WO 87/00023) und anorganische Metallkomplexe (Bacon, J. R. und Demas, J. N. in der UK-Patentanmeldung Nr. 2 132 348). Das Luminophor kann in einer Matrix eingebettet sein, wie eine Glasmatrix, offenbart von Bergman, I., Nature 218, 1968, Seite 376, oder eine Polymermatrix, offenbart von Khail, siehe oben, oder Bacon, siehe oben. Das Verfahren der Lumineszenzlöschung wurde in einer Vielzahl von Systemen eingesetzt. Beispielsweise sind Faseroptiksonden, die einen Farbstoff enthalten und die in ein menschliches Körpergewebe implantierbar sind, von Peterson et al. in dem US-Patent Nr. 4 476 870 offenbart.
- Das optische Quenchverfahren ist ferner unter anderem offenbart in:
- Vaughan, W.M. und Weber, G., "Oxygen Quenching and Pyrenebutyric Acid Fluorescence in Water". A Dynamic Probe of the Microenvironment", Biochemistry, Vol. 9, Nr. 3, 3. Februar 1970, Seiten 464-473,
- Buckles, R.G. in dem US-Patent Nr. 4 399 099,
- Murray, R. C., Jr. und Lefkowitz, S.M. in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 190 829,
- Hirschfeld in dem US-Patent Nr. 4 542 987,
- Lübbers et al. in dem neu herausgegebenen US-Patent Nr. Re. 31 879,
- Hesse, H.-C. in der DD-Patentanmeldung Nr. 106 086 und
- Murray, R. C., Jr. und Lefkowitz, S. M. in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 190 830.
- Das US-Patent Nr. 4 576 173 (von Parker et al.) offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Niveaus des Singulett-Zustandes (d. h. angeregter Zustand) von Sauerstoff, der in einem "biologischen Medium" (wie ein Tumorgewebe in einem lebenden Organismus) nach dessen Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge in Gegenwart eines Sensibilisierungsmittels erzeugt wird, wobei das Sensibilierungsmittel den in dem biologischen Medium vorhandenen Sauerstoff von seinem Grundzustand zu Singulett-Sauerstoff anregen kann. Das Niveau des Singulett-Sauerstoffs wird auf Basis des erfaßten 1,27 Mikron (d. h. 1.270 nm) Lichtemissionssignals bestimmt, das von dem Singulett-Sauerstoff ausgeht.
- Die Erfindung stellt ein neues Verfahren und System für die optische Bestimmung der Konzentration von molekularem Sauerstoff in seinem Grundzustand, der in einer Probe vorliegt, bereit.
- Bei Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung wird die Konzentration von molekularem Sauerstoff im Grundzustand in einer Probe durch Anregen der Sauerstoffmoleküle der Probe von dem elektronischen Grundzustand in den angeregten ¹Δg-Zustand (angeregter Singulett-Zustand) bestimmt, eine 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft der angeregten Sauerstoffmoleküle wird gemessen und die gemessene Lumineszenzeigenschaft wird mit der Konzentration des molekularen Sauerstoffs im Grundzustand in der Probe korreliert. Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 41 gekennzeichnet.
- Im Gegensatz zu dem Grundprinzip der bekannten optischen Verfahren zur Bestimmung der Menge von molekularem Sauerstoff (d. h. molekularer Sauerstoff im Grundzustand), wobei Licht, das von einer anderen Substanz als Sauerstoff emittiert wurde, gemessen wird, basiert die Erfindung auf dem Prinzip der Bestimmung der Konzentration von molekularem Sauerstoff im Grundzustand in einer Probe, bei dem die Lumineszenz bei 1.270 um gemessen wird, die von dem angeregten Singulett ¹Δg-Zustand des Sauerstoffs ausgeht. Das Verfahren nach der Erfindung besitzt die gleichen Vorteile wie die bekannten optischen Verfahren (zum Beispiel wird der Sauerstoff nicht verbraucht nach dem Verfahren der Erfindung), wobei es jedoch von einem praktischen Meßgesichtspunkt aus gegenüber den bekannten Verfahren überlegen ist. Insbesondere ist das Verfahren für Sauerstoff spezifisch, da das bei 1.270 nm erzielte Signal im wesentlichen dem Sauerstoff zugeordnet werden kann und es gegenüber einer Interferenz mit Substanzen, die kein Sauerstoff darstellen, wenig empfindlich ist. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten, auf der Lumineszenzlöschung basierenden Verfahren, worin die Verminderungen der Intensität oder der Lebensdauer, die von anderen Substanzen hervorgerufen werden, nicht von den Veränderungen des von dem Sauerstoff abstammenden Signal unterschieden werden können. Das bei 1.270 nm erzielte Lumineszenzsignal wächst mit zunehmenden Sauerstoffkonzentrationen an, wobei es in Abwesenheit von Sauerstoff im wesentlichen bei 0 liegt. Dies ermöglicht eine Amplifizierung des in Gegenwart von Sauerstoff erzielten 1.270 nm Signals durch das Verfahren nach der Erfindung. Demgegenüber erlaubt die sauerstoffinduzierte Signalreduktion der bekannten Lumineszenzlöschungsverfahren keine Signalamplifizierung. Ferner ist die Kalibrierung des Bestimmungsverfahrens nach der Erfindung sehr viel einfacher, als die Kalibrierung der bekannten Lumineszenzlöschungsverfahren, da die Errichtung einer Standardkurve nur auf einer bekannten Sauerstoffkonzentration und einem zusätzlichen Referenzwert, der implizit bekannt ist (0 in der Abwesenheit von Sauerstoff) basieren kann.
- Beispiele für Publikationen, welche die 1.270 nm Emission des Singulett-Sauerstoffs beschreiben, sind:
- Parker et al. in dem US-Patent Nr. 4 592 361,
- Parker et al. in dem US-Patent Nr. 4 576 173,
- Ogilby, P. R. et al., "The Photosensitized Production of Singlet Molecular Oxygen (¹Δg O&sub2;) in a Solid Organic Polymer Glass: A Direct Time-Resolved Study", J. Am. Chem. Soc., 109, 1987, Seiten 4746-4747.
- Die Anregung von Sauerstoffmolekülen zur Bildung des angeregten Singulett-Zustandes oder des Singulett-Sauerstoffes, wie er auch bezeichnet wird, kann mit signifikanter Effizienz durch direkte Absorption von elektromagnetischer Strahlung nicht erzielt werden. Die Sauerstoffmoleküle müssen somit auf eine andere Weise angeregt werden. Die Anregung von Sauerstoffmolekülen wird in geeigneter Weise durch ein sogenanntes Sensibilisierungsmittel durchgeführt, das eine Verbindung oder eine Zusammensetzung darstellt, die bei Aufnahme von Energie in einer geeigneten Form, d. h. elektromagnetische Strahlung, in einen angeregten elektronischen Zustand (sensibilisierender angeregter Zustand) gebracht werden kann, der molekularen Sauerstoff von dem elektronischen Grundzustand in den angeregten Singulett-Zustand anregen kann.
- Die gegenseitige Anordnung der elektronischen Zustände des Sensibilisierungsmittels und des molekularen Sauerstoffs kann in einem Jablonski-Diagramm dargestellt werden, wie dies in der Fig. 5 für einige der niederen relevanten elektronischen Zustände gezeigt ist. Durch Absorption von Licht kann der Grundzustand (S&sub0;) des Sensibilisierungsmittels auf den ersten angeregten Singulett-Zustand (S&sub1;) oder auf den zweiten oder einen höheren angeregten Singulett-Zustand (S&sub2;, S&sub3;, . . . ) angeregt werden. Diese angeregten Singulett-Zustände können durch nicht-strahlende, interne Umwandlung (wie durch die Wellenpfeile dargestellt) oder durch Fluoreszenz (wie durch die geraden Pfeile dargestellt) auf den Grundzustand zurückfallen, oder sie können einer sogenannten Intersystemüberschreitung unterliegen, wobei angeregte Triplett-Zustände (T&sub1;, T&sub2;, . . . ) gebildet werden. Die am häufigsten auftretende Intersystemüberschreitung ist durch den Wellenpfeil von S&sub1; zu T&sub1; dargestellt. Die angeregten Triplett-Zustände können durch Phosphoreszenz (gerader Pfeil von T&sub1; zu S&sub0;) oder durch nicht-strahlende Prozesse, einschließlich Quenchen, zu dem Grundzustand zurückkehren. In diesem Zusammenhang ist das Quenchen (d. h. die Deaktivierung) des angeregten Sensibilisierungsmittels durch molekularen Sauerstoff (Wellenpfeil von T&sub1; zu ¹Δg) unter Bildung von Singulett-Sauerstoff das interessante Merkmal, das im Detail weiter unten beschrieben werden wird.
- Das Sensibilisierungsmittel ist normalerweise in einer "Matrix" "eingebettet" (obwohl, wie unten erläutert, es auch in der Probe eingebettet sein kann). Der Ausdruck "eingebettet in", wie er in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, beabsichtigt jeden geeigneten Weg der Aufnahme, der Lokalisierung oder der räumlichen Fixierung des Sensibilisierungsmittels zu umfassen, zum Beispiel durch Auflösung, Lösen, Adhäsion oder kovalente Bindung. Die "Matrix" ist typischerweise ein anorganisches Lösungsmittel oder ein Polymer.
- Das Sensibilisierungsmittel und der molekulare Sauerstoff müssen in Diffusionskontakt zueinander stehen (d. h. die Moleküle des Sensibilisierungsmittels und die Sauerstoffmoleküle müssen zur Kollision durch Diffusion von wenigstens einer dieser molekularen Spezien fähig sein), um das Quenchen des molekularen Sauerstoffs im Grundzustand durch die sensibilisierenden angeregten Zustände des Sensibilisierungsmittel sicherzustellen. Wenn dies der Fall ist, kann ein Energietransfer zwischen dem Sensibilisierungsmittel und dem molekularen Sauerstoff, d. h. ein Quenchen, stattfinden, wodurch der sensibilisierende angeregte Zustand des Sensibilisierungsmittels auf einen elektronischen Zustand geringerer Energie, im allgemeinen der Grundzustand, deaktiviert und Singulett-Sauerstoff gebildet wird.
- Es wird normalerweise beobachtet, daß die Sauerstoffquenchprozesse der sensibilisierenden angeregten Zustände diffusionsgesteuert sind. Somit hängen die aktuellen Werte der Quenchratenkonstanten von der Viskosität der Matrix, in der das Sensibilisierungsmittel vorliegt, ab.
- Durch Anregung eines Sensibilisierungsmittels D mit einem sensibilisierenden angeregten Zustand D* (X), der zur Herstellung von Singulett-Sauerstoff fähig ist, könnte das allgemeine Reaktionsschema, das zu Singulett-Sauerstoff führt, das folgende sein:
- die primäre Anregung des Sensibilisierungsmittels durch elektromagnetische Strahlung (hv).
- Bildung eines sensibilisierenden angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels D* (X).
- Fall des sensibilisierenden angeregten Zustandes D* (X) des Sensibilisierungsmittels auf den Grundzustand D mit einer durch kX bestimmten Rate, siehe unten.
- Energietransfer von dem sensibilisierenden angeregten Zustand D* (X) auf den Grundzustand des molekularen Sauerstoffs O&sub2; (³Σg), um Singulett- Sauerstoff O&sub2; (¹Δg) mit einer durch ket bestimmten Rate, siehe unten.
- Die Quantenausbeute (d. h. die Zahl der pro absorbierten Photons gebildeten Moleküle) der Singulett-Sauerstoffherstellung φ(¹Δg) würde sein
- φX = Quantenausbeute der Bildung des sensibilisierenden angeregten Zustandes D* (X),
- Quantenausbeute der Singulett-Sauerstoffbildung von D* (X), d. h. die Fraktion von D* (X), die Singulett-Sauerstoff liefert,
- ket die Ratenkonstante für den Energietransfer von dem Sensibilisierungsmittel auf den molekularen Sauerstoff im Grundzustand ist,
- kX die Ratenkonstante für den Fall des sensibilisierenden angeregten Zustandes ist (kX = 1/rX, rX ist die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands),
- [O&sub2;] die Konzentration des molekularen Sauerstoffs in der das Sensibilisierungsmittel enthaltenden Matrix ist.
- Die Gesamtausbeute φL (¹Δg) der Singulett-Sauerstofflumineszenz (die Zahl der Photonen, die pro absorbiertes Photon emittiert werden) bei 1.270 nm ist gegeben durch
- φP (¹Δg) die intrinsische Phosphoreszenz-Quantenausbeute des Singulett-Sauerstoffs (d. h. die Zahl der Photonen, die pro Singulett-Sauerstoffmolekül emittiert werden) unter den aktuellen Bedingungen ist. Wird berücksichtigt, daß φP (¹Δg) und φX unabhängig von der Sauerstoffkonzentration sind, wird die Sauerstoffkonzentrationsabhängigkeit der 1.270 nm Lumineszenz allein von et bestimmt. Die Annahme, daß φP (¹Δg) und φX von der Sauerstoffkonzentration unabhängig sind, ist wahrscheinlich nur strikt gültig für φP (¹Δg). In der Literatur kann bezüglich der Sauerstoffkonzentrationsabhängigkeit kein Hinweis gefunden werden. Die Frage, ob φX irgendeine Sauerstoffkonzentrationsabhängigkeit aufweist, wird durch die chemische Zusammensetzung des aktuellen Sensibilisierungssystems bestimmt. Für viele mögliche Sensibilisierungsmittel wird φX die Quantenausbeute der Triplett-Bildung φT sein (d. h. Intersystemüberschreitung von dem Singulett- zu dem mehrfachen Triplett-Zustand. In solchen Fällen ist φX wahrscheinlich von der Sauerstoffkonzentration abhängig, da eine durch Sauerstoff verstärkte Intersystemüberschreitung ein allgemeiner Mechanismus für das Löschen des Singulett- Zustandes durch Sauerstoff ist. Dieser Prozeß wurde tatsächlich beobachtet, wenn als Sensibilisierungsmittel (siehe Beispiel 3) Tetraphenylporrphyrin (H&sub2;TPP) verwendet wurde.
- Aus Gleichung (2) ist zu erkennen, daß die Gesamtausbeute der Singulett-Sauerstofflumineszenz φL (¹Δg) proportional zu der intrinsischen Phosphoreszenz-Quantenausbeute des Singulett-Sauerstoffs φP (¹Δg) ist. Aus der Gleichung
- worin kP (¹Δg) und r (¹Δg) die strahlende Ratenkonstante (Zahl der Photonen, die pro Zeiteinheit emittiert werden) bzw. die Lebensdauer des Singulett-Sauerstoffs sind, ist zu erkennen, daß die 1.270 nm Lumineszenzausbeute mit zunehmender Singulett-Sauerstofflebensdauer anwächst, wenn berücksichtigt wird, daß kP (¹Δg) Matrix-unabhängig ist. Es wurde experimentell herausgefunden, daß in flüssigen Phasen kP (¹Δg) relativ unabhängig von dem Typ der fraglichen Matrix ist, während r (¹Δg) mit wenigstens einem Faktor von 103 sich ändern kann, wenn die Matrix gewechselt wird. Es ist bekannt, daß die Gegenwart von OH-Gruppen insbesondere effektiv für die Reduktion von r (¹Δg) ist. Deshalb sollte die bevorzugte Matrix keine OH-Gruppen enthalten.
- Die Sauerstoffabhängigkeit der Gesamtlumineszenzausbeute des Singulett-Sauerstoffs bei 1.270 nm, wie sie durch den Ausdruck für φet (Gleichung 1) gegeben ist, wird durch die drei Parameter ket, kX und [O&sub2;], wie oben definiert, bestimmt. Die Hauptfaktoren, welche die Größe dieser Parameter steuern, werden unten erläutert:
- ket: Ratenkonstante für den Energietransfer von dem Sensibilisierungsmittel zu dem molekularen Sauerstoff im Grundzustand. Dieser Prozeß ist im wesentlichen für alle potentiellen Sensibilisierungsmittel diffusions-gesteuert. Somit wird ket proportional zu der Summe der Diffusionskonstanten des molekularen Sauerstoffs und des Sensibilisierungsmittels in der beteiligten Matrix sein.
- [O&sub2;]: Für einen gegebenen Umgebungspartialdruck des molekularen Sauerstoffs wird die Konzentration des molekularen Sauerstoffs in der Matrix (d. h. die das Sensibilisierungsmittel enthaltende Matrix) proportional zu der Löslichkeit des molekularen Sauerstoffs in der beteiligten Matrix sein.
- kX: Ratenkonstante für den Abfall des sensibilisierenden angeregten Zustands (in der Abwesenheit von Sauerstoff) wird in hohem Maße von der Wahl des Sensibilisierungsmittels bestimmt. Kleinere Effekte der Matrix und der Konzentration des Sensibilisierungsmittels können auftreten.
- Wenn die obigen Gleichungen (1) und (2) miteinander kombiniert werden und wenn angenommen wird, daß φP (¹Δg) und φX unabhängig von der Sauerstoffkonzentration sind, kann die Gesamtausbeute der Singulett-Sauerstofflumineszenz wie folgt ausgedrückt werden:
- wobei φL (¹Δg) die Gesamtausbeute der Singulett-Sauerstofflumineszenz bei 1.270 nm ist, die bei der Sauerstoffkonzentration [O&sub2;] erzielt wird,
- φmax die maximale Ausbeute der Singulett-Sauerstofflumineszenz ist, die in dem fraglichen System erzielbar ist.
- Aus der Gleichung (2) ist zu erkennen, daß ein Diagramm der Singulett-Sauerstofflumineszenz bei 1.270 nm, φL (¹Δg) gegen [O&sub2;], eine Kurve sein wird, die sich asymptotisch der maximalen Lumineszenzausbeute φmax annähert.
- Unter den Bedingungen von ket [O&sub2;] » kX wird sich der Wert von φet Eins annähern und die Singulett-Sauerstofflumineszenz wird sich ihrem maximalen Wert annähern, d. h. die Lumineszenzintensität wird im wesentlichen bei variierenden Sauerstoffkonzentrationen konstant sein. Die Sauerstoffkonzentration in der Matrix, die einer Lumineszenzintensität mit der Hälfte des Maximalwertes (d. h. φet = 0,5) entspricht, ist gegeben durch
- (4) [O&sub2;] 1/ 1/2 = kX/ket
- oder, anders ausgedrückt, die Hälfte der maximalen Lumineszenzintensität wird erreicht, wenn die Gleichung
- (5) ket [O&sub2;] = kX
- erfüllt ist. Wenn ket [O&sub2;] « kX ist, wird die Lumineszenzintensität sehr klein sein.
- Bei moderaten Unterschieden zwischen ket [O&sub2;] und kX wird die φL (¹Δg) versus [O&sub2;] Kurve eine nützliche Neigung innerhalb eines Sauerstoffkonzentrationsbereiches um und einschließlich von [O&sub2;]1/2 zeigen. Für jedes individuelle System gibt es somit einen Sauerstoffkonzentrationsbereich, in dem die Größenvariation von φL (¹Δg) (die Gesamtausbeute der Singulett-Sauerstofflumineszenz bei 1.270 nm) mit der Sauerstoffkonzentration (die Neigung der Kurve) ausreichend sein wird, um die 1.270 nm Lumineszenz für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration zu verwenden. Selbstverständlich bezieht sich der Ausdruck "ausreichend" in diesem Zusammenhang auf das verwendete Lumineszenzerfassungssystem, wobei ein sensitiveres System auch mit einer ausreichenden Genauigkeit kleinere Variationen bestimmen kann, während ein weniger sensitives Erfassungssystem eine größere Lumineszenzvariation erfordert, um eine sinnvolle Bestimmung sicherzustellen.
- Bei Kombination der Gleichungen (3) und (4) scheint die 1.270 nm Gesamtlumineszenzausbeute wie folgt zu sein:
- wobei diese Gleichung äquivalent zu der Funktion von
- Y = x/1+x
- ist. Diese Funktion ist in der Fig. 7 dargestellt.
- Es ist zu erkennen, daß sich die Lumineszenz φL (¹Δg) asymptotisch φmax nähert, wenn die Sauerstoffkonzentration [O&sub2;] anwächst. Wie oben erwähnt, gibt es keine besondere Beschränkung, bei der die Neigung der Kurve so klein wird, daß es nicht länger sinnvoll ist, diese für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration zu verwenden. Dies hängt von dem verwendeten Detektionssystem ab. Für die meisten praktischen Anwendungen sollte jedoch das System so adaptiert sein, daß die unter Verwendung des Systems zu messende, maximale Sauerstoffkonzentration einer φL (¹Δg) von höchstens 98% des φmax entspricht, wobei eine φL (¹Δg) von höchstens 95% des max oft bevorzugt ist und eine φL (¹Δg) von höchstens 90% des φmax am bevorzugsten ist. Demgemäß sollte die zu messende, maximale Sauerstoffkonzentration zu einer Matrixsauerstoffkonzentration von höchstens 50 · [O&sub2;] 1/2 führen, wobei 20 · [O&sub2;]1/2 bevorzugt und 10 · [O&sub2;]1/2 am bevorzugsten ist. Im folgenden wird erläutert werden, wie das System auf den zu messenden Sauerstoffkonzentrationsbereich eingestellt werden kann.
- Die "1.270 nm Lumineszenzeigenschaften", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf jeden Weg der Charakterisierung oder Messung der 1.270 um Lumineszenz. Die 1.270 nm Lumineszenz wird in geeigneter Weise durch die 1.270 nm Lumineszenzintensität charakterisiert, was in dem breitesten Sinn zu verstehen ist, d. h. die Größe des durch kontinuierliche Anregung erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignals oder der integrierte Wert des zeitabhängigen 1.270 nm Lumineszenzsignals, das durch gepulste Anregung erzielt wird, oder die erste Ableitung des abfallenden Teils des zeitabhängigen Lumineszenzsignals. Jedoch fallen auch andere Wege der Expression der Lumineszenzeigenschaften, wie die Amplituden- und Phasenverschiebung zwischen dem 1.270 um Lumineszenzsignal und einem modulierten Sauerstoffanregungsmittel, unter die Definition des Ausdruckes "Lumineszenzeigenschaften". Vorzugsweise wird die während einer kontinuierlichen Anregung erzielte 1.270 nm Lumineszenzintensität gemessen.
- Der Sauerstoff, der durch das Verfahren nach der Erfindung bestimmt wird, ist molekularer Sauerstoff, d. h. O&sub2;. Wie oben diskutiert, beruht das Verfahren nach der Erfindung auf der Anregung von Sauerstoffmolekülen von dem elektronischen Grundzustand in einen angeregten elektronischen Zustand, dem ¹Δg-Zustand. Sauerstoffmoleküle in dem ¹Δg-Zustand werden hier und gemaß konventionell verwendeter Ausdrücke als Singulett-Sauerstoff oder als molekularer Singulett-Sauerstoff bezeichnet. Der ¹Δg-Zustand der Sauerstoffmoleküle bezeichnet den angeregten Singulett-Zustand des molekularen Sauerstoffs. Diese elektronischen Zustände sind von M. Kasha in "Singlet O&sub2;", Vol. I, A.A. Frimer Ed., CRC-PRESS, Boca Raton, 1985, Seiten 1-11 definiert.
- Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird die strahlende Deaktivierung von Singulett-Sauerstoff für die Bestimmung der Konzentration des molekularen Sauerstoff verwendet. Die strahlende Deaktivierung entspricht einer Lichtemission mit einer Wellenlänge von etwa 1.270 nm. In der Gasphase entspricht die strahlende Deaktivierung von Singulett-Sauerstoff einer Lichtemission mit einer Wellenlänge von 1.268,7 nm (M. Kasha, siehe oben). In einer kondensierten Phase ist die Wellenlänge des Lichtes, das von dem Singulett-Sauerstoff abstammt, bekannterweise weniger genau, sie wird aber im allgemeinen mit 1.270 nm angenommen. Ein typisches Emissionsspektrum von Singulett-Sauerstoff in Perfluorhexan ist in der Fig. 6 gezeigt. Die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) des 1.270 nm Emissionsspektrums beträgt etwa 30 nm. Bezüglich des vorliegenden Verfahrens kann die Breite des akzeptablen Wellenlängenbereiches, in dem die Erfassung durchgeführt wird, von der gewünschten Genauigkeit der Bestimmung, der Größe des Hintergrundsignals, etc., abhängen. Normalerweise wird ein akzeptables Lumineszenzsignal des Singulett-Sauerstoffs erzielt, wenn die Erfassung innerhalb eines Wellenlängenbereiches von 1.270 ± 90 nm, insbesondere 1.270 ± 60 nm, vorzugsweise 1.270 ± 40 um erfolgt. Der Ausdruck "1.270 nm Lumineszenzeigenschaft", wie er hier verwendet wird, beabsichtigt, die bei einem Wellenlängenbereich um 1.270 nm gemessene Lumineszenz sowie die oben angegebenen Wellenlängenbereiche zu umfassen.
- Wie oben erwähnt, ist es innerhalb des Standes der Technik bekannt, daß die 1.270 nm Lumineszenz hochspezifisch für den angeregten Singulett-Zustand von molekularem Sauerstoff ist (M. Kasha, siehe oben). Somit wird es in den meisten Fällen nicht notwendig sein, den Teil der Lumineszenz zu berücksichtigen, der von anderen Komponenten abstammt, da die Größe dieses Teils normalerweise vernachlässigbar ist. Auch der Störpegel, der der verwendeten Ausrüstung zugesprochen werden kann, ist normalerweise im Vergleich zu dem Lumineszenzsignal des Singulett-Sauerstoffes nicht signifikant. In bestimmten Fällen kann es jedoch wünschenswert sein, einen Wert der Lumineszenzeigenschaft zu erzielen, der alleine von dem Sauerstoffgehalt der Probe abhängig ist. In diesen Fällen kann es notwendig sein, das Hintergrundsignal, das von anderen Komponenten abstammt, sowie den von der Ausrüstung abstammenden Störpegel zu korrigieren. Der Ausdruck "Bestimmung der 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft" beabsichtigt somit, die Bestimmung der 1.270 nm Gesamtlumineszenzeigenschaft einzuschließen, die wahlweise begleitet oder gefolgt wird von einer Korrektur für den Störpegel und des Hintergrundsignals, das durch die Lichtemission von anderen, in der Probe vorhandenen Komponenten hervorgerufen wird.
- In den meisten Fällen wird die Menge des Sauerstoffes, der gemäß dem vorliegenden Verfahren bestimmt wird, als eine Konzentration ausgedrückt, d. h. als Mol pro Liter oder als einen Partialdruck, z. B. als mmHg oder kPa oder deren Äquivalente. Da die Einheit der Sauerstoffmenge von der Einheit des Referenzwertes abhängig ist, der verwendet wird, um die 1.270 nm Lumineszenzintensität mit der aktuellen Sauerstoffkonzentration zu korrelieren, kann diese auch auf einem anderen Wege ausgedrückt werden. Der Ausdruck "Konzentration des molekularen Sauerstoffs", so wie er hier verwendet wird, erfaßt somit die Menge an molekularem Sauerstoff, die in jeder geeigneten Weise ausgedrückt sein kann.
- Das 1.270 nm Lumineszenzsignal, das mit der Probe, die den zu messenden Sauerstoff enthält, erzielt wird, wird mit Standardwerten korreliert, die auf 1.270 nm Lumineszenzsignalen basieren, die mit Referenzproben von bekanntem Sauerstoffgehalt erzielt werden, wobei das gleiche oder ein äquivalentes System verwendet wird, um so die unbekannte Sauerstoffmenge zu quantifizieren.
