DE3872875T2

DE3872875T2 - Verfahren zur herstellung von liposomen.

Info

Publication number: DE3872875T2
Application number: DE8888902213T
Authority: DE
Inventors: Keisuke Sakaguchi; Kazuhiko Suzuki
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2008-02-27
Also published as: EP0357773B1; EP0357773A1; US5049391A; EP0357773A4; DE3872875D1; AU1364888A; AU608304B2; WO1988006437A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Liposomen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen mit einer ihrem Inneren einverleibten wäßrigen Lösung.
Weiterhin betrifft die Erfindung neue hämoglobinhaltige Liposomen (im folgenden als "Hämosomen" bezeichnet) mit einer in ihrem Inneren befindlichen hochkonzentrierten wäßrigen Hämoglobinlösung.
Liposomen sind geschlossene Bläschen aus Lipiddoppelschichten mit dazwischenbefindlichen wäßrigen Räumen. Biologische Membranen sind vermutlich von Lipidbimolekularstruktur. Aus diesem Grunde werden Liposomen in großem Umfang bei der Untersuchung physiochemischer Eigenschaften der Biomembran als Modellmembran eingesetzt. In wäßrigen Räumen oder in Phospholipiddoppelschichten von Liposomen können die verschiedensten Substanzen untergebracht werden. Die Liposomen werden mit den Zellen verschmolzen oder in die Zellen eingebaut, so daß sie auch als Träger zur Abgabe einer Substanz an den lebenden Körper eingesetzt werden können. Untersuchungen mit Liposomen decken die verschiedensten Gebiete einschließlich der Biologie, der Medizin, und der Pharmazie ab. Es wurden auch bereits Untersuchungen bezüglich ihrer Einsatzmöglichkeit als Träger zur Abgabe von Sauerstoff oder eines Antikrebsmittels, zum immunologischen Einsatz, für eine Zellenwechselwirkung oder zum Einsatz als Arzneimittelabgabesystem und dergleichen durchgeführt.
Darüber hinaus dürften sich Hämosomen erwartungsgemäß als künstliche Erythrozythen mit hoher Sauerstofftransportkapazität, Sicherheit und Oxyditätsstabilität einsetzen lassen.

