DE3853430T2

DE3853430T2 - Enzym-immunotestverfahren zum nachweis von hiv-antigenen in menschlichen seren.

Info

Publication number: DE3853430T2
Application number: DE3853430T
Authority: DE
Inventors: Meryl Forman; David Hofheinz; Kenneth Kortright; Song Lee; Paulette Smariga; Candie Stoner
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Coulter Corp
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-10-24
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2008-10-25
Also published as: IE61407B1; US4886742A; IL88248A0; MX168290B; EP0386136B1; ES2009368A6; KR890702038A; ZA888170B; CN1036837A; JPH03502241A; DE3853430D1; IL88248A; CA1337264C; WO1989004488A1; EP0386136A1; CN1021375C; EP0386136A4; IE883225L

Description

EINZYM-IMMUNTESTVERFAHREN ZUM NACHIVEIS VON HIV-ANTIGENEN IN MENSCHLICHEN SEREN

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung stellt ein verbessertes Immunnachweisverfahren bzw. einen verbesserten Immunassay zum Nachweis von HIV-Antigenen in einer Testprobe einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, welche zirkulierende Antikörper aufweisen kann, zur Verfügung.
Diese Erfindung stellt in einer bevorzugten Ausführungsform einen einzigartigen Immunassay zur Verfügung, welcher zum Nachweis des HIV-Virus, von HIV-Virusfragmenten oder HIV-infizierten Zellen durchgeführt werden kann. Dieser Immunassay liefert ein je nach Fall auf HIV-Antigen positives oder negatives Testergebnis mit einem größeren Ausmaß an Genauigkeit oder Empfindlichkeit und Konsistenz in einer kürzeren Zeitspanne, als dies bis heute mit einem HIV-Antigenassay realisiert wurde. Der Assay, der die Erfindung verkörpert, verwendet eine Festphasen-Assay-Methodik, in welcher ein monoklonaler Antikörper, der auf bestimmte HIV-Kernantigene spezifisch ist, auf die feste Oberfläche aufgetragen wird.

HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK

Eine HTLV III-Infektion, heute als HIV-Infektion bezeichnet, führt üblicherweise zu AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome). Berichtete steigende Zahlen an AIDS-Patienten in den Vereinigten Staaten haben dazu geführt, daß erkannt wird, daß sich die Krankheit epidemischen Verhältnissen nähert, wobei kein Heilverfahren oder Impfstoff bekannt ist. Das Auftreten von AIDS hat insbesondere in Europa und in afrikanischen Ländern der Welt zugenommen, da die Krankheit über sexuelle Tätigkeiten, Drogenmißbrauch, kontaminierte Organe bei Transplantationen und durch Bluttransfüsionen übertragen wird. Andere Stämme von HIV, wie z.B. HTLV IV, entwickeln sich durch Mutation dieses Virus.
Es sind eigene Tests auf Vorhandensein von HIV-Antikörper oder HIV-Antigen von Forschern, z.B. von Wissenschaftern am National Institute of Health (NIH),entwickelt worden. Assays zum Nachweis von HIV-Antikörper im Plasma oder Serum haben die klinische Zulassung zur Kommerzialisierung erhalten. Assays zum Nachweis von HIV-Antigen sind zur Verwendung in der Forschung bekannt, unseres Wissens nach hat aber keiner die klinische Zulassung zur Kommerzialisierung erhalten. Diese Tests analysieren getrennt und unabhängig das Plasma, das Serum oder einen Blutzellen-Kulturüberstand von gescreenten Einzelpersonen auf einen Gehalt an HIV-Antigen oder menschlichem anti-HIV-Antikörper, welcher an das HIV-Antigen bindet, siehe Anti-HIV-Testing: Screening and Confirmation Tests, Medical Laboratory Products, April 1987, S, 16-18, für einen jüngsten Ubersichtsartikel, in welchem mehrere solche getrennten Tests verglichen werden.
Bei 70-80% jener Leute, welche durch Geschlechtsverkehr, Bluttransfusionen, kontaminierte Organe bei Transplantationen oder kontaminierte Nadeln von Leuten, welche Drogen mißbrauchen, HIV ausgesetzt wurden, entwickelt sich ein menschlicher Antikörper. Die verbleibenden 20-30% der ausgesetzten Individuen, welche während einer Zeitspanne bis zu 6 Monaten keine Antikörper gegen den eindringenden Virus entwickeln, können unerkannte Träger in der Gesellschaft bleiben. Falls man daher wiksarn Blut- und Organspender, Einzelpersonen oder Blutprodukte darauf screenen muß, ob sie das sich ausbreitende AIDS enthalten, ist es unbedingt notwendig, daß der screenende Immunassay in der Lage ist, nicht nur den HIV-Antikörper sondern auch das HIV-Virus selbst und/oder infizierte Zellen, die das Virus tragen, nachzuweisen.
Bis heute begegnet man Schwierigkeiten mit falsch-positiven Ergebnissen, welche aufgrund nichtspezifischer Antikörper oder aufgrund von Antikörpern auftreten können, welche gegen Antigene in Trägerzellkulturen gerichtet sind, die verwendet werden, um Uberstände zu erhalten, die virale Partikel in ausreichenden Mengen enthalten, da es allgemein notwendig ist, die unerwünschte Empfindlichkeit früherer Tests zu überwinden.
Der Assay, der die Erfindung verkörpert, testet erfolgreich auf den Virus und auf mit Virus infizierte Zellen. Der Assay kann in einem einzigen Gefäß wie z.B. einer Mikrotiterplattenvertieftmg, durchgeführt werden. Vorzugsweise umfaßt die Testprobe des Patienten menschliches Plasma, d.h. Vollblut, von welchem anfangs alle Zellen entfernt wurden, oder Serum, d.h. Plasma, von welchem alle Gerinnungsfaktoren entfernt worden sind. Der Assay liefert durch einen Enzym-Immunassay (EIA) je nach Fall ein "positives" oder ein "negatives" Ergebnis. Die Eignung der Verwendung des Assays dieser Erfindung, die mit AIDS infizierten Patienten zu identifizieren, ist signifikant höher, als bis heute realisiert worden ist, wo ein Immunassay lediglich Antikörper auf HIV in einer physiologischen Probe, wie z.B. peripherem Blut, aufspürt. Das Testergebnis wird in etwa vier Stunden erhalten.
Lysieren viraler Konzentrate, um virale Proteine vor Anwendung einer Elektrophorese zur Verteilung viraler Proteine, d.h. Antigene, auf Polyacrylamidgel freizusetzen, ist hinsichtlich einer Western Blot-Technik zur Bestätigung der Anwesenheit von lediglich anti-HIV-Antikörpern, nicht Antigenen, bekannt und ist daher von keinem praktischen Nutzen während jener Zeitspanne, wenn keine Antikörper vorhanden sind, sogar obwohl der Patient mit HIV infiziert worden ist. Ähnlich ist die Verwendung eines viralen HIV-Lysates als Festphasenprotein, das an einen Festphasenträger, wie einer aus Polystyrol gebildeten Mikrotiterplatte, angebracht ist, bekannt, u.zw. hinsichtlich einer ELISA-Technik zum Screenen auf anti-HIV-Antikörper, nicht Antigenen, während der Zeitspanne nach einer HIV-Infektion, wenn keine Antikörper vorhanden sind. Man hat jedoch nicht erkannt, daß das Lysieren von HIV in einer Patientenblutprobe in Kontakt mit einem einzigartigen monoklonalen Antikörper, der auf eine feste Phase aufgetragen ist, in Gegenwart eines biotinylierten anti-HIV-Säugetierantikörpers eine relativ schnelle, empfindiiche quantitative Messung auf HIV-Antigene in einer einzigen Testprobe bieten kann, wie mit der vorliegenden Erfindung verwirklicht wird.
Ein Immunassay vom Sandwich-Typus und monoklonale Antikörper für das p24-Kernantigen des menschlichen T-Zellen lymphotropen Virustypus III sind von J.R. Higgins et al J. Clin. Microbiol. 24:424430 (1986) beschrieben worden.
T. Hattori et al. beschreiben in Japan J. Cancer Res. (Gann). 78:235-241 (1987) die Herstellung von drei monoklonalen Antikörpern unter Verwendung zerteilter gereinigter HIV als ein Antigen. Die Antikörper erkennen HIV-Kernantigene, die p24, p40 und p57 entsprechen.
Ferns et al. beschreiben in J. Gen. Virol. 68:1543-1551 (1987) 13 monoklonale Antikörper, welche mit HIV-Gag-Proteinen reagieren. Sieben der Antikörper reagieren mit p55 und p24. Drei reagieren mit p55 und p18. Drei reagieren nur mit p18. Keiner der 13 Antikörper reagiert mit den Hüllenproteinen gp 160 oder gp120, oder erkennt die Kernproteine p33 und p39.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird ein Enzyin-Immunassay zum Testen auf HIV-Antigen in einer Testprobe einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, wie z.B. Plasma oder Serum oder ein Zellkulturüberstand, zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Immunassay verwendet, um eine einzelne Probe auf HIV-Antigene zu Testen, wobei die verwendete Methodik jene eines Festphasenassays ist, z.B. ein Enzym-verbundener Immunsorbentassay (ELISA), welcher Mikrotiterstreifen, Polystyrolperlen oder Eisenperlen zum Beispiel als Trägermedium verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Testprobe oder die Probe mit einem vorbestimmten Volumen, wie z.B. 200 Mikroliter (ul), in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingebracht, welche mit einem besonderen monoklonalen Antikörper beschichtet worden ist, der das gleiche Epitop einer Gruppe von Kernantigenen erkennt. Ein Zellen-lysierendes Reagens wird eingebracht, und das Gemisch wird für eine ausreichende Zeitspanne bei 37ºC inkubiert. Eine Menge eines bevorzugt menschlichen anti-HIV-Antikörper/Biotin- Komplexreagens wird zugegeben und eine ausreichende Zeitspanne inkubiert. Dann wird die Probe Inkubationsverfahren unterworfen, welche ausgewählte Entwicklungsreagentien ausnützen. Der gesamte Assay ist in ungefähr vier Stunden beendet.
Der Immunassay dieser Erfindung unterscheidet sich in drei Hauptaspekten von jenem, der in der betreffenden Anmeldung beschrieben wird. Die Verwendung des sogenannten "Spikes" oder "Zusatzes" wird eliminiert. Der vorzugsweise menschliche anti-HIV-Antikörper-Biotinkomplex besitzt eine besondere Formulierung. Die feste Phase ist mit einem besonderen monoklonalen Antikörper beschichtet, der als der monoklonale Antikörper KC-57 identifiziert wird.