- Wie oben erläutert, kann durch direkte Absorption einer elektromagnetischen Strahlung Singulett-Sauerstoff in keiner signifikanten Effizienz gebildet werden. Die Sauerstoffmoleküle müssen über einen anderen Weg angeregt werden. Die Anregung der Sauerstoffmoleküle kann in vorteilhafter Weise durch ein Sensibilisierungsmittel durchgeführt werden, das einen angeregten elektronischen Zustand (sensibilisierenden angeregten Zustand) aufweist, der fähig ist, molekularen Sauerstoff aus dem elektronischen Grundzustand auf den angeregten Singulett-Zustand anzuregen, wobei das Sensibilisierungsmittel in Diffusionskontakt mit der Probe steht.
- Das Sensibilisierungsmittel, so wie es hier verwendet wird, kann zusätzlich zu den Sensibilisierungsmitteln, die weiter oben in dem Abschnitt über den theoretischen Hintergrund erläutert wurden, einen Quencher aufweisen, der die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels reduzieren kann. Dies wird im Detail weiter unten diskutiert. Wie bereits oben erläutert wurde, ist das Sensibilisierungsmittel vorzugsweise in Sauerstoff- Diffusionskontakt mit der Probe in einer Matrix eingebettet. Alternativ kann das Sensibilisierungsmittel in der Probe eingebettet sein.
- Der Kontakt zwischen dem Sensibilisierungsmittel und dem molekularen Sauerstoff in der Probe (die ein Fluid, d. h. ein Gas oder eine Flüssigkeit, oder ein Feststoff sein kann) wird über Diffusion hergestellt. Wie oben erläutert, ist der Sauerstoffdiffusionskontakt zwischen der Probe und dem Sensibilisierungsmittel notwendig, da die Sauerstoffmoleküle und das angeregte, sensibilisierende Mittel miteinander kollidieren müssen, um die Anregung der Sauerstoffmoleküle aus dem Grundzustand in den angeregten Singulett-Zustand zu ermöglichen.
- Demgemäß muß sowohl die Probe, die den zu bestimmenden molekularen Sauerstoff enthält, als auch die Matrix, falls sie verwendet wird, zulassen, daß Sauerstoffmoleküle eindiffundieren können.
- Durch Quenchen der angeregten Singulett-Zustände des Sensibilisierungsmittels sowie der angeregten Triplett-Zustände des Sensibilisierungsmittels kann Singulett-Sauerstoff hergestellt werden. Die angeregten Triplett-Zustände sind normalerweise effizienter für die Herstellung des Singulett- Sauerstoffs als die angeregten Singulett-Zustände. In beiden Fällen jedoch muß das Sensibilisierungsmittel eine Energielücke von wenigstens 0,98 eV zwischen den elektronischen Zuständen am Start und den endgültigen elektronischen Zuständen, die sich aus dem Quenchen des molekularen Sauerstoffs ergeben, aufweisen, da die zu dem molekularen Sauerstoff transferierte Energie eine Größe von wenigstens 0,98 eV (die Energie des angeregten Singulett-Zustandes des Sauerstoffs) haben muß.
- Bestimmte Sensibilisierungsmittel, z. B. bestimmte Porphyrine, sind durch einen Elektronentransfermechanismus aufgrund von Bestrahlung dazu in der Lage, molekularen Sauerstoff in Superoxid umzuwandeln (d. h. O&sub2;&supmin;, das radikalische Anion des Sauerstoffs). Superoxid, das in nicht-polaren organischen Lösungsmitteln relativ stabil ist, stellt einen effizienten Quencher für Singulett-Sauerstoff dar (Guiraud, H. J. und Foot, C.S., J. Am. Chem. Soc. 98, 1984 (1976)). Wenn Superoxid in einer Singulett-Sauerstoff enthaltenden Probe gebildet wird, kann es einen Teil des Singulett-Sauerstoffs quenchen, was zu einer 1.270 nm Lumineszenzintensität führt, die im Vergleich zu dem Äquivalent der wahren molekularen Sauerstoffkonzentration der Probe zu gering ist. Aufgrund der Stabilität von Superoxid in organischen Lösungsmitteln kann sogar eine sehr langsame Bildung von Superoxid in diesen Lösungsmitteln kritisch sein, da sich evtl. eine signifikante Superoxidkonzentration aufbauen kann. Das Sensibilisierungsmittel ist somit vorzugsweise eine Substanz, die ein Oxidationspotential des sensibilisierenden angeregten Zustandes hat, das im wesentlichen das Sensibilisierungsmittel unfähig dazu macht, molekularen Sauerstoff in Superoxid umzuwandeln. Somit muß das Oxidationspotential des Sensibilisierungsmittels in dem sensibilisierenden angeregten Zustand höher als das Reduktionspotential des Sauerstoffs in der fraglichen Matrix sein.
- Demgemäß wäre das Reduktionspotential des Sauerstoffs in der Matrix ein geeigneter Richtwert für die Wahl der Matrix und des Sensibilisierungsmittels, jedoch ist diese Größe nur für sehr wenige Lösungsmittel bekannt. Es ist berichtet worden, daß das Reduktionspotential von Sauerstoff in Acetonitril -0,82 V gegenüber einer gesättigten Kalomelelektrode (SCE) beträgt. Es ist wahrscheinlich, daß das Reduktionspotential von Sauerstoff in Matrices von geringerer Polarität als Acetonitril geringer als -0,82 V (versus SCE) sein dürfte. Für praktische Zwecke wird ein Sensibilisierungsmittel mit einem Oxidationspotential des sensibilisierenden angeregten Zustands von mehr als -0,7 V (versus SCE) als nützlich angesehen.
- Ein Beispiel für den nachteiligen Effekt der Superoxidbildung ist eine Reduktion der 1.270 nm Lumineszenzsignale anzusehen, die bei belüfteten Proben von Zink-octaethylporphyrin (ZnOEP) und Zink-tetraphenylporphyrin (ZnTPP) (siehe Beispiele 1a und 2a bzw. die Fig. 8 und 9). Gemäß der obigen theoretischen Erläuterung haben diese Substanzen Oxidationspotentiale ihrer sensibilisierenden angeregten Zustände, die geringer als das geschätzte Reduktionspotential von Sauerstoff in Toluol sind. Die Oxidationspotentiale von ZnOEP und ZnTPP im Triplett-Zustand betragen -1,13 V vs. SCE und -0,88 V vs. SCE. Für Proben, die Tetraphenylporphyrin (H&sub2;CPP) (siehe Beispiel 3 und Fig. 10) enthalten, wurde gemäß dem höheren Oxidationspotential von H&sub2;TPP (-0,48 V vs. SCE) im Triplett-Zustand keine ähnliche Signalreduktion beobachtet.
- Gemäß der obigen Beschreibung sollte das System, bei dem das Verfahren nach der Erfindung durchgeführt wird, vorzugsweise so eingestellt werden, daß die unter Verwendung des Systems zu messende, maximale Sauerstoffkonzentration einer φL (¹Δg) von höchstens 98% des φmax entspricht, wobei eine φL (¹Δg) von höchstens 95% des φmax oft bevorzugt und eine φL (¹Δg) von höchstens 90% des max am bevorzugsten ist. Für den Fall, daß das Sensibilisierungsmittel in einer Matrix eingebettet ist, bedeutet dies, daß die Konzentration des Sauerstoffs in der Probe (die "Umgebungs"-Konzentration, betrachtet von dem Gesichtspunkt des Sensibilisierungsmittels in der Matrix) eine solche sein sollte, die zu einer Konzentration von Sauerstoff in der Matrix führt, welche eine Lumineszenz ergibt, welche die oben beschriebenen Kriterien erfüllt. Das Sensibilisierungsmittel/Matrixsystem kann so eingestellt werden, daß diese Bedingung für einen besonderen Bereich der Umgebungssauerstoffkonzentration durch Variation einer Seite der Gleichung (5) erfüllt ist. Im folgenden werden diese zwei Möglichkeiten:
- - Modifikation der Lebenszeiten des sensibiliserenden angeregten Zustands, d. h. Einstellen von kX,
- - Einstellen oder Modifizieren von ket [O&sub2;] getrennt voneinander erläutert werden.
- Die Lebenszeiten 1/kX der sensibilisierenden angeregten Zustände können durch Zusatz eines Quenchers modifiziert werden, der den sensibilisierenden angeregten Zustand, insbesondere ohne Beeinflussung des primären Ertrages dieses Zustandes, deaktiviert. Somit kann, wie oben erwähnt, das Sensibilisierungsmittel ein Sensibilisierungsmittel mit einem angeregten Zustand, welcher molekularen Sauerstoff aus dem elektronischen Grundzustand in den angeregten Singulett-Zustand anregen kann, und einen Quencher, der den sensibilisierenden angeregten Zustand des Sensibilisierungsmittels deaktivieren kann, um die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands des Sensibilisierungsmittels zu verringern, aufweisen, wobei der Quencher in Diffusionskontakt mit dem Sensibilisierungsmittel ist. Der Quencher kann den sensibilisierenden angeregten Zustand durch einen Energietransfer- oder durch einen Elektronentransfermechanismus deaktivieren. In Gegenwart eines Quenchers (Q) wird die modifizierte Lebenszeit des sensibilisierenden angeregten Zustands (rX') bestimmt durch
- 1/rX' = (1/rX) + kQ [Q],
- wobei 1/rX = kX und kQ die Ratenkonstante für das Löschen des sensibilisierenden angeregten Zustands durch Q ist.
- Wenn der sensibilisierende angeregte Zustand der angeregte Triplett-Zustand des Sensibilisierungsmittels ist, entspricht die Löschung des Energietransfers der folgenden Reaktion:
- ³D* + Q → D+³ Q*,
- wobei D und Q einen elektronischen Zustand von geringerer Energie des Sensibilisierungsmittels bzw. des Quenchers darstellen, und ³D* und ³Q* die angeregten Triplett-Zustände des Sensibilisierungsmittels bzw. des Quenchers darstellen. Dieser Prozeß wird allgemein effektiv sein, wenn ET (D) > ET (Q) ist, wobei ET (D) und ET (Q) die Triplett-Energien des Sensibilisierungsmittels und des Quenchers sind. Die Modifikation der Triplett-Lebensdauer von ZnOEP durch den Energietransfer zu Tetraphenylbutadien (TPB) ist in Beispiel 1b dargestellt.
- Das Löschen des Elektronentransfers eines angeregten Triplett-Zustands basiert auf den folgenden Reaktionen:
- ³D* + Q → (D&spplus;Q&supmin;) → D+Q
- oder
- ³D* + Q → (D&supmin;Q&spplus;) → D+Q,
- wobei (D&spplus;Q&supmin;) und (D&supmin;Q&spplus;) die Zwillingsionenpaare sind, die durch Elektronentransfer von oder zu dem Triplett-Zustand des Sensibilisierungsmittels gebildet werden. Der Elektronentransfer wird ein spontaner Prozeß sein, wenn Eox - Ered - ET (D) < 0 ist, wobei Eox und Ered die reversiblen Einelektronen-Oxidations- und Reduktionspotentiale des Elektronendonors bzw. Elektronenakzeptors sind. Wie in den Beispielen 1c und 2b und 2c beschrieben, führt die Elektronentransferlöschung der Triplett-Zustände von ZnOEP und ZnTPP durch Durochinon (DQ) zu Sauerstoffsensitivitäten, die von der Menge des zugefügten DQ abhängen.
- Ein allgemeines Problem bei der Elektronentransferlöschung der angeregten Triplett-Zustände ist die Interferenz mit der Löschung des angeregten Singulett-Zustandes. Die Elektronentransferreaktionen, die für den angeregten Triplett-Zustand exotherm sind, werden mit dem angeregten Singulett-Zustand noch mehr exotherm, da die Ungleichung ES (D) > ET (D) allen praktischen Zwecken gehorcht, wobei ES (D) die Singulett- Energie des Sensibilisierungsmittels ist. Das Quenchen des angeregten Singulett-Zustands wird zu einem reduzierten Ertrag des Triplett-Zustandes führen und somit zu einer reduzierten 1.270 nm Lumineszenzintensität. Die Situation, bei der der Quencher allein den angeregten Singulett-Zustand deaktiviert und nicht den Triplett-Zustand, kann auch auftreten. Dieses Problem wurde bei Versuchen zur Modifikation der Triplett-Lebensdauer von H&sub2;TPP durch Verwendung von Benzochinon als Quencher (siehe Beispiel 3 und Fig. 10) berücksichtigt. Der effektivste Weg zur Minimierung der Singulett-Quenchinterferenz wird der sein, Sensibilisierungsmittel mit sehr kleinen Singulett-Lebensdauern auszuwählen, vorzugsweise unter 2 ns. Tetraphenylporphyrine (H&sub2;TPP), die mit Brom in den Phenylgruppen substituiert sind, wie beispielsweise offenbart von Quimby, D.J. und Longo, F.R., J. Am. Chem. Soc. 97, 1975, Seite 5111 und von Kim, J. B., Leonard, J. J. und Longo, F.R., J. Am. Chem. Soc. 94, 1972, Seite 3986, können diesbezüglich wertvoll sein. Sie sind effektive Sensibilisierungsmittel des Singulett-Sauerstoffs und sie besitzen Singulett-Lebenszeiten, die deutlich unter 1 ns liegen.
- Wie oben in Verbindung mit den Gleichungen (1) und (2) erwähnt wurde, ist die Sauerstoffquenchratenkonstante ket proportional zu der Diffusionskonstante des molekularen Sauerstoffs in der fraglichen Matrix, und die Konzentration des molekularen Sauerstoffs ([O&sub2;]) in der Matrix ist gleich dem Produkt der Löslichkeit des molekularen Sauerstoffs in der Matrix und dem Umgebungspartialdruck des Sauerstoffs. Die Menge ket [O&sub2;], gezeigt in der Gleichung (2), wird deshalb proportional zu der Permeabilität der Matrix für molekularen Sauerstoff sein (das Produkt der Diffusionskonstante und der Löslichkeit des molekularen Sauerstoffs). Der Einfluß der Matrix auf die Lebensdauer des sensibilisierenden Mittels, d. h. 1/kX, ist normalerweise vernachlässigbar. Somit kann die Sauerstoffsensitivität eines gegebenen Sensibilisierungsmittels durch Auswahl einer Matrix mit einer geeigneten Sauerstoffpermeabilität auf den gewünschten Bereich der Sauerstoffkonzentrationen eingestellt werden. Die Permeabilitäten der Polymere für Sauerstoff sind in der Literatur tabelliert, wobei diese Tabellen wertvolle Richtlinien für die Wahl einer geeigneten Matrix darstellen. In Beispiel 4 sind die [O&sub2;]1/2-Werte für die verschiedenen Kombinationen von Sensibilisierungsmitteln und Matrices angezeigt.
- Bei der Auswahl zwischen zwei Matrices mit gleicher Permeabilität für Sauerstoff sollte die Matrix mit der geringsten Sauerstofflöslichkeit (und somit der höchsten Diffusionskonstante) bevorzugt werden, da diese die schnellste Reaktion auf Veränderungen in den Sauerstoffkonzentrationen zeigt. Im Falle eines Wettbewerbs zwischen der Singulett-Sauerstoffherstellung und der oben diskutierten Superoxidherstellung wird die Herstellung von Singulett-Sauerstoff in einer nicht-polaren Matrix favorisiert.
- Gemäß der Erfindung wird der sensibilisierende angeregte Zustand des Sensibilisierungsmittels aus einem anderen elektronischen Zustand, der in den meisten Fällen der elektronische Grundzustand des Sensibilisierungsmittels ist, durch Absorption einer elektromagnetischen Strahlung gebildet. Vorzugsweise ist die Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung kleiner als 1.270 nm, wobei sie insbesondere in dem Bereich von 300-1000 nm liegt. Die Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung wird in vorteilhafter Weise so ausgewählt, daß sie einen Bereich einer starken Absorption durch das in Frage stehende Sensibilisierungsmittel trifft. Die Strahlungsquelle kann durch einen oder mehrere Filter somit gefiltert werden, um Licht einer unerwünschten Wellenlänge heraus zufiltern.
- Beispiele von nützlichen Filtern sind Filter, die Infrarotstrahlung entfernen, z. B. ein 2 mm KG5 Filter (von Schott Glaswerke, Deutschland), oder Filter, die eine direkte Anregung des fraglichen Quenchers minimieren, z. B. ein 2 mm GG385 Filter (von Schott).
- Die elektromagnetische Bestrahlung des Sensibilisierungsmittels kann von jeder geeigneten Bestrahlungsquelle durchgeführt werden. Das von der elektromagnetischen Bestrahlungsquelle abstammende Licht kann kohärent oder inkohärent und es kann kontinuierlich, moduliert oder gepulst sein. Eine gepulste Anregungsquelle kann wertvoll sein, da sie die Zeitabhängigkeit der aufzuzeichnenden 1.270 nm Lumineszenzintensität erlaubt. Eine kinetische Analyse der Zeitabhängigkeit kann eine separate Information über die Herstellungs- und Verringerungsprozesse des Singulett-Sauerstoffs sein. Potentiell interferrierende Substanzen (d. h. Substanzen, die kein Sauerstoff sind und die das 1.270 nm Lumineszenzsignal beeinflussen) können als Quencher des sensibilisierenden angeregten Zustands (d. h. Abfall der Ausbeute, aber Anstieg der apparenten Rate der Singulett-Sauerstoffherstellung) oder des Singulett-Sauerstoffs (d. h. Anstieg der Rate des Singulett-Sauerstoffabfalls) sein, wobei diese Mechanismen durch eine kinetische Analyse der zeitlich aufgelösten 1.270 nm Lumineszenz unterschieden werden können. In IUPAC Commission of Photo Chemistry "Glossary of terms used in photochemistry", Teil 1, 2 und 3, EPA Newsletter, November 1985, März 1986 bzw. Juli 1986 werden verschiedene Lichtquellen, die für das vorliegende Verfahren nützlich sind, erwähnt. Unter diesen sind Laserdioden, Gaslaser, wie Argon-Ion, Cadmium-Neon, CO&sub2;, Helium-Neon, und ein Stickstofflaser oder Feststofflaser, wie ein Niodymium (YAG oder Glas), oder ein Rubinlaser und Farbstofflaser. Auch konventionelle lichtemittierende Dioden, Blitzlicht- oder Entladungslampen und Hochdruckquecksilberlampen, mittlere Druckquecksilberlampen, geringe Druckquecksilberlampen und Antimon-Xenon-, Quecksilber-Xenon-, Quarz-Iod-, Wolfram-Halogen-, Resonanz- und Xenon-Lampen sind nützlich. Diese Liste sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden, da jede Quelle einer elektromagnetischen Strahlung mit einem geeigneten Wellenlängenband verwendet werden kann.
- Die 1.270 nm Lumineszenz wird mit einem Detektor, der eine ausreichende Sensitivität um 1.270 nm hat, gemessen. Die Lumineszenz wird in vorteilhafter Weise durch einen oder mehrere Filter gefiltert, die verwendet werden, um Licht von nicht-relevanter Wellenlänge herauszufiltern, um so sicherzustellen, daß nur Licht mit gewünschter Wellenlänge (um 1.270 nm) den Detektor erreicht. Der Filter ist vorzugsweise ein Interferenzfilter, z. B. ein BP-1270-080-B Filter, hergestellt von Spectrogon, New Jersey, USA. Der Detektor kann eine Fotovervielfacherröhre (PMT) oder ein Festkörperdetektor sein, wie eine Diode aus Indium-Galliumarsenid (InGaAs), Bleisulfid (PbS) oder Germanium (Ge). Vorzugsweise ist der Detektor ein InGaAs-Detektor, z. B. des Typs FID 13 S 13 WX, erhältlich von Fujitsu Microelectronics, Inc., Kalifornien.
- Bevorzugte Sensibilisierungsmittel zur Verwendung nach der Erfindung sind Verbindungen mit i) hoher Stabilität gegenüber einem Lichtabbau (einschließlich Fotooxidation) und ii) großen optischen Extinktionskoeffizienten. Eine fotochemische Stabilität ist wünschenswert, um ein Singulett- Sauerstoffmeßsystem herzustellen, das ein langlebiges Funktionieren bei kontinuierlicher Bestrahlung sicherstellt. Ein großer optischer Extinktionskoeffizient ist wünschenswert, um eine große optische Dichte mit einer kurzen optischen Weglänge zu erzielen, d. h. eine dünne Schicht der Matrix, die ihrerseits ein Meßsystem liefert, das auf einen Wechsel in den Sauerstoffkonzentrationen schnell reagiert. Ein geringerer optischer Extinktionskoeffizient des Sensibilisierungsmittels kann natürlich durch Anwendung einer höheren Sensibilisierungsmittelkonzentration kompensiert werden. Für die meisten praktischen Zwecke, insbesondere in Verbindung mit Polymermatrices, wird jedoch eine Sensibilisierungsmittelkonzentration verwendet, die an die maximale Menge, die in der Matrix lösbar ist, heranreicht.
- Nützliche Klassen von Sensibilisierungsmitteln sind im allgemeinen Porphyrin und Porphyrin-verwandte Verbindungen, wie Metall-freies Porphyrin, Metall-Porphyrine, Phtalocyanine, Metall-Phtalocyanine und deren Derivate. Beispiele für nützliche Porphyrine sind Octaalkylporphyrine, Tetraphenylporphyrine, Tetrabenzoporphyrine und deren substituierten Derivate. Insbesondere sind fluorierte (teilweise oder ganz) Derivate nützlich, da sie gegenüber einer Fotooxidation stabil sind. Ferner wurde herausgefunden, daß der Zn (II)-Komplex von Tetrabenzoporphyrin (H&sub2;-TBP) bei der Wellenlänge eines He-Ne-Lasers einen Extintionskoeffizienten nahe bei 10&sup5; M&supmin;¹ cm&supmin;¹ besitzt. Diese Verbindung (ZnTBP), aber auch andere Metallkomplexe von H&sub2;TBP sowie Fluor-, Chlor-, Brom-, Alkyl- und Aryl-, wie Phenyl-substituierte Derivate müssen somit als sehr geeignete Kandidaten zur Verwendung als Sensibilisierungsmittel für Singulett-Sauerstoff angesehen werden. Ferner besitzen Tetrabenzoporphyrine, die mit tertiären Butyl-Gruppen substituiert sind, und Meso-(tetraaryl)-Tetrabenzoporphyrine, die einfach zu synthetisieren sind, günstige Löslichkeitseigenschaften. Diese Porphyrine und insbesondere ihre Metallkomplexe können somit als Sensibilisierungsmittel für Singulett-Sauerstoff verwendet werden.
- Wenn die 1.270 nm Lumineszenzintensität verwendet wird, um die Konzentration des Sauerstoffs zu quantifizieren, wird das gemessene Signal (d. h. die Intensität) direkt proportional zu der absorbierten Intensität der Anregungslichtquelle sein. Deshalb ist es wünschenswert, das gemessene Signal für die Variationen in der Intensität der Anregungslichtquelle oder in der Effizienz der Lichtabsorption durch das Sensibilisierungsmittelsystem, z. B. in Verbindung mit einem Bleichen des Sensibilisierungsmittels, zu korrigieren. Dies kann durch Verwendung eines Sensibilisierungsmittels erreicht werden, das die folgenden Kriterien erfüllt:
- (1) Es weist Fluoreszenz auf.
- (2) Die Fluoreszenz ist deutlich von 1.270 nm getrennt.
- (3) Die Fluoreszenz hat eine Lebensdauer, die ausreichend kurz ist, um die Fluoreszenzquantenausbeute unabhängig vom Sauerstoff zu manchen.
- Bei einem Sensibilisierungsmittel mit den oben angegebenen Eigenschaften kann die Fluoreszenzintensität des Sensibilisierungsmittels, die gleichzeitig mit der Messung der 1.270 nm Lumineszenz erfolgt, ein Signal geben, mit dem das 1.270 nm Lumineszenzsignal korrigiert werden kann.
- Metall-Porphyrine haben typischerweise Fluoreszenzlebenszeiten, die < 3 ns sind. Demgemäß werden die Fluoreszenzquantenausbeuten dieser Verbindungen im wesentlichen auch in flüssigen Matrices unabhängig von Sauerstoff sein. Die Substitution von Br in den Phenylgruppen von H&sub2;TPP reduziert in bemerkenswerter Weise die Fluoreszenzlebensdauer, so daß diese Verbindungen auch unter diesem Aspekt nützlich sind. Die freien Basenporphyrine (z. B. H&sub2;OEP, H&sub2;TPP und H&sub2;TFPP) haben typische Fluoreszenzlebenszeiten von 10-15 ns. In flüssigen Matrices werden diese Verbindungen sauerstoffabhängige Fluoreszenzquantenausbeuten aufweisen. Jedoch wird die Verwendung von Matrices mit niedrigen Sauerstoffpermeabilitäten (z. B. Polymere) die Fluoreszenzlöschung durch Sauerstoff reduzieren. Somit sollte die Intensitätskorrektur durch die Fluoreszenz des Sensibilisierungsmittels mit allen fluoreszierenden Porphyrinen möglich sein, wenn Matrices mit einer geringen Sauerstoffpermeabilität verwendet werden.
- Unter den Porphyrin-verwandten Verbindungen ist eine neue Klasse von synthetischen Verbindungen, die strukturelle Isomere von Porphyrinen sind, d. h. Porphycene, nützlich. Diese Klasse ist beschrieben von E. Vogly et al., (Angew. Chem. 98, 1936, S. 262), wobei diese Verbindungen gegenüber eine Fotooxidation sehr stabil sind.
- Andere Metall-Porphyrine und Metall-Phtalocyanine als das oben erwähnte ZnTBP sind Komplexe von Metallen, die aus Zn (II), Fd (II), Pt (II), Ru (II) und Os (II) ausgewählt sind.
- Andere potentiell nützliche Sensibilisierungsmittel sind Tris-α-Diiminkomplexe von Übergangsmetallen, wie Ru (II), Os (II), Ir (III) und Rh (III), gemäß der Beschreibung von z. B. Bacon und Demas in der UK-Patentanmeldung Nr. 2 132 348 A.
- Eine Reihe von Farbstoffen, wie Rosenbengal, Erythrosin, Eosin, Fluorescein und Methylenblau, sind auch nützlich.
- Polycyklische aromatische Verbindungen, wie Pyren, Naphthalen, Anthracen oder Decacyclen oder deren Derivate sind potentielle Sensibilisierungsmittel.
- Wie oben erwähnt, kann die Reduktion der Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands des Sensibilisierungsmittels durch verschiedene Mechanismen stattfinden. Die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands des Sensibilisierungsmittels kann durch intermolekulares Quenchen, wie durch einen Energietransferprozeß, reduziert werden, der vorzugsweise ein exothermer Prozeß ist. Ein Beispiel für einen Quencher, der den sensibilisierenden angeregten Zustand des Sensibilisierungsmittels durch diesen Typ des Prozesses deaktiviert, ist ein substituiertes Polyen, z. B. Tetraphenylbutadien.
- Das intermolekulare Quenchen kann auch einen Elektronentransferprozeß beinhalten, der vorzugsweise ein exothermer Elektronentransferprozeß ist. Elektronenakzeptoren, die den sensibilisierenden angeregten Zustand des Sensibilisierungsmittels oxidieren können, sind Chinone, wie Benzochinon oder Durochinon oder substituierte Chinone, vorzugsweise Halogensubstituierte Chinone. Das intermolekulare Quenchen durch einen Elektronentransferprozeß kann jedoch auch stattfinden, wenn der Quencher ein Elektronendonor ist, welcher den sensibilisierenden angeregten Zustand des Sensibilisierungsmittels reduzieren kann.
- Aus der obigen Diskussion ist zu verstehen, daß der Diffusionskontakt zwischen dem Sensibilisierungsmittel und der Probe durch einfaches Zusetzen des Sensibilisierungsmittels zu der den molekularen Sauerstoff enthaltenen Probe und Lösen des Sensibilisierungsmittels in der Probe hergestellt werden kann, oder der Diffusionskontakt wird durch Kontaktieren der Probe mit einer Matrix, in der das Sensibilisierungsmittel eingebettet ist, hergestellt. Falls gewünscht, kann eine sauerstoffpermeable Membran zwischen die Probe und der das Sensibilisierungsmittel enthaltenen Matrix eingesetzt werden. Insbesondere in Verbindung mit Messungen von Proben biologischen Ursprungs kann eine Membrantrennung nützlich sein, um eine mögliche Wechselwirkung mit Verbindungen, die kein Sauerstoff sind, zu vermeiden, wobei eine Membrantrennung auch nützlich ist, um eine langwierige kontinuierliche Erfassung der Sauerstoffkonzentration einer strömenden Probe, z. B. in vivo Erfassung der Blutsauerstoffkonzentration, zu erzielen.
- Wenn das Sensiblisierungsmittel per se über physikalische/chemische Eigenschaften verfügt, die seine Verwendung ohne Einbettung in einer Matrix und ohne Lösen in der Probe erlauben, liegt dies selbstverständlich auch innerhalb des Umfanges der Erfindung.
- Wie oben erläutert, sollte vorzugsweise die Gegenwart von OH-Gruppen in der Matrix, in der das Sensibilisierungsmittel eingebettet ist, vermieden werden, da diese OH-Gruppen sehr effektiv die Lebensdauer des Singulett-Sauerstoffs herabsetzen. Wenn die Lebensdauer des Singulett-Sauerstoffs bezüglich der Messungen kritisch ist, wie oben erläutert, können nützliche Matrices ausgewählt werden, wobei als Richtlinie die Lebensdauer des Singulett-Sauerstoffs in der fraglichen Matrix verwendet werden kann.
- Die Matrix umfaßt vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel oder ein Polymer. Beispiele für potentiell geeignete organische Lösungsmittel sind aromatische Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Xylol und ähnliche Verbindungen. Andere Beispiele von potentiell nützlichen Lösungsmitteln sind Aceton, Acetonitril und halogenierte Lösungsmittel, wie halogenierte aromatische Lösungsmittel, z. B. Chlorbenzol, Brombenzol, Hexafluorbenzol, und Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Chlor-Fluorkohlenstoffe, z. B. CF11, CF113, und Tetrachlorethylen.
- Beispiele von potentiell nützlichen Polymeren sind Polyvinylchlorid (PVC) und plastiziertes PVC, Polycarbonat-Silikon-Copolymere, Silikongummis, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polytetrafluorethylen (PTFE), Zelluloseacetat, Polystyrol und Polyurethan.
- Die oben angegebenen Beispiele für nützliche Matrixkomponenten sind nur als Richtlinie anzusehen und stellen keine erschöpfende Liste dar.
- Die Sauerstoff enthaltenden Proben, die zu analysieren sind, sind vorzugsweise flüssige Proben biologischen Ursprungs, wie Blut, wobei die Konzentration des molekularen Sauerstoffs eine physiologische Höhe hat, die Sauerstoffpartialdrücken in dem Bereich von Null oder gerade über Null, d. h. einige wenige mmHg, bis einige Hundert mmHg, d. h. etwa 800 mmHg, insbesondere bis zu 400 mmHg, vorzugsweise bis zu 150 mmHg, am bevorzugsten bis zu 120 mmHg, entspricht. Somit werden Sensibilisierungsmittel/ Matrixkombinationen bevorzugt, die eine Bestimmung von Sauerstoffpartikaldrücken erlauben, die innerhalb des gesamten physiologischen Bereiches variieren. Die bevorzugten Sensibilisierungsmittel/ Matrixkombinationen zum Bestimmen von physiologischen Sauerstoffpartikaldrücken sind solche Kombinationen, die [O&sub2;]1/2-Werte von 10 bis 200 mmHg, vorzugsweise von 20 bis 150 mmHg und insbesondere von 30 bis 120 mmHg aufweisen.
- Die Probe, die Sauerstoff aufweist, kann auch ein Sauerstoff enthaltendes Gas biologischen Ursprungs sein. Dies wird auftreten, wenn das Verfahren nach der Erfindung auf eine transcutane Bestimmung von Sauerstoff oder auf eine Bestimmung von Respirationsgasen angewendet wird.
- Ein geeignetes System zum Bestimmen der Konzentration von molekularem Sauerstoff in einer Probe mit den Verfahren nach der Erfindung kann Mittel zum Anregen von Sauerstoffmolekülen der Probe von dem elektronischen Grundzustand in den angeregten ¹Δg-Zustand (angeregter Singulett-Zustand), Mittel zum Messen einer 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft der angeregten Sauerstoffmoleküle und Mittel zur Korrelation der 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft mit der Konzentration des molekularen Sauerstoffs in der Probe aufweisen. Die Mittel zur Anregung von Sauerstoffmolekülen der Probe von dem elektronischen Grundzustand in den angeregten ¹Δg-Zustand (angeregter Singulett-Zustand), weisen vorzugsweise eine elektromagnetische Bestrahlungsquelle auf, vorzugsweise eine, bei der die elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge von weniger als 1.270 nm hat, vorzugsweise sie in dem Bereich von 300-1000 nm liegt, sowie ein Sensibilisierungsmittel, das wahlweise in einer Matrix eingebettet ist, wobei das Sensibilisierungsmittel in Diffusionskontakt mit der Probe ist.
- Das Mittel zur Messung einer 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft der angeregten Sauerstoffmoleküle weist vorzugsweise einen Detektor auf, der wahlweise von einem Filter abgedeckt ist und der die Lumineszenzeigenschaft bei einer Wellenlänge von etwa 1.270 nm messen kann, wobei der Detektor wahlweise an einen Verstärkerschaltkreis angeschlossen ist.
- Die Mittel zum Korrelieren der 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft mit der Konzentration des molekularen Sauerstoffs in der Probe können jedes geeignete Signal- und Datenverarbeitungs- und Vergleichsmittel sein, wie jede Kombination von elektronischen Konvertern oder Verstärkern und Computer- oder Mikroprozessormittel, einschließlich Datenspeichermittel, um die Standardlumineszenz/Sauerstoffwerte, mit denen die Korrelation durchgeführt wird, zu speichern. Die Mittel zum Korrelieren der 1.270 nm Lumineszenzeigenschaft mit der Konzentration des molekularen Sauerstoffs in der Probe können auch einfach eine Standardkurve umfassen.
- Eine geeignete Vorrichtung zum Messen der Konzentration des molekularen Sauerstoffs in einer Probe ist eine Vorrichtung, die eine Matrix, in der ein Sensibilisierungsmittel eingebettet ist, wobei die Matrix so angeordnet ist, daß sie dem Sensibilisierungsmittel erlaubt, eine Anregungsstrahlung von einer externen elektromagnetischen Bestrahlungsquelle zu empfangen, um so einen sensibilisierenden elektronischen Zustand des Sensibilisierungsmittels zu bilden; eine Region, worin die Probe bei einem Test in Diffusionskontakt mit dem Sensibilisierungsmittel ist, um so die Anregung der Sauerstoffmoleküle der Probe auf den angeregten Singulett-Zustand durch das Sensibilisierungsmittel in seinem sensibilisierenden elektronischen Zustand zu erlauben; einen Übertragungsweg umfaßt, um die Strahlung von dem angeregten Singulett- Zustand der Sauerstoffmoleküle auf die 1.270 nm Lumineszenzmeßmittel zu übertragen. Vorzugsweise ist die Matrix, in der das Sensibilisierungsmittel eingebettet ist, auf einem Träger angeordnet, z. B. ein Glasabdeckstreifen.
- Die Region, in der die Probe in Diffusionskontakt mit dem Sensibilisierungsmittel steht, kann ein Oberflächenteil der Vorrichtung nach der Erfindung sein oder kann eine die Probe aufnehmende Kammer darstellen, die in oder an der Vorrichtung nach der Erfindung angeordnet ist.
- Die eine Probe aufnehmende Kammer kann beispielsweise eine Küvette sein, die mit Probeneinlaßmittel und Probenauslaßmittel versehen ist, wie sie normalerweise bei automatischen Analysiervorrichtungen verwendet werden. Andere Konfigurationen der eine Probe auf nehmenden Kammer können auch geeignet sein, z. B. kann die eine Probe aufnehmende Kammer eine absorbierende fibröse oder poröse Struktur besitzen, die benachbart zu der Matrix oder einem strukturellen Teil, das im gleichen Ausmaß von einer Körperoberfläche definiert ist, angeordnet ist. Die letztere Konfiguration ist für Vorrichtungen gedacht, die an nicht-invasiven, transcutanösen Sauerstoffmessungen angepaßt ist.
- Insbesondere in Verbindung mit invasiven in vivo Sauerstoffmessungen könnte die Region, in der die Probe bei einem Test in Diffusionskontakt mit dem Sensibilisierungsmittel ist, ein Oberflächenteil der Vorrichtung sein.
- Die Erfindung wird nun weiter unter Bezug auf die Zeichnungen erläutert.
- Fig. 1 ist eine gesamtgrafische und perspektivische Ansicht einer Testanordnung oder Aufbauausführungsform eines Systems nach der Erfindung.
- Fig. 2a ist eine perspektivische Ansicht einer ersten Ausführungsform einer Testzelle, die eine Komponente des Systems nach Figur 1 aufweist.
- Fig. 2b ist eine perspektivische Ansicht einer alternativen oder zweiten Ausführungsform einer Testzelle.
- Fig. 3 ist eine detaillierte, perspektivische Ansicht einer Meßeinheit, die eine Zelle nach Fig. 2a und ferner ein Element des Systems nach Fig. 1 enthält.
- Fig. 4 ist eine detaillierte, perspektivische und teilweise explodierte Ansicht der Meßeinheit nach Fig. 3.
- Fig. 5 ist eine grafische Darstellung, die spezifische elektronische Zustände eines Sensibilisierungsmittels und von molekularem Sauerstoff zeigt.
- Fig. 6 ist eine grafische Ansicht eines Emissionsspektrums des Singulett-Sauerstoffs.
- Fig. 7 ist eine grafische Darstellung des Verlaufs der Funktion.
- wie oben beschrieben.
- Die Fig. 8, 9 und 10 sind grafische Ansichten der erzielten Ergebnisse gemäß den Beispielen 1-3, die unten beschrieben werden.
- In Fig. 1 ist eine Testbankausführungsform eines Systems nach der Erfindung gezeigt, die mit dem Bezugszeichen 20 bezeichnet ist. Das System 20 gemäß Fig. 1 ist in den Beispielen 1-3, die unten beschrieben werden, verwendet worden. Ein essentielles Teil des Systems 20 ist ein Shimadzu Spektrofluorofotometer RF 540 (erhältlich von Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). Das Shimadzu RF 540 weist ein Anregungsteil, ein Emissionsteil und ein Probenteil auf. In der Fig. 1 sind die Komponenten 1-5 gewöhnliche Komponenten des Anregungsteils des Shimadzu RF 540 und die Komponenten 10-13 sind normale Komponenten des Emissionsteils von Shimadzu RF 540. Die Komponenten 6-9 und 14-19 sind für den Zweck der Erfindung vorgesehen, wobei die Komponenten 6-9 und 15-16, 19 in dem Probenkompartmentteil des Shimadzu RF 540 angeordnet sind. Das System 20 wird nun im Detail beschrieben.
- Eine Anregungsquelle 1, die einen 150 W Xenonbogen aufweist, emittiert Licht, das durch einen ellipsoiden Spiegel der Anregungsquelle 1 expandiert wird. Das Licht wird durch einen konkaven Spiegel 2 und weiter durch einen Schlitz 3a einer ersten Schlitzanordnung 3 und durch ein konkaves Diffraktionsgitter 4 und von dort zurück durch einen Schlitz 3b der ersten Schlitzanordnung 3 geleitet. Die erste Schlitzanordnung 3 und das Diffraktionsgitter 4 bilden zusammen einen Monochromator eines seitenebenen Typs. Von dem Monochromator wird das Licht durch ein Paar von Licht-sammelnden Linsen 5 geleitet. Das Sammellicht passiert dann ein Paar von Filtern 6, wobei der erste Filter ein 2 mm KG5 (Schott) Filter ist, das die Infrarotstrahlung aus dem Licht filtert, und wobei der zweite Filter ein 2 mm GG 385 (Schott) Filter ist, der die ultraviolette Strahlung herausfiltert. Von den Filtern tritt das Licht durch eine Zerhackerscheibe 7, an der benachbart zwei geschlitzte, optische Schalter OPB 804 (von TRW Corporation, Texas, USA) angeordnet sind, die an zwei Eingänge eines Verstärkerschaltkreises 17 angeschlossen sind. Die Zerhackerscheibe 7 wird durch einen Elektromotor 19 gedreht. Der Verstärkerschaltkreis 17 empfängt elektrische Signale von den geschlitzten Schaltern 8, wobei diese Signale die Gegenwart oder die Abwesenheit der Zerhackerscheibe 7 in den Schlitzen der geschlitzten Schalter 8 repräsentieren. Aufgrund der Anordnung der geschlitzten Schalter 8 relativ zu der Zerhackerscheibe 7 und dem Lichtstrahl repräsentieren diese Signale auch einen Lichtdurchtritt/Nicht-Durchtritt durch die Zerhackerscheibe 7. Eine SUPRASIL Fluoreszenzzelle (HELLMA) 9, welche die Sauerstoff enthaltende Probe aufweist, wird von dem Licht, das durch die Zerhackerscheibe 7 tritt, bestrahlt. Für Steuerzwecke tritt das Licht, das von der in der Fluoreszenzzelle 9 vorliegenden Probe emittiert wird, durch eine Lichtsammellinse 10 des gleichen Typs wie die Linse 5. Das Licht tritt dann durch einen Schlitz 11a einer zweiten Schlitzanordnung 11, fällt auf ein konkaves Diffraktionsgitter 12 und von dort durch einen Schlitz 11b der zweiten Schlitzanordnung 11 auf einen konkaven Spiegel 13. Das Signal wird von einem rotsensitiven Fotoverstärker 14 des Typs R 928 von Hamamatsu Photonics, K.K., Japan gesammelt. Die Komponenten 10-14 des Systems 20 bilden ein Lichtemissionssteuersystem, das dem Zweck der Messung der Lumineszenz dient, die von dem Sensibilisierungsmittel erzeugt wird, wobei die Lumineszenz zur Steuerung der Aktivität des Sensibilisierungsmittels benutzt wird. Um die 1.270 nm Lumineszenz der Probe zu messen, tritt die Lumineszenz der Probe, die in der Fluoreszenzzelle 9 enthalten ist, durch ein Interferenzfilter 15 des Typs BP-1270-080-B, hergestellt von Spectrogon, das eine maximale Transmission (72%) bei 1.265 nm und eine volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) von 80 nm hat. Die sich ergebende Lumineszenz wird von einer InGaAs-Diode 16 erfaßt, die eine Fujitsu 13S13WX Diode ist und einen Aluminiumbehälter enthält. Das Diodensignal wird zu einem dritten Eingang des Verstärkerschaltkreises 17 übertragen, der einen synchronisierten Verstärker (10 mV/pA) aufweist, der die Meßsignale, die von der InGaAs-Diode 16 empfangen werden, mit den von den geschlitzten Schaltern 8 empfangenen, elektrischen Signalen korreliert, um ein Lumineszenzsignal zu erhalten, welches die Differenz zwischen den Lumineszenzsignalen der bestrahlten Probe und der nicht-bestrahlten Probe darstellt. Das Signal wird auf ein Aufzeichnungsgerät 18 des Typs Radiometer REC 80 übertragen.
- Die Fig. 2a zeigt im größeren Detail die in der Fig. 1 gezeigte SUPRASIL Fluoreszenzzelle 9, welche die zu messende, Sauerstoff enthaltende Probe aufweist. Die Fluoreszenzzelle 9 ist eine Modifikation einer Hellma Standardfluoreszenzzelle des Typs 101 QS* (5 · 5 mm), wobei die Standardzelle einen Grundabschnitt 29 der Fluoreszenzzelle 9 darstellt. Für den Zweck der Erfindung weist der Grundabschnitt 29 Einlaß- und Auslaßröhren 25 bzw. 26 auf. Eine Lösung des Sensibilisierungsmittels in einer geeigneten Matrix, die wahlweise einen Quencher aufweisen kann, wird durch die Einlaßröhre 25 dem Inneren der Zelle 9 in einer ausreichenden Menge zugeführt, um sicherzustellen, daß die Lösung den Grundabschnitt 29 und wenigstens einen Teil der Auslaßröhre 26 füllt. Die Einlaß- und Auslaßröhren 25 und 26 werden mit Glasstopfen 27 und 28 verschlossen. Das Gas, welches den zu messenden molekularen Sauerstoff enthält, wird durch die das Sensibilisierungsmittel enthaltende Lösung über die Einlaßröhre 29 eingeblasen, wobei der Glasstopfen 28 entfernt ist, um einen Druckaufbau in der Zelle 9 zu vermeiden. Nachdem die das Sensibilisierungsmittel enthaltende Lösung mit dem Gas gesättigt worden ist, wird der Glasstopfen 28 auf der Ausgangsröhre 26 angeordnet und nachfolgend wird der Glasstopfen 27 auf der Einlaßröhre 25 angeordnet, wobei anschließend die Zelle, welche die Probe enthält, der Bestrahlung unterworfen wird.
- Die Fig. 2b zeigt eine alternative Testzelle, die in einer Testanordnung gemäß der Testanordnung nach Fig. 1 verwendet werden kann. Die Testzelle ist in einem festen Probenhalter 204-26836-01, hergestellt von Shimadzu, Corp., Kyoto, Japan, angeordnet. Ein kreisförmiger, zylindrischer Körper 30 weist innere Bohrungen 31 und 32 auf, wobei die inneren Bohrungen mit einer Einlaßröhre 33 bzw. mit einer Auslaßröhre 34 verbunden sind. Der kreisförmige, zylindrische Körper 30 ist mit einem vorspringenden Ring 36 versehen, der ein Außengewinde und einen O-Ring 37 aufweist. Ein Befestigungsring 38 hat ein Innengewinde 39, das auf das Außengewinde des Ringes 36 paßt. Eine Sonde 35, die eine HF-geätzte, 19 mm Durchmesser Mikroskopglasscheibe ist (von Chance Propper Ltd., Wesley, England), wobei eine Mischung einer Matrixkomponente und eines Sensibilisierungsmittels auf eine ihrer Oberflächen gegossen ist, ist zwischen dem kreisförmigen, zylindrischen Körper 30 und dem Befestigungsring 38 angeordnet und unterliegt einer Bestrahlung durch eine Bohrung 41 des Befestigungsringes 38. Die zu untersuchende, Sauerstoff enthaltende Probe wird durch die Einlaßröhre 33 und weiter durch die innere Bohrung 31 eingeführt, um einen Raum, der durch eine Blindbohrung 40 des kreisförmigen, zylindrischen Körpers 30 und der Sonde 35 definiert ist, einzunehmen, wodurch sich ein Diffusionskontakt zwischen der Probe und der Sonde 35 ergibt. Ein Gleichgewicht zwischen dem Sauerstoffgehalt der Sauerstoff enthaltenden Probe und dem Sauerstoffgehalt der Matrix wird aufgestellt. Die Probe wird durch die innere Bohrung 32 und die Auslaßröhre 34 aus der Testzelle herausgeführt. Die Strömung der Sauerstoff enthaltenden Probe, welche die Sonde 35 passiert, kann kontinuierlich oder diskontinuierlich sein.
- Die Fig. 3 zeigt die Meßeinheit der schematischen Darstellung der Testausführungsform nach Fig. 1. Die Fluoreszenzzelle 9 ist in einer Ausnehmung 59 eines schwarzen Blockes 50, der aus DEL-RIN besteht, aufgenommen. Die in der Fluoreszenzzelle 9 vorliegende Probe wird durch einen Kanal 51 des Blockes 50 bestrahlt, wobei der Kanal 51 durch die oben beschriebene Zerhackerscheibe 7 abgedeckt ist. In der Fig. 3 sind die oben beschriebenen Komponenten 8, 15, 16, 19 auch dargestellt. Das von der Diode 16 aufgenommene Signal wird durch ein Mehraderkabel 60 zu dem Verstärkerschaltkreis 17 (nicht gezeigt) geführt.
- Die Fig. 4 zeigt die ebenfalls in den Fig. 1 und 3 dargestellte Meßeinheit. Die 1.270 nm sensitive Diode 16 ist in der Fig. 4 in Explosionsansicht dargestellt, so daß ein Diodenteil 16a und ein Behälterteil 16b dargestellt sind. Die Fluoreszenzzelle 9 wurde herausgezogen. Die Lumineszenz des Sensibilisierungsmittels in der Probe wird durch eine Öffnung 70 in dem schwarzen Block 50 emittiert. In der Fig. 4 sind die oben beschriebenen Komponenten 7, 8, 15, 16, 19, 60 auch gezeigt.
- Fig. 5 zeigt die Beziehung zwischen den relevanten elektronischen Zuständen eines Sensibilisierungsmittels und eines Sauerstoffmoleküls bezüglich dem Energieinhalt jeder dieser Zustände. S&sub0;, S&sub1; und S&sub2; bezeichnen den Grundzustand, den ersten angeregten Singulett-Zustand bzw. den zweiten angeregten Singulett-Zustand des Sensibilisierungsmittels. Dementsprechend bezeichnen T&sub1; und T&sub2; den ersten angeregten Triplett-Zustand bzw. den zweiten angeregten Triplett-Zustand des Sensibilisierungsmittels. Strahlende Übergänge zwischen den einzelnen elektronischen Zuständen sind durch gerade Pfeile und nicht-strahlende Übergänge sind durch Wellenpfeile angezeigt. Der elektronische Grundzustand und der angeregte Singulett-Zustand des Sauerstoffmoleküls sind mit ³Σg&supmin; und ¹Δg bezeichnet.
- Der obere Teil der Fig. 6 zeigt ein typisches 1.270 nm Emissionsspektrums, das von einer bestrahlten Sensibilisierungsmittel enthaltenden Matrix in Gegenwart von Sauerstoff erzielt wird. Die Wellenlängen, bei denen die Emission gemessen wird, sind in nm auf der X-Achse dargestellt. Die Emissionsintensität der Probe ist auf der Y-Achse angezeigt. Der untere Teil der Fig. 6 zeigt das Spektrum, das von der Matrix in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugt wird.
- Die Erfindung wird nun weiter anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
- Alle Chemikalien, soweit nicht anders vermerkt, wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet.
- Tetraphenylporphyrin (H&sub2;TPP); Zink-Tetraphenylporphyrin (ZnTPP), Octaethylporphyrin (H&sub2;OEP) und Zink-Octaethylporphyrin (ZnOEP) wurden von Porphyrin Products, Utah, USA, erhalten.
- Durochinon und Benzochinon von Fluka wurden vor Verwendung durch Sublimation und Rekristallisierung gereinigt. Tetraphenylbutadien (TPB) besaß Szintillationsreinheit.
- Toluol (Uvasol) stammte von Merck, PVC des Typs BREON S110/10 von BP-Kemi, Polycarbonatsilikon des Typs L.R.TM3320 von General Electrics, Polyurethan des Typs Desmopan von Bayer und Zelluloseacetat mit geringer Viskosität und mit mittlerer Viskosität stammte von Serva. Tetrahydrofuran (TEF) (p.a.) wurde von Merck bezogen, wobei Stabilisatoren und andere Verunreinigungen durch Passage des Tetrahydrofurans durch eine mit basischem Aluminiumoxid gepackte Säule entfernt wurden.
- Der zu messende Sauerstoff lag in der Form von O&sub2;/Ar-Gasmischungen vor (von Strandmollen Industrigas A/S, Dänemark). Die tatsächliche Konzentration des Sauerstoffs wurde anhand der Löslichkeit von O&sub2; bei 1 atm bestimmt.
- Der Ausdruck "belüftete Probe" bedeutet eine Probe, die mit Umgebungsatmosphärenluft gesättigt ist.
- Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Lösungen wurden bei gedämpftem Licht hergestellt und gehandhabt und sie wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert.
- In den Beispielen 1, 2 und 3 lagen die zu untersuchenden Proben in der 5 · 5 mm SUPRASIL Fluoreszenzzelle (Hellma) vor, die in der Fig. 2a gezeigt ist.
- Die Prinzipien der Probenanregung und die Erfassung der sich ergebenden Lumineszenz sind in der Fig. 1 dargestellt.
- Verwendung von Zink-Octaethylporphyrin (ZnOEP) als Sensibilisierungsmittel für die Bildung von Singulett-Sauerstoff.
- Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Verwendbarkeit von ZnOEP als Sensibilisierungsmittel für die Bildung von Singulett-Sauerstoff zu zeigen und um die Möglichkeit der Modifikation der Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands von ZnOEP durch geeignete Quencher zu demonstrieren, um eine Lebensdauer zu erzielen, die in einem Bereich liegt, der eine geeignete Größenvariation gegenüber dem zu messenden Sauerstoffkonzentrationsbereich gewährleistet.
- ZnOEP wurde in Toluol gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von 2,3 · 10&supmin;&sup4; M ZnOEP zu erzielen. Die Lösung wurde in der SUPRASIL-Fluoreszenzzelle nach Fig. 2a angeordnet, und O&sub2;/Ar Gasmischungen mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen wurden durch die Zelle, wie dies in Verbindung mit der Fig. 2a beschrieben wurde, geblasen. Auf diese Weise wurde die ZnOEP-Lösung mit dem Gas gesättigt. Die Anregung und die Messung der 1.270 nm Lumineszenz wurde gemaß der Darstellung in Fig. 1 durchgeführt. Die Sauerstoffkonzentration der verwendeten O&sub2;/Ar Gasmischungen waren 0%, 1%, 10%, 20,9% (die inhärente O&sub2;-Konzentration der atmosphärischen Luft) bzw. 100%. Die 1.270 nm Lumineszenzsignale (in pA) entsprechend den verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen, die in den Experimenten erzielt wurden, sind in der oberen Kurve von Fig. 8 dargestellt. Aus dieser Kurve ist zu ersehen, daß das 1.270 nm Lumineszenzsignal bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 1% O&sub2; gesättigt ist, was eine sehr hohe Sauerstoffsensitivität anzeigt. Es ist auch zu erkennen, daß das 1.270 nm Lumineszenzsignal, welches von der belüfteten Probe (20,9% O&sub2;) abstammt, niedriger ist als die Erwartung gemäß der Größe der anderen Signale. Wie oben diskutiert, liegt diesem Phänomen wahrscheinlich eine Superoxid-Herstellung zugrunde.
- Um die Sauerstoffsensitivität der ZnOEP-Lösung zu erhöhen und so diese Lösung für die Bestimmung von höheren Sauerstoffkonzentrationen nützlich zu machen, wurde die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands von ZnOEP durch den Zusatz von Tetraphenylbutadien reduziert. Die 2,3 · 10&supmin;&sup4; M ZnOEP-Lösung wurde mit Tetraphenylbutadien gesättigt und dann verdünnt, um eine ZnOEP-Lösung mit halber Tetraphenylbutadien-Sättigung zu erzielen. Die Tetraphenylbutadien enthaltende Lösung wurde dann mit O&sub2;/Ar Gasmischungen mit den gleichen Sauerstoffkonzentrationen, wie oben angegeben, gesättigt. Die sich ergebenden 1.270 nm Lumineszenzsignale (in pA) sind in der mittleren Kurve von Fig. 8 dargestellt. Es ist zu erkennen, daß die Sauerstoffsensitivität reduziert ist, d. h. das 1.270 nm Lumineszenzsignal wächst innerhalb des gesamten Konzentrationsbereiches mit zunehmenden Sauerstoffkonzentrationen an. Der Zusatz von Tetraphenylbutadien reduziert somit die Lebensdauer des Singulett-Sauerstoff sensibilisierenden angeregten Zustand von ZnOEP, so daß es möglich ist, das ZnOEP/Tetraphenylbutadien Sensibilisierungsmittel zu verwenden, um Sauerstoffkonzentrationen in dem Bereich von etwa 0-760 mmHg, entsprechend 0-100%, zu messen.
- Der Effekt der Verwendung von Durochinon als Quencher für den sensibilisierenden angeregten Zustand von ZnOEP wurde untersucht. Durochinon wurde zu der ZnOEP-Toluol-Lösung zur Erzielung einer Gesamtkonzentration von Durochinon von 1,1 · 10&supmin;² M. Die oben erwähnten O&sub2;/Ar Gasmischungen wurden verwendet. Die erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignale (in pA) sind in der unteren Kurve von Fig. 8 dargestellt. Daraus ist zu erkennen, daß die Sauerstoffsensitivität weiter reduziert wird im Vergleich zu der reinen ZnOEP-Lösung und zu der halb mit Tetraphenylbutadien gesättigten ZnOEP-Lösung.
- Daraus folgt, daß das ZnOEP/Durochinon Sensibilisierungsmittel verwendet werden kann, um Sauerstoffkonzentrationen in dem Bereich von 0-760 mmHg, entsprechend 0-100% O&sub2;, zu messen. Die tatsächliche Sensitivität wird von der Konzentration an Durochinon abhängen, wie dies in den Beispielen 2b und 2c unten dargestellt ist, wo ZnTPP als Sensibilisierungsmittel verwendet wird, das durch verschiedene Durochinonkonzentrationen einem Quenchen unterliegt.
- Verwendung von Zink-Tetraphenylporphin (ZnTPP) als Sensibilisierungsmittel für die Bildung von Singulett-Sauerstoff.
- Gemäß den Experimenten von Beispiel 1 wurden Experimente durchgeführt, wobei ZnTPP anstelle von ZnOEP verwendet wurde. Eine Lösung von 3,4 · 10&supmin;&sup4; M ZnTPP in Toluol wurde mit den O&sub2;/Ar Gasmischungen mit den Sauerstoffkonzentrationen gemäß Beispiel 1 behandelt. Die erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignale sind in der oberen Kurve von Fig. 9 dargestellt. Daraus ist zu erkennen, daß die Sauerstoffsensitivität sogar größer ist als die Sauerstoffsensitivität, die mit der ZnOEP-Lösung von Beispiel 1a erzielt wurde, d. h. das maximale Lumineszenzsignal wird bei einer Sauerstoffkonzentration von 0,1% erzielt. Das reduzierte 1.270 nm Lumineszenzsignal, das mit der belüfteten Probe (20,9% O&sub2;) erzielt wurde, ist niedriger als erwartet, wobei angenommen wird, daß dieses niedrigere Signal entsprechend dem ZnOEP in Beispiel Ia auf eine Superoxid-Bildung zurückgeht.
- Durochinon wurde der ZnTPP-Lösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von Durochinon von 1,9 · 10&supmin;³ M zu erzielen. Diese Lösung wurde mit den O&sub2;/Ar Gasmischungen mit den Sauerstoffkonzentrationen gemäß Beispiel Ia behandelt. Die erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignale sind in der mittleren Kurve von Fig. 9 dargestellt. Es ist zu erkennen, daß die Sauerstoffsensitivität durch die Beigabe von Durochinon reduziert ist, was die Lösung nützlich macht, um Sauerstoffkonzentrationen in einem Bereich von 0-760 mmHg, entsprechend 0-100%, zu messen.
- Der Effekt der Zunahme der Durochinon-Konzentration wurde untersucht. Eine Lösung mit einer Endkonzentration von Durochinon von 9,6 · 10&supmin;³ M wurde hergestellt und zur Messung von Sauerstoffkonzentrationen gemäß Beispiel 1 verwendet. Die erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignale sind in der unteren Kurve von Fig. 9 dargestellt. Daraus ist zu erkennen, daß der Effekt der Zunahme der Durochinonkonzentration so ist, daß die Saurstoffsensitivität weiter reduziert und auch die Höhe der 1.270 nm Lumineszenzsignale vermindert wird. Durch Veränderung der Durochinonkonzentration in der ZnTPP- Lösung ist es somit möglich, den Sauerstoffsensitivitätsbereich auf besondere Meßzwecke einzustellen.
- Verwendung von Tetraphenylporphin (H&sub2;TPP) als Sensibilisierungsmittel für die Herstellung von Singulett-Sauerstoff
- Unter Verwendung von H&sub2;TPP als Sensibilisierungsmittel wurden zu den Experimenten der Beispiele 1 und 2 analoge Experimente durchgeführt. Eine Lösung von 5,4 · 10&supmin;&sup4; M H&sub2;CPP in Toluol wurde mit O&sub2;/Ar Gasmischungen mit den Sauerstoffkonzentrationen gemaß Beispiel 1 gesättigt. Im Gegensatz zu den ZnOEP- und ZnTPP-Lösungen der Beispiele 1a und 2a wurde keine Reduktion des Lumineszenzsignals mit der belüfteten Probe beobachtet. Gemäß der obigen Erläuterung bedeutet dies, daß eine Bildung von Superoxid vermieden wurde. Die Tatsache, daß kein Superoxid gebildet wird, entspricht gut den obigen theoretischen Energiebetrachtungen, da das Oxidationspotential des Triplett-Zustands von H&sub2;TPP -0,48 V vs. SCE ist und somit größer als das angenommene Reduktionspotential des Sauerstoffs in der Matrix.
- Die erzielten 1.270 nm Lumineszenzsignale sind in der oberen Kurve von Fig. 10 gezeigt. Aus der oberen Kurve von Fig. 10 ist zu erkennen, daß die Sauerstoffsensitivität hoch ist, da das maximale 1.270 nm Lumineszenzsignal schon fast bei einer Sauerstoffkonzentration von 1% erreicht ist.
- Durch Zusatz von Benzochinon in einer Konzentration von 1,0 · 10&supmin;² M zu der H&sub2;TPP-Toluollösung wurde versucht, die Sauerstoffsensitivität zu reduzieren. Wie aus der unteren Kurve von Fig. 10 zu erkennen ist, wurde eine solche Reduktion der Sauerstoffsensitivität nicht beobachtet. Durch die Zugabe von Benzochinon wurde ein Abfall in der 1.270 nm Lumineszenzintensität erzielt, aber kein signifikanter Effekt bezüglich der Sauerstoffsensitivität.
- Wie oben erläutert, bestimmen die Sauerstoffpermeabilität der Matrix und die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels die Verwendbarkeit eines gegebenen Sensibilisierungsmittel/Matrixsystems bezüglich besonderer Messungen des molekularen Sauerstoffs.
- In diesem Beispiel wurde die Phosphoreszenz-Intensitätsveränderung der Phosphoreszenz des Sensibilisierungsmittels verwendet, um [O&sub2;]1/2-Werte von verschiedenen Sensibilisierungsmitteln/Matrixsystemen zu etablieren. Wie oben erläutert, ist der [O&sub2;]1/2-Wert die Sauerstoffkonzentration, bei der 50% der maximalen Lumineszenzausbeute φmax erreicht wird, und ist auch die Sauerstoffkonzentration, bei der eine 50% Löschung der sensibilisierenden angeregten Zustände des Sensibilisierungsmittels erreicht wird. Demgemäß wird der [O&sub2;]-Wert, der zu einem 50%-igen Löschen der Phosphoreszenz des Sensibilisierungsmittels führt (d. h. die Phosphoreszenz der senbilisierenden angeregten Zustände des Sensibilisierungsmittels), identisch mit dem [O&sub2;]1/2-Wert der 1.270 nm Singulett-Sauerstofflumineszenz sein.
- Verschiedene Kombinationen von Sensibilisierungsmitteln und Matrices wurden bezüglich ihrer Effizienz für das Sauerstoffquenchen untersucht. Pd (II)- und Pt (II)-Komplexe von Porphyrinen wurden ausgewählt, da diese Komplexe bei Raumtemperatur eine starke Phosphoreszenz zeigen. Das Phosphoreszenzquenchen von Palladiumtetraphenylporphin (PdTPP), Platintetraphenylporphin (PtTPP) und deren Fluor-substituierten Derivaten, Palladium (II)-tetra-(pentafluorphenyl)porphyrin (PtTFPP) und Platin (II)-tetra-(pentafluorphenyl)porphyrin (PtTFPP) durch Sauerstoff wurde untersucht. Die verwendeten Matrices waren PVC, Polykarbonat/Silikon, Polyurethan und Zelluloseacetat der oben angegebenen Typen. Das verwendete PdTPP stammte von Aldrich. PtTPP wurde, wie von Eastwood und Goutertman in J. Mol. Spectroscopy, 35, 359-375 (1970) beschrieben, hergestellt. PdTFPP wurde gemäß der Beschreibung von Spellane et al. in Inorg. Chem. 19, 386-391 (1980) hergestellt, und PtTFPP wurde gemäß der Beschreibung von Kahil et al. in WO 87/00023 hergestellt.
- Die Konzentration des Sensibilisierungsmittels in der Matrix betrug in jedem Fall etwa 2 mg des Sensibilisierungsmittels pro 100 mg der Matrix. Die Matrixkomponente wurde mit dem fraglichen Sensibilisierungsmittel gemischt, und 100 mg der erzielten Mischung wurden in 10 ml gereinigtes Tetrahydrofuran (LiChrosolvTM von Merck Darmstadt, Deutschland) (THF) gelöst. Die erzielte Lösung wurde auf die Oberfläche einer mit Wasserstofffluorid-geätzten, kreisförmigen, 19 mm Durchmesser aufweisenden Mikroskopglasabdeckscheibe gegossen, die von Chance Propper Ltd. stammte. Dieses Mikroskopglasabdeckplättchen, welches das Sensibilisierungsmittel/Matrix aufwies, wird im folgenden als Sonde bezeichnet. Die Sonde wurde in die Testanordnung nach Fig. 2b angeordnet, durch die Sauerstoff enthaltende Fluide (d. h. Flüssigkeiten und Gase) mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen strömten. Die Sonde wurde mit einem Spektrofluorometer des Typs Shimadzu RF540 gemäß den Beispielen 1-3 angeregt. Das Licht des Spektrofluorophotometers wurde mit einem Filter des Typs GG 385 gefiltert und wies eine Wellenlänge von λex auf. Die sich ergebende Phosphoreszenzintensität wurde bei einer Wellenlänge von λem gemessen. Jede Wellenlänge λex und λem, die für das fragliche Porphyrin verwendet wurden, ist in der Tabelle 1 spezifiziert. Die Umgebungssauerstoffkonzentrationen, die einem 50% Phosphoreszenzquenchen ([O&sub2;]1/2) entsprachen, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgezeigt. Tabelle 1 Umgebungssauerstoffkonzentrationen (mmHg) bei 50% Quenchen ([O&sub2;]1/2) Polymer (Literaturwerte der O&sub2;-Permeabilität in Barrer) Polycarbonat Silicon Polyurethan Celluloseacetat PORPHYRIN in nm r = Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands.
- NP: Nur die O&sub2;-Permeabilitätswerte von PVC und Zelluloseacetat sind hier gezeigt, da die entsprechenden O&sub2;-Permeabilitätswerte von Polykarbonat/Silikon und Polyurethan nicht verfügbar sind.
- Die [O&sub2;]1/2-Werte von 8 mmHg und 61 mmHg, die für PdTPP in Polykarbonat/Silikon bzw. PVC erzielt wurden, können mit den [O&sub2;]1/2-Werte von PdTPP in Toluol von weniger als 1,5 mmHg verglichen werden. Bei Vergleich der Ergebnisse der Experimente, bei denen PVC (einer geringeren Sauerstoffpermeabilität) und Celluloseacetat (einer höheren Sauerstoffpermeabilität) getestet wurden, ist zu erkennen, daß die Matrix der geringeren Sauerstoffpermeabilität (PVC) zu den höchsten [O&sub2;]1/2-Werten führt und daß allgemein die Sauerstoffpermeabilität der Matrix ein kritischer Parameter der Effizienz des Sauerstoffquenchens für ein gegebenes Sensibilisierungsmittel ist. Ferner ist aus den Ergebnissen der Tabelle 1 zu erkennen, daß die Lebensdauer des sensibilisierenden angeregten Zustands des Sensibilisierungsmittels kritisch ist, d. h. die Sensibilisierungsmittel mit den kürzeren Lebenszeiten des sensibilisierenden angeregten Zustands (PtTPP und PtTFPP) führen zu den höheren [O&sub2;]1/2-Werten, während Sensibilisierungsmittel mit längeren Lebenszeiten des sensibilisierenden angeregten Zustands zu niedrigeren [O&sub2;]1/2-Werten führen.
- Basierend auf der Tatsache, daß die Lebenszeiten der sensibilisierenden angeregten Zustände (in diesem Fall die Lebenszeiten des Triplett-Zustands) von PdTPP und von PdTFPP bei Raumtemperatur typisch für Porphyrine und Zn (II)-Komplexe der Porphyrine sind, und basierend auf den Ergebnissen nach Tabelle 1, ist zu schließen, daß Octaethylporphyrin (H&sub2;OEP), Tetraphenylporphyrin (H&sub2;TPP), Tetra(pentafluorphenyl)-porphyrin (H&sub2;TFPP), Tetrabenzoporphyrin (H&sub2;TBP), Alkyl- und Aryl-substituierte Tetrabenzoporphyrine und deren Zn (II)-Komplexe in vorteilhafter Weise in Kombination mit der aus PVC bestehenden Matrix verwendet werden können, da die obigen Ergebnisse anzeigen, daß die Quantenausbeute der Singulett-Sauerstoffherstellung (φet) für Sauerstoffkonzentrationen von etwa 38 mmHg 0,5 sein wird.
- In ähnlicher Weise wird erwartet, daß Tetraphenylporphyrine, die mit Brom substituiert sind, und deren Metallkomplexe nützlich sind, wenn beispielsweise Zelluloseacetat als Matrix verwendet wird. Es ist ferner anzumerken, daß die Ergebnisse der Tabelle 1 als Richtlinie für die Auswahl von Sensibilisierungsmitteln/Matrixsystemen zur Verwendung bei Sauerstoffbestimmungen gemäß den im Stand der Technik bekannten Lumineszenzquenchverfahren nützlich sind.
- Das Sensibilisierungsmittel kann alternativ auf der Matrix in der folgenden Weise angewandt werden (erläutert durch PdTFPP, das auf einer PVC-Matrix angewandt wurde):
- Eine Lösung von 15 mg PdTFPP, das gemäß der Beschreibung von Spellane et al., siehe oben, hergestellt wurde, 199,5 mg PVC (BREON S110/10 von BP-Kemi, Kopenhagen, Dänemark) und 1,5 ml Tetrahydrofuran (LiChrosolvTM von Merck, Darmstadt, Deutschland) wurde auf eine sich drehende Mikroskopglasabdeckscheibe gegossen, die einen Durchmesser von 12 mm hatte und von Chance Propper Ltd. stammte, wobei in einer trockenen Luftatmosphäre tropfenweise 10 ul der Lösung auf die Glasabdeckscheibe gegeben wurde. Die Drehgeschwindigkeit betrug 110-120 Umdrehungen pro Sekunde. Weniger als zwei Stunden nach der Zugabe der Losung auf die Glasabdeckscheibe wurde die Glasabdeckscheibe, welche die Lösung aufwies, in einen Ofen gegeben und bei 90ºC für 40 Minuten erhitzt, um die PVC-Lösung zu härten. Die Dicke der erzielten PVC-Schicht, die das PdTFPP enthielt, war etwa 2 mm.
Claims (52)
1. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von
molekularem Sauerstoff im Grundzustand in einer Probe, wobei
das Verfahren umfaßt:
Anregen von Sauerstoffmolekülen der Probe von dem
elektronischen Grundzustand in den angeregten
Singulett-Zustand ¹Δg mittels: einer elektromagnetischen
Strahlungsquelle; und einem Sensibilisierungsmittel mit
einem angeregten elektronischen Zustand, welcher
molekularen Sauerstoff aus dem elektronischen Grundzustand
in den angeregten Singulett-Zustand ¹Δg anregen kann,
wobei das Sensibilisierungsmittel in Diffusionskontakt
mit der Probe ist; und
Messen der 1270-nm-Lumineszenz der angeregten
Sauerstoffmoleküle und Bestimmen der Konzentration von
molekularem Sauerstoff im Grundzustand in der Probe durch
Korrelieren der gemessenen Lumineszenz mit einer Kurve
oder gespeicherten Daten, welche Lumineszenzwerte von
Sauerstoff im angeregten Singulett-Zustand ¹Δg mit
Konzentrationswerten von molekularem Sauerstoff im
Grundzustand in Beziehung setzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die gemessene
1270-nm-Lumineszenz die Intensität der 1270-nm-Lumineszenz ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Energie des
angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels höher
als 0,98 eV ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Oxidationspotential des angeregten Zustandes
des Sensibilisierungsmittels eine Größe hat, welche im
wesentlichen das Sensibilisierungsmittel unfähig macht,
molekularen Sauerstoff in Superoxid umzuwandeln.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das
Oxidationspotential des angeregten Zustandes des
Sensibilisierungsmittels hoher als -0,7 V gegen SCE ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Sensibilisierungsmittel in eine Matrix
eingebettet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das
Sensibilisierungsmittel und die Matrix, in welcher es vorhanden ist, so
ausgewählt sind, daß die Lebensdauer des angeregten
Zustandes des Sensibilisierungsmittels und die
Sauerstoffdurchlässigkeit der Matrix aufeinander eingestellt
sind, um eine ausreichend große Schwankung der
gemessenen Lumineszenz über den
Sauerstoffkonzentrationsbereich, innerhalb dessen Messungen vorgenommen werden
sollen, zu erhalten.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das
Sensibilisierungsmittel und die Matrix, in welcher es vorhanden ist, auf
eine bestimmte maximale
Umgebungssauerstoffkonzentration, die gemessen werden soll, eingestellt sind, so
daß eine Matrix-Sauerstoffkonzentration von maximal
50·[O&sub2;]1/2 erhalten wird, wenn die Matrix mit einer
Probe der bestimmten maximalen
Umgebungssauerstoffkonzentration in Berührung gebracht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das
Sensibilisierungsmittel und die Matrix, in welcher es vorhanden ist, so
eingestellt sind, daß eine
Matrix-Sauerstoffkonzentration von maximal 20·[O&sub2;]1/2 erhalten wird, wenn die
Matrix mit einer Probe mit der bestimmten maximalen
Umgebungssauerstoffkonzentration in Berührung gebracht
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin das
Sensibilisierungsmittel und die Matrix, in welcher es vorhanden ist, so
eingestellt sind, daß eine
Matrix-Sauerstoffkonzentration von maximal 10·[O&sub2;]1/2 erhalten wird, wenn die
Matrix mit einer Probe mit der bestimmten maximalen
Umgebungssauerstoffkonzentration in Berührung gebracht
wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Sensibilisierungsmittel ein
Sensibilisierungsmittel mit einem angeregten Zustand, welcher
molekularen Sauerstoff aus dem elektronischen Grundzustand
in den angeregten Singulett-Zustand anregen kann und
einen Quencher, der den angeregten Zustand des
Sensibilisierungsmittels desaktivieren kann, um die
Lebensdauer des angeregten Zustandes des
Sensibilisierungsmittels zu verringern, umfaßt, wobei der Quencher
in Diffusionskontakt mit dem Sensibilisierungsmittel
ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der angeregte Zustand des
Sensibilisierungsmittels aus einem anderen elektronischen Zustand des
Sensibilisierungsmittels durch Absorption von
elektromagnetischer Strahlung gebildet ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die
elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge von weniger als 1270 nm
hat.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die
elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge im Bereich von 300
bis 1000 nm hat.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Sensibilisierungsmittel ein Porphyrin,
Metallporphyrin, Phthalocyanin oder Metallphthalocyanin
oder ein Derivat davon ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das
Sensibilisierungsmittel ein Übergangsmetallkomplex ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Übergangsmetall
Zn(II), Pd(II), Pt(II), Ru(II) oder Os(II) ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das
Sensibilisierungsmittel ein Tris-α-Diiminkomplex eines
Übergangsmetalls ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das Übergangsmetall
Ru(II), Os(II), Rh(III) oder Ir(III) ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das
Sensibilisierungsmittel ein Farbstoff ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, worin der Farbstoff
Bengalrosa, Erythrosin, Eosin, Fluorescein oder Methylenblau
ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das
Sensibilisierungsmittel eine polycyclische aromatische
Verbindung oder ein Derivat davon ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die polycyclische
aromatische Verbindung Pyren, Naphthalin, Anthracen
oder Decacyclen ist.
24. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Lebensdauer des
angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels durch
intermolekulares Quenchen verringert ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das intermolekulare
Quenchen durch einen Energietransferprozeß vor sich
geht.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin das
intermolekulare Quenchen durch einen exothermen
Energietransferprozeß vor sich geht.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, worin der Quencher
ein substituiertes Polyen ist.
28. Verfahren nach Anspruch 24, worin das intermolekulare
Quenchen durch einen Elektronentransferprozeß vor sich
geht.
29. Verfahren nach Anspruch 24 oder 28, worin das
intemolekulare Quenchen durch einen exothermen
Elektronentransferprozeß vor sich geht.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, worin der Quencher
ein Elektronenakzeptor ist, welcher den angeregten
Zustand des Sensibilisierungsmittels oxidieren kann.
31. Verfahren nach Anspruch 20, worin der Quencher bin
Chinon oder ein substituiertes Chinon ist.
32. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Quencher
Benzochinon, Durochinon oder ein halogensubstituiertes
Chinon ist.
33. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, worin der Quencher
ein Elektronendonor ist, welcher den angeregten Zustand
des Sensibilisierungsmittels reduzieren kann.
34. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der sensibilisierende angeregte Zustand des
Sensibilisierungsmittels
der angeregte Triplett-Zustand
ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, worin der
sensibilisierende angeregte Zustand des
Sensibilisierungsmittels der angeregte Singulett-Zustand ist.
36. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Sensibilisierungsmittel zu der Probe, welche
den molekularen Sauerstoff im Grundzustand enthält,
zugegeben wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 35, worin der
Diffusionskontakt zwischen dem Sensibilisierungsmittel
und der Probe durch eine Membran hergestellt wird,
welche eine Matrix, die das Sensibilisierungsmittel
enthält, von der Probe, die den molekularen Sauerstoff im
Grundzustand, dessen Konzentration bestimmt werden
soll, enthält, trennt.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 37, worin die
Matrix ein organisches Lösungsmittel oder ein Polymer
umfaßt.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 38, worin die
Matrix im wesentlichen drei von OH-Gruppen ist, um die
Lumineszenzintensität des angeregten
Singulettsauerstoffs zu maximieren.
40. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der molekulare Sauerstoff im Grundzustand in
einer biologischen Probe enthalten ist, wobei die
Konzentration des Sauerstoffs eine physiologische Höhe
hat, die einem Sauerstoffpartialdruck von bis zu etwa
800 mmHg entspricht.
41. System, das zum Bestimmen der Konzentration von
molekularem Sauerstoff im Grundzustand in einer Probe
eingerichtet ist, wobei das System umfaßt:
Anregungsmittel, die zum Anregen von
Sauerstoffmolekülen der Probe von dem elektronischen Grundzustand in
den angeregten Singulett-Zustand ¹Δg eingerichtet sind,
wobei das Anregungsmittel eine elektromagnetische
Strahlungsquelle und ein Sensibilisierungsmittel
umfaßt, wobei das Sensibilisierungsmittel einen
angeregten elektronischen Zustand hat, welcher molekularen
Sauerstoff aus dem elektronischen Grundzustand in den
angeregten Singulett-Zustand ¹Δg anregen kann und in
Diffusionskontakt mit der Probe ist;
Meßmittel, die eingerichtet sind, um die
1270-nm-Lumineszenz der angeregten Sauerstoffmoleküle zu messen;
und
Mittel, die eingerichtet sind, um die Konzentration von
molekularem Sauerstoff im Grundzustand in der Probe
durch Korrelieren der gemessenen 1270-nm-Lumineszenz
mit einer Kurve oder gespeicherten Daten, welche
Lumineszenzwerte von Sauerstoff im angeregten
Singulett-Zustand ¹Δg mit Konzentrationswerten von molekularem
Sauerstoff im Grundzustand in Beziehung setzen, zu
bestimmen.
42. System nach Anspruch 41, worin das
Sensibilisierungsmittel in einer Matrix eingebettet ist.
43. System nach Anspruch 41 oder 42, worin das
Sensibilisierungsmittel ein Sensibilisierungsmittel wie in einem
der Ansprüche 3 bis 11 oder 15 bis 35 ist.
44. System nach einem der Ansprüche 41 bis 43, worin das
Sensibilisierungsmittel in einer Matrix eingebettet ist,
die wie in Anspruch 28 oder 39 ist.
45. System nach einem der Ansprüche 42 bis 44, worin das
Sensibilisierungsmittel und die Matrix, in welcher es
vorhanden ist, so ausgewählt sind, daß die Lebensdauer
des angeregten Zustandes des Sensibilisierungsmittels
und die Sauerstoffdurchlässigkeit der Matrix
aufeinander eingestellt sind, um eine ausreichend große
Schwankung der gemessenen Lumineszenz über den
Sauerstoffkonzentrationsbereich, innerhalb dessen Messungen
vorgenommen werden sollen, zu erhalten.
46. System nach einem der Ansprüche 41 bis 45, worin der
Diffusionskontakt zwischen dem Sensibilisierungsmittel
und der Probe an einer Grenzfläche zwischen dem
Sensibilisierungsmittel und der Probe oder durch eine
Membran hergestellt wird, welche eine Matrix, die das
Sensibilisierungsmittel enthält, von der Probe, die den
molekularen Sauerstoff im Grundzustand, dessen
Konzentration bestimmt werden soll, enthält, trennt.
47. System nach einem der Ansprüche 41 bis 46, worin die
von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierte
elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge von
weniger als 1270 nm hat.
48. System nach einem der Ansprüche 41 bis 47, worin die
von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierte
elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge im
Bereich von 300 bis 1000 nm hat.
49. System nach einem der Ansprüche 41 bis 48, worin das
Meßmittel einen Detektor umfaßt, der Lumineszenz bei
einer Wellenlänge von etwa 1270 nm messen kann.
50. System nach Anspruch 49, worin der Detektor durch einen
Filter abgedeckt ist.
51. System nach Anspruch 49 oder 50, worin der Detektor an
einen Verstärkerschaltkreis angeschlossen ist.
52. System nach einem der Ansprüche 41 bis 51, worin das
Mittel, das zum Bestimmen der Konzentration von
molekularem Sauerstoff eingerichtet ist, ein Signal- oder
Datenverarbeitungsmittel umfaßt.
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