Hintergrundtechnologie

Wie bereits ausgeführt, werden Liposomen auf den verschiedensten Gebieten eingesetzt.
Aus der EP 0 107 559 ist beispielsweise ein Verfahren zum Homogenisieren einer Dispersion hydratisierter lipidartiger lamellarer Phasen durch Dispergieren einer lipidartigen Phase oder einer lipidartigen lamellaren Phase in einer Dispergierflüssigkeit und anschließendes Homogenisieren der erhaltenen Dispersion durch Einspeisen derselben unter einem Druck von 10.000 bis 70.000 kPa in einen Durchflußkanal geringer Breite bekannt.
Nach den bekannten Verfahren ließen sich jedoch keine Liposomen zur Herstellung von Liposomen mit einer in deren Inneres eingearbeiteten hochviskosen wäßrigen Lösung gewinnen. Zu den bekannten Verfahren zur Herstellung von Liposomen gehören sogenannte Filmverfahren, ein Netzmittelentfernungsverfahren und ein Umkehrphasenverdampfungsverfahren. Bei dem Filmverfahren wird auf der Innenwandfläche eines Gefäßes ein getrockneter dünner Film aus liposomenbildenden Lipiden erzeugt, worauf eine wäßrige Lösung einer einzuarbeitenden Substanz zugegeben und danach die erhaltene Masse geschüttelt oder einer Ultraschallbehandlung unterworfen wird. Das Netzmittelentfernungsverfahren beruht auf der Entfernung von Netzmitteln bzw. oberflächenaktiven Mitteln durch Dialyse aus einer Netzmittel bzw. oberflächenaktive Mittel und Phospholipide enthaltenden wäßrigen Lösung zur Bildung von Mischmizellen. Dabei entstehen Liposomen. Bei dem Umkehrphasenverdampfungsverfahren handelt es sich um ein Verfahren, bei welchem man durch Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion durch Zusatz einer wäßrigen Lösung einer einzuarbeitenden Substanz in einer organischen Lösungsmittellösung liposomenbildender Lipide und anschließende Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Verdampfen Liposomen herstellt. Obwohl man im Rahmen dieser bekannten Verfahren dann Liposomen erhält, wenn die in ihr Inneres einzuarbeitende wäßrige Lösung eine niedrige Viskosität aufweist, wird die Ausbeute extrem niedrig, wenn sie von hoher Viskosität über 0,01 Pa·s (10 cP)(20º C) ist. In einigen Fällen werden die gewünschten Liposomen überhaupt nicht gebildet. Dadurch sind dem Einsatz von Liposomen deutliche Grenzen gesetzt. Liposomen mit einer wäßrigen Hämoglobinlösung sind beispielsweise als künstliche Erythrozythen bekannt. Wegen der Viskositätsbeschränkung kann jedoch die Hämoglobinkonzentration nicht so hoch gemacht werden wie die natürliche, 35% (g/v) betragende Hämoglobinkonzentration. Sie beträgt vielmehr nur etwa 15%, so daß die Sauerstofftransportkapazität (entsprechend) niedrig ist.
Andererseits berichteten Miller und Mitarbeiter in der US-PS 4 133 874 über nach dem sogenannten Filmverfahren hergestellte hämoglobinhaltige Liposomen. Bei diesem Verfahren erhält man das Liposom durch Auflösen liposomenbildender Lipide in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Chloroform, Abdestillieren des Lösungsmittel aus der gebildeten Lösung zur Bildung eines Lipidfilms, Zugabe einer wäßrigen Hämoglobinlösung zu diesem und anschließende Beschallung des Liposoms mit Ultraschall. Vorteilhaft an diesem Verfahren ist, daß in Folge eines lediglich kurzzeitigen Kontakts mit Sauerstoff der Abbau des Hämoglobins relativ gering gehalten werden kann. Die Sauerstofftransportfunktion ist jedoch in Folge der langsamen Oxidation des Hämeisens von Hämoglobin im Liposom während der Lagerung verlustanfällig. Obwohl Hämoglobin im Blutkörperchen mit einem Mechanismus ausgestattet ist, gemäß dem das zu dem Methämoglobin oxidierte Hämoglobin durch die Wirkung von Enzymen in die ursprüngliche Form reduziert wird, läuft dieser Mechanismus nicht ab, wenn er aus den Blutkörperchen durch Hämolyse entfernt wird. Wenn also einmal eine Denaturierung zu dem Methämoglobin stattgefunden hat, ist die Sauerstofftransportkapazität verloren.
Hämoglobin stellt eine makromolekulare Substanz eines Molekulargewichts von etwa 65.000 dar. Seine wäßrige Lösung besitzt eine hohe Viskosität. Nach den bekannten Verfahren können Liposomen mit einer wäßrigen Lösung derart hohen Molekulargewichts und derart hoher Viskosität nicht zubereitet werden, man erhält vielmehr Liposomen mit Hämoglobin in einer Konzentration von nur etwa 15%. Im Vergleich zur Hämoglobinkonzentration von etwa 35% in natürlichen Erythrozythen ist die genannte Konzentration nicht hoch genug, um Sauerstoff tragen bzw. transportieren zu können. Um nun eine Sauerstofftransportkapazität entsprechend derjenigen von Blut zu gewährleisten, läßt sich allenfalls die Konzentration an dem Hämosom erhöhen, hierdurch erhöht sich aber auch die Konzentration an dem membranbildenden Lipidmaterial. Gleichzeitig treten hierbei Sicherheitsprobleme auf. Schließlich wird auch die Viskosität der Lipidsuspension so hoch, daß die Dynamik des Blutstroms ungünstig beeinflußt wird. Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf nach Liposomen mit hochkonzentriertem Hämoglobin in ihrem Inneren.
Dieser Bedarf läßt sich nun erfindungsgemäß wie folgt befriedigen:
1. Verfahren zur Herstellung von Liposomen durch Auflösen Liposommembran bildender Lipide in einem organischen Lösungsmittel, Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung, Zugabe einer wäßrigen Lösung zum Rückstand, Schütteln des Gemischs oder Beschallung des Gemischs mit Ultraschall zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension, Ausüben eines Gasdrucks von 7.848 bis 12.750 kPa (80 bis 130 Kg/cm²) zum Hindurchtreiben des Gases durch die Suspension und anschließendes Hochdruck-Hindurchpressen der Suspension durch feine Öffnungen unter Aufrechterhalten des angegebenen Drucks mit Hilfe einer Hochdruckabgabeemulgiervorrichtung, umfassend eine übliche Gasbombe oder eine Hochdruckgasversorgung, und ein mit einer Düse mit feiner Öffnung ausgestattetes Druckgefäß.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, bei welchem die Viskosität der wäßrigen Lösung 0,01 bis 3 Pa·s (10 bis 3.000 cP)(20ºC) beträgt.
3. Verfahren gemäß Punkt 1, bei welchem das Gas aus einem Inertgas besteht.
4. Hämoglobinhaltige Liposomen, in denen eine wäßrige Hämoglobinlösung untergebracht ist, umfassend eine Liposomenmembran aus hauptsächlich hydrierten Phospholipiden eines Hydrierungsgrades von 50% oder mehr und eine wäßrige Hämoglobinlösung mit Hämoglobin in einer Konzentration von 30 bis 60% (g/v).
5. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 4, bei welchem die hydrierten Phospholipide aus hydrierten natürlichen Phospholipiden bestehen.
6. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 5, bei welchem die hydrierten natürlichen Phospholipide aus hydrierten Lecithinen bestehen.
7. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 6, umfassend hydrierte Lecithine eines Hydrierungsgrades von 80% oder mehr.
8. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 7, umfassend hydriertes Phosphatidylcholin eines Hydrierungsgrades von 80% oder mehr.
9. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 4, worin die Hämoglobinkonzentration 50% (g/v) beträgt.
10. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß einem der Punkte 4 bis 8, worin die Liposomenmembran eine für eine negative Ladung sorgende Substanz enthält.
11. Hämoglobinhaltiges Liposom gemäß Punkt 9, worin die für eine negative Ladung sorgende Substanz aus Phosphatidinsäure, Dicetylphosphat oder einer Fettsäure besteht.
Bezüglich der liposomenmembranbildenden Lipide gibt es keine speziellen Beschränkungen, es können vielmehr beliebige natürliche oder synthetische Lipide, die Liposomen bilden, verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Phospholipide. Beispiele hierfür sind Lecithine, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidinsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglyzerin, Sphingomyelin, Cardiolipin und deren in üblicher bekannter Weise hergestellte Hydrierungsprodukte. Es können auch Kombinationen derselben verwendet werden. Im Liposomenmembranbestandteil kann ein Verstärkungsmittel für die Membranstruktur, z. B. ein Sterin, und ein den Zerfall zeitlich steuerndes Mittel einer für eine elektrische Ladung sorgenden Substanz, beispielsweise Staerinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Phosphatidinsäure und Phosphatidylglyzerin, zugegeben werden. Bezüglich der in das Innere der Liposomen einzubauenden hochviskosen wäßrigen Lösung gibt es keine speziellen Beschränkungen, d. h. es können wäßrige Lösungen beliebiger chemischer Substanzen verwendet werden. Als Beispiel für solche chemische Substanzen seien neben Hämoglobin makromolekulare Verbindungen, wie β-Glucuronidase, Heparinase und α-Glucosidase, genannt.
Die Viskosität der wäßrigen Lösung hängt vom Einsatz der Liposomen und von der Natur des Soluten ab. Erfindungsgemäß wird üblicherweise eine wäßrige Lösung einer Viskosität im Bereich von 0,01 bis 3 Pa·s (10 cP bis 3.000 cP)(20ºC) verwendet. Obwohl erfindungsgemäß auch eine wäßrige Lösung einer Viskosität von 0,01 Pa·s (10 cP oder darunter) (20º C) verwendet werden kann, läßt sich diese auch im Rahmen der bekannten Herstellungsverfahren einsetzen. Zur Herstellung künstlicher Erythrozyten wird vorzugsweise eine wäßrige Hämoglobinlösung in einer Konzentration von 30 bis 60% (g/v) einer Viskosität von 0,01 bis 3 Pa·s (10 bis 3.000 cP)(20ºC) verwendet.
Die erfindungsgemäßen Liposomen erhält man durch Auflösen liposomenmenbranbildender Lipide in einem organischen Lösungsmittel, Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung, Zugabe einer wäßrigen Lösung zu dem Rückstand, Schütteln oder Beschallen (mit Ultraschall) der Mischung zur Bildung einer gleichmäßigen Suspensiom, Ausüben eines Gasdrucks auf die Suspension, um das Gas durch die Suspension durchtreten zu lassen und anschließend die Hochdruckabgabe der Suspension durch feine Öffnungen.
Die Stufen bis zur Zubereitung einer gleichmäßigen Suspension im Rahmen des geschilderten Verfahrens entsprechen einschlägigen Schritten im Rahmen des zuvor geschilderten und als Filmverfahren bekannten Verfahrens zur Herstellung von Liposomen. Sie werden in üblicher bekannter Weise durchgeführt. Das organische Lösungsmittel wird entsprechend spezieller Einsatzarten der Liposome gewählt, üblicherweise handelt es sich hierbei um Chloroform, Ethanol oder dergleichen.
Vorzugsweise bedient man sich eines Inertgases, wie Stickstoff oder Argon, zur Druckapplikation, wenn die wäßrige Lösung eine abbauanfällige Substanz enthält oder der Hydrierungsgrad der Phospholipide niedrig ist.
Die Druckeinwirkung auf die erhaltene Suspension erfolgt in einem mit einer Düse mit feinen Öffnungen ausgestatteten Druckgefäß mittels eines Inertgases (beispielsweise Stickstoff oder Argon). Ein angemessener Druck beträgt 7.848 bis 12.750 kPa (80 bis 130 kg/cm²). Nachdem das Inertgas die Suspension vollständig durchdrungen hat, erfolgt die Suspensionsabgabe aus den Düsen.
Die Stufe der Hochdruckabgabebehandlung der Suspension erfolgt durch ein- bis mehrmalige Abgabe der Suspension durch die Öffnungen mittels einer Hochdruckabgabeemulgiervorrichtung, vorzugsweise einer Gasdruck-Hochdruckabgabevorrichtung, unter Aufrechterhalten des angegebenen Drucks. In dieser Stufe wird die Suspension, durch die das Inertgas durchgetreten ist, durch rasches Expandieren des Gases unter Druck zur Bildung von Liposomen kräftig emulgiert. Eine Abgabe unter höherem Druck läßt Liposomen geringerer Teilchengrößen entstehen. Nicht festgehaltene Materialien werden aus den erhaltenen Liposomen in üblicher bekannter Weise ausgewaschen. Die Liposomen werden durch Ultrazentrifugieren und dergleichen isoliert.
Es sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäß benutzte Gasdruck-Hochdruckabgabeemulgiervorrichtung eine übliche Gasbombe oder eine Hochdruckgasversorgung sowie ein mit einer Düse mit feiner Öffnung ausgestattetes Druckgefäß umfaßt. Das Druckgefäß steht in Verbindung mit der Gasbombe oder der Hochdruckgasversorgung. Da das Prinzip einfach ist, läßt sich das Verfahren in verschiedensten Maßstäben von einer Kleinproduktion bis zum großtechnischen Maßstab unter Benutzung eines der zur behandelnden Menge entsprechenden Druckgefäßes durchführen. Darüber hinaus ist bei wenigen mechanischen Teilen in vorteilhafter Weise auch nur mit geringen Störungen zu rechnen.
Das Membranmaterial der erfindungsgemäßen Hämosome besteht hauptsächlich aus hydrierten Phospholipiden eines Hydrierungsgrades von 50% oder mehr.
Eine Fettsäurezusammensetzung natürlicher Phospholipide aus Sojabohnen, Eigelb und sonstigen Quellen enthält zahlreiche ungesättigte Fettsäureketten. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise hydrierte Phospholipide, bei denen 50% oder mehr der ungesättigten Fettsäureketten des natürlichen Phospholipids - vergleiche oben - mit Wasserstoff gesättigt wurden, bevorzugt.
Künstlich hergestelltes Distearoyllezithin ist in Folge Abwesenheit einer ungesättigten Fettsäure im Molekül oxidationsstabil, ist jedoch hydrierten natürlichen Lezithinen hinsichtlich ihrer Einschlußfähigkeit für Hämoglobin unterlegen. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß hydrierte Phospholipide aus einem Gemisch von Phospholipiden mit verschiedenen Fettsäuren im Molekül bestehen, während synthetisches Distearoyllecithin aus einer als Fettsäure lediglich Stearinsäure enthaltenden Einzelverbindung besteht.
Der Hydrierungsgrad in den erfindungsgemäß einsetzbaren hydrierten Phospholipiden beträgt 50% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr und, ausgedrückt als Jodzahl, nicht mehr als 30, vorzugsweise nicht mehr als 10. Ein Hydrierungsgrad unter 50% reicht für eine Verhinderung der Hämoglobinoxidation nicht aus. Beispiele für das hydrierte Phospholipid sind die genannten Hydrierungsprodukte von Lecithinen, Phosphatidylethanolamin, Phophatidylinosit, Phosphatidylserin, Phosphatidylglyzerin, Sphingomyelin, Cardiolipin und dergleichen nach üblichen bekannten Verfahren hergestellte Produkte. Besonders bevorzugt sind hydrierte natürliche Lecithine, die man durch Hydrieren von Sojabohnenlecithin, Eigelblecithin, Maislecithin, Baumwollsaatöllecithin, Rapsöllecithin und dergleichen erhält.
Der Hydrierungsgrad wird wie folgt bestimmt: Die Fettsäureketten hydrierter Phospholipide werden nach dem von Jhum und Mitarbeiter (J. Am. Oil Chem. Soc. , 132 (1982)) beschriebenen Verfahren in Methylester übergegeführt und danach durch Gas/Flüssigchromatographie zur Ermittlung der Jodzahl aus der Fettsäurezusammensetzung analysiert. Die Jodzahl des nichthydrierten Phospholipids wird in entsprechender Weise ermittelt, worauf der Hydrierungsgrad aus dem Verhältnis der Jodzahl des letzteren zur Jodzahl ersterer hydrierter Phospholipide errechnet wird.
Dem Membranmaterial der erfindungsgemäßen Hämosomen kann ein Sterin, wie Cholesterin oder Cholestan, zugesetzt werden, um die Membran zu verstärken. Zur Verhinderung einer Liposomenaggregation kann eine für eine negative Ladung sorgende Substanz, beispielweise Phophatidinsäure, eine höhere Fettsäure oder Dicetylphosphat, zugegeben werden. Wenn dem Membranmaterial ferner ein Antioxidationsmittel, wie Tocopherol (Vitamin E), zugegeben wird, läßt sich die Oxidation der Liposomenmembran verhindern.
Tocopherol kann pro Mol Phospholipide in einer Menge von 0,01 bis 0,1, vorzugsweise von 0,04 Mol, zum Einsatz gelangen.
Als in das Liposomeninnere einzubringendes Hämoglobin benutzt man ein Produkt, welches man durch übliches bekanntes Hämolysieren von Erythrozythen und anschließendes Ultrafiltrieren unter Verwendung einer Fraktioniermembran für Molekulargewichte von 50.000 und darunter auf eine Konzentration von 30% (g/v) oder darüber erhalten hat. Das Hämoglobin wird den Liposomen in Form einer wäßrigen Lösung in einer Konzentration von 30 bis 60% (g/v) einer Viskosität von etwa 0,01 bis 3 Pa·s (10 bis 3.000 cP)(20º C) einverleibt.
Die erfindungsgemäßen Hämosomen erhält man durch Auflösen eines Liposomenmembranmateriales, welches hauptsächlich aus dem genannten hydrierten natürlichen Phospholipid besteht, in einem organischen Lösungsmittel, Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung, Zugabe einer 30 bis 60%igen (g/v) wäßrigen Hämoglobinlösung zum Rest, Schütteln oder Beschallen (mit Ultraschall) des Gemischs zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension, Ausüben eines Drucks auf die Suspension mittels eines Inertgases, um das Inertgas durch die Suspension hindurchtreten zu lassen, und anschließende Hochdruckabgabe der Suspension durch feine Öffnungen.
Die Stufen bis zur Zubereitung der homogenen Suspension im Rahmen des geschilderten Herstellungsverfahrens entsprechen - wie oben erwähnt - dem als Filmverfahren bekannten Liposomenherstellungsverfahren mit Ausnahme der Verwendung eines hauptsächlich aus hydrierten natürlichen Phospholipiden bestehenden Membranmaterials. Diese Stufen werden in üblicher bekannter Weise durchgeführt. Als organisches Lösungsmittel gelangt üblicherweise Chloroform, Ethanol und dergleichen zum Einsatz.
Die erhaltene Suspension wird nach dem geschilderten Hochdruckabgabeverfahren behandelt, in üblicher bekannter Weise gewaschen und schließlich ultrazentrifugiert, um die gewünschten Hämosomen zu erhalten.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Beispiele und Testbeispiele näher erläutert.

Beispiel

1. Herstellung einer stromafreien Hämoglobin (SFH)-lösung

Unter Verwendung eines Antikoagulationsmittel enthaltenden Blutsammelbeutels werden aus der Vene 15 l Rindervollblut gesammelt. Das gesammelte Vollblut wird in einem geschlossenen Gefäß bei 4ºC aseptisch transportiert und gelagert. Sämtliche nachfolgenden Stufen werden aseptisch bei niedriger Temperatur durchgeführt.
Die Zentrifugenwäsche erfolgt mit physiologischer Kochsalzlösung mittels einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge, wobei 5 l rohe gewaschene Erythrozythen, von denen Blättchen, Leukozythen und Plasma entfernt wurden, erhalten wurden.
Das weitere Waschen erfolgte mit physiologischer Kochsalzlösung mittels eines Plasmascheiders eines Porendurchmessers von 0,45um. Die Hämolyse erfolgte mit 10 l hämfreien destillierten Wassers pro 5 l der gewaschenen Erythrozythen. Die Entfernung der Erythrozythenmembran und die Filtrationssterilisation erfolgten mittels eines Plasmascheiders eines Durchmessers von 0,45um bzw. eines Plasmakomponentenscheiders eines Durchmessers von 0,1um. Hierbei erhielt man etwa 12 l stromafreies Hämoglobin in einer Hämoglobinkonzentration von 8% (g/v).
Beim Ultrafiltrieren unter Verwendung einer Dialysiervorrichtung zur Dialyse TAF10W (Zellulosehohldialysevorrichtung, hergestellt von Terumo Corporation) erhält man etwa 1,8 l stromafreies Hämoglobin (SFH)-Lösung in einer Hämoglobinkonzentration von 50% (g/v).

2. Herstellung liposomenbildender Lipide

In Chloroform wurden 27,76 g gereinigten Eigelbphosphatidylcholins eines Hydrierungsgrades von 80%, 6,96 g Cholesterin und 3,75 g gereinigter Phosphatidinsäure eines Hydrierungsgrades von 80% gelöst. Die erhaltene Lipidlösung wird in einen Rundkolben gefüllt, darin zur Entfernung des Chloroforms einer Verdampfung unterworfen. Hierbei bildete sich am Kolbenboden die Lipidmembran. Zur vollständigen Entfernung des Chloroform wurde 16 h lang vakuumgetrocknet.

3. Herstellung eines SFH-Lipid-Gemischs

Der Lipidmembran werden 300 ml des bei der SFH-Herstellung erhaltenen 50% igen SFH's zugebeben. Das Gemisch wurde danach geschüttelt oder einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um eine als Ausgangsmaterial verwendete gleichmäßige Suspension zu bereiten.

4. Herstellung hämoglobinhaltiger Liposomen durch Druckabgabe mit einem Inertgas

Das Ausgangsmaterial wurde in eine Parr-Bombe (hergestellt von Parr Instrument Company, USA), bei der es sich um ein Druckgefäß mit einer Düse mit einer Öffnung handelt, gefüllt und durch Einleiten von gasförmigem Stickstoff unter einen Druck von 121750 kPa (130 kg/cm²) gesetzt. Der gasförmige Stickstoff darf sich während eines 30-minütigen Stehenlassens gründlich durch das Ausgangsmaterial verteilen. Danach wird das Ventil der Düse langsam geöffnet, um das Ausgangsmaterial unter Aufrechterhalten des Drucks von 12.750 kPa (130 kg/cm²) abzugeben.

5. Reinigung der hämoglobinhaltigen Liposomen

Das Material wird nach der Abgabe mit physiologischer Kochsalzlösung 10mal verdünnt und zur Abtrennung hämoglobinhaltiger Liposomenfällungen zentrifugiert (17.000 Upm, 30 min). Das Hämoglobin im Überstand, das an der Einkapselung nicht teilgenommen hat, wird durch Dekantieren entfernt. Danach werden die hämoglobinhaltigen Liposomenniederschläge in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, worauf die Suspension erneut zentrifugiert wird. Dieselben Maßnahmen werden so lange wiederholt, bis im Überstand kein Hämoglobin mehr nachweisbar ist.

6. Entfernen grober Teilchen

Die Suspension der hämoglobinhaltigen Liposomen nach der Reinigung wird durch ein poröses Polycarbonatfilter eines Porendurchmessers von 0,4um (hergestellt von Nuclepore Corporation, USA) filtriert, um grobe Teilchen zu entfernen.

7. Einstellung der Hämoglobinkonzentration

Man erhielt 180 ml einer Suspension in physiologischer Kochsalzlösung, die auf eine Hämoglobinkonzentration von 10% eingestellt ist.
Die Ausbeute an Hämoglobin in dieser Stufe ergibt sich aus Endhämoglobin-konzentration·Volumen an flüssigen künstlichen Erythrozythen (ml)/SFH-Konzentration·zugegebene Menge SFH (ml)·100% = (10·180/50·300)·100=12%.

Testbeispiel 1

Hämoglobinoxydation

Die gemäß dem Beispiel (Nr. 1) zubereiteten hydrierten Phospholipidhämosome, Vitamin E enthaltende nicht-hydrierte Phospholipidhämosome (Nr. 2) und nicht-hydrierte, von Vitamin E freie Phospholipidhämosome (Nr. 3) wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und bei 37º C stehengelassen. Danach wurde im Laufe der Zeit der prozentuale Anteil an Methämoglobin bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1 zeigt deutlich, daß sich bei den hydrierten Phospholipidhämosomen gemäß der Erfindung (Nr. 1) eine Oxidations- bzw. Methoumwandlungs-verhindernde Wirkung beobachten läßt.

Testbeispiel 2

Es wurde die Lipidkonzentration-senkende Wirkung der Überführung einer konzentrierten wäßrigen Hämoglobinlösung in Liposomen auf die Hämoglobinkonzentration in der Hämosomensuspension untersucht.
Das Verhältnis der Lipidkonzentration in der Hämosomensuspension: L (mg/ml)/Hämoglobinkonzentration: H (mg/ml) in dem 50% SFH-Hämosom gemäß dem Beispiel (Nr. 1), einem Hämosom aus 30% (g/v) SFH (Nr. 4) und einem Hämosom aus 15% (g/v) SFH (Nr. 5) als Vergleich, d. h. L/H, ist in Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1
Probe L/H
Nr. 1 50 % SFH-Hämosome 1,29
Nr. 4 30 % SFH-Hämosome 3,48
Nr. 5 15 % SFH-Hämosome 6,76
Aus Tabelle 1 geht hervor, daß die Wirkung einer Abnahme in der Lipidkonzentration auf die Hb-Konzentration mit steigender SFH-Konzentration deutlicher wird.

Testbeispiel 3

Es wurde der Einfluß der Überführung einer konzentrierten wäßrigen Hämoglobinlösung in Liposome auf die Viskositätsabnahme der Hämosomensuspension untersucht.
Es wurde die Viskosität einer 50%igen SFH-Hämosomensuspension (Nr. 1), einer 30%igen SFH-Hämosomensuspension (Nr. 4), bzw. einer 15%igen SFH-Hämosomensuspension (Nr. 5) bei konstanter Hämoglobinkonzentration in der Hämosomensuspension (physiologischen Kochsalzlösung) von 7% untersucht. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 2.
Aus Fig. 2 geht hervor, daß die Viskosität der Hämosomensuspension im Vergleich bei konstanter Hämoglobinkonzentration der Hämosomensuspension mit zunehmendem Gehalt an SFH immer stärker abnimmt.

Vergleichsbeispiel

Die gemäß dem Beispiel (Stufe 3 im Beispiel) erhaltene SFH-Lipid-Suspension wurde mittels einer französischen Presse (Ohtake Seisakusho) behandelt. Es wurde derselbe Effekt wie im Beispiel in Bezug auf die Teilchengröße untersucht. Bei einer Behandlung mit einem Druck von 19.620 kPa (200 kg/cm²) entstanden Liposomen, deren Teilchengröße irregulär waren. Es waren fünf Behandlungen erforderlich, um dieselbe Teilchengröße wie im Beispiel zu erreichen. Dieselben Maßnahmen wie in und nach Stufe 5 im Beispiel lieferten 154,5 ml künstlicher Erythrozythen. Die Ausbeute betrug (10·154,5 (ml)/50·300 (ml))·100(%) = 10,3%. Diese Ausbeute war schlechter als die Ausbeute im Beispiel. Im Beispiel war auch eine kürzere Behandlungsdauer erforderlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der zeitlichen Änderung der Methämoglobinmenge (%) in den Hämosomen.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Viskosität der Hämosomensuspension.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, das die folgenden Schritte umfaßt:

Auflösen von die Liposomenmembran bildenden Lipiden in einem organischen Lösungsmittel, Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung, Zugeben einer wässerigen Lösung zum Rückstand, Schütteln des Gemisches oder Beschallung mit Ultraschall zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension, Aufdrücken eines Gases auf diese Suspension mit einem Druck von 7848-12750 kPa (80-130 kg/cm²), damit das Gas die Suspension durchdringen kann, und anschließend Passieren dieser Suspension unter hohem Druck durch feine Öffnungen mit Hilfe einer Hochdruckpassieremulgiervorrichtung, die eine übliche Gasbombe oder eine Hochdruckgasversorgung und ein mit einer Düse mit feiner Öffnung ausgestattetes Druckgefäß umfaßt, wobei der gleiche Druck aufrechterhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Viskosität der wässerigen Lösung 0,01-3 Pa·s (10-3000 cP) (20º C) beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gas ein inertes Gas ist.

4. Hämoglobin enthaltende Liposome, in denen eine wässerige Lösung von Hämoglobin eingeschlossen ist und die eine hauptsächlich aus hydrierten Phospholipiden mit einem Hydrierungsgrad von 50% oder mehr zusammengesetzte Liposomenmembran und eine wässerige Hämoglobinlösung umfassen, die Hämoglobin in einer Konzentration von 30%-60% (Gew./Vol.) enthalten.

5. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 4, wobei die hydrierten Phospholipide hydrierte natürliche Phospholipide sind.

6. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 5, wobei die hydrierten natürlichen Phospholipide hydrierte Lecithine sind.

7. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 6, die hydrierte Lecithine mit einem Hydrierungsgrad von 80% oder mehr enthalten.

8. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 7, die hydriertes Phosphatidylcholin mit einem Hydrierungsgrad von 80% oder mehr enthalten.

9. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 4, wobei die Hämoglobinkonzentration 50% (Gew./Vol.) beträgt.

10. Hämoglobin enthaltende Liposome nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Liposomenmembran eine negative Ladung liefernde Substanz enthält.

11. Hämoglobin enthaltende Liposome nach Anspruch 9, wobei die negative Ladung liefernde Substanz Phosphatidsäure, Dicetylphosphat oder eine Fettsäure ist.