BESTE ART DER AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG

In der bevorzugten Ausführungsform der betreffenden Anmeldung wird ein Assay einer einzigen Probe zum gleichzeitigen Nachweis von HIV Antigen und/oder HIV-Antikorper in einer menschlichen physiologischen Testprobe, wie z.B. Plasma oder Serum, zur Verfügung gestellt. Mikrovertiefungen, wie jene einer Mikrotiterplatte mit Mikrovertiefungsstreifen, werden mit HIV Antikorper beschichtet, der von einem Serum erhalten wurde, welches hohe Titer eines anti HIV Antikorpers aufweist. Das Festphasen Trägermedium, d.h. die Mikrotiterplatte, wird für den Assay hergestellt, indem die Vertiefungen mit einem gereinigten anti-HIV-Antikörper beschichtet werden, welcher von einer hochtitrigen Säugetierserum- oder Säugetierplasmaquelle stammen, wie z.B. vom Menschen, von der Ziege oder anderen Arten.
Die Testprobe wird einer beschichteten Mikrovertiefung oder bevorzugt mehreren beschichteten Mikrovertiefüngen zugegeben, da Zweifachtests bevorzugt sind. Kontrollvertiefüngen werden für normale, d.h. Antigen- und Antikörper-negative physiologische Flüssigkeit, z.B. normales menschliches Plasma oder Serum, vorgesehen. Auch eine Antigen-positive Kontrollvertiefung wird vorzugsweise verwendet. Eine bekannte Menge eines HIV-Antigens, d.h. der "Zusatz", wird jeder Probenmikrovertiefung und jeder Kontrollvertiefung oder -vertiefüngen und der so kombinierten Probe zugegeben, und das zugegebene Antigen wird einem Lysierungspuffer ausgesetzt, um ein Auseinanderreißen des in der Testprobe vorhandenen Virus in seine Komponententeile sicherzustellen. Nach einer einfachen Inkubation bei Körpertemperatur wird die Mikrotiterplatte gewaschen, um Material zu entfernen, welches das Signal-produzierende System stören könnte, und das abgefangene Antigen wird als nächstes mit dem anti-HIV-Antikörper, welcher mit dem Biotin konjugiert worden ist, reagieren gelassen. Nach einer anschließenden Inkubation mit Streptavadin/Peroxidase-Reagens wird eine Farbentwicklung des gebundenen Enzyms unter Verwendung eines geeigneten Substrates durchgeführt. Die erhaltenen optischen Dichten sind proportional zur relativen Menge an HIV-Antigen und/oder anti-HIV-Antikörper, welche in der Testprobe und in der Antigen-positiven Kontrolle oder ihrem Fehlen in der Testprobe und in den Kontrollen auftreten.
Wie üblich, werden der mit Antikörper beschichtete Festphasenträger und im allgemeinen alle Reagentien, die zum Ausführen eines Assays notwendig sind, in Kit-Form zur Verfügung gestellt. In der Praxis der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein solcher Kit:
eine Mikrotiterplafte aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen, wobei die Vertiefungen mit einem anti-HIV-Antikörper beschichtet sind;
einen Vorrat an Plattenabdeckungen;
einen Lysierungspuffer;
ein "Zusatz"-Antigenreagens;
ein Antigenverdünnungsmittel;
ein anti-HIV-Antikörper-Biotinreagens;
ein Biotinreagens-Verdünnungsmittel;
Streptavidin/Meerrettichperoxidase(HRPO)-Konjugat;
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Reagens;
TMB-Substratpuffer;
Kontrolle mit normalem menschlichen Plasma;
Kontrolle mit normalem menschlichen Serum;
Antigen-positive Kontrolle (50 pg Antigen pro 20 ul);
10 x Puffer zum Waschen;
Wasserstoffperoxidlösung; und
Stopplösung.

