DE3885090T2

DE3885090T2 - Zusammensetzung und verfahren zur behandlung von hepatitisvirusinfektionen unter verwendung von 1-(2'-deoxy-2'-fluoro-beta-d-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil.

Info

Publication number: DE3885090T2
Application number: DE88908588T
Authority: DE
Inventors: Jack Fox; Carlos Lopez; Christian Trepo; Kyoichi Watanabe
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1987-09-03
Filing date: 1988-09-02
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2008-09-03
Also published as: EP0338042A1; DE3885090D1; ES2014042A6; EP0338042B1; EP0338042A4; JPH02500524A; PT88420A; AU2487688A; IL87646A; PT88420B; KR970011386B1; CA1328865C; KR890701112A; WO1989001776A1

Description

Die vorliegende Erfindung wurde teilweise vom National Cancer Institute gemäß den Förderungsbeschlüssen Nr. CA-08748, 18601 und 18856, durch CA-44094, Department of Health and Human Services, durch The Veterans Administration und dem Förderungsbeschluß Nr. NO-A1-62521 vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases gefördert. Folglich besitzt die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Im Rahmen dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen durch in Klammern gesetzte arabische Zahlen Bezug genommen. Die vollständigen Zitate dieser Referenzen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen beschreiben vollständig den für diese Erfindung relevanten Stand der Technik.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von 1-(2'-Desoxy- 2'-fluor-β-D-arabino-furanosyl)-5-ethyluracil (FEAU) zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hepatitisvirusinfektionen. FEAU gehört zu der Familie der 5-substituierten-1-(2'- desoxy-2'-substituierten-β-D-arabinofuranosyl)-Verbindungen, die bereits als Antiherpesvirusmittel bekannt sind (vgl. US-PS 4 211 773 von Lopez et al.). FEAU selbst ist in der genannten Patentschrift jedoch nicht offenbart. FEAU und seine Antiherpesaktivität sind jedoch bei Fox et al. in "Herpes Viruses and Virus Chemotherapy" (R. Kano, A. Nakajima, Herausgeber), Excerpta Medica, Amsterdam, Seiten 53-56 (1985) offenbart. Weitere Beispiele dieser Familie von Verbindungen sind 1-(2'- Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluracil (FMAU) und 1-(2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-jodcytosin (FIAC).
Obwohl nicht erwartet worden wäre, daß ein Antiherpesvirusmittel auch bei der Behandlung von Hepatitis wirksam ist, wurde die Nützlichkeit dieser Verbindungen als Antihepatitismittel untersucht. Während dieser Untersuchung wurde festgestellt, daß FEAU bei der Behandlung von Hepatitis besonders günstig ist. Obwohl gezeigt wurde, daß FMAU bei der Hemmung einer Replikation des Hepatitisvirus wirksam oder vielleicht noch wirksamer ist, traten bei ihm potentiell lethale, toxische Nebenwirkungen auf. Es wurde jedoch gezeigt, daß FEAU eine Replikation des Hepatitisvirus ohne starke, toxische Nebenwirkungen wirksam hemmt. Die in vitro-Wirksamkeit von FEAU gegen die Herpes simplex-Virusreplikation ist in J. Med. Chem. 1987, 30, Seiten 867-871, offenbart. Die US-A-4 666 892 offenbart die in vitro-Wirksamkeit von FIAC, FMAU und FIAU gegen Heptatitis B Virusinfektionen.
Eine besonders allgemeine Form von Hepatitis ist das Hepatitis B Virion (HBV). HBV, auch bekannt als das Dane- Partikel, ist ein 42 nm großes komplexes kugelförmiges Teilchen, das aus einer äußeren Lipoproteinhülle (Hepatitis B- Oberflächenantigen, HBsAg) und einer inneren Hülle (Hepatitis B-Kernantigen, HBcAG) besteht. Dieser Kern enthält eine ringförmige, teilweise doppelsträngige DNA und eine DNA-Polymerase. In vitro beschickt die DNA-Polymerase einen großen einzelsträngigen Bereich im Genom, wodurch ein vollständig doppelsträngiger Bereich im Genom erzeugt wird.
Die spezifische Natur der mit dem Dane-Partikel verbundenen DNA-Polymerase ist ungewiß. Eine selektive Inhibierung der HBV DNA-Polymerase durch Interkalationsmittel, Pyrophosphatanaloge und Arabinofuranosylnukleotide ist bekannt und liefert die Fähigkeit, eine Hepatitis B-Virusreplikation bei an chronischer Hepatitis B leidenden Patienten zu inhibieren.
Ein mit HBV sehr eng verwandtes Mittel ist bei Waldmurmeltieren bekannt: Der Waldmurmeltierhepatitisvirus (WHV). Beide Viren gehören zur selben Klasse von Viren, die manchmal als Hepa-DNA-Viren bezeichnet werden. Wie vormals vermutet, weisen die HBV- und WHV DNA-Polymerase dieselben grundlegenden Merkmale auf. Die WHV DNA-Polymeraseaktivität wurde deshalb parallel zu der von HBV im Rahmen einer anfänglichen in vitro- Untersuchung studiert.
Von der Klasse der Hepa-DNA-Viren verursachen bekanntermaßen nur HBV und WHV eine chronische aktive Hepatitis und ein hepatozelluläres Karzinom. Im allgemeinen ist die WHV-Infektion bei Waldmurmeltieren sowohl virologisch als auch histopathologisch eine Nachahmung der HBV-Infektion beim Menschen.
Die den Hepatitis B-Virus und das hepatozelluläre Karzinom verbindenden Befunde stammen von dem Waldmurmeltier- Hepatitisvirus (WHV)/Waldmurmeltier-Modell. Ein hepatozelluläres Karzinom läßt sich experimentell beim Waldmurmeltier durch Impfen mit WHV zum Zeitpunkt der Geburt induzieren. Diese Daten liefern nicht nur eine experimentelle Unterstützung für die Rolle von WHV bei der Krebserzeugung, sondern rechtfertigen des weiteren die Verwendung des Waldmurmeltier-Hepatitisvirus als ein pathogenes Modell für den Hepatitis B-Virus beim Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Struktur:
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Hepatitisvirusinfektion bei einem Patienten in einer zur Hemmung der Replikation des Hepatitisvirus in dem Patienten wirksamen Menge.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 veranschaulicht die WHV DNA-Polymeraseaktivität bei chronisch infizierten Waldmurmeltieren.
Fig. 2 ist ein Vergleich der Hemmung der WHV Replikation bei mit FMAU und FEAU behandelten Waldmurmeltieren.
Fig. 3 ist ein Vergleich der Hemmung der WHV Replikation bei mit FMAU und FEAU in geringeren Dosen behandelten Waldmurmeltieren.
Fig. 4 veranschaulicht die Hemmung einer WHV Replikation bei Waldmurmeltieren, denen FEAU oral verabreicht worden war.
In der hier verwendeten Form umfaßt der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptables Salz" jedes beliebige herkömmliche Salz von FEAU, das anstelle von FEAU verwendet werden kann, beispielsweise irgendein Alkali- oder Erdalkalisalz von FEAU. Schließlich umfaßt der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabler Träger" in der hier verwendeten Form jeden beliebigen pharmazeutischen Standardträger, beispielsweise sterile Lösungen, Tabletten, Tabletten mit einem Überzug und Kapseln. Typischerweise enthalten derartige Träger Streckmittel, beispielsweise Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Tontypen, Gelatine, Stearinsäure oder ihre Salze, Magnesium- oder Calciumstearat, Talkum, pflanzliche Fette oder Öle, Gummisorten, Glykole oder weitere bekannte Streckmittel. Derartige Träger können auch Geschmacksstoffe und Farbstoffzusatzstoffe oder weitere Bestandteile enthalten. Derartige Träger umfassende Mittel werden nach allgemein bekannten herkömmlichen Verfahren zubereitet. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform eignet sich das Mittel zur oralen Verabreichung.
Entsprechend der Lehre dieser Erfindung kann es sich bei dem Hepatitisvirus um den Hepatitis A-, Hepatitis B- oder Hepatitis nicht-A-, nicht-B-Virus, insbesondere den Hepatitis B-Virus, handeln.
Ferner kann erfindungsgemäß die Menge an der Verbindung, die der Zusammensetzung einverleibt wird, stark schwanken. Verfahren zur Bestimmung der genauen Menge sind dem Fachmann wohlbekannt und hängen unter anderem von dem zu behandelnden Patienten, dem verwendeten spezifischen pharmazeutischen Träger und Verabreichungsweg sowie der Häufigkeit, mit der das Mittel verabreicht werden soll, ab. Im allgemeinen beträgt die zur Hemmung einer Replikation des Hepatitisvirus wirksame Menge an der Verbindung in dem Mittel etwa 0,01 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag bis etwa 100,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag. Vorzugsweise liegt die Menge über etwa 0,04 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag, beispielsweise bei etwa 0,04 bis etwa 50,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag.

Materialien und Methoden

IN VITRO-UNTERSUCHUNG

Herstellung von Viruspartikeln

HBV-Teilchen mit DNA-Polymeraseaktivität wurden aus dem Serum eines HBsAG-positiven Patienten mit Immunsuppression aufgereinigt. WHV wurde aus einem Serumpool von fünf Waldmurmeltieren (Marmota monax), chronischen Trägern des Virus, erhalten. Die ursprünglich aus Pennsylvania importieren Waldmurmeltiere gehörten zu einer Kolonie, die über ein Jahr hinweg durch serologische Untersuchungen überwacht worden waren (vgl. Berichte von Hantz et al., J. Virol. Metho. 7: 45-55 (1983)). Der Virus wurde durch Zentrifugation auf Saccharose und isopyknischen CsCl-Gradienten gereinigt.

Chemikalien

Zur in vitro-Untersuchung wurden Triphosphate verwendet. Die Verwendung von Triphosphaten ist aufgrund der erwarteten Zellmetabolismusvorgänge erforderlich.
Nicht-markierte Nucleosidtriphosphate wurden bei Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, U.S.A., bezogen. Tritiummarkierte Desoxyribonucleosidtriphosphate, [³H]-dTTP (30 Ci/mMol), [³H]-dATP (24 Ci/mMol), [³H]-dCTP (17 Ci/mMol) und [³H]-dCTP (9,5 Ci/mMol) wurden bei Amersham (Amershal, Frankreich) bezogen. ACV wurde bei Burroughs Welcome, Chapel Hill, North Carolina, bezogen. Die Synthese von BVdU wird von Clerq et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 : 2947-2951 (1979) beschrieben. Die FIAC-Synthese wird von Lopez et al. (US-PS 4 211 773) beschrieben. Die Synthese von FEAU wird von Watanabe et al., J. Med. Chem. 27 : 91-94 (1984) beschrieben. Alle drei Nucleosidanaloge wurden nach dem von Allaudeen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 : 2698-2702 (1981) beschriebenen Verfahren in ihre entsprechenden 5'-Triphosphate umgewandelt. Die Reinheit der Triphosphate wurde ¹H NMR-spektroskopisch auf einem Bruker HX-270-Spektrometer und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einem Altex Modell. 332-Gradientenflüssigkeitschromatographen untersucht.

DNA-Polymeraseuntersuchung

Die DNA-Polymerase wurde mit kleinen Veränderungen entsprechend der Beschreibung von Kaplan et al., J. Virol. 12: 995 (1973) untersucht. Die Untersuchung erfolgte in einem Reaktionsgemisch von 50 ul mit 50 mM Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 40 mM MgCl&sub2;, 60 mM NH&sub4;Cl, jeweils 100 uM dATP, dCTP und dGTP, 0,2-0,7 uM [³H]-dTTP (30 Ci/mMol), 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% Nonidet P-40 und Enzym. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Virusteilchen mit 2-Mercaptoethanol und Nonidet P-40 gestartet. Die Inkubation erfolgte 1 h lang bei 37ºC. In Säure unlösliches radioaktives Material wurde auf einem Glasfaserfilter (GF/C Whatman) gesammelt. Die Filter wurden 5mal mit kalter, 10 mM Natriumpyrophosphat enthaltender 5%iger Trichloressigsäure und anschließend mit 95% Ethanol gewaschen. Die Radioaktivität des getrockneten Filters wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt.

Agarosegel-Elektrophorese von [³²P]-DNA

Das [³²P]-DNA-Produkt der endogenen DNA-Polymerasereaktion wurde mit Hilfe der von Summers et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 : 4597-4601 (1975) beschriebenen Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die Reaktion erfolgte in 15 ul des Standard-DNA-Polymerasegemisches mit 1 uM [³²P]-dCTP (500 Ci/mMol) als radioaktiv markiertem Nucleotid.
Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 ul 10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml Proteinase K, 0,1% (g/v) Natriumdodecylsulfat beendet. Anschließend wurde weitere 60 min lang bei 37ºC inkubiert. Nach Zugabe von 5 ul einer 5%igen (g/v) Saccharose, 1% Bromphenol-Blau wurde das gesamte Gemisch 60 min lang auf 65ºC erwärmt, augenblicklich auf 4ºC gekühlt und anschließend durch Elektrophorese auf einem auf einer horizontalen Platte befindlichen Gel von 1% Agarose analysiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und durch Autoradiographie entwickelt.
Produkt der HBV- und WHV-DNA-Polymerasereaktion Die Spezifität und Wirksamkeit der DNA-Polymerase in den HBV- und WHV-Teilchenpräparationen wurden durch Analyse der während der endogenen Reaktion synthetisierten radioaktiv markierten DNA kontrolliert. Die Untersuchung der DNA-Polymerase erfolgte entsprechend der Beschreibung unter Methoden und Materialien mit einem [³²P]-dCTP als radioaktiv markiertem Nucleotid. Das Produkt der Reaktion wurde anschließend durch Agarosegelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. Die Ergebnisse zeigten eine schrittweise Synthese von HBV- und WHV-DNA nach 15-, 30-, 120- und 180-minütiger Reaktion. Bei HBV wurden eine vollständige 3,3 kB-lange DNA und kleinere Formen (einer Länge von 1,8 bis 2,8 kB) entsprechend einem unvollständigen Füllen des einzelsträngigen Bereichs des viralen Genoms erhalten. Das Produkt der WHV-DNA-Polymerasereaktion war heterogener und wanderte etwas schneller. Nach einer 180- minütigen Reaktionsdauer maß die längere Form der WHV-DNA eine Länge von 3,1 kB.

Relative Empfindlichkeiten von HBV- und WHV-DNA-Polymerasen gegenüber ACVTP, FIACTP und BVdUTP

Die relativen Empfindlichkeiten beider Enzyme gegenüber ACVTP, FIACTP und BVdUTP wurden unter Verwendung eines Nucleotidüberschusses verglichen. Bei jedem Inhibitor wurde die Konzentration an dem entsprechenden radioaktiven Triphosphat beim 2- bis 3fachen des Km-Werts gehalten, während die restlichen Nucleotide in großem Überschuß (50 uM) vorlagen. Die Ergebnisse zeigen, daß FIACTP der wirksamste Inhibitor von HBV-DNA- Polymerase ist. ara-CTP war am wenigsten wirksam. BVdUTP und ara-TTP zeigten eine ähnliche Hemmung.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit der WHV-DNA-Polymerase erhalten. Die zur Hemmung von 50% der HBV- und WHV-DNA-Polymerasen erforderlichen Triphosphatkonzentrationen wurden bestimmt. Dabei zeigte es sich, daß der ID&sub5;&sub0;-Wert von FIACTP, verglichen mit den für BVdUTP und ACVTP erhaltenen Werten, die 5- bzw. 18fach höher waren, sehr gering war (0,5 uM).

Kinetik der Inhibierung

Obwohl der Wirkmodus für die verschiedenen Verbindungen bekanntermaßen unterschiedlich ist, wurde die Art. Der ACVTP-, FIACTP- und BVdUTP-Hemmung einer durch HBV- und WHV-DNA-Polymerasen katalysierten viralen DNA-Synthese durch Bestimmung des Ausmaßes der Hemmung mit zunehmenden Substratkonzentrationen untersucht. Bei Untersuchungen mit ACVTP war [³H]-dGTP das geschwindigkeitsbegrenzende Substrat, während die anderen drei Nucleotide im Überschuß vorlagen. Dieselben Bedingungen herrschten bei [³H]-dCTP zur FIACTP-Hemmung und bei [³H]-dTTP zur BVdUTP-Hemmung. Lineweaver-Burk-Plots zeigen, daß die Inhibierung der HBV-DNA-Polymerasereaktion durch ACVTP, FIACTP und BVdUTP mit dGTP, dCTP bzw. dTTP kompetitiv ist. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der WHV-DNA-Polymerase erhalten. Die Km- Werte von dGTP, dCTP, dTTP und der Ki-Wert von ACVTP und BVdUTP für die DNA-Polymerasen beider Viren wurden bestimmt. Die WHV-DNA-Polymerase zeigte eine geringere Affinität zu ACVTP, FIACTP und BVdUTP als die HBV-DNA-Polymerase. Die Km/Ki Verhältnisse waren jedoch bei beiden Enzymen vergleichbar.
Wirkung von BVdUTP FIACTP und ACVTP in vitro auf eine DNA- Synthese Zur Bestimmung der Wirkung der drei Analoga auf eine virale DNA-Synthese wurde mit HBV-DNA-Polymerase ein den zeitlichen Verlauf untersuchendes Experiment durchgeführt. Als radioaktiv markiertes Substrat wurde [³H]-dATP verwendet. Bei allen vier Nucleosidtriphosphat-Substraten verlief die Reaktion bis 60 min linear. Bei Weglassen von dTTP, dCTP oder dGTP aus dem Reaktionsgemisch wurde keine signifikante DNA-Synthese beobachtet. Die Substitution von dTTP durch BVdUTP führte nach 3-stündiger Reaktion zu einer 46%igen viralen DNA-Synthese, verglichen mit der Kontrolle. Dieser Wert erhöhte sich auf 67% der optimalen Aktivität nach 4-stündiger Reaktion. Wurde in einem ähnlichen Experiment dTTP durch ara-TTP ersetzt, wurde keine signifikante DNA-Synthese beobachtet.
Wurde ein derartiges Experiment mit FIACTP anstelle von dCTP durchgeführt, wurde ein geringer Einbau von [³H]-dAMP (etwa 10% der Kontrolle nach. 3-stündiger Reaktion) erhalten, während bei Verwendung von ara-CTP anstelle von dCTP kein signifikanter Einbau beobachtet wurde. Die Substitution von dGTP durch ACVTP führte zu keiner Erhöhung des Polymerisationsprozesses, wie sich aus der Wirksamkeit dieser verschiedenen Analogen gegenüber den alternativen Substraten der HBV- und WHV-DNA-Polymerasen zeigte. BVdUTP war bei beiden Enzymen das wirksamste alternative Substrat. Die durch BVdUTP als älternatives Substrat synthetisierte DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Mit BVdUTP wurde nur ein unvollständiges Füllen des einzelsträngigen Bereichs der HBV- oder WHV-DNA erhalten.
Die Wirkung von ACVTP auf die HBV-DNA-Synthese wurde auch in einem den zeitlichen Verlauf betrachtenden Experiment untersucht. [³H]-dTTP war das radioaktiv markierte Substrat. Die Reaktion wurde ohne dGTP oder mit 5 um ACVTP anstelle von dGTP gestartet. Unter diesen Bedingungen wurde kein Einbau von [³H]-dTMP nachgewiesen. Nach einer 120-minütigen Reaktion wurden 100 uM dGTP zugegeben. In der Untersuchung nur ohne dGTP führte die Zugabe von dGTP erwartungsgemäß zu einer Steigerung der DNA-Synthese. Als jedoch zuerst die Untersuchung mit 5 uM ACVTP anstelle von dGTP durchgeführt wurde, wurde nach Zugabe von 100 um dGTP keine DNA-Synthese beobachtet. Wenn zum Vergleich die Reaktion mit demselben Anteil ACVTP (5 uM) und dGTP (100 uM) gestartet wurde, wurde eine deutliche DNA-Synthese beobachtet. Ähnliche Experimente erfolgten mit ara-ATP und ara-CTP. In beiden Fällen führte die Zugabe von normalem Substrat (dATP und dCTP) nach einer 120-minütigen Reaktion in Gegenwart des Analogen zu einer Steigerung der HBV-DNA-Synthese. Die Zugabe von ACVTP anstelle des natürlichen Triphosphatsubstrats dGTP führte somit zu keiner Steigerung der DNA-Synthese, sondern scheinbar zu einer Blockierung einer weiteren Verlängerung.

Hemmwirkung der Nucleosidanaloge auf HBV- und WHV-DNA- Polymerasen

Eine antivirale Aktivität zeigende Nucleosidanaloge müssen in der Zelle zur Störung einer viralen DNA-Synthese in ihre Triphosphatderivate umgewandelt werden. Von einer bevorzugten Hemmung der Herpes simplex-Virus DNA-Polymerase durch ACVTP, BVdUTP und FIACTP wurde berichtet. Diese vermag teilweise die selektive antivirale Aktivität der Nucleosidanaloge ACV, BVdUTP und FIAC zu erklären. Der oben beschriebene in vitro-Befund zeigt, daß alle drei Verbindungen die DNA-Polymerasen von HBV und WHV hemmen und daß die Hemmung mit den entsprechenden natürlichen Triphosphatsubstraten kompetitiv ist. Es wurden die jeweiligen Hemmaktivitäten von ACVTP, BVdUTP, FIACTP und zwei weiterer Nucleotidanaloge, ara-CTP und ara- TTP, verglichen. Die Hemmaktivität auf HBV- und WHV-DNA-Polymerasen nahm in der folgenden Reihenfolge ab: FIACTP, BVdUTP, ara-TTP, ACVTP, ara-CTP.

IN VIVO-UNTERSUCHUNG

In vivo-Untersuchung von FMAU fegen chronische aktive Hepatitis bei Waldmurmeltieren

Die Verbindung FMAU ist in Wasser löslich. Folglich ist Wasser oder eine Lösung auf wäßriger Basis das bevorzugte Lösungsmittel zur Verabreichung der Verbindung. Die Löslichkeit von FMAU beträgt 66 mg/ml bei 24ºC und 81 mg/ml bei 28ºC. Sein Molekulargewicht beträgt 260.
Allen den chronischen aktiven Hepatitisvirus tragenden Waldmurmeltieren (Hantz, aaO) wurde FMAU zweimal täglich durch intraperitoneale Injektion von FMAU in der folgenden Dosierung verabreicht:
Zahl der Tiere Dosierung
2 2 mg/kg pro Tag während 7 Tagen
2 4 mg/kg pro Tag während 5 Tagen
Bei allen vier Tieren wurde eine dramatische und beinahe plötzliche Hemmung der Waldmurmeltier-Hepatitisvirusreplikation beobachtet. Am Ende einer Woche nach den Dosierungsverabreichungen war die Waldmurmeltier-Hepatitisvirus DNA-Polymerase auf Hintergrundniveaus gefallen. FMAU unterdrückte eine Waldmurmeltier-Hepatitisvirusreplikation. Diese Hemmung blieb 20-50 Tage lang nach Beendigung der Behandlung bestehen.
Ferner wurden Untersuchungen unter Verwendung von Acyclovir oder ara-AMP in ähnlichen Dosen durchgeführt. Die Virusreplikationsgehalte wurden vermindert. Diese Gehalte stiegen jedoch bald nach Beendigung der Behandlung wieder auf die Gehalte vor der Behandlung an.
Eine weiterführende Untersuchung von den Hepatitisvirus tragenden Waldmurmeltieren erfolgte mit den folgenden zusätzlichen Pyrimidinnucleosidverbindungen: FIAC (2'-Fluor-2'-desoxy-arabinosyl-5-jodcytosin) und FIAU (2'-Fluor-2'-desoxy-arabinosyl-5-joduracil). Wie bei FMAU ist Wasser der bevorzugte Träger. Diese Verbindungen sind auch in Wasser wie folgt löslich: Molekulargewicht
Wenn nötig kann die Löslichkeit der Verbindungen FMAU, FIAC und FIAU durch Zugabe von Säure oder Base zu dem wäßrigen Lösungsmittel erhöht werden. In diesem Fall kann die FIAC-Löslichkeit durch Zugabe von etwa 1 Moläquivalent Chlorwasserstoffsäure (etwas schwächer konzentrierte Chlorwasserstoffsäure auch einsetzbar) auf etwa 250 mg/ml erhöht werden. Für FIAU kann die Löslichkeit durch Zugabe von einem Äquivalent Natriumhydroxid, das zur Herstellung des Natriumsalzes von FIAU führt, mehrfach erhöht werden.

BEISPIEL 1

In vivo-Untersuchung von FEAU

In diesem Beispiel werden vergleichende biochemische und antivirale Untersuchungen für die 2'-fluorsubstituierten Arabinosylpyrimidinnucleoside, FMAU und FEAU, beschrieben. Biochemische Untersuchungen zeigten, daß FEAU ein selektives Antiherpesvirusmittel geringerer Toxizität als FMAU sein sollte. Die Wirkung von FEAU gegen eine Affen-Varicella-Virusinfektion wurde bei afrikanischen grünen Affen untersucht. Dabei zeigte sich, daß es ähnlich wie FMAU in höchst wirksamer Weise Hautausschlag verhinderte und die Virämie verringerte, ohne daß bei Dosen von 30, 10 oder 3 mg/kg/Tag, die 10mal intravenös verabreicht wurden, eine augenscheinliche Toxizität auftrat. Eine orale Verabreichung von FEAU bei diesen Affen in einer Menge von 10, 3 und 1 mg/kg/Tag (10malige Verabreichung) war in gleicher Weise wirksam.
FEAU scheint das erfolgversprechendste der bisher gegen Hepa-DNA-Viren untersuchen Nucleosidanaloge zu sein. Es zeigt erfindungsgemäß eine klinische Wirksamkeit gegen Hepatitis B- Virus.
Seit dem ursprünglichen Report (1) über die Synthese und die Antiherpesvirusaktivitäten von verschiedenen 5-substituierten Pyrimidinnucleosiden, die die 1-(2'-Desoxy-2'-fluor-β- D-arabinofuranosyl)-Einheit tragen, haben Strukturaktivitätsuntersuchungen gezeigt, daß der 2'-Fluorsubstituent in der "up"-(arabino)-Konfiguration einen wirksameren Beitrag zur antiviralen Aktivität lieferte als ein 2'-OH, -Wasserstoff oder weitere 2'-Halogene (2). Darüber hinaus waren in Untersuchungen (3, 4) die 2'-Fluornucleoside gegen eine katabolische Spaltung durch Nucleosidphosphorylasen beständig. Dies ist vermutlich ein Ergebnis der erhöhten metabolischen Stabilität der N-Glycosylverknüpfung, die durch diesen elektronegativen 2'-Substutienten bedingt wird. Es wurde gezeigt, daß von den verschiedenen 2'-Fluor-5-substituierten-arabinosyl-pyrimidinnucleosiden, die synthetisiert wurden (1), FIAC [1-(2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-jodcytosin] eine klinische Wirksamkeit gegen Herpesvirusinfektionen in klinischen Phase 1 (5) und gegen Varicella Zoster-Virus in Phase 2 (6) Untersuchungen an Krebspatienten mit einem bloßgestellten Immunsystem (mit Immunsuppression) aufweist. Das entsprechende Thyminanaloge 1-(2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5- methyluracil (FMAU) erwies sich bei mit dem Herpes simplex- Virus (HSV) Typ 1 und 2 infizierten Mäusen als wirksamer, ohne daß eine Toxizität bei wirksamen Dosisniveaus auftrat. Ferner wurde festgestellt, daß FMAU in vitro und in vivo gegen P-815- und L-1210-Leukämie-zellinien, die gegen das Antileukämiemittel Arabinofuranosylcytosin (Ara-C) resistent sind, aktiv ist. Eine Phase 1-Untersuchung von FMAU bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs zeigte, daß eine arzneimittelinduzierte Fehlfunktion des zentralen Nervensystems (CNS) die dosisbegrenzende Toxizität darstellte (7).
Mit FMAU als Leitverbindung wurden die Synthesen weiterer 5-alkylsubstituierter 2'-Fluor-ara-uracile (8, 9) einschließlich 1-(2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil (FEAU) durchgeführt. Obwohl, wie in Tabelle I dargestellt, FEAU gegen HSV-1 und HSV-2 infizierte Vero-Zellen in Kulturen etwa eine logarithmische Größenordnung weniger wirksam als FMAU war, zeigte das erstere eine deutlich geringere Wirtszellentoxizität, was zu einem extrem günstigen therapeutischen Index führt (9, 10). TABELLE I Vergleich der Anti-HSV-Aktivität von FMAU und FEAU in Untersuchungen bezüglich der Plaqueverringerung bei Vero-Zellen
* Korrelationskoeffizient 0 ,86.
# In schnell teilenden Zellen bestimmte cytotoxische Wirkung.
Ein Vergleich der antiviralen Aktivität von FMAU, FEAU und 5-Ethyl-2'-desoxyuridin (EDU) bei intrazerebral mit HSV-2 geimpften Mäusen ist in Tabelle II angegeben (10). FEAU zeigte 4 Tage lang eine Aktivität bei 50 mg/kg/Tag und erwies sich als hochwirksam bei der Verringerung der Mortalität dieser Mäuse bei Dosen von 100-200 mg/kg/Tag. Bei diesen Dosisniveaus wurde keine Toxizität beobachtet. Bei normalen (nicht infizierten) Mäusen war FEAU bei zweimal täglich 4 Tage lang verabreichten Dosen von 800 mg/kg/Tag nicht toxisch. Ferner ist erwähnenswert, daß EDU, das sich strukturell von FEAU nur durch die Abwesenheit des 2'-Fluorsubstituenten unterscheidet, bei diesem HSV-2-Mäuseenzephalitismodell viel weniger wirksam ist als FEAU. Diese Erkenntnis steht mit der zuvor gemachten Beobachtung (1), die die Wirksamkeit des 2'-Fluorsubstituenten für die durch diese Arabinofuranosylpyrimidinnucleoside gelieferte Anti-HSV-Aktivität bescheinigt, im Einklang.
Es wurde vormals der Schluß gezogen (11), daß FMAU die wirksamste und selektivste antivirale Verbindung zur Behandlung von durch HSV-2 verursachter Mäuseenzephalitis darstellt. Aufgrund dessen erfuhr sie bei Versuchen am Menschen als mögliches Mittel zur Behandlung von HSV-Enzephalitis bei Neugeborenen und Erwachsenen bei niedrigen Dosisgehalten Beachtung. Die in den Tabellen I und II beschriebenen vorläufigen Daten für FEAU ließen die Vermutung zu (10), daß diese Verbindung für ähnliche Betrachtungen wertvoll sein kann. Basierend auf diesen früheren Erkenntnissen (10) und auf dem vorläufigen biochemischen Report (12) wurden weitere biochemische und antivirale Vergleichsuntersuchungen mit FMAU und FEAU, einschließlich ihrer relativen Aktivitäten gegen den Affenvaricellavirus bei den afrikanischen grünen Affen und gegen den Hepatitisvirus im Waldmurmeltier-Tiermodell durchgeführt. Tabelle II Antivirale Wirkungen von FEAU, FMAU und EDU bei intrazerebral mit HSV-2 (Stamm G) geimpften Mäusen BEHANDLUNG Dosis Überlebende Prozentuale Gewichtszunahme am Tag § NEG-Vergleich (kein Virus) PBS (Virusvergleich) * Verabreicht 5 h nach intrazerebraler Impfung; Dosiszeitplan: 2·täglich 4 Tage lang. ** Berechnet auf der Basis von Tag 21. # Zahlen in Klammern geben den Tod eines einzelnen Tieres an. § Im Vergleich zu Tag 1. + Bezogen auf das Gewicht nur eines einzelnen überlebenden Tieres.

Vergleichende biochemische Untersuchungen

In Tabelle III sind biochemische Untersuchungen (13) bezüglich der relativen Wirkungen von FEAU und FMAU auf das Wachstum von Säugetierzellen dargestellt. Es sei darauf hingewiesen, daß FEAU gegen die promyelocytische leukämische Humanzellinie (HL-60) sowie gegen Vero-Zellen (von den afrikanischen grünen Affen) eine weit geringere Wachstumshemmung aufweist als FMAU. Dies läßt sich in günstiger Weise mit der in Tabelle I angegebenen in vitro-Untersuchung gleichstellen. In ähnlicher Weise zeigt FEAU gegen Nagetierzellinie (P-815, L-1210 und Ratten-Knochenmarkzellen) eine wesentlich geringere Wachstumshemmung auf als FMAU (Tabelle II).
Für die Hemmung des Einbaus natürlicher Vorläufer in die DNA von L-1210 Zellen durch FEAU und FMAU wurde zelluläre kinetische Konstanten (Ki) bestimmt. Unter Verwendung von tritiummarkierten natürlichen Vorläufern als Substraten (Thymidin, 2'-Desoxyuridin und 2'-Desoxycytidin) zeigte es sich, daß FEAU ein viel schwächerer Inhibitor des natürlichen Nucleosidanabolismus in diesen Säugetierzellen als FMAU ist (12, 13).
Untersuchungen bezüglich des Einbaus von 2-¹&sup4;C-markiertem FEAU und FMAU in die DNA von Säugetierzellen zeigten sehr deutliche Unterschiede (Tabelle IV). Es fand kein nachweisbarer Einbau von FEAU-Radioaktivität in die DNA sowohl der L-1210- als auch der Vero-Zellinien statt. Andererseits wurden merkliche Mengen FMAU-Radioaktivität in die DNA beider Zelllinien eingebaut. Wurden mit HSV-1 infizierte Vero-Zellen mit ¹&sup4;C-radioaktiv markiertem FEAU und FMAU zusammengebracht, wurden beide Nucleoside in die DNA dieser virusinfizierten Zellen eingebaut. Unter diesen Bedingungen ist der FMAU-Einbau in mit HSV-1 infizierten Vero-Zellen 7mal größer als der, der für FEAU beobachtet wird. Dieser Unterschied im Einbau ist vermutlich auf die größere Affinität von FMAU zu der viral codierten DNA-Polymerase zurückzuführen und mit der Größe der Differenz ihrer Antiherpeswirkungen in vitro vergleichbar (13). TABELLE III Vergleich der Wirkungen von FEAU und FMAU in Säugetierzellen ED&sub5;&sub0; (in uM) zur Hemmung eines Zellwachstums bei: HL-60-Zellen Vero-Zellen ED&sub5;&sub0; (uM) zur Hemmung eines Thymidineinbaus in DNA P-815-Zellen L-1210-Zellen Ratten-Knochenmarkzellen TABELLE IV Einbau von [2-¹&sup4;C]-FEAU or [2-¹&sup4;C]-FMAU in die DNA von Säugetierzellen Einbau bei 10 uM (in p Mol/10&sup6; Zellen/h) Zellinie nicht nachweisbar Vero Mit HSV-1 infizierte Vero-Zellen * nicht nachweisbar bei 100 uM
Es ist allgemein anerkannt, daß die selektive Antiherpesaktivität von 2'-Fluor-arabinosylpyrimidinnucleosiden in starkem Maß mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, als gute Substrate für die HSV-spezifizierte Thymidinkinase (TK), jedoch nicht durch den Wirt TK erkannt zu werden (14, 15). Wie in Tabelle V dargestellt, ist FMAU ein gutes Substrat (relativ zu Thymidin) für cytosole und mitochondriale TKs, die aus der HL-60 Humanzellinie stammen, sowie für von HSV-1 und HSV-2 stammende TKs. Im Gegensatz dazu ist FEAU ein sehr schlechtes Substrat für die vom Wirt HL-60 stammenden TKs (13). Diese Daten stehen im Einklang mit dem jüngsten Bericht von Mansuri et al. (16), der zeigte, daß FEAU eine sehr geringe Affinität für Vero-Zell-TK (verglichen mit Thymidin), jedoch eine hohe Affinität zu HSV-1 und HSV-2 codierten TKs aufweist. Diese Daten zeigen auch, daß in Gegenwart von Thymidin FEAU in nicht-infizierten Vero- Zellen mit einer sehr geringen Geschwindigkeit phosphoryliert würde.
Die biochemischen Untersuchungen (10, 12 - 16) legen die Vermutung nahe, daß FEAU in seiner antiviralen Aktivität selektiver sein sollte und somit eine geringere Wirtstoxizität zeigen sollte. In vivo-Untersuchungen an Mäusen (10, 13) zeigen, daß sowohl FMAU als auch FEAU relativ nicht-toxisch sind. FMAU ist jedoch bei Hunden in starkem Maße neurotoxisch (lethale Dosis 2,5 mg/kg/Tag, i.v.·5) während erste Untersuchungen an FEAU bei Hunden in Dosen von 50 mg/kg/Tag·10 nur eine mäßige Toxizität zeigen (lethale Dosis 100 mg/kg/Tag· 10). Wie vormals erwähnt, zeigte FMAU eine dosislimitierende ZNS-Toxizität bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs (7) bei einer intravenösen Dosis von 0,8 mg/kg/Tag·5. TABELLE V Prozentuale Phosphorylierungsraten von FEAU und FMAU (relativ zu Thymidin*) durch verschiedene Thymidinkinasen Enzymquelle HL-60-Zellen Cytosol-TK Mitochondrial-TK HSV-1 (Stamm KOS) TK HSV-2 (Stamm 333) TK * Thymidin bei 400 uM

Vergleichende Untersuchungen bei Affen gegen Affen-Varicella- Virus

Untersuchungen am Delta Regional Primate Research Center verglichen die Aktivitäten von FEAU und FMAU bei afrikanischen grünen Affen, die mit Affenvaricellavirus (SVV) infiziert waren. Wie in Tabelle VI dargestellt, zeigten die drei nicht behandelten Vergleichstiere eine deutliche Virämie und starben bis zum 11. Tag. Mit FEAU in drei Dosisniveaus (intravenöse Verabreichung) behandelte Affen zeigten selbst bei der höheren Dosis von 30 mg/kg/Tag·10 keine sichtbare Toxizität. Hämatologische Untersuchungen und chemische Untersuchungen am Serum lieferten bei allen behandelten Affen normale Werte und die Virämie (relativ zu den Vergleichstieren) war selbst bei der niedrigen Dosis von 3 mg/kg/Tag minimal. Während bei den Vergleichsaffen ein starker Hautausschlag auftrat, zeigte keiner der mit FEAU behandelten Affen bei diesen Arzneimittelgehalten einen Hautausschlag. Weitere Untersuchungen zeigten, daß eine niedrigere Dosis von 1 mg/kg/Tag das Auftreten eines Hautausschlags verhinderte, die Virämie bei zwei von drei Affen jedoch nicht verringerte. Diese Daten legen die Vermutung nahe, daß die minimal wirksame Dosis in diesem System für FEAU etwa 1 mg/kg/Tag beträgt. Gleichzeitige Untersuchungen mit FMAU zeigten, daß es etwa 40fach wirksamer gegen SVV bei einer minimalen wirksamen Dosis von etwa 0,04 mg/kg/Tag·10 war.
FEAU war auch bei der Behandlung von Affenvaricellavirus auf oralem Verabreichungsweg in hohem Maße wirksam. Eine orale Verabreichung in Dosisgehalten von 10, 3 oder 1 mg/kg/Tag·10 verhinderte einen Hautauschlag (Tabelle VII) und verringerte die Virämie in deutlichem Maße. Selbst bei einer Dosis von l mg wurde der Hautausschlag beinahe vollständig verhindert (zwei Vesikel erschienen am 9. Tag und verschwanden anschließend umgehend). Bei oraler Verabreichung von Dosen von 10 mg/kg/Tag·10 konnte keine Toxizität beobachtet werden. Somit zeigt sich, daß FEAU ein in hohem Maße wirksames und selektives antivirales Mittel bei der Behandlung einer SVV-Infektion sowohl bei intravenöser als auch oraler Verabreichung ist. TABELLE VI Bewertung von FEAU bei der Behandlung einer Affenvaricellavirusinfektion bei den afrikanischen grünen Affen: Wirkung auf Virämie Behandlungsgruppe* Affen Nummer Virämie** Mittlerer PFU-Wert am Tag P.I. VERGLEICH * Behandlung erfolgte durch intravenöse Verabreichung zweimal täglich; sie begann 48 h nach der Impfung des Virus und wurde 10 Tage lang fortgesetzt. ** Die Virämie wurde mit Hilfe einer aus 3 ml heparinisiertem Blut an den angegebenen Tagen nach Infektion (p.i.) gesammelten Lymphozytenkultur bestimmt. Der angegebene mittlere PFU-Wert ist die durchschnittliche Zahl an Plaques, die in zwei Kolben von mit jeder Lymphozytensuspension angeimpften Vero-Zell-Cokulturen vorliegt. TABELLE VII Bewertung einer oralen Dosierung von FEAU bei der Behandlung einer Affenvaricellavirusinfektion bei den afrikanischen grünen Affen: Wirkung auf Hautausschlag# Stärke des Hautausschlags am Tag P.I. Behandlungsgruppe Affen Nummer VERGLEICH * Behandlung erfolgte durch Verabreichung mit Hilfe eines Schlauches in den Magen zweimal täglich; sie begann 48 h nach Impfung mit dem Virus und wurde 10 Tage lang fortgesetzt. # Die Strenge des Hautausschlages wurde auf einer Skala von ± bis 4+ bewertet. Ein t Hautausschlag ergab sich bei Feststellung mehrerer Vesikel, während ein 4+ Hautausschlag die weitverbreitete Verteilung eines Hautausschlages auf der Körperoberfläche anzeigte.
Aufgrund von
a) der in vitro-Aktivität (15, 17) von FIAC und FMAU gegen Varicella-Zoster-Virus (VZV, ein Mitglied der Humanherpesvirusgruppe),
b) des Berichts über die Wirksamkeit von FIAC bei der Behandlung des Varicella-Zoster-Virus in Phase 2-Untersuchungen bei Patienten mit unterdrücktem Immunsystem (6) und
c) der in vivo-Aktivitäten von FMAU und FEAU gegen Affenvaricellavirus, wie sie hier und an anderer Stelle (18) beschrieben sind, kann man erwarten, daß FEAU auch eine signifikante selektive Aktivität gegen VZV bei Menschen zeigt.

BEISPIEL 2

Vergleichende Antihepatitisvirusuntersuchungen bei Waldmurmeltieren

In diesem Beispiel wurde (die Wirkung von) FEAU und FMAU gegen Waldmurmeltierhepatitisvirus (WHV) bei chronisch infizierten Waldmurmeltieren (ein wählbares Tiermodell zur Bewertung potentieller Antihepatitis B-Virusmittel beim Menschen) bewertet. FEAU hemmt eine WHV-Replikation bei einer Dosis von 2 und 0,2 mg/kg/Tag·10 bei allen untersuchten Tieren. Die Hemmwirkung fand augenblicklich statt und war nicht toxisch und langandauernd. Vorläufige Untersuchungen zeigten, daß FEAU auch gegen WHV bei oraler Verabreichung wirksam ist. Auch FMAU führte bei Dosen von 2 und 0,2 mg/kg/Tag·5 zu augenblicklichen Hemmwirkungen gegen eine WHV-Replikation. Es wurden jedoch bei FMAU bei diesen Dosen unakzeptable Toxizitäten beobachtet.
Hepatitis B-Virus (HBV), ein Mitglied der Hepa-DNA-Viren, verursacht beim Menschen eine akute und chronische Hepatitis. Es wird angenommen, daß etwa 200 Millionen Menschen Träger dieses Virus sind. HBV kann als die Hauptursache für ein hepatozelluläres Karzinom angesehen werden (19). Ferner wurden Hepa-DNA-Viren bei anderen Tieren, beispielsweise dem Waldmurmeltier (Marmota Monax), festgestellt. Die zwischen dem Waldmurmeltierhepatitisvirus (WHV) und HBV festgestellten engen strukturellen und klinisch pathologischen Ähnlichkeiten, einschließlich der Nucleinsäurehomologie (20), legen die Vermutung nahe, daß das Waldmurmeltier ein nützliches Modell zur Untersuchung persistierender Hepatitisvirusinfektionen sowie ihrer Beziehung zur Entstehung von Leberkrebs (21) darstellt. In ähnlicher Weise wie HBV führt der Waldmurmeltierhepatitisvirus zu einer "Herausarbeitung" einer sehr ähnlichen DNA-Polymerase für seine Replikation und Integration. Potentielle Anti-HBV-Mittel können durch ihre Hemmung einer endogenen WHV- oder HBV-DNA-Polymerase, erhalten aus Seren, die aus einen chronischen Träger darstellenden Waldmurmeltieren und aus Patienten (mit unterdrücktem Immunsystem) mit einer positiven Antwort auf das Hepatitis-B-Oberflächenantigen hergestellt sind, nachgewiesen werden. Derartige Untersuchungen wurden an der Hepatitis Virus Unit, INSERM, Lyon, Frankreich, zur Bestimmung der Hemmwirkungen bestimmter Nucleosidtriphosphate auf diese endogenen viralen DNA-Polymerasen durchgeführt.
In einer Reihe von Untersuchungen (22, 23) wurden die relativen Empfindlichkeiten von HBV- und WHV-DNA-Polymerasen auf verschiedene Nucleosidtriphosphate bestimmt (Tabelle VIII). Von den sechs untersuchten Nucleosidtriphosphaten war FMAU der wirksamste Hemmer sowohl von HBV- als auch WHV-DNA-Polymerasen, dicht gefolgt von FIAC. Darüber hinaus waren die Wirksamkeiten (ID&sub5;&sub0;-Werte) jedes dieser sechs Triphosphate gegen HBV- oder WHV-DNA-Polymerasen, wenn auch nicht identisch, so doch ziemlich gleichwertig. Noch wichtiger ist, daß die Wirksamkeitsgrößenordnungen dieser viralen DNA-Polymerasen als Hemmer identisch waren. Diese Ergebnisse bescheinigen des weiteren die auffallenden Ähnlichkeiten zwischen HBV und WHV und weisen auf die Gültigkeit des Waldmurmeltiers als Tiermodell der Wahl zur in vivo-Bewertung potentieller Antihepatitis-B-Virusmittel hin (23).
Im Rahmen dieses Tiermodells unter Verwendung von natürlich chronisch mit Waldmurmeltierhepatitisvirus infizierten Waldmurmeltieren wurden anschließend Untersuchungen zur Bewertung von FMAU und FEAU durchgeführt (24). Es wurde angenommen, daß diese Nucleoside im Tier zu ihren Nucleosidtriphosphaten anabolisiert würden. Die WHV-Replikation wurde durch die endogene DNA-Polymeraseaktivität und den Nachweis von WHV-DNA durch Dot-Blot-Hybridisierungsuntersuchung periodisch bestimmt. Die viralen DNA-Polymeraseaktivitäten nicht behandelter Waldmurmeltiere sind in Fig. 1 angegeben. Drei verschiedene Dosierungen von FMAU und FEAU wurden untersucht. FMAU in einer Dosis von 2 mg/kg/Tag·5 (bei intraperitonealer Verabreichung, beginnend am Tage 0) lieferte eine deutliche Hemmung der WHV-Replikation, wie durch die vollständige Suppression der WHV-DNA-Polymeraseaktivität dargestellt wird (Fig. 2). Bei dieser Dosis wurde jedoch eine starke ZNS-Toxizität, die schließlich tödlich endete, beobachtet. Intraperitoneal in einer Menge von 2 mg/kg/Tag·10 verabreichtes FEAU lieferte auch eine nahezu augenblickliche Suppression einer WHV-Replikation und zeigte ferner keine toxischen Wirkungen. Bei einer Menge von 0,2 mg/kg/Tag waren FMAU (verabreicht·5) und FEAU (verabreicht·10) hinsichtlich einer Suppression viraler Replikation gleich wirksam (Fig. 3). Bei dieser Dosis zeigte FMAU eine weniger schwere und verzögerte Toxizität, während FEAU abermals nicht toxisch war. Selbst bei Dosen von 0,04 mg/kg/Tag·10 zeigte FEAU noch eine etwas verringerte Anti-WHV-Wirkung. Eine vorläufige Untersuchung bei einem Waldmurmeltier, dem FEAU oral in einer Dosis von 0,2 mg/kg/Tag·10 verabreicht worden war, ergab eine signifikante Suppression der WHV-Replikation, ohne daß abermals irgendeine Toxizität beobachtet wurde (Fig. 4). TABELLE VIII Vergleich der Hemmaktivitäten von Nucleosidtriphosphatanalogen auf DNA-Polymerasen des Humanhepatitisvirus (HBV) und des Waldmurmeltierhepatitisvirus (WHV) Nucleosidtriphosphathemmer DNA-POLYMERASE * ID&sub5;&sub0; = Hemmkonzentration, die eine 50%ige Hemmung der DNA-Polymeraseaktivität liefert.
Nach Beendigung der Arzneimittelbehandlung wurde die Hemmaktivität von FEAU bei Dosen von 0,2 oder 2 mg über einen Zeitraum von 6 Wochen in signifikanter Weise beibehalten, während sie langsam auf Niveaus vor der Behandlung zurückkehrte. Eine FEAU-Hemmung der WHV-Replikation fand nahezu augenblicklich statt und wurde in deutlich höherem Maße aufrechterhalten als im Falle der anderen antiviralen Mittel, beispielsweise 6- Dexoxyacylovir, DHPG oder Ara-AMP. Diese letzteren Arzneimittel verminderten auch die WHV-DNA-Polymerasegehalte, diese haden jedoch bald nach Beendigung der Arzneimittelbehandlung auf Niveaus vor der Behandlung zurück. Im Gegensatz zu den früheren Untersuchungen mit FMAU und FIAC (wo eine lethale Toxizi- Lät nachgewiesen wurde) wurde nach einer FEAU-Behandlung nur ein etwa 10%iger Gewichtsverlust beobachtet (24).
Die beobachtete Wirksamkeit von FEAU gegen Waldmurmeltierhepatitisvirusreplikation bei diesen niedrigen Dosen war ziemlich überraschend. Auf der Basis der in vitro-Untersuchungen der Herpes simplex-Viren (9, 10), der in vivo-Untersuchungen am Herpesenzephalitismodell bei Mäusen (10) und der Affenvaricellavirus-Untersuchungen bei den afrikanischen grünen Affen, worüber hierin berichtet wurde, hätte man erwartet, daß FEAU viel weniger wirksam sein würde als FMAU. Diese Daten legen die Vermutung nahe, daß FEAU ein wirksames Mittel klinisch gegen Hepatitis B-Virus sein kann. Auf der Basis seiner Wirksamkeit und Selektivität scheint es das erfolgversprechendste der bisher untersuchten Nucleosidanaloge zu sein.

BEISPIEL 3

Entsprechend dem Vorgehen von Beispiel 2 wurde die FEAU- Hemmung einer WHV-Replikation weiter mit verschiedenen Dosen, die Waldmurmeltieren durch Schläuche in den Magen oral verabreicht wurden, untersucht. Es wurden zwei Gruppen von Waldmurmeltieren mit unterschiedlichen anfänglichen WHV-Replikationswerten untersucht.

A. Hohe Replikation

Sieben Waldmurmeltiere mit einer hohen WHV-Replikation wurden getestet. Eine hohe Replikation ist als (ein Wert von) mehr als 1000 counts per minute DNA-Polymeraseaktivität definiert, wobei die mittlere Replikation 1600 betrug. Zwei dieser Waldmurmeltiere wurden als Vergleichstiere gehalten. Diese zeigten mit geringen Schwankungen während der 60-tägigen Untersuchung dieselbe WHV-Replikation.
Die restlichen fünf Waldmurmeltiere wurden oral mit 0,2 mg FEAU/kg/Tag behandelt. Bis zum 23. Tag waren die Replikationswerte aller dieser Waldmurmeltiere verringert worden. Vier der fünf Tiere lagen jedoch noch über dem normalen Niveau, das als 50 counts per minute DNA-Polymeraseaktivität definiert ist. Folglich wurde am Tag 24 die Dosierung dieser vier Tiere auf 1 mg FEAU/kg/Tag erhöht, während die Dosierung des fünften Tiers bei 0,2 mg FEAU/kg/Tag gehalten wurde. Am 60. Tag war bei allen fünf Tieren ohne toxische Nebenwirkungen die Replikation vollständig gehemmt.

B. Niedrige Replikation

Sieben Waldmurmeltiere mit einer niedrigen WHV-Replikation wurden getestet. Eine niedrige Replikation ist als ein Wert von weniger als 1000 counts per minute DNA-Polymeraseaktivität definiert, wobei die mittlere Replikation 600-800 betrug. Zwei dieser Waldmurmeltiere wurden als Vergleichstiere gehalten. Diese zeigten mit geringen Schwankungen während des 60tägigen Experiments dieselbe WHV-Replikation.
Die restlichen fünf Waldmurmeltiere wurden oral mit 0,04 mg FEAU/kg/Tag behandelt. Am 23. Tag waren bei allen diesen Waldmurmeltieren die Replikationswerte verringert. Zwei der fünf Tiere wiesen jedoch noch Werte oberhalb des normalen Niveaus auf. Folglich wurde am 24. Tag die Dosierung dieser beiden Tiere auf 0,2 mg FEAU/kg/Tag erhöht, während die Dosis der restlichen drei Tiere bei 0,04 mg FEAU/kg/Tag beibehalten wurde. Am 60. Tag war die Replikation bei allen fünf Tieren ohne toxische Nebenwirkungen vollständig gehemmt.
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Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Struktur:

oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Hepatitisvirusinfektion bei einem Patienten in einer zur Hemmung der Replikation des Hepatitisvirus in dem Patienten wirksamen Menge.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Hepatitisvirus der Hepatitis A Virus ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Hepatitisvirus der Hepatitis B Virus ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Hepatitisvirus der Hepatitis nicht-A, nicht-B Virus ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die wirksame Menge an der Verbindung 0,01 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag bis zu 100,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag beträgt.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die wirksame Menge an der Verbindung mehr als 0,04 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag beträgt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Menge an der Verbindung 0,04 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag bis 50,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag beträgt.