DE3882233T2

DE3882233T2 - Gefässaktive peptide.

Info

Publication number: DE3882233T2
Application number: DE88908781T
Authority: DE
Inventors: Per Melin; Jerzy Trojnar
Original assignee: Ferring AB
Current assignee: Ferring AB
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2008-10-05
Also published as: NO901558L; AU606476B2; EP0380554B1; SE8703855D0; FI901773A0; AU2533988A; WO1989003393A1; NO901558D0; ATE91286T1; SE469473B; DK87090D0; DE3882233D1; JPH03500409A; EP0380554A1; SE8703855L; DK87090A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Vasotocinderivate, insbesondere auf derartige Vasotocinderiviate, die sich von dem natürlichen Hórmon dadurch unterscheiden, daß die Vasotocin-(VT)-Struktur in den Positionen 1, 2 und 8 modifiziert worden ist.
Die neuen VT-Derivate sind vasoaktiv, insbesondere dadurch, daß sie den Blutdruck spezifisch anheben, und sie haben in einigen Fällen eine beträchtlich verlängerte Wirkung.
Das von dem hinteren Organlappen der Hirnhangdrüse hergestellte Peptidhormon Vasopressin hat hauptsächlich zwei Funktionen, d. h., das Hormon hat sowohl eine antidiuretische Wirkung (verminderte Ausscheidung von Urin) wie auch eine Kontraktionswirkung auf glatte Muskeln in der vaskulären Wand, wobei der zuletzt genannte Effekt einen Blutdruckanstieg und eine verminderte Tendenz im Hinblick auf Blutung hervorruft. Bei der klinischen Verwendung hat Vasopressin somit eine unspezifische Wirkung von kurzer Dauer.
Heutzutage gibt es auf dem Markt ein Vasopressinanalog mit einer verlängerten Wirkung, nämlich Lysin-Vasopressin, welches an dem N- terminalen Ende durch drei Aminosäurereste verlängert ist. Dieses Vasopressinanalog wirkt als sogenanntes Prohormon oder Hormonogen, d. h. es verlängert die Dauer der Vasopressinwirkung. Das verlängerte Vasopressinanalog besitzt selbst einen sehr geringen pharmakologischen Effekt, welcher nicht auftritt, bis die zusätzlichen N-terminalen Aminosäurereste durch enzymatische Hydrolyse gespalten sind und freies Lysin-Vasopressin gebildet ist. Neben der verlängerten Wirkung ist ein derartiges Prohormon dadurch vorteilhaft, daß das Risiko der Überdosierung durch die begrenzte Enzymkapazität des Organismus, die die Plasmaspiegel des freigesetzten Vasopressins festlegt, vermindert ist. Auf diese Weise ist es möglich, übermäßig hohe Plasmaspiegel von Vasopressin, die zu vergrößertem Blutdruck führen, welcher für den Patienten nachteilig ist, zu vermeiden. Das zuvor beschriebene Vasopressinanalog weist jedoch größere Nachteile insofern auf, als daß es eine geringe Wirksamkeit besitzt und ähnlich wie Vasopressin unspezifisch ist.
Es besteht ein Verlangen nach Gefäßverengung verursachenden Substanzen für die Verwendung als Blutungsinhibitoren und bei der sogenannten orthostatischen Hypotonie, d. h. Zustand des Blutdruckabfalls im Anschluß an Änderungen der Körperhaltung. Diese Mittel sollten den Blutdruck spezifisch anheben, und somit eine geringe antidiuretische Wirkung besitzen, um Wasservergiftung bei Patienten, die einer Langzeitbehandlung ausgesetzt sind, zu vermeiden. Es ist auch vorteilhaft, wenn sie eine Langzeitwirkung zeigen.
Die vorliegenden neuen vasoaktiven Peptide heben den Blutdruck spezifisch an, d. h. sie sind druckspezifisch, dieses bedeutet ein hohes Verhältnis der Blutdruckaktivität zur antidiuretischen Aktivität. Darüber hinaus besitzen sie in einigen Fällen eine beträchtlich verlängerte Wirkung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sollen dazu dienen, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Inhibieren von Blutung und beim Zustand des Blutdruckabfalls im Anschluß an Änderungen der Körperhaltung, sogenannte orthostatische Hypotonie, und auch als allgemeine blutdruckanhebende Mittel verwendet zu werden.
Die VT-Derivate gemäß der Erfindung haben die Formel
wobei
Hmp = ein 2-Hydroxy-3-mercaptopropionsäurerest
Q&sub1; und Q&sub2; sind gleich oder unterschiedlich und bedeuten H oder Peptidreste, die aus 1 bis 3 gleichen oder unterschiedlichen natürlichen oder unnatürlichen L- oder D-Aminosäuren hergestellt sind, und
n bedeutet 1, 2 oder 3.
Die VT-Derivate gemäß der Erfindung konnen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen mindestens ein VT-Derivat gemäß der Erfindung als aktiver Bestandteil in Kombination mit pharmazeutisch geeigneten Additiven und/oder Verdünnungsmitteln enthalten ist, angeboten werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung liegen vorzugsweise in Form von Präparationen vor, die sich für parenterale Verabreichung eignen. Sie werden vorzugsweise durch Injektion, Infusión oder intranasale Verabreichung verabreicht. Das Verdünnungsmittel kann beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung sein.
Ein pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann ein spezifisch den Blutdruck anhebendes Derivat, welches eine relativ kurze Dauer für die Erzeugung einer sofortigen Wirkung benötigt, in Kombination mit einem spezifisch den Blutdruck anhebenden Derivat, welches eine lange Dauer zum Erzeugen einer Verlängerung der Wirkung benötigt, enthalten.

Herstellung der VT-Derivate gemäß der Erfindung

Die erfindungsgemäßen VT-Derivate können mit Hilfe von Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die im Peptidbereich bekannt sind, hergestellt werden.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf konventionelle Weise hergestellt werden, indem Aminosäuren schrittweise aneinander in flüssiger Phase gekoppelt werden, wie es beispielsweise von Law, H.B. & Du Vigneaud, V. im Journal of the American Chemical Society 82, (1960) 4573-4581, von Zhuze, A.L., Jost, K., Kasafirek, E. & Rudinger, J. in Collection of Czechoslovak Chemical Communications 29, (1964), 2648- 2662, beschrieben worden ist und modifiziert von Larsson, L.-E., Lindeberg, G., Melin, P. / Pliska, V. in Journal of Medicinal Chemistry 21, (1978), 352-356. Die Kopplung der Aminosäuren aneinander, welche sogenannte Peptidbindungen ergibt, kann auch mit einer Festphase (im allgemeinen ein Harz) als Ausgangsmaterial, an die das C-terminale Ende der ersten Aminosäure gekoppelt wird, worauf das C-terminale Ende der nächsten Aminosäure an das N-terminale Ende der ersten Aminosäure usw. gekoppelt wird, erzeugt werden. Letztendlich wird das fertiggestellte Peptid aus der Festphase freigesetzt. In den im nachfolgenden dargestellten Beispielen ist diese sogenannte Festphasentechnik in Übereinstimmung mit der Offenbarung von Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149, Merrifield, R.B. Biochemistry (1964), 3, 1385 und König, W., Geiger, R., Chem. Ber. (1970), 103, 788 verwendet worden.

Allgemeine Beschreibung der Synthese

Alle VT-Derivate, die in den im nachfolgenden aufgeführten Beispielen hergestellt wurden, wurden mit Hilfe eines Applied Biosystems 430A Peptid Synthesizers unter Verwendung eines Doppelkopplungsprogramms mit einem Beendigungsschritt nach der zweiten Kopplung synthetisiert. Das verwendete Harz war von 4-Methylbenzhydrylaminart mit einer theoretischen Beladung von 0,66 meq/g (Peptides International, Louisville, KY, USA). Das Endprodukt der Synthese wurde über Nacht im Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde anschließend von dem Harz durch Behandlung mit flüssigem Fluorwasserstoff in Anwesenheit von Anisol und Ethyl-Methyl-Sulphid als Spülmittel (HF:Anisol:EMS - 10:05:05) abgespalten. Nach Entfernung von Fluorwasserstoff mittels Verdampfung wurde das Harz in Ethylacetat (100 ml) suspendiert und filtriert. Der Feststoff wurde auf dem Filter mit zusätzlichem Ethylatetat (3x100 ml) gewaschen, und das gespaltene Peptid wurde mit Essigsäure (100 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde unverzüglich mit 20 %iger Essigsäure in Methanol auf ein Volumen von 2 l verdünnt und mit 0,1 M Lösung von Jod in Methanol behandelt, bis eine schwachbraune Farbe zurückblieb. Anschließend wurde ein Dowex 1x8 Ionenaustauscher in Acetatform (3 g) (Bio-Rad, Richmond, CA) hinzugegeben, und die Mischung wurde filtriert. Das Filtrat wurde verdampft, und der Rückstand wurde aus 1 %iger Essigsäure in Wasser gefriergetrocknet. Das Produkt wurde anschließend mit Hilfe von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie auf einer Säule, die mit Vydac 20-25 u (Separation Group, CA) gefüllt war, in einem geeigneten System, welches Acetonitril in 0,1 %iger Trifluoressigsäurewasserlösung enthielt, gereinigt. Die von der Säule gesammelten Proben wurden mit Hilfe von analytischer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) (Varian 5500, Sunnyvale, CA), ausgerüstet mit einer Bondapak C18-Säule (Millipore, Milford, Mass.), analysiert. Die die reine Substanz enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, das Lösungsmittel wurde verdampft, und das Produkt wurde aus 1 %iger Essigsäure in Wasser gefriergetrocknet. Es wurde mit dem fertigen Produkt eine End-HPLC-Analyse durchgeführt, und die Struktur des Peptids wurde mit Hilfe von Aminosäurenanalyse und Massenspektrometrie beruhend auf schnellem Atombeschuß (FAB MS) bestätigt.
Alle während der Synthese verwendeten Aminosäuren waren L- Aminosäuren, und sie wurden an der α-Aminofunktion mit einer tert- Butoxycarbonylgruppe geschützt. Die Nebenketten wurden folgendermaßen geschützt:
Ser(BZL), Thr(BZL), Tyr(2-BrCbz), Lys(2-ClCbz), Orn(Cbz), Asp(BZL), Glu(BZL), Arg(Tos), Cys(Mob), Hmp(Acm), Cys(Acm), Orm(Bor)
Die Abkürzungen in den Klammern bedeuten:
BZL = Benzyl;
2-BrCbz= 2-Bromcarbobenzoxy;
2-ClCbz= 2-Chlorcarbobenzoxy;
Cbz = Carbobenzoxy;
Tos = Tosyl;
Mob = 4-Methoxybenzyl;
Acm = Acetamidomethyl; und
Boc = t-Butyloxycarbonyl
Die Aminosäurederivate wurden von Bachem AG, Schweiz geliefert.

Beispiel 1

1-Hmp-2-Phe-8-Orn-VT
[Q&sub1; = H, n = 3 und Q&sub2; = H]
Das Peptid wurde gemäß der allgemeinen Beschreibung synthetisiert. 2- Hydroxy-mercaptopropionsäure [S-(p-Methoxy)benzyl] wurde für die Position 1 verwendet. Reinheit (HPLC) : 99,5 % (27 % Acetonitril in 0,1 % TFA, Verweilzeit 8,13 Min bei 2 ml/Min, Nachweis bei 223 nm)

Aminosäurenanalyse:

Asp 1,05; Glu 1,02; Pro 1,00; Gly 0,94; Ile 1,00; Phe 0,95; Orn 0,91.

Beispiel 2

1-Hmp-2-Phe-8-Dab-VT
(Q&sub1; = H, n = 2, Q&sub2; = H]
Dieses Analog wurde gemäß der allgemeinen Beschreibung und Beispiel 1 synthetisiert. Boc Dab(Cbz) wurde für die Kopplung in der Position 8 (Dab = 2,4-Diaminobuttersäure) verwendet.
Reinheit (HPLC): 99,5 % (24 % Acetonitril/0,1 % TFA, Verweilzeit 6,0 Min bei 2 ml/Min, Nachweis bei 223 nm)

Aminosäureanalyse:

Asp 1,00; Glu 1,03; Pro 0,97; Gly 1,08; Ile 0,98; Phe 0,99.

Beispiel 3

1-Hmp-2-Phe-8-Orn (Ala)-VT
[Q&sub1; = H, n = 3 und Q&sub2; = Alanyl]
Die Synthese dieser Verbindung wurde wie im Beispiel 1 jedoch mit der Ausnahme der Aminosäure in der Position 8 durchgeführt. Boc-Orn(Ala)-OH wurde anstelle von Boc-Orn(Cbz)OH verwendet.
Reinheit (HPLC): 97,8 % (27 Acetonitril/0,1 % TFA; Verweilzeit: 10,09 Min bei 2 ml/Min, Nachweis bei 223 nm).