Reagentienglossar

Es ist allgemein erforderlich, daß die Reagentien vorher hergestellt werden, so daß sie bei den zugehörigen Schritten beim Ausführen des beispielhaften bevorzugten Immunassayverfahrens verfügbar sind. Diese Schritte sind wie folgt:

Lysierungspuffer

Peroxid-freier Octylphenolpoly(ethylenglycolether) z.B. Triton X-100, 5%
Boehringer Mannheim Biochemicals
Polyoxyethylensorbitonmonolaurat, z.B. Tween 20, Sigma Chemicals Co. 2%
Natriumethylmercurithiosalicylat, z.B. Thiomersal, Sigma Chemical Co. 0,05%
Farbstoffe FDC Blau Nr. 1 0,9mg/ml
Destilliertes Wasser Q.S. 11

Antigenreagens

Ein HIV-Antigengehalt, der ausreicht, wenn mit Antigen-Verdünnungsmittel verdünnt wurde, einen Zusatz von 50 Pikogramm HIV-Antigen pro 20 ul verdünntes Reagens zur Verfügung zu stellen. Die Konzentration an Antigen im Zusatz kann auf Basis eines P24-Äquivalents unter Verwendung eines P24 Radioimmunassays (RIA) von DuPont bestimmt werden.

Antigen-Verdünnungsmittel:

Protease-freies Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter 1,0%
Salzlösung (PBS)
Natriumazid 0,1%
Farbstoff, FDC Rot Nr. 3 0,5mg/ml

anti-HIV-Antikörper-Biotinreagens:

Menschlicher anti-HIV-Antikörper/Biotin-Konjugat (vorzugsweise lyophilisiert)

Biotinreagens-Verdünnungsmittel: für 11

Triton X-100 0,5%
Normales menschliches Serum (hitzeinaktiviert) 0,5%
Tween 0,2%
Thiomersal 0,5%
10X PBS (10mMol Phosphat, 145 mMol NaCl, pH 7,2) 100 ml
Destilliertes Wasser Q.S. 11

Streptavidin/HRPO-Konjugat

Calbiochem-Behring Corp.

TMB-Reagens:

TMB 1m0g
DMSO (Dimethylsulfoxid) Q.S. 100,0ml

TMB-Verdünnungspuffer:

Na&sub2;HPO&sub4;.7H&sub2;O 24,13g
Zitronensäuremonohydrat 11,38g
Chloracetamid 1,00g
Destilliertes Wasser G.S. 11
pH auf 4,4 eingestellt

Stopplösung:

18 Mol konzentrierte H&sub2;SO&sub4; 100,0ml
Destilliertes Wasser 800,00 ml

Wasserstoffperoxidlösung:

30% H&sub2;O&sub2;

10 x Puffer zum Waschen (1 zu 10 verdünnt):

Tween 20 10,0ml
10X PBS 0,99 1
1% Chloracetamid 10,0g
Abhängig von der Natur der Reagentien sowie vom Protokoll wird für die Fachleute des Standes der Technik von Immunassays klar sein, daß die Konzentration der einzelnen Reagentien breit variiert werden kann, sobald erkannt worden ist, daß ein wesentlicher Aspekt dieser Erfindung im Schritt zum Zugeben eines Zusatzes ist, der aus einer bekannten Menge eines Antigens eines Einzelbindungspaares, auf welches geprüft wird, besteht.

IMMUNASSAYVERFAHREN:

Der Immunassay, welcher die Erfindung der betreffenden Anmeldung verkörpert, wird vorzugsweise in einer vertrauten Mikrotiterplattenvertiefüng ausgeführt. In der bevorzugten Ausführungsform wird eine Patientenprobe mit 200 Mikroliter (ul) getestet. Die Patientenprobe kann menschliches Plasma umfassen, welches von Vollblut stammt, aus welchem die Zellen durch Zentriftigierung entfernt worden sind, zum Beispiel Serum oder kultivierte Zellen. Die Testprobe von 200 ul wird in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingebracht, welche mