DE3880632T2

DE3880632T2 - Küvette.

Info

Publication number: DE3880632T2
Application number: DE88311059T
Authority: DE
Inventors: Richard Lewis C O Eas Columbus; Jeffrey Lawrence Helfer; Johannes Jacobus Porte; Jeffrey Allen Wellman
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2008-11-24
Also published as: US4902624A; EP0318255A3; EP0318255B1; DE3880632D1; JPH0569585B2; EP0318255A2; JPH01266858A

Description

Diese Erfindung behandelt Küvetten, in denen Reaktionen zwischen in der Küvette enthaltenen Flüssigkeiten ablaufen, und zwar insbesondere Reaktionen, die genau kontrollierte Temperaturen, begrenzte Probenmengen und eine rasche Änderung der Flüssigkeitstemperatur erfordern.
Obwohl diese Erfindung nicht auf Küvetten beschränkt ist, die bei der Nukleinsäurevermehrung eingesetzt werden, wird ihr Hintergrund in diesem Zusammenhang beschrieben.
Die Nukleinsäurevermehrung läuft im allgemeinen in den folgenden (in Fig. 1 dargestellten) Schritten ab:
1) Falls DNA vermehrt werden soll, wird eine vollständige DNA-Doppelhelix wahlfrei unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme chemisch exzidiert, um den betreffenden Abschnitt zu isolieren.
2) Eine Lösung aus dem isolierten Nukleinsäureteil < hier: DNA) und Nukleotiden wird erhitzt und über einen Zeitraum von beispielsweise nicht mehr als 10 Minuten auf 92ºC - 95ºC gehalten, um die beiden Nukleinsäurestränge zu denaturieren, das heißt, uin zu bewirken, daß sie sich entwinden und voneinander trennen und eine Vorlage bilden.
3) Die Lösung wird dann durch einen Bereich mit 50ºC - 60ºC abgekühlt, um zu bewirken, daß ein Primer-Nukleinsäurestrang sich an beide Vorlagenstränge anschließt oder "anhängt". Um sicherzugehen, daß dieser Vorgang erfolgt, wird die Lösung in einem "Inkubations"-Bereich auf einer geeigneten Temperatur gehalten, wie beispielsweise auf 55ºC über 15 Sekunden.
4) Die Lösung wird dann auf etwa 70 ºC erhitzt und auf dieser Temperatur gehalten, um zu bewirken, daß ein Extensionsenzym, vorzugsweise ein thermisch stabiles Enzym wie aus Thermus aquaticus isolierte Polymerase, unter Verwendung der vorhandenen Nukleotide den an den Vorlagenstrang gebundenen Primer-Strang erweitert.
5) Das vollständige neue Strangpaar wird erneut für etwa 10 - 15 Sekunden auf 92 ºC - 95 ºC erhitzt, um die Trennung dieses Paars zu bewirken.
6) Die Schritte 3) - 5) werden dann mehrere Male wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Strängen erreicht worden ist. (Siehe beispielsweise das US-Patent 4,683,202 mit einer genaueren Beschreibung.) Je mehr Wiederholungen erfolgen, desto größer ist die Anzahl der erzeugten Nukleinsäureduplikate (hier: DNA-Duplikate). Vorzugsweise wird die gewünschte Nukleinsäurekonzentration im kürzestmöglichen Zeitraum erreicht.
Eine Küvette wird üblicherweise verwendet, um die Lösung aufzunehmen, während sie die erwähnten Temperaturbereiche durchläuft. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Küvette können die verschiedenen Phasen mehr oder weniger schnell durchlaufen werden. Ein diesbezüglich entscheidender Gesichtspunkt ist der thermische übertragungsgrad der Küvette, das heißt ihre Fähigkeit, Wärme mehr oder weniger unverzüglich zu oder von der Flüssigkeitslösung in der Küvette zu übertragen. Die Anordnung und der Wärmewiderstand der Flüssigkeitslösung selbst sind die hauptsächlichen Gesichtspunkte bezüglich der Wärmeübertragung, da Teilbereiche der Flüssigkeitslösung, die vergleichsweise weit von der Wärmequelle beziehungsweise vom Aufnehmer entfernt sind, längere Zeit benötigen, um die gewünschte Temperatur zu erreichen.
Die einfachste und erste Art einer nach dem bisherigen Stand der Technik verwendeten Küvette ist ein Reagenzglas, das einen schlechten thermischen Übertragungsgrad aufweist, a) weil die Wände der Küvette, da sie aus Glas oder Kunststoff sind, Wärmeenergie nicht gut übertragen und b) weil ein Flüssigkeitszylinder innerhalb der Flüssigkeit eine vergleichsweise schlechte Wärmeübertragung aufweist. Das heißt, daß nicht nur die Wärmeleitfähigkeit der Flüssigkeit niedrig ist, sondern daß zudem ein Flüssigkeitszylinder ein kleines Oberflächen/Volumen-Verhältnis aufweist, das bei einer Füllung von 100 ul etwa 10,6 cm&supmin;¹ (27 in&supmin;¹) beträgt.
Ein weiteres Problem bei der DNA-Vermehrung ist die Art, in der die Küvette die leichte Entnahme der Flüssigkeit nach der erfolgten Reaktion ermöglicht. Bei einem Reagenzglasaufbau ist diese Entnahme einfach möglich. Die Änderung der Küvette zur Verbesserung des thermischen übertragungsgrades kann aber die Entnahme von Flüssigkeiten einschränken.
Neuere Küvetten- oder Behälterkonstruktionen für Flüssigkeitsreaktionen sind in den US-Patenten Nr. 4,426,451, erteilt am 17. Januar 1984, und Nr. 3,691,017, erteilt am 12. September 1972, dargestellt. Im ersten dieser Patente wird kaum der Versuch unternommen, einen hohen thermischen übertragungsgrad bereitzustellen, mit Ausnahme der Tatsache, daß die Flüssigkeit als dünner Film verteilt wird, der eine schnelle Erwärmung ermöglicht, falls Wärme zur Flüssigkeit durchdringt. Die Art der Konstruktion der Küvette aus Metall oder aus einem anderen sehr wärmeleitfähigen Material wird dagegen nicht erwähnt. Da zudem der Abstand zwischen der oberen und der unteren Wand nicht 125 um übersteigt, um einen starken Kapillareffekt zu erreichen, ist die Flüssigkeitsentnahme aus einer derartigen Küvette schwierig. Bestenfalls wird wegen der starken Kapillarkraft nicht die gesamte Flüssigkeit entnommen.
Bei den Küvetten im US-Patent Nr. 3,691,017 sind mehr für die DNA-Vermehrung geeignete Merkmale vorhanden. Da der Abstand zwischen den wesentlichen Oberflächen beispielsweise 5 mm beträgt, ist die Entnahme der gesamten Flüssigkeit leichter möglich, da bei einem so großen Abstand weniger Kapillarkraft verbleibt. Zusätzlich wird eine Metallschicht auf der Außenseite der Küvette bereitgestellt, um den Kontakt zu einer Heizeinrichtung herzustellen. Diese Küvette hat aus mehreren Gründen aber keine niedrige Wärmeträgheit. Ein Grund ist, daß die wesentlichen Oberflächen, um Transparenz sicherzustellen, nicht aus Metall hergestellt sind, sondern stattdessen aus einem Isolationsmaterial. Demzufolge ist ein langer Wärmeübertragungsweg erforderlich, indem sich die Metallschicht um die Kante der Einrichtung und nur in einen Teilbereich der Küvette erstreckt. Diese thermische Weglänge überschreitet deutlich 0,5 mm, da sie weit größer ist als die Wandstärke, die jede der wesentlichen Oberflächen aufweist. So ist nur ein Teilbereich des Küvettenvolumens in direktem Kontakt mit dem metallischen WärmeenergieÜbertragungselement.
Der zweite und wichtigere Grund ist, daß die im US-Patent Nr. 3,691,017 beschriebene Küvette wegen des durch die Hohlraumgeometrie verursachten niedrigen Oberflächen/Volumen- Verhältnisses der Flüssigkeit einen hohen Wärmewiderstand aufweist. Dies wird im folgenden ausführlich besprochen.
Bis zu dieser Erfindung lag somit ein ungelöstes Problem vor hinsichtlich der Bereitstellung einer für eine Replikation von DNA-Teilen geeigneten Küvette mit schnellen Wärmeübertragungseigenschaften hinsichtlich ihrer ermittelten Wärmeträgheit bei Füllung mit einer beliebigen Flüssigkeit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das oben geschilderte Problem gelöst durch eine Thermoküvette für die gesteuerte Reaktion von Bestandteilen einer Flüssigkeit, wobei die thermische Beeinflussung in einem Temperaturbereich von mindestens 35 ºC erfolgt und die Thermoküvette mindestens eine die Flüssigkeit enthaltende Kammer mit jeweils zwei einander gegenüberliegenden Wänden umfaßt, die jeweils eine größere Berührungsfläche bilden, Seitenwände, die die einander gegenüberliegenden Wände mit einem Abstand von höchstens 0,5 mm miteinander verbinden, und Mittel zur Einführung von Flüssigkeit in die Kammer und zur Entnahme von Flüssigkeit aus der Kammer. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einander gegenüberliegenden Wände und die Seitenwände so bemessen sind, daß sie ein vorbestimmtes Oberflächen/Volumen-Verhältnis für die Kammer bestimmen, daß mindestens eine der gegenüberliegenden Wände eine vorbestimmte thermische Weglänge und einen thermischen Widerstand aufweist, derart, daß das Oberflächen/Volumen-Verhältnis, die Weglänge und der thermische Widerstand für reines Wasser, das sich in der Kammer in Berührung mit den einander gegenüberliegenden Wänden befindet, eine thermische Zeitkonstante liefern, die für ein Flüssigkeitsvolumen von höchstens 200 ul höchstens 10 sec beträgt.
Es ist vorteilhaft, wenn dieses vorbestimmte Oberflächen/Volumen-Verhältnis bei einem Füllvolumen zwischen 100 ul und 200 ul zwischen 25,6 cm&supmin;¹ (65 in&supmin;¹) und 51 cm&supmin;¹ (130 in&supmin;¹) liegt.
Vorzugsweise beträgt die erwähnte thermische Weglänge nicht mehr als 0,3 mm, und der Wärmewiderstand ist nicht größer als 0,01 ºC/Watt.
Vorzugsweise umfassen die erwähnten Mittel zur Einführung und Entnahme von Flüssigkeit eine Flüssigkeitseintrittsöffnung, einen Luftkanal und ein bewegbares Ventil, um einen Flüssigkeitsstrom wahlfrei zwischen a) entweder der Flüssigkeitseintrittsöffnung oder dem Luftkanal und b) der Kammer auszuschließen.
Ein Abschnitt des erwähnten Ventils kann drehbar in der Küvette gelagert sein, und Mittel zur Rotation dieses Ventilteils um eine Achse können ebenfalls vorhanden sein, wobei die Flüssigkeitseintrittsöffnung und der Luftkanal drehbar um die Achse ausgerichtet sind und mit dem Ventilabschnitt bei seiner Drehung so zusammenwirken, daß die Flüssigkeitseintrittsöffnung und der Luftkanal geöffnet und geschlossen werden.
Alternativ dazu kann das erwähnte Ventil innerhalb der Küvette translatorisch gelagert sein, und eine Vorspanneinrichtung kann vorhanden sein, die das Ventil in eine geschlossene Stellung vorspannt, in der die Flüssigkeitseintrittsöffnung und der Luftkanal mit der Kammer nicht mehr in einer Strömungsverbindung stehen.
Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt die Küvette eine zweite Flüssigkeit enthaltende Kammer, die zwei einander gegenüberliegende Wände sowie Seitenwände besitzt, die die beiden einander gegenüberliegenden Wände der zweiten Kammer miteinander verbinden, Mittel zur Einführung von Flüssigkeit von der ersten Kammer in die zweite Kammer und Mittel zur Entnahme der Flüssigkeit aus der zweiten Kammer, wobei die Kammern eine größere die Flüssigkeit begrenzende Fläche bilden und die größere Fläche der jeweils einen Kammer über der größeren Fläche der jeweils anderen Kammer liegt.
Es ist damit ein vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung, daß eine schnelle Wärmeenergieübertragung in die Küvette und in ihren flüssigen Inhalt und daraus heraus erfolgt, wobei die Flüssigkeit je nach Bedarf bei der gewünschten Reaktion mehrere Temperaturänderungen durchlaufen kann. Demzufolge kann eine erforderliche Anzahl von Wiederholzyklen im Vergleich zum bislang möglichen Verfahren in einem kürzeren Zeitraum durchgeführt werden.
Ein damit zusammenhängendes vorteilhaftes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine Küvette bereitgestellt wird, die eine schnelle thermische Verarbeitung von DNA-Strängen über einen Mehrbereichszyklus ermöglicht, der zahlreiche Warm/Kalt-Wiederholungen erfordert.
Ein weiteres damit zusammenhängendes vorteilhaftes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine derartige Küvette und die darin enthaltene Flüssigkeit eine reduzierte Wärmeträgheit aufweisen, so daß beim Aufwärmen oder Abkühlen der Flüssigkeit nur eine sehr geringe Verzögerung auftritt.
Ein anderes vorteilhaftes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine derartige Küvette auch die vergleichsweise einfache Entnahme des gesamten Flüssigkeitsinhalts ermöglicht, nachdem die Reaktionen abgeschlossen sind.
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist die Bereitstellung einer Küvette, in der sich der Inhalt leicht vor atmosphärischen Einflüssen schützen läßt.
Ein zusätzliches vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist die Bereitstellung einer Küvette mit zwei Kammern und mit einer minimalen Länge und Breite.
Die Erfindung wird anhand eines Beispiels unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben:
Fig. 1 ist ein Diagramm mit der Wiedergabe typischer Temperaturänderungen bei einer Küvette, in der eine DNA-Replikation erfolgt.
Fig. 2 ist eine dreidimensionale Ansicht einer gemäß der Erfindung vorbereiteten Küvette.
Fig. 3 ist eine Draufsicht der Küvette aus Fig. 2.
Fig. 4 ist eine allgemein entlang der Linie IV-IV aus Fig. 3 ausgeführte Schnittzeichnung.
Fig. 5 ist ein vergrößerter Ausschnitt, der dem in Fig. 4 eingekreisten Abschnitt der Küvette mit der Bezeichnung "V" entnommen wurde.
Fig. 6 ist eine Aufzeichnung eines tatsächlichen Zeit- Temperatur-Ansprechverhaltens einer derartigen Küvette, um deren Wärmeträgheit zu ermitteln.
Fig. 7 ist eine Aufzeichnung der Heizverlaufskurve einer derartigen Küvette anhand der Daten aus Fig. 6.
Fig. 8 und 9 sind Schnittzeichnungen ähnlich der Fig. 4, die aber zwei unterschiedliche Ausführungsformen veranschaulichen.
Fig. 10 ist eine fragmentarische Schnittzeichnung ähnlich der Fig. 4, die das Zusammenwirken von einer Pipette und einer Dichtung mit der Küvette veranschaulicht.
Fig. 11 ist eine fragmentarische Draufsicht einer anderen Ausführungsform und insbesondere des Ventilmechanismus.
Fig. 12 ist eine Schnittzeichnung, die allgemein entlang der Linie XII-XII aus Fig. 11 ausgeführt wurde.
Fig. 13 ist eine fragmentarische Draufsicht ähnlich der Fig. 11, wobei aber das Ventil um 45º gedreht ist.
Fig. 14 ist eine Schnittzeichnung ähnlich der Fig. 12, die entlang der Linie XIV-XIV aus Fig. 13 ausgeführt wurde, wobei aber das Ventil wie bei Fig. 13 angegeben gedreht ist.
Fig. 15 ist eine Schnittzeichnung ähnlich der Fig. 12, wobei aber eine weitere Ausführungsform dargestellt ist.
Fig. 16 ist eine Draufsicht einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei der einige Teile nicht dargestellt sind.
Fig. 17 ist eine Schnittzeichnung, die allgemein entlang der Linie XVII-XVII aus Fig. 16 ausgeführt wurde.
Fig. 18 ist eine Schnittzeichnung ähnlich der Fig. 17, wobei aber wiederum eine andere Ausführungsform dargestellt ist.
Fig. 19 ist eine schematische Darstellung einer Inkubationsvorrichtung, die zweckmäßig ist, um die Küvette die DNA-Verarbeitungstemperaturen durchlaufen zu lassen.
Fig. 20 ist eine Schnittzeichnung ähnlich der Fig. 17, mit einer weiteren Ausführungsform.
Fig. 21 ist eine Schnittzeichnung, die allgemein entlang der Linie XXI-XXI aus Fig. 20 ausgeführt wurde.
Die Erfindung wird im folgenden vorzugsweise für Temperaturbereiche mit mindestens 35 ºC beschrieben, die besonders für die Replikation von DNA-Strängen zweckmäßig sind. Außerdem ist dies auch zweckmäßig für alle Arten von Reaktionen flüssiger Komponenten und Reagenzien, die eine wiederholte Erhitzung und Abkühlung der Küvette erfordern, in der die Reaktion durchgeführt wird.
Richtungsangaben wie "aufwärts", "abwärts", "oberhalb" und "unterhalb" werden mit Bezug auf den vorzugsweisen Einsatz der Küvette verwendet.
In den Figuren 2-4 umfaßt eine gemäß der Erfindung konstruierte Küvette eine Flüssigkeit enthaltende Kammer 32 mit zwei einander gegenüberliegenden Wänden 34 und 36, Figur 4, die durch einen Abstand t&sub1; voneinander getrennt sind. Dieser Abstand wird durch die Seitenwände 38 und 40, Figur 3, erreicht, die an den gegenüberliegenden Enden 42 und 44 der Kammer aufeinandertreffen. Vorzugsweise haben die Seitenwände 38 und 40 eine abgestuft konkave Formgebung, so daß sie am Ende 42 in einem Winkel alpha von etwa 90º auseinandergehen und an einer Stelle auf halber Strecke zwischen den Enden 42 und 44 beginnen, wieder in einem Winkel von etwa 90 aufeinanderzutreffen. Der Abstand t&sub1;, Figur 4, ist so gewählt, daß dieser Abstand angesichts der Formgebung der Seitenwände 38 und 40 die Flüssigkeitsmenge minimiert, die bei der Entnahme der Flüssigkeit in der Küvette verbleibt. Es ist bereits bekannt, daß kapillare Abstände sich der Flüssigkeitsentnahme widersetzen. Die Dicke der Flüssigkeit zwischen den eng beabstandeten Wänden 34 und 36 ist vorzugsweise ein nicht kapillarer Abstand, das heißt ein Abstand ≥ 0,5 min und idealerweise zwischen 0,5 mm und 2,5 mm. Im einzelnen kann bei einer gegebenen Form des Flüssigkeitsbehälters die Fähigkeit des Behälters zur Entleerung bei entgegenwirkenden Faktoren wie der Kapillarkraft als Kapillarität Nca ausgedrückt werden. Die Gleichung lautet Nca = u V/γ. In dieser Gleichung ist u die Viskosität, die bei Wasserlösungen etwa 0,01 mPas (0,01 cP) beträgt. γ ist die Oberflächenspannung, die bei Wasserlösungen etwa 0,07 N/m (70 dyn/cm) beträgt. V ist die Geschwindigkeit in cm/s, ermittelt anhand des gesamten zu entleerenden Volumens, geteilt durch den Durchflußbereich des Ausgangs und geteilt durch die akzeptable Entleerungszeit. Der Geschwindigkeitsfaktor muß deshalb im einzelnen untersucht werden.
Das zu entleerende Volumen schwankt zwischen 200 ul und 100 ul. Die akzeptablen Zeiten liegen zwischen 1 s und 10 s. V liegt damit in einem Bereich zwischen höchstens 200/A 1 und mindestens 100/A 10. In Zusammenhang mit dieser Erfindung wird A als Durchflußbereich des Ausgangs mit etwa 5,2 X ¹&sup0;&supmin;³cm² angenommen. Damit liegt V zwischen etwa 1,9 cm/s und etwa 38,5 cm/s. Die Kapillarität dieser Küvette ist dann wiederum zwischen etwa 0,0003 und 0,006. Allerdings ist dies an einen nicht kapillaren Abstand gebunden, da nur ein derartiger Abstand eine solche Entleerungsgeschwindigkeit zuläßt.
Die Wände 34 und 36 stellen die größeren Oberflächen dar, die mit der Flüssigkeit in Berührung kommen. Dadurch ist ihre Oberfläche so gewählt, daß angesichts der Dicke des Abstands t&sub1; das Oberflächen/Volumen-Verhältnis für die Kammer 32 für eine hohe Wärmeenergieübertragung optimiert ist. Ein bevorzugtes Beispiel ist die offene Fläche von 2,4 cm² (0,37 in²) bei beiden Wänden 34 und 36, wobei die Oberfläche der Seitenwände eine Kontaktfläche von etwa 0,36 cm² bildet. Vorzugsweise liegt daher das Oberflächen/Volumen-Verhältnis zwischen etwa 25,6 cm&supmin;¹ (65 in&supmin;¹) und etwa 51 cm&supmin;¹ (130 in&supmin;¹) bei einem entsprechenden Füllvolumen zwischen 200 ul und 100 ul.
Ein so großes Oberflächen/Volumen-Verhältnis der Flüssigkeit bietet einen weiteren Vorteil neben der schnellen Wärmeenergieübertragung. Es bedeutet auch, daß bei einem gegebenen Volumen eine weitaus größere Oberfläche für die Beschichtung von Reagenzien verfügbar ist. Dies ist besonders wichtig bei Reagenzien, mit denen unterschiedliche Stellen der Oberfläche beschichtet werden müssen, um ihre vorzeitige Vermischung zu verhindern, das heißt die Vermischung vor dem Einspritzen von Flüssigkeit in die Kammer. Außerdem erfolgt bei diesen Reagenzien bei der Einführung von Flüssigkeit eine wirksamere Auflösung.
Wahlfrei können daher eine oder mehrere Reagensschichten 50 auf die Innenfläche der Wand 36, Figur 4, aufgetragen werden, und zwar in einer Form, die es einer oder mehreren Schichten erlaubt, eine Reaktion mit der in die Kammer 32 eingeführten Flüssigkeitsprobe einzugehen. Somit ist "ein Reagensll eine Substanz, die eine physikalische oder chemische Wechselwirkung mit der Flüssigkeitsprobe aufweist. Derartige Reagenzien können auf herkömmliche Weise aufgetragen werden, wie zum Beispiel durch Versprühen und Trocknen. Diese Reagenzien können ein Polymeraseenzym, Salze, Puffer und Stabilisatoren umfassen. Die überzugsschicht kann auch für die Replikation benötigte Primer-Paare und Dinukleotide umfassen.
Eine Flüssigkeitseintrittsöffnung 60 ist in der Wand 36 neben dem Ende 42 ausgebildet. Die Öffnung hat einen oberen Bereich 62 und einen unteren Bereich 64, der den oberen Bereich mit der Kammer 32 verbindet. Vorzugsweise ist mindestens der Bereich 62 konisch geformt, wobei es seine Abschrägung ermöglicht, eine große Anzahl unterschiedlicher konischer Pipetten P, Figur 2, dort hineinzugeben.
Am gegenüberliegenden Ende 44 ist ein Luftkanal 70 vorhanden, wobei die Anordnung der im US-Patent Nr. 4,426,451 beschriebenen ähnlich ist. Vorzugsweise läuft der Luftkanal 70 in einen Durchlaß 72, Figur 3, der an eine Position neben dem Ende 42 zurückgeführt wird, wo er in der Öffnung 74 neben der Eintrittsöffnung 60 endet.
Damit mit einer einzelnen Schließeinrichtung sowohl die Eintrittsöf fnung 60 als auch die Öffnung 74 des Luftkanals abdichtend verschlossen werden kann, sind beide Öffnungen von einem erhöht angeordneten zylinderförmigen Wulst 80 umgeben. Beliebige herkömmliche Schließeinrichtungen sind für die Verwendung mit dem Wulst 80 zweckdienlich, beispielsweise ein Stopfen 82, Figur 10. Ein derartiger Stopfen kann Außengewinde 84 aufweisen, die in die nicht dargestellten passenden Innengewinde am Wulst eingreifen, oder er kann für einen Festsitz innerhalb des Wulstes 80 konstruiert sein.
Vorzugsweise sind mit Ausnahme der im folgenden beschriebenen Wand 34 die Wände der Einrichtung aus weniger benetzbaren Materialien geformt, wie beispielsweise aus Polycarbonat-Kunststoffmaterial.
Hinsichtlich eines Gesichtspunkts dieser Erfindung ist die der Wand 36 gegenüberliegende Wand 34 mit vorbestimmter thermischer Weglänge und vorbestimmtem Wärmewiderstand konstruiert, so daß eine hohe Wärmeenergieübertragung bereitgestellt wird. Vorzugsweise ist diese Weglänge (t&sub2; in Figur 5) nicht länger als etwa 0,3 mm; und der Wärmewiderstand ist nicht größer als etwa 0,01 ºC/W. Diese Eigenschaften lassen sich leicht erreichen, indem die Wand 34 aus einem Metall wie zum Beispiel Aluminium mit etwa 0,15 min Dicke hergestellt wird. Derartiges Aluminium hat einen Wärmewiderstand R, berechnet als Dicke 1/(Wärmeleitfähigkeit K Oberfläche A), der etwa 0,003 ºC/W beträgt. (Diesen Werte können die für gewöhnliches Glas gleicher Dicke gegenübergestellt werden, das einen Wärmewiderstand von etwa 0,24 ºC/W aufweist.)
Die Wand 34 kann mit beliebigen geeigneten Mitteln an den Seitenwänden 38 und 40 befestigt werden. Ein derartiges Mittel ist eine Schicht 90, Figur 5, eines Primers, der beispielsweise aus einem herkömmlichen Hochtemperatur-Acrylklebstoff bestehen kann, gefolgt von einer Schicht 92 aus herkömmlichem Polyesterklebstoff. In einigen Fällen brauchen die Schichten 90 und 92 nicht auf der Oberfläche der Wand 34 vorzuliegen, da dadurch der Wärmewiderstand der Wand 34 erhöht und eine mögliche Beeinflussung von den in der Kammer 32 beschriebenen Reaktionen bewirkt würde. Andererseits ist offensichtlich, daß einige Reaktionen genauso nachteilig durch vorhandene Metallionen beeinflußt werden können; und bei derartigen Reaktionen bedeckt der Klebstoff die gesamte Oberfläche der Wand 34.
Bei einer Küvette, die wie oben in Zusammenhang mit den Figuren 2-4 beschrieben konstruiert ist, ergibt sich, daß sie eine Wärmeträgheit tau (τ) für die in ihr enthaltene Flüssigkeit verursacht, die 10 Sekunden nicht übersteigt. Bevorzugt werden Küvetten, bei denen f in der Größenordnung von 3-8 Sekunden liegt. In Figur 6 ist eine derartige mit Wasser gefüllte Küvette dargestellt, die entlang der Außenseite der Wand 34 erhitzt wird, wobei ihre Temperatur am Punkt Y, Figur 4, gemessen wird und eine Temperaturanstiegskurve von 28 C bis zur Endtemperatur von 103,9 ºC erzeugt wird. Die Zeit, die die darin befindliche Flüssigkeit benötigt, um eine Temperatur von 76 ºC zu erreichen (Anfangstemperatur von 28 ºC plus 63 % der Differenz (103,9 - 28)), ist der ungefähre Wert von tau (τ). Dies ergibt sich (näherungsweise) aus der bereits bekannten Temperaturanstiegsgleichung:

1) Temperatur T (t) = Endtemperatur + (Anfangstemperatur - Endtemperatur) e-t/τ

Ist das betreffende Zeitintervall t somit gleich tau, gilt e-t/τ = e&supmin;¹ ≈ 0,37. In einem solchen Fall ist T(t) (bei t = tau) die Temperatur, die der Anfangstemperatur plus 63 % von (Endtemperatur - Anfangstemperatur) entspricht. (Die abgestufte Darstellung der Daten in Figur 6 ist durch das Aufzeichnungsgerät bedingt.)
Der Wert tau für die Flüssigkeit dieser Küvette ist daher etwa 3,5 Sekunden (unter der Annahme, daß die Anstiegskurve in Figur 6 der obigen Gleichung (1) folgt, was mit hinreichend enger Annäherung der Fall ist).
Falls sich der Klebstoff der Schichten 90 und 92 über die gesamte Oberfläche der Wand 34 erstreckt, kann tau auf 7 bis 8 Sekunden verlängert werden.
Bei einem tau-Wert von etwa 3,5 s läßt sich die Temperaturanstiegskurve der gleichen Küvette unter den Bedingungen voraussagen, die dafür entsprechend dem Diagramm in Figur 1 gelten. Figur 7 gibt eine derartige Anstlegskurve wieder, wobei allgemein nur der letzte als "X" bezeichnete Abschnitt aus Figur 1 wiedergegeben ist und wobei die abgestuften Bereiche "A" die Ofen- oder Inkubatortemperaturen sind und die Kurve "B" die Temperatur des Flüssigkeitsinhalts mit tau ≈ 3 Sekunden ist. (In diesem Beispiel wurde allerdings eine Inkubatortemperatur von 37 ºC statt von 55 ºC gewählt.)
Als Vergleichsbeispiel wird auf die folgenden Eigenschaften der im US-Patent Nr. 3,691,017 beschriebenen Küvette verwiesen. Die Gesamtdicke (Spalte 8, Zeilen 42-44) beträgt 7,94 mm (5/16 in beziehungsweise 0,31 in). Der von der Flüssigkeit eingenommene Raum hat eine Dicke von 5 mm (Zeile 44, Spalte 8). Das Fenster ist 12,7 mm (1/2 in) mal 6,35 mm (1/4 in) (Zeile 45), so daß sich das Flüssigkeitsvolumen einer Flächeneinheit von einem Quadratzoll auf etwa 3,23 cm³ (0,197 in³) schätzen läßt, und die mit der Küvette in Berührung befindliche Oberfläche wird auf etwa 18 cm² (2,79 in²) geschätzt. Hierbei ergibt sich bestenfalls ein Oberflächen/Volumen-Verhältnis von lediglich etwa 5,6 cm&supmin;¹ (14,2 in&supmin;¹). Eine Kugel gleichen Inhalts hat ein S/V(-Oberflächen/Volumen)-Verhältnis von 3,27 cm&supmin;¹ (8,3 in&supmin;¹). Dies weist darauf hin, daß die Küvette in ihrem S/V-Verhältnis nur geringfügig günstiger ist als die schlechtestmögliche Anordnung (die Kugel). Zudem ist das Heizelement eine Aluminiumfolie, die von außen in die Aushöhlung hineinreichen muß, wodurch eine thermische Weglänge von deutlich mehr als 1 mm entsteht. All dies ist ein klares Indiz dafür, daß die Wärmeträgheit tau von Wasser in einer derartigen Küvette wesentlich größer als 10 s ist.
Die Verwendung von Klebstoff beim Zusammenfügen der Küvette ist nicht erforderlich. Eine nichtklebende Ausführungsform ist in Figur 8 dargestellt, bei der diejenigen Teile, die den in der vorangegangenen Ausführungsform verwendeten Teilen ähnlich sind, die gleiche Bezugsnummer unter Hinzufügung des Buchstabens "a" tragen. Die Küvette 30a umfaßt somit zwei einander gegenüberliegende Wände 34a und 36a, die mit den Seitenwänden (von denen nur 40a dargestellt ist) eine Kammer 32a definieren. Eine Flüssigkeitseintrittsöffnung 60a und ein Luftkanal 70a sind wie bei der vorangegangenen Ausführungsform vorhanden, und die Wand 34a hat die gleichen, weiter oben besprochenen Eigenschaften. Bei dieser Ausführungsform gibt es aber an keiner Stelle Klebstoffschichten zwischen der Wand 34a und der Seitenwand 40a. Stattdessen ist um den gesamten Rand der Kammer 32a zwischen der Wand 34a und der Seitenwand Dichtungsmaterial 100 aus einem Elastomer oder anderes geeignetes Dichtungsmaterial angebracht. Zusätzlich verlaufen Erhebungen 110 aus Kunststoffmaterial von den Seitenwänden ausgehend durch entsprechende Öffnungen in der Wand 34a. Die Erhebungen 110 werden dann durch Hitze oder Druck für die ortsfeste Vernietung der Wand 34a vorbereitet. Wahlfrei kann das Dichtungsmaterial 100 auch um diese Erhebungen herum verlaufen.
Wenn die Eintrittsöffnung und der Luftkanal abdichtend verschlossen sind und die Küvette erhitzt ist, baut sich in der Kammer 32 und 32a Druck auf. Vorzugsweise wird daher ein Teilbereich der Küvette, der nicht die wärmeleitfähige Wand ist, verformt, um den Druckanstieg aufzunehmen, so daß ein enger Kontakt zwischen der Reaktionsgefäßwand 34 und 34a und dem Inkubator erhalten bleibt. Im weiteren Verlauf wird durch die Verformung einer anderen Wand die Beanspruchung der Dichtung reduziert, die die wärmeleitfähige Wand in Position hält. Eine derartige Ausführungsform ist in Figur 9 dargestellt, und sie entspricht der Beschreibung und den Ansprüchen in unserer zeitgleich anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 88 311 066.3. Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, haben die gleichen Bezugszeichen, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "b" hinzugefügt wurde.
Die Küvette 30b umfaßt somit zwei einander gegenüberliegende Wände 34b und 36b, die mit den Seitenwänden (von denen nur 40b dargestellt ist) eine Kammer 32b mit einem Abstand t&sub1; definieren. Diese Teile sowie die Eintrittsöffnung 60b und der Luftkanal 70b sind wie bei allen vorangegangenen Ausführungsformen konstruiert. Um aber sicherzustellen, daß sich die Wand 34b nicht unter Druck verformt, ist die Wand 36b so konstruiert, daß sie eine geringere Biegefestigkeit aufweist als die Wand 34b. Insbesondere erfolgt dies vorzugsweise wie folgt: Falls die Wand 34b eine Aluminiumschicht in einer Dicke von etwa 0,15 mm enthält, läßt sich ihre Biegefestigkeit K im Mittelpunkt der Biegung auf der folgenden Grundlage ermitteln:
Die Durchbiegung X bestimmt sich durch die bereits bekannte Gleichung
(2) X = α Pa²/Et³
mit P = gesamte aufgelegte Last, E = Elastizitätsmodul der Platte, t = Plattendicke, a = Länge einer Seite der Platte, und α als empirischem Koeffizienten (der üblicherweise etwa 0,015 entspricht). Die Gleichung läßt sich umstellen zu
(3) P/X = Et³/αa²
Da P/X dem Verhältnis F/X gleich K entspricht, gilt
(4) K ≈ Et³/αa²
Hierdurch läßt sich K mit etwa 6,11 x 10&sup4; N/m (6,11 x 10&sup6; dyn/mm) berechnen. Soll die Wand 36b eine Biegefestigkeit haben, die geringer als dieser Wert ist, braucht lediglich eine etwa 0,3 mm dicke Schicht Polyäthylen oder Polypropylen enthalten zu sein (die Dicke t&sub3; ist die doppelte Dicke der Aluminiumwand 34b), um eine nach dem gleichen Verfahren errechnete Biegefestigkeit von etwa 8,3 x 10³ N/m (8,3 x 10&sup5; dyn/mm) zu erhalten. Bei einer solchen Konstruktion wölbt sich die Wand 36b nach oben, wenn in der Kammer 32b Druck erzeugt wird, und die Wand 34b liegt weiterhin flach am Heizelement an (gestrichelt als "E" dargestellt).
Im Betrieb wird jede der oben beschriebenen Ausführungsformen bis auf etwa 90 % ihres Füllvermögens mit einer Flüssigkeit gefüllt, die die gewünschte Probe für die Reaktion enthält, beispielsweise mit einer Lösung einer DNA-Sequenz, die vermehrt werden soll. Die Einrichtung wird dann in einen geeigneten Inkubator eingesetzt, um die erforderlichen Phasen für die Reaktion zu durchlaufen.
Gemäß eines anderen Ausführungsbeispiels der Erfindung ist ein bewegbares Ventil vorgesehen, um den Zugang zur Kammer in der Küvette selektiv zu öffnen und zu schließen. Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, haben die gleichen Bezugszeichen, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "c" hinzugefügt wurde.
In den Figuren 11-14 liegen beim Ende 42c der Kammer 32c somit sowohl die Flüssigkeitseintrittsöffnung 60c als auch der Luftkanaldurchlaß 72c nebeneinander und innerhalb des vorstehenden Wulstes 80c, Figur 11. Der obere Abschnitt 62c ist wie bei den vorangegangenen Aus führungs formen konisch geformt, so daß eine Pipette P, Figur 12, paßgenau eingeführt werden kann.
Bei dieser Ausführungsform ist aber ein Ventil vorhanden, das einen drehbaren Abschnitt 120 umfaßt, der in einer entsprechenden konisch geformten Öffnung 122, Figur 12, gelagert ist. Der drehbare Abschnitt 120 hat eine konisch geformte Außenfläche 123. Das Ventil hat eine Rotationsachse 124, die vorzugsweise konzentrisch in der Öffnung 60c angeordnet ist. Ein Griff 126 ermöglicht die manuelle oder automatische Drehung des Ventils. Sowohl die Eintrittsöffnung 60c als auch die Luftkanalöffnung 74c befinden sich im drehbaren Ventilabschnitt 120, Figuren 11 und 13.
Zur selektiven Verbindung der Öffnung 60c und der Öffnung 74c mit der Kammer 32c sind im drehbaren Abschnitt 120 zwei Wege ausgebildet. Der Weg 130 verläuft von der Öffnung 60c zu den Außenflächen 123, Figur 12, wo er sich in einem Winkel e auf dieser Oberfläche, Figur 11, öffnet. Der Weg 132 verläuft wie in Fig. 14 von der Öffnung 74c zu einem Ausgang 134 auf der Oberfläche 123. Die Höhen der Wege 130 und 132 sind bezogen auf die Kammer 32c beziehungsweise den Durchlaß 72c so bemessen, daß die Wege bei der Drehung des drehbaren Abschnitts 120 in die in Figur 13 dargestellte Position eine Strömungsverbindung mit der Kammer oder dem Durchlaß eingehen können. Wegen des bei dem Weg 130 vorliegenden Eintrittswinkels theta (θ) kann außerdem bei Bedarf der Abschnitt 120 auch in eine (nicht dargestellte) Position gedreht werden, in der nur die Eintrittsöffnung 60c in Strömungsverbindung mit der Kammer 32c steht.
Ein Endabschnitt 140 hält den drehbaren Abschnitt 120 vertikal in seiner Position und bewegt sich in einem Schlitz 144, Figur 12.
Das Eintritts- und Luftkanalventil muß nicht drehbar sein. Translatorisch gelagerte Ventile sind ebenso zweckmäßig. Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, haben die gleichen Bezugszeichen, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "d" hinzugefügt wurde.
Der Ventilabschnitt 120d ist dann in Figur 15 so am Ende 42d angeordnet, daß er sowohl die Eintrittsöffnung 60d als auch die Luftkanalöffnung 74d beinhaltet. Anders als bei der vorangegangenen Ausführungsform ist aber der Abschnitt l20d vertikal translatorisch gelagert, wobei der Endabschnitt 140d sich vertikal in einem Schlitz 144d bewegt, der keine Drehung ermöglicht. Eine Feder 150 spannt den Abschnitt 120d vor, so daß dieser normalerweise angehoben wird, um die Wege 130d und 132d bezüglich der Kammer 32d beziehungsweise des Luftkanaldurchlasses 72d zu trennen und damit die Kammer 32d für die Außenumgebung abdichtend zu verschließen. Für den Zugang zur Kammer braucht der Benutzer lediglich den Abschnitt 120d nach unten zu drücken, wie beispielsweise beim Einsetzen einer Pipette P in die Eintrittsöffnung 60d, und gegen die Feder 150 zu drücken.
Die Luftkanalöffnung 74d ist bei dieser Ausführungsform eine in der Außenfläche 123d ausgebildete Rille, die die Entlüftung des Durchlasses 72d ermöglicht, wenn der Abschnitt 120d um eine ausreichende Strecke nach unten gedrückt wird, um eine Strömungsverbindung der Kammer 32d auch mit der Öffnung 60d herzustellen.
Bei bestimmten Reaktionen ist es wünschenswert, daß die Flüssigkeit nach einer angemessenen Verweilzeit in der ersten Kammer zu einer zweiten Kammer bewegt wird. DNA-Sondenversuche erfordern beispielsweise einen weiteren einzelnen und zusätzlichen thermischen Zyklus, in dem die DNA-Sonden an die vermehrte Zielsequenz angebunden werden. Im Anschluß an den weiter oben besprochenen Temperaturzyklus bei der DNA-Vermehrung wird die DNA-Trägersubstanz mit spezifischen DNA-Sonden für die vermehrte Zielsequenz in Kontakt gebracht. Derartige Sonden können auf den Wänden eines Reaktionsbehälters aufgetragen sein, und zwar insbesondere auf den Wänden einer zweiten Kammer, der DNA-Sondenaufnahmekammer, die in den Figuren 16-17 dargestellt ist. Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, haben die gleichen Bezugszeichen, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "e" hinzugefügt wurde.
Die Küvette 30e umfaßt dann die Kammer 32e, die zwischen den beiden einander gegenüberliegenden Wänden 34e und 36e, Figur 17, mit größeren Oberflächen angeordnet ist, sowie Seitenwände 38e und 40e, Figur 16, die alle im allgemeinen den vorangegangenen Ausführungsformen ähnlich sind, mit einer Eintrittsöffnung 60e, einem Luftkanal 70e und einer Luftkanalöffnung 74e. Anders als bei den vorangegangenen Ausführungsformen befindet sich die metallische Wand 34e aber oberhalb und nicht unterhalb der Kammer 32e, Figur 17, so daß Hitze von der oberen Küvette 30e nach unten geleitet wird. (Eine nicht dargestellte Filtermembrane kann wahlfrei bei 70e angebracht werden.)
Diese Neuanordnung der Wände 34e und 36e geht auf den Umstand zurück, daß eine zweite Kammer 160 bereitgestellt wird, die unterhalb der Kammer 32e angeordnet ist. Das heißt, daß jede der beiden Kammern eine größere, die Flüssigkeit begrenzende Ebene bereitstellt und vorzugsweise wegen der einander gegenüberliegenden Wände der primären Oberfläche, die allgemein flach und in einer Ebene verlaufen, einen allgemein flachen Aufbau hat. Die größere, die Flüssigkeit begrenzende Ebene der Kammer 32e ist oberhalb der größeren, die Flüssigkeit begrenzenden Ebene der Kammer 160 angeordnet.
In Figur 17 ist ersichtlich, daß die Kammer 160 eine gegenüberliegende primäre Oberflächenwand aufweist, die als Wand 36e bezeichnet wird. Die gegenüberliegende Wand 164 ist die Wand, die die Wärmeenergieübertragung leistet, da sie im wesentlichen entsprechend der Wand 34e konstruiert ist. Die Seitenwände 166 und 168, Figur 16, sind für die Kammer 160 wie im Fall der Kammer 32e formgebend, wobei aber die Kammer 160 bezüglich der Kammer 32e um 45 gedreht ist, so daß ihr im folgenden beschriebener Luftkanal und der untere Abschnitt 64e der Eintrittsöffnung 60e sich nicht gegenseitig beeinträchtigen.
Für die Kammer 160 in Figur 16 ist ein Luftkanal und Durchlaß 170 vorhanden. Er ist ähnlich dem Luftkanaldurchlaß des Luftkanals vorangegangener Ausführungsformen konstruiert. Nicht dargestellt ist die alternative Form und Position der Luftkanalöffnung 74e, wobei die direkte Flüssigkeitsentnahme aus der Kammer 160 möglich ist, ohne daß eine Rückwärtsbewegung durch die Kammer 32e, wie in Figur 16 dargestellt, erforderlich ist.
Beim praktischen Einsatz muß die Flüssigkeit in der Kammer 32e in die Kammer 160 strömen, wie durch die Pfeile in Figur 17 dargestellt ist, indem entweder Luftdruck über die Eintrittsöffnung in die Kammer 32e eingegeben wird oder indem beispielsweise Lösungen eingespritzt werden, die wahlfreie Reagenzien für eine weitere Reaktion in der Küvette enthalten, oder indem in der Kammer 160 ein Unterdruck geschaffen wird.
Alternativ dazu können die beiden Kammern aufeinander aufliegen, wobei die Seitenwände genau zueinander ausgerichtet sind, statt um 45 versetzt zu sein. Diese Ausführungsform ist in Figur 18 wiedergegeben, wobei Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, die gleichen Bezugszeichen haben, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "f" hinzugefügt wurde.
Die Küvette 30f umfaßt dort eine obere und eine untere Kammer 32f beziehungsweise 160f, die sich eine gemeinsame Wand 36f teilen, die keine Wärmeübertragungswand ist. Der Luftkanal 70f leitet Flüssigkeit von der Kammer 32f in die Kammer 160f, und die Wände 34f und 164f leisten die erforderliche schnelle Übertragung der Wärmeenergie. Anders als bei der vorangegangenen Ausführungsform sind aber die Seitenwände (wobei 40f für die Kammer 32f dargestellt ist) bezüglich der Seitenwände der Kammer 160f (die Wand 166f ist dargestellt) ausgerichtet. Dies wird ermöglicht, indem der Wulst 80f um 90 gedreht wird, so daß die Eintrittsöffnung 60f zugänglich wird, die sich vollständig in der größeren Ebene der in der Kammer 32f enthaltenen Flüssigkeit befindet. In einer derartigen Küvette sind der Luftkanal 170f und seine Öffnung 74f in der größeren Ebene der in der Kammer 160f enthaltenen Flüssigkeit angeordnet.
Bei den beiden Ausführungsformen in den Figuren 16-18 wird der Vorteil erzielt, daß die Länge oder Breite der Küvette nicht spürbar den entsprechenden Wert der Küvette in Figur 2 übersteigt, wie es dagegen der Fall wäre, falls die beiden größeren, die Flüssigkeit begrenzenden Ebenen in einer Ebene verliefen. Nur die vertikale Dicke ist geringfügig höher, um zu ermöglichen, daß die beiden Kammern senkrecht gestapelt werden können, um eine dreidimensionale Strömung bereitzustellen.
Noch ein weiterer zweckdienlicher Aufbau ist in den Figuren 20 und 21 wiedergegeben, wobei eine dritte, Flüssigkeit enthaltende Kammer mit der erwähnten zweiten Kammer in Strömungsverbindung steht und wobei eine flüssigkeitsdurchlässige Membrane die dritte Kammer von der zweiten Kammer isoliert und trennt. Teile, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, haben die gleichen Bezugszeichen, denen zur Unterscheidung der Buchstabe "g" hinzugefügt wurde.
Die Küvette 30g umfaßt dann eine erste Kammer 32g mit einander gegenüberliegenden Wänden 34g und 36g (wobei die Wand 34g metallisch ist), Seitenwänden 38g und 40g (Figur 21) und einer Eintrittsöffnung 60g. Die Kammer 32g führt über einen Durchlaß oder Luftkanal 70g zur zweiten Kammer 160g, die in einer größeren Aufbauebene angeordnet ist, die entsprechend der Ausführungsform in Figur 16 zu der von der Kammer 32g eingenommenen größeren Aufbauebene parallel ist. Bei dieser Ausführungsform befindet sich die Kammer 160g aber über der Kammer 32g, und nicht darunter. Die Kammer 160g ist zum Teil durch die einander gegenüberliegenden Wände 162 und 136 definiert, wobei die Wand 136 bevorzugt eine gekrümmte und vorzugsweise transparente Wand wie bei der Wand 36b in der in Figur 9 dargestellten Ausführungsform ist. Vorzugsweise ist die Wand 136 auch unter die Oberfläche 137 zurückversetzt, um die Außenfläche der Wand 136 vor Kratzern zu schützen. Die Kammer 160g ist ferner durch eine flüssigkeitsdurchlässige Membrane 300 definiert, deren obere Fläche 302 in die Kammer 160g weist. Eine untere Fläche 304 der Membrane weist von der Kammer 160g weg. Zweckdienliche Materialien für diese Membrane sind beispielsweise gegossene, gewebte oder elektrooptisch hergestellte Mikrofiltermembranen. Die Seitenwände 166g und 168g, Figur 21, vervollständigen die Kammer.
Eine dritte Kammer 310 steht über die Membrane 300 in Strömungsverbindung mit der Kammer 160g, so daß die Kammer 310 durch die Membrane von den beiden anderen Kammern isoliert und getrennt ist. Vorzugsweise ist die Kammer 310 innerhalb des zwischen den Wänden 36g und 162, Figur 20, befindlichen Blocks ausgebildet, so daß die drei Kammern einen senkrechten Stapel aus (in Abwärtsrichtung) den Kammern 160g, 310 und 32g bilden. Der Luftkanaldurchlaß 170g führt von der Kammer 310 zur Luftkanalöffnung 74g, die sich wie bei vorangegangenen Aus führungs formen innerhalb des Wulstes 80g befindet. Zusätzlich verläuft ein (nicht dargestellter) Luftkanal mit einem flüssigkeitsundurchlässigen aber luftdurchlässigen Stöpsel von der Kammer 160g zum Wulst 80g in einer Position, die allgemein über dem Durchlaß 170g liegt.
Vorzugsweise ist in der Kammer 310 ein flüssigkeitsabsorbierendes Material 320 vorhanden, um die Kammer zu füllen und um möglichst mit der unteren Fläche 304 der Membrane 300 in Berührung zu treten.
Ein bevorzugter Einsatzbereich der Küvette 30g ist die Zurückhaltung und Identifizierung einer bestimmten Nukleinsäureseguenz, wie beispielsweise von einer DNA, die in der Küvette vermehrt wird. Zu diesem Zweck umfaßt die Oberfläche 302 vorzugsweise Mittel zur Zurückhaltung proteinhaltiger Materialien, die einen DNA-Strang binden können. Derartige Rückhalteproteine sind bereits bekannt und umfassen eine komplementäre Nukleotidsequenz, die sich an die gewünschte DNA-Sequenz bindet, wobei sich an dieser Sequenz geeignete Mittel zur Anbindung an die Membrane befinden. Derartige Rückhaltemittel können beispielsweise, wie es üblich ist, entweder Avidin oder Biotin sein. Der andere Teil dieses Paares ist an die Oberfläche 302 gebunden.
Das Verfahren beim Einsatz der Küvette 30g ergibt sich aus der vorstehenden Beschreibung und verläuft im allgemeinen wie folgt:
Die Kammer 32g enthält in vorbereiteter Form die meisten oder alle für die DNA-Vermehrung benötigten Reagenzien. Die DNA enthaltende Flüssigkeit wird über die Pipette P injiziert und füllt die Kammer 32g nur teilweise. Die Kappe C wird verschraubt oder auf andere Weise in ihrer Position angebracht. Die Denaturierung, die Inkubation und die Replikation laufen wie bei den anderen Ausführungsformen ab. Anschließend wird die Pipette P erneut verwendet, um in die Kammer 32g die oben besprochenen Rückhaltesonden und auch Erkennungssonden zu injizieren. Diese Erkennungssonden sind ebenfalls herkömmlicher Art und umfassen ein Protein und komplementäre Nukleotide, die sich gegenüber dem Ende, an das sich die Rückhaltesonden anschließen, an den gewählten DNA-Strang anschließen. Die Erkennungssonde umfaßt auch einen geeigneten signalerzeugenden Teil, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, der in Reaktion mit einem Leukofarbstoff ein erkennbares Signal (zum Beispiel eine Farbänderung) erzeugen kann. Die Technik zur Anbindung zweier unterschiedlicher Sonden an die gegenüberliegenden Enden 3' und 5' ist bekannt. Beispielsweise werden zweckdienliche Verfahren zur Anbindung an das 3'-Ende besprochen in "Efficient Methods for Attachment of Thiol Specific Probes to the 3' End of Synthetic Oligodeoxyribonucleotides", Band 15 von Nucleic Acids Research, S. 5305 (1987). Die Artikel, in denen die Anbindung an das 5'-Ende besprochen werden, sind sehr zahlreich, so daß der folgende Aufsatz lediglich ein repräsentatives Beispiel ist: "Introduction of 5' Terminal Functional Groups.....", Band 164 von Analytical Biochemistry, S. 336 (1987). Es ist leicht ersichtlich, daß entweder das 3'-Ende oder das 5'-Ende zur Anbindung einer der beiden Sonden verwendet wird und daß das andere Ende benutzt wird, um die jeweils andere der beiden Sonden anzubinden.
Alternativ dazu können die Erkennungssonde und die Rückhaltesonde in einer Sonde vereint und beispielsweise unter Verwendung des im erwähnten Artikel aus Analytical Biochemistry geschilderten Verfahrens nur am 5'-Ende angebunden sein.
Die Küvette, die jetzt beide Sonden sowie die vermehrte DNA enthält, wird bewegt oder geschüttelt, um den Mischvorgang zu unterstützen.
Anschließend wird der Teilabschnitt "X" des in Figur 1 wiedergegebenen Zyklus wiederholt, um zu bewirken, daß die beiden Sonden sich an getrennte DNA-Stränge anschließen.
Im Anschluß an diesen Schritt wird die noch in der Kammer 32g befindliche Flüssigkeit über den Durchlaß 70g nach oben in die Kammer 160g bewegt. Diese Druckbewegung wird erreicht, indem über die Pipette P entweder zusätzliche Flüssigkeit oder Luft injiziert wird oder indem an der Luftkanalöffnung 74g Unterdruck angelegt wird. Bei Verwendung einer Flüssigkeit wird eine neutrale Lösung < die keine aktiven Bestandteile enthält) benutzt. In der Kammer 160g kann die Inkubation der Flüssigkeit erfolgen, wobei vorzugsweise die Luftkanalöffnung 74g durch die Kappe C verschlossen wird.
Anschließend wird die gesamte Flüssigkeit durch die Membrane 300 in das absorbierende Material 320 eingezogen. Dies erfolgt durch einen zusätzlich eingeblasenen Luftstoß, durch Unterstützung der natürlichen Strömung der Flüssigkeit durch die Membrane 300, durch Anlegen von Unterdruck an der Öffnung 74g oder durch die Kapillarkraft des absorbierenden Materials 320. Zu diesem Zeitpunkt sind die Rückhalte- und die Erkennungssonde infolge des Replikationteils des Zyklusabschnitts X an den DNA-Strang angebunden, und die Rückhaltesonde wird an der Oberfläche 302 der Membrane festgehalten. DNA-Stränge, die die Rückhaltesonde verfehlen, passieren die Membrane 300 und werden vom Material 320 absorbiert.
Der abschließende Schritt ist die Injektion einer Flüssigkeit in die Kammern 32g und 160g, die einen Leukofarbstoff oder eine andere Substanz enthält, die mit der Erkennungssonde reagieren kann, die aus den an der Oberfläche 302 zurückgehaltenen DNA-Strängen herausragt. Zu den zweckmäßigen Leukofarbstoffen gehören die im US-Patent Nr. 4,089,747 beschriebenen, vorzugsweise in Verbindung mit einem Lösungspolymer wie Polyvinylpyrrolidon. Ein bevorzugtes Beispiel für den Farbstoff ist 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5- bis(4-methoxyphenyl)-imidazol, da sich hierbei etwa 1000 Farbstoffmoleküle pro 1 Molekül Meerrettich-Peroxidase ergeben.
Als Alternative zu dem vorstehenden Verfahren können auch Rückhaltesonden verwendet werden, die an ebenfalls herkömmliche Perlen angebunden sind. Diese Perlen werden so gewählt, daß ihr Durchmesser zu groß ist, um die Poren der Meinbrane 300 zu passieren.
Ein beliebiger geeigneter Inkubator ist für den Zyklus der gemäß dieser Erfindung hergestellten Küvetten durch die gewünschten Erhitzungs- und Abkühlungsschritte zweckdienlich. Vorzugsweise weist der Inkubator Phasen auf, bei denen die in Figur 21 dargestellten Temperaturen durchlaufen werden. Ein diesbezüglich geeigneter Inkubator 200 verfügt über die in Figur 19 dargestellten Stationen. Eine Vorinkubationsstation 202 besitzt Aufheizmittel, die eine Temperatur von etwa 95 ºC herstellen. Von dort wird die Küvette durch herkömmliche Druckmittel auf einen Ring 210 aus Stationen mit konstanter Temperatur geschoben, wobei die erste dieser Stationen 212 auf einer konstanten Temperatur von 55 ºC gehalten wird. Von dieser Station wird die Küvette zur Station 214 befördert und dort auf 70 ºC erhitzt. Diese Temperatur wird über einen Zeitraum aufrechterhalten, und dementsprechend weist auch die Station 216 diese Temperatur auf. Als nächstes wird in einer Kurzzeit-Denaturierungsstation 218 die gerade reduplizierte DNA denaturiert, wobei diese Station auf 95 ºC gehalten wird. In den Stationen 220-234 werden die bereits in den Stationen 212-218 ausgeführten Zyklen noch zweimal wiederholt. Nach dem Passieren der Station 234 und nach Abschluß des vollständigen Vermehrungsvorgangs bewegt ein (nicht dargestellter) herkömmlicher Übertragungsmechanismus die Küvette zur weiteren Verarbeitung vom Ring 210 weg. (Sowohl die Injektion von Flüssigkeit in die Küvette als auch die Flüssigkeitsentnahme hieraus erfolgen außerhalb dieses Zyklus, das heißt außerhalb des Inkubators 200.) Falls eine weitere Vermehrung erforderlich ist, durchläuft eine entsprechende Küvette weiterhin den Inkubator mit zusätzlichen Zyklen.

Claims

1. Thermoküvette (30; 30a; 30b; 30e; 30f; 30g) für die gesteuerte Reaktion von Bestandteilen einer Flüssigkeit, wobei die thermische Beeinflussung in einem Temperaturbereich von mindestens 35 ºC erfolgt und die Thermoküvette (30; 30a; 30b; 30e; 30f; 30g) mindestens eine die Flüssigkeit enthaltende Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) mit jeweils zwei einander gegenüberliegenden Wänden (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) umfaßt, die jeweils eine größere Berührungsfläche bilden, Seitenwände (38, 40; 40a; 40b; 38e, 40e; 40f; 38g, 40g), die die einander gegenüberliegenden Wände (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) mit einem Abstand (t&sub1;) von höchstens 0,5 mm miteinander verbinden, und Mittel (60, 62, 64; 60a; 60b; 60c, 62c; 60d; 60e, 64e; 60f; 60g) zur Einführung von Flüssigkeit in die Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) und zur Entnahme von Flüssigkeit aus der Kammer, dadurch gekennzeichnet, daß die einander gegenüberliegenden Wände (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) und die Seitenwände (38, 40; 40a; 40b; 38e, 40e; 40f; 38g, 40g) so bemessen sind, daß sie ein vorbestimmtes Oberflächen/Volumen-Verhältnis für die Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) bestimmen, daß mindestens eine der einander gegenüberliegenden Wände (34; 34a; 34b; 34e; 34f; 34g) eine vorbestimmte thermische Weglänge (t&sub2;) und einen thermischen Widerstand aufweist, derart, daß das Oberflächen/Volumen-Verhältnis, die Weglänge und der thermische Widerstand für reines Wasser, das sich in der Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) in Berührung mit den einander gegenüberliegenden Wänden (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) befindet, eine thermische Zeitkonstante liefern, die für ein Flüssigkeitsvolumen von höchstens 200 ul höchstens 10 sec beträgt.

2. Thermoküvette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vorbestimmte Oberflächen/Volumen-Verhältnis für ein Füllvolumen von 100 bis 200 ul zwischen 25,6 cm&supmin;¹ (65 in&supmin;¹) und 51 cm&supmin;¹ (130 in&supmin;¹) liegt.

3. Thermoküvette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die thermische Weglänge (t&sub2;) höchstens 0,3 mm und der thermische Widerstand höchstens 0,01º C/Watt beträgt.

4. Thermoküvette nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die einander gegenüberliegnden Wände (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) und die Seitenwände (38, 40; 40a; 40b; 38e, 40e; 4ºf; 38g, 40g) in einem solchen Abstand voneinander angeordnet sind, daß Wasser in höchstens 10 sec mit einer Kapillarität von weniger als 0,05 wirksam entnehinbar ist.

5. Thermoküvette nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand (t&sub1;) zwischen den einander gegenüberliegenden Wänden (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) in einem Bereich zwischen 0,5 mm und 2,5 mm liegt.

6. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der einander gegenüberliegenden Wände (34; 34a; 34e; 34f; 34g) als baulichen Bestandteil Aluminium in einer Dicke von höchstens 0,15 mm enthält.

7. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine ganze Fläche einer der einander gegenüberliegenden Wände (34; 34a; 34e; 34f; 34g) der Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) einen thermischen Widerstand von höchstens 0,01º C/Watt besitzt.

8. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der einander gegenüberliegenden Wände (34, 36; 34a, 36a; 34b, 36b; 34e, 36e; 34f, 36f; 34g, 36g) mit einem Reagens beschichtet ist.

9. Thermoküvette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine Wand (36; 36a; 36b; 36e; 36f; 36g) sich gegenüber der Wand (34; 34a; 34b; 34e; 34f; 34g) mit der thermischen Weglänge befindet.

10. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (60, 62, 64; 60a; 60b; 60c, 62c; 60d; 60e, 64e; 60f; 60g) zur Einführung und Entnahme von Flüssigkeit eine Einrichtung umfassen, die eine Flüssigkeitseintrittsöffnung (60; 60a; 60b; 60c; 60d; 60e; 60f; 60g) bildet.

11. Thermoküvette nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, daß eine Öffnung (80; 80e; 80f; 80g) vorgesehen ist, die größer ist als die Flüssigkeitseintrittsöffnung (60; 60a; 60b; 60c; 60d; 60e; 60f; 60g) und in der eine Schließvorrichtung (82) sitzt, die die größere Öffnung (80; 80e; 80f; 80g) abdichtet, und daß die Flüssigkeiteintrittsöffnung (60; 60a; 60b; 60c; 60d; 60e; 60f; 60g) sich innerhalb der größeren Öffnung (80; 80e; 80f; 80g) befindet.

12. Thermoküvette nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichet, daß ein Luftkanal (70, 72, 74; 70a; 70b; 72c, 74c; 72d, 74d; 70e, 74e; 70f, 74f; 70g, 74g) für die Kammer (32; 32a; 32b; 32c; 32d; 32e; 32f; 32g) vorgesehen ist.

13. Thermoküvette nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Luftkanal (70, 72, 74; 70a; 70b; 72c, 74c; 72d, 74d; 70e, 74e; 70f, 74f; 70g, 74g) an einem Punkt in die größere Öffnung (80; 80e; 80f; 80g) mündet.

14. Thermoküvette nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitseintrittsöffnung (60, 62, 64; 60a; 60b; 60c, 62c; 60d; 60e, 64e; 60f; 60g) so ausgebildet ist, daß eine Pipette oder Pipettenspitze (P) einführbar und entnehmbar ist.

15. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (60c, 62c; 60d) zur Einführung und Entnahme von Flüssigkeit eine Flüssigkeitseintrittsöffnung (60c; 60d), einen Luftkanal (74c; 74d) und ein bewegbares Ventil (120, 122, 123, 124, 130, 132; l20d, 130d, 132d, 140d, 114d, 150) umfassen, um einen Flüssigkeitsstrom wahlweise zwischen a) entweder der Flüssigkeitseintrittsöffnung (60c; 60d) oder dem Luftkanal (74c; 74d) und b) der Kammer (32c; 32d) auszuschließen.

16. Thermoküvette nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Abschnitt (120) des Ventils (120, 122, 123, 124, 130, 132) in der Thermoküvette (30c) drehbar gelagert ist und daß eine Einrichtung (126) vorgesehen ist, mittels derer der Ventilabschnitt (120) um eine Achse (124) drehbar ist und daß die Flüssigkeitseintrittsöffnung (60c) und der Luftkanal (74c) drehbar um die Achse (124) ausgerichtet sind und mit dem Ventilabschnitt (120) bei seiner Drehung so zusammenwirken, daß die Flüssigkeitseintrittsöffnung (60c) und der Luftkanal (74c) geöffnet und geschlossen werden.

17. Thermoküvette nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Ventil (120d, 130d, 132d, 140d, 114d, 150) innerhalb der Thermoküvette (30d) translatorisch gelagert ist und daß eine Vorspanneinrichtung (150) das Ventil (120d, 130d, 132d, 140d, 114d, 150) in eine geschlossene Stellung vorspannt, in der die Flüssigkeitseintrittsöffnung (60d) und der Luftkanal (74d) mit der Kammer (32d) nicht mehr in einer Strömungsverbindung stehen.

18. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine zweite, Flüssigkeit enthaltende Kammer (160; 160f; 160g), die zwei einander gegenüberliegende Wände (36e, 164; 36f, 164f; 36g) sowie Seitenwände (166, 168; 166f, 168f; 166g, 168g) besitzt, die die beiden einander gegenüberliegenden Wände (36e, 164; 36f, 164f; 36g) der zweiten Kammer miteinander verbinden, Mittel (70e; 170f; 170g) zur Einführung von Flüssigkeit von der ersten Kammer (32e; 32f; 32g) in die zweite Kammer (160; 160f; 160g) und Mittel (74e; 74f; 74g) zur Entnahme der Flüssigkeit aus der zweiten Kammer (32e; 32f; 32g), wobei die Kammern (32e, 160; 32f, 160f; 32g, 160g) eine größere, die Flüssigkeit begrenzende Fläche bilden und die größere Fläche der jeweils einen Kammer über der größeren Fläche der jeweils anderen Kammer liegt.

19. Thermoküvette nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß dieselbe Küvette kürzer und schmäler ist als eine vergleichbare Küvette, bei der die größeren Flächen in einer Ebene liegen.

20. Thermoküvette nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine dritte, Flüssigkeit enthaltende Kammer (310) vorgesehen ist, die mit der zweiten Kammer (160g) in Strömungsverbindung steht, und daß eine flüssigkeitsdurchlässige Meinbrane (300, 302, 304) die dritte Kammer (310) von der zweiten Kammer (160g) trennt.

21. Thermoküvette nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß in der dritten Kammer (310) ein flüssigkeitsabsorbierendes Material (320) vorgesehen ist.

22. Thermoküvette nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Meinbrane (300, 302, 304) Mittel vorgesehen sind, die ein proteinhaltiges Material zurückhalten, das eine DNA-Faser binden kann.

23. Thermoküvette nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß diese Rückhaltemittel entweder Avidin oder Biotin enthalten und daß an dem proteinhaltigen Material jeweils entweder Avidin oder Biotin gebunden ist.

24. Thermoküvette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Wände durchsichtig und zum Schutz vor Kratzern zurückversetzt ist.

Zeichnungsbeschriftung

FIG. 1

a TEMPERATUR (ºC)

b ZEIT (min)

c RAUMTEMPERATUR

d EXZISION (WAHLFREI)

e AUSKÜHLUNG

f (DENATURIERUNG)

g (INKUBATION)

h (REPLIKATION)

i (WIEDERHOLUNG)

FIG. 7

a TEMPERATUR (ºC)

b ZEIT (Sekunden)

c (DENATURIERUNG)

d (AUSKÜHLUNG)

e (INKUBATION)

f (AUSDEHNUNG)