Aminosäurenanalyse:

Asp 1,05; Glu 0,95; Pro 1,03; Gly 1,0; Ala 0,98; Cys 0,87; Ile 0,73; Phe 0,90; Orn 0,96.

Beispiel 4

Glyº-1-Hmp-2-Phe-8-Orn-VT
[Q&sub1; Gly, n = 3 und Q&sub2; = H]
Das geschützte Nonapeptid Hmp(Acm)-Phe-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro- Orn(Boc)-Gly-NH&sub2; (500 mg; hergestellt mit Hilfe des Festphasenverfahrens gemäß der allgemeinen Beschreibung) wurde in DMF (25 ml) gelöst. Pyridin (5 ml) und zuvor gebildetes Boc Gly Anhydrid (10 Äquivalente) wurden bei 0ºC unter heftigem Rühren hinzugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Das Produkt wurde mittels Fällung mit Ethano_ und Diethylether, Filtration und Trocken im Vakuum isoliert.
Das geschützte Decapeptid (Boc-Gly-Hmp (Acm)-Phe-Ile-Glu-Asn-Cys(Acm)- Pro-Orn(Boc)-Gly-NH&sub2; (342 mg, 0,25 mmol) wurde in 70 Methanol (1500 ml) gelöst, und eine Lösung von Jod (160 mg) in Methanol (375 ml) wurde tropfenweise unter Rühren hinzugegeben. Dowex 1x8 (50 g Acetatform) wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, und der Rückstand wurde durch Verdampfung mit Toluol getrocknet, woran sich Trocknen im Exikator im Vakuum anschloß.
Das Produkt wurde dann mit TFA (10 ml), welches Anisol (1 ml) enthielt, behandelt, 15 Min gerührt und anschließend mit Diethylether (100 ml) behandelt. Der Niederschlag wurde mittels Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet.
Das Produkt wurde mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt.
Reinheit (HPLC) : 95 (24 % Acetonitril/0,1 % TFA; Verweilzeit: 5,08 Min bei 1 ml/Min, Nachweis bei 223 nm) .
Die Struktur wurde mit Hilfe von Aminosäurenanalyse und FAB MS- Analyse bestätigt.

Aminosäurenanalyse:

Asp 1,29; Glu 1,00; Pro 0,96; Gly 2,35; Cys 0,44; Ile 0,82; Phe 0(97; Orn 1,12.

Pharmakologische Tests

Vasotocinderivate gemäß der Erfindung wurden im Hinblick auf ihre Wirksamkeit sowohl in Bezug auf Blutdruck wie auch im Hinblick auf antidiuretische Aktivität in einem sogenannten Vier-Punkte-Test untersucht, d. h. die Aktivität der Testsubstanzen wurde in Bezug zu einer Standardpräparation (AVP = Arginin-Vasopressin) gesetzt, und es wurden die Wirkungen von zwei Dosisniveaus für jede Substanz analysiert. Zusätzlich wurden zwei bekannte druckspezifische Analoge (VT-Derivate) zum Vergleich untersucht, nämlich 1-mpa-2-Phe-8-Orn-VT (mpa = 3-Mercaptopropionyl) (Huguenin, R.L., Boissonnas, R.A., 1966. Helv. Chim. Acta, 49, 711) und 2-Phe-8-Orn-VT (SE-332993, Sandoz).
Es wurden Blutdruckuntersuchungen mit anästhesierten Sprague-Dawley- Ratten (etwa 250 g), die zuvor mit Dibenamin (Dekanski, J., 1952. Br. J. Pharmacol. 7, 567) behandelt worden waren, durchgeführt. Der maximale Blutdruckanstieg nach intravenösen Peptidinjektionen wurde als Maß für die Wirkung, ausgedrückt als Intensität, verwendet.
Neben der auf dem Intensitätseffekt basierenden Wirksamkeitsbestimmung wurde ein Maß für die Länge des Effekts angegeben (Ausdauerindex (I.P.) , Pliska, V., 1966. Arzheim. Forsch. 16, 886). Dieser dimensionslose Faktor ist ein Maß im Hinblick auf die Wirksamkeitsdauer des entsprechenden Analogen in Bezug zu dem Standard AVP.
Die antidiuretische Wirksamkeit wurde mit Hilfe von anästhesierten, mit Wasser abgefüllten Sprague-Dawley-Ratten (200 g) (Larsson, L.E., Lindeberg, G., Melin, P. und Pliska, V., 1978, T. Med. Chem. 21, 353) bestimmt. Es wurde der maximale Anstieg des Urinleitvermögens nach intravenösen Injektionen als Wirksamkeitsparameter verwendet.
Bei diesen zwei Tests wurde ein Vergleich zwischen den Wirkungen des entsprechenden Derivats und der Wirkung einer Standardpräparation, AVP, durchgeführt, und die Wirksamkeit wurde mit Hilfe eines Vier-Punkte-Tests bestimmt und ist in internationalen Einheiten pro Milligramm (IE/mg) (Stürmer, E., siehe: Handbook of Experimental Pharmacology, 1966, Band 23, Seiten 130-189) angegeben.
Die Spezifität im Hinblick auf den Blutdruck wird durch das Verhältnis aus dem Wirksamkeitsvermögen im Hinblick auf den Blutdruck zu dem Wirksamkeitsvermögen im Hinblick auf Antidiurese (BP/AD) angegeben.
Die pharmakologischen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen 4 und 5 ein sehr hohes Wirksamkeitsvermögen im Hinblick auf den Blutdruckanstieg in Bezug zu den bekannten Derivaten 2 und 3 und eine äquivalente oder höhere Spezifität als die bekannten Verbindungen 1, 2 und 3 zeigen. Das sehr hohe Wirksamkeitsvermögen im Hinblick auf den Blutdruckanstieg ermöglicht es, die Verbindungen 4 und 5 in beträchtlich niedrigeren Dosierungen als die bekannten druckspezifischen Substanzen 2 und 3 zu verabreichen. Es ist weiterhin aus Tabelle 1 ersichtlich, daß die Verbindungen 6 und 7, die als Proarzneimittel angesehen werden können, eine überraschend hohe Wirksamkeit in Bezug auf den Blutdruck und adäquate Spezifität zeigen. Darüber hinaus haben sie eine beträchtlich verlängerte Wirkung im Vergleich zu den bekannten Substanzen 1, 2 und 3.

Herstellungsbeispiel für eine pharmazeutische Zusammensetzung

Das VT-Derivat wird in destilliertem Wasser zusammen mit Mannit gelöst. Die Lösung wird in eine Ampulle gegossen, gefriergetrocknet und verschlossen. Der Inhalt der Ampulle kann dann gewünschtenfalls mit einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung auf eine für die Verabreichung geeignete Konzentration verdünnt werden. Tablle 1 BLUTDRUCK BP ANALOG I.P. (Maß für die Dauer der Wirkung) ANTIDIURESE AD IE/mg BP/AD (Spezifitätsmaß) 1. AVP (bekannt) 2. 2-Phe-8-Orn-VT (bekannt) 3. 1-mpa-2-Phe-8-Orn-VT (Bekannt) 4. 1-Hmp-2-Phe-8-Orn-VT (Beispiel 1) 5. 1-Hmp-2-Phe-8-Dab-VT (Beispiel 2) 6. 1-Hmp-2-Phe-8-Orn (Ala)-VT (Beispiel 3) 7. GLyº-1-Hmp-2-Phe-8-Orn-VT (Beispiel 4)

Claims

1. Vasotocinderivat der Formel

wobei

HmP = ein 2-Hydroxy-3-mercaptopropionsäurerest

Q&sub1; und Q&sub2; sind gleich oder unterschiedlich und bedeuten H oder Peptidreste, die aus 1 bis 3 gleichen oder unterschiedlichen natürlichen oder unnatürlichen L- oder D-Aminosäuren hergestellt sind, und n ist 1, 2 oder 3.

2. Vasotocinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Q&sub1; H ist, n 3 ist und Q&sub2; H ist.

3. Vasotocinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Q&sub1; H ist, n 2 ist und Q&sub2; H ist.

4. Vasotocinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Q&sub1; H ist, n 3 ist und Q&sub2; Alanyl ist.

5. Vasotocinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Q&sub1; Glycyl ist, n 3 ist, und Q&sub2; H ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Vasotocinderivat nach Anspruch 1 als aktiven Bestandteil in Kombination mit pharmazeutisch geeigneten Additiven und/oder Verdünnungsmitteln enthält.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Zubereitung, die sich für parenterale Verabreichung eignet, vorliegt.

8. Pharmazeutisthe Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer für intranasale Verabreichung geeigneten Lösung vorliegt.