Hintergrund der Erfindung
-
Die Erfindung betrifft eine Zellenhandhabungsvorrichtung
und insbesondere eine Zellenverschmelzungsvorrichtung,
die zur Durchführung einer eins-zu-eins-Verschmelzung von
Zellen geeignet ist.
-
Bei einer herkömmlichen Zellenverschmelzungsvorrichtung,
wie sie beispielsweise auf den Seiten 845 und 846 der
Sammlung der Abhandlungen der akademischen Vorlesung bei
dem Frühjahrstreffen der Japan Society of Precision
Engineering 1987 beschrieben ist, werden verschiedene Arten
von Zellen jede für sich zu Kammern geführt, die
matrixartig angeordnet sind. Die Zellen werden an
entsprechenden kleinen Schlitzen der Kammern fixiert, indem sie mit
Absorptionsdüsen absorbiert werden, um eine
Zellenverschmelzung in jeder Kammer zu bewirken.
-
Bei dem vorstehend beschriebenen Stand der Technik wird
dem Phänomen keine Beachtung geschenkt, daß eine
Zellmembran an den Wänden der Kammern haftet, wenn sie darauf
über einen langen Zeitraum ruht, so daß die
Zellenverschmelzungsrate nicht verbessert werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, die
Zellenverschmelzungsrate der Zellenhandhabungsvorrichtung dadurch zu
verbessern, daß das Anhaften der Zellmembran an den
Kammerwänden unterbunden wird, so daß Schäden an den Zellen
vermieden werden.
-
Dieses Ziel kann dadurch erreicht werden, daß für eine
kurze Zeit eine mechanische oder eine hydrodynamische
Kraft auf die Zellen, die in den Kammern durch Absorption
fixiert sind, aufgebracht wird, so daß der gleiche
Abschnitt einer Zelle nicht in Kontakt mit der Wandfläche
über einen bestimmten Zeitraum bleibt.
-
Um das Problem beim Stand der Technik zu lösen, wird eine
Kompressionsvorrichtung in dem Absorptionssystem
bereitgestellt, die unter den Kammern angeordnet ist. Diese
Kompressionsvorrichtung dient dazu, an die Zellen
periodisch einen feinen Druck anzulegen. Da dieser periodisch
aufgebrachte Druck den Absorptionsdruck überschreitet,
werden die Zellen, welche an den Schlitzen durch
Absorption fixiert worden sind, davon getrennt. Da der geringe
Druck in Form von Impulsen aufgebracht wird, werden die
Zellen nicht aus den Kammern herausgetrieben, sondern
fallen durch Absorption wieder nach unten auf die
Schlitze. Durch Wiederholung dieses Vorgangs kann verhindert
werden, daß die gleichen Zellenabschnitte in Kontakt mit
den Kammerwänden über einen langen Zeitraum verbleiben.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
-
Fig. 1 ist eine schematische Ansicht der
Zellenverschmelzungsvorrichtung gemäß einer
Ausführungsform dieser Erfindung;
-
Fig. 2A, 2B, 2C und 2D
stellen das Verhalten eines Paars von Zellen in
einer Kammer der Vorrichtung gemäß der Erfindung
dar;
-
Fig. 3 zeigt eine Wellenform, die den Druckzustand in
dem Absorptionsgefäß der erfindungsgemäßen
Vorrichtung wiedergibt, und
-
Fig. 4 ist eine schematische Ansicht der
Zellenhandhabungsvorrichtung gemäß einer weiteren
Ausführungsform dieser Erfindung.
Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
-
Eine Ausführungsform dieser Erfindung wird nun unter
Bezug auf Fig. 1 beschrieben.
-
Wie in der Zeichnung gezeigt ist, ist die Vorrichtung aus
einer Durchflußküvette 1 zum Fließenlassen von Zellen,
Kammern 5 für die jeweilige Aufnahme von Zellen, einem
Absorptionsgefäß 7 zum Fixieren und Halten der Zellen,
einem Detektor zum Sortieren der Zellen, einer Bühne
(nicht gezeigt) zum Bewegen der Kammern in eine Position
unter der Durchflußküvette, einer Absorptionspumpe 15 zum
Erzeugen eines negativen Drucks in dem Absorptionsgefäß
und einer Druckpumpe 17 zum Anlegen eines Drucks in Form
von Impulsen an das Absorptionsgefäß zusammengesetzt. An
einem Halter 10 ist ein Siliziumwafer 9, auf welchem
kleine Kammern 5 matrixartig angeordnet sind, gehalten
und in einem Behälter 11 auf einer XY-Bühne (nicht
gezeigt) angeordnet. Jede Kammer 5 hat einen quadratischen
Einlaß, dessen Seite 670 µm lang ist, eine Tiefe vom 365
µm und einen quadratischen Boden, dessen Seite 150 µm
beträgt. Der innere Raum 8 des Behälters 11 ist mit einem
Sorbitol als isotonische Lösung gefüllt, die eine Dichte
hat, welche für die Zellen 3 und 4 geeignet ist. Das
Absorptionsgefäß 7 wird dadurch begrenzt, daß der Halter
10, mit dem der die Kammern aufweisenden Wafer haftend
verbunden ist, an einem O-Ring 12 in dem stationären
Abschnitt des Behälters 11 fixiert wird. Die Zellen 3 und 4
werden in die Kammern 5 mit Hilfe der Durchflußküvette 1
gegossen, jeweils ein Paar für eine Kammer.
-
Zunächst werden die ersten Zellen 3 allein in eine
Zellenprobenflüssigkeit gelegt und zusammen mit einer
Hüllflüssigkeit in die matrixartig angeordneten Kammern 5 mit
Hilfe der Durchflußküvette 1 einzeln gegossen. In dem
Kanal der Durchflußküvette 1 ist ein Detektor 18
vorgesehen, der für ein optisches Sortieren von Zellen geeignet
ist. Der Kanal der Durchflußküvette 1 wird mit einem
Laserstrahl 2 aus einer Lichtquelle (nicht gezeigt)
bestrahlt. Der Detektor 18 empfängt den Lichtstrahl, der
von den in dem Kanal strömenden Teilchen gestreut wird,
und beurteilt, ob die Teilchen in dem Kanal die
gewünschten Zellen oder unbedeutende Teilchen, wie Staub, sind.
Wenn der Durchgang der gewünschten Zellen festgestellt
worden ist, wird die XY-Bühne durch einen CPU 19 und ein
Bühnensteuersystem 20 so angetrieben, daß eine vorher
bestimmte Kammer 5 direkt unter der Durchflußküvette 1
positioniert wird, wodurch eine der ersten Zellen 3 in
die Kammer fließen gelassen werden kann. Durch
Wiederholen dieses Vorgangs werden die ersten Zellen 3 in alle
Kammern fließen gelassen. Danach werden die zweiten
Zellen 4 allein in eine Zellenprobenflüssigkeit gelegt. Es
wird ein ähnlicher Arbeitsablauf durchgeführt. Als Folge
ist jede der Kammern mit einem Paar von Zellen 3 und 4
beschickt.
-
An dem Boden jeder Kammer 5 ist ein Schlitz 6 vorgesehen,
der eine kleinere Abmessung als die Zellen 3 und 4 hat.
Das Fluid in der Kammer wird durch diesen Schlitz
absorbiert.
Als Folge werden die Zellen 3 und 4 in jeder
Kammer durch diesen Schlitz absorbiert und daran fixiert,
wie dies in Fig. 2A gezeigt ist. Nimmt man an, daß der
Druck in dem oberen Abschnitt der Kammer Pa ist, kann die
Differenz des Absorptionsdrucks Pa - Po geeignet auf 50
bis 200 Pa eingestellt werden. Der Absorptionsdruck wird
auf einen vorher bestimmten Wert mit Hilfe der
Absorptionspumpe 15 und eines Druckreglers 14 eingestellt. Das
Beschicken jeder Kammer mit einem Paar von Zellen, wie es
bisher beschrieben wurde, kann auch mit bekannten
Vorrichtungen bewirkt werden. Es wurde jedoch klar
herausgestellt, daß, wenn nach dem Einfließenlassen die Zellen in
Kontakt mit dem Schlitz, wie es in Fig. 2A gezeigt ist,
über eine lange Zeit bleiben, die Zellenmembran
beschädigt werden kann. Um dieses Problem auszuschließen, sieht
diese Erfindung einen Mechanismus vor, der geeignet ist,
einen vorher festgelegten Druck auf das Absorptionsgefäß
7 mittels einer Druck erhöhenden Pumpe 17 aufzubringen,
um so die Zellen von jedem Schlitz um einen
mikroskopischen Abstand zu entfernen. Der Druck ΔP der Druck
erhöhenden Pumpe 17 wird auf das Absorptionsgefäß, wie in
Fig. 3 gezeigt, aufgebracht, nachdem er auf einen vorher
festgelegten Wert über einen Druckregler 16 eingestellt
worden ist. Nimmt man an, daß der Absorptionsdruck Po und
der Druck im oberen Abschnitt jeder Kammer Pa sind, so
wird das Aufbringen des Drucks periodisch derart bewirkt,
daß der Druck unter dem Kammerschlitz (Pa - Po + ΔP) ein
positiver Druck wird. Als Folge wird das Paar von Zellen
nach oben von dem Schlitz getrennt, wie es in den Figuren
2B und 2C gezeigt ist. Wenn nach dem Abtrennen der Zellen
der aufgebrachte Druck verschwindet, fällt das Paar von
Zellen nach unten auf den Schlitz durch den
Absorptionsdruck, wodurch die Zellen nahe beieinander sind. Während
das Abtrennen und die Absorption alternierend wiederholt
werden, wird ein die Verschmelzung begünstigender Effekt
auf die Atmosphäre um die Zellen herum ausgeführt, so daß
das Paar von Zellen miteinander verschmolzen wird, wie
dies in Fig. 2D gezeigt ist. Abhängig von den verwendeten
Zellen kann der Absorptions- und der
Druckaufbringungsvorgang unterbrochen werden, um die Zellenverschmelzung
zu bewirken. Insbesondere Zellen, die miteinander
verschmolzen worden sind, unterliegen Schäden für einen
bestimmten Zeitraum nach dem Verschmelzen.
Dementsprechend wird bevorzugt, daß der Absorptionsdruck auf Null
unmittelbar nach der Verschmelzung reduziert wird und daß
ein geringer positiver Druck aufgebracht wird, der es den
Zellen ermöglicht, für sich allein in der Kammer zu
schwimmen.
-
Wie oben beschrieben worden ist, werden bei dieser
Erfindung die Vorgänge der Fixierung der Zellen an den
Schlitzen und ihrer Abtrennung davon, wie es in Fig. 2A, 2B und
2C gezeigt ist, wiederholt, so daß Schäden an den Zellen,
die sonst verursacht werden könnten, wenn ihre gleichen
Abschnitte in Kontakt mit den Schlitzen während eines
langen Zeitraums verbleiben, vermieden werden können.
-
Während bei der obigen Ausführungsform die Zellen an
jedem Schlitz davon nur durch die Druckkraft abgetrennt
werden, ist es möglich, zusätzlich eine mechanische feine
Vibration einzusetzen. In diesem Fall wird gemäß der
Erfindung ein piezoelektrisches Material 13 um das
Absorptionsgefäß 7 herum angeordnet, um die Abtrennung der
Zellen von den Schlitzen zu begünstigen, indem das
Material periodisch mit Elektrizität beaufschlagt wird. Für
diesen Zweck kann alternativ ein bekannter
Ultraschallloszillator verwendet werden.
-
Zur Unterstützung des Verschmelzungseffekts kann eine
Maßnahme getroffen werden, wie die Zugabe von etwas PEG
(Polyethylenglykol), was ein Verschmelzungsbeschleuniger
ist. Die Zellenverschmelzung kann auch dadurch
unterstützt werden, daß Elektroden in der Nähe der Kammern
vorgesehen werden, um daran ein geeignetes
elektrostatisches Feld anzulegen, wodurch jedes Paar von Zellen
veranlaßt wird, durch Dielektrophorese miteinander zu
verschmelzen. Selbstverständlich können auch andere
Gestaltungen als die vorstehend beschriebenen bezüglich Form
und Material der Kammern verwendet werden.
-
Wenn auf die Zellen infolge der Differenz des
spezifischen Gewichts zwischen den Zellen und der Lösung um sie
herum ein Auftrieb wirkt, kann dieser leicht dadurch
überwunden werden, daß der Siliziumwafer 9, wie er in
Fig. 2 gezeigt ist, umgedreht wird, so daß die Kammern 5
nach unten weisen können.
-
Nun wird eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung
anhand von Fig. 4 beschrieben.
-
Bei dieser Ausführungsform ist ein Behälter vorgesehen,
der eine Wand 24, die mit einer Vielzahl von feinen
Durchgangsöffnungen 25 versehen ist, und einen Raum 28
hat, der die Wand 24 umgibt. Der von der Wand 24
gebildete innere Raum nimmt Zellen 21 und eine Lösung 22 auf,
die zur Aktivierung der Zellen geeignet ist. Der von der
Wand 24 und einer äußeren Wand 23 gebildete Raum 28 steht
mit dem Atmosphärendruck allein über eine Leckageöffnung
27 in Verbindung. Der Raum 28 ist zum Anlegen eines
geringen Drucks mit einer Druckaufbringungsöffnung 26
versehen.
-
Die Zellen 21 in dem Gefäß sinken zur Bodenwand aufgrund
des Dichteunterschieds oder werden in Kontakt mit der
Seitenwand 24 durch den Hauptstrom der Lösung gebracht.
Wenn der vorher festgelegte Druck über die
Druckaufbringungsöffnung 26 in impulsartiger Weise angelegt wird,
steigt der Druck im Raum 28 schnell an, wodurch die
Lösung veranlaßt wird, in den inneren Raum des Gefäßes
durch die Öffnungen 25 zu fließen, was es den Zellen
ermöglicht, sich von der Wand 24 getrennt zu halten. Der
Druck in dem Raum 28, der schnell angestiegen ist, wird
durch die Leckage über die Leckageöffnung 27 allmählich
reduziert. Der Rückstrom der Lösung durch die Öffnungen
25 infolge dieser Leckage kann sehr langsam dadurch
gemacht werden, daß der Querschnitt der Leckageöffnung 27
so eingestellt wird, daß ein Wieder-in-Kontakt-Bringen
der Zellen mit der Wand 24 nicht herbeigeführt wird.
Anstelle der Lösung 22 kann der Raum 28 mit einem Gas
gefüllt werden, das in den Innenraum des Gefäßes als
Schaum injiziert wird. Anstatt den Raum 28 mit Druck zu
beaufschlagen, kann eine Saugwirkung auf den Innenraum
des Behälters ausgeübt werden, in welchem die Zellen 21
so angeordnet sind, daß der Druck darin niedriger als der
Atmosphärendruck werden kann, wodurch die Lösung dazu
gebracht wird, durch die Öffnungen 25 zu strömen.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Zellen, die in
Paaren in den Kammern angeordnet sind, darin gehalten
werden, ohne in Kontakt mit den Kammerwänden während
eines langen Zeitraums zu stehen, und ohne daß sie aus
den Kammern herausgelangen können, wodurch eine
Handhabung der Zellen ohne Beschädigung möglich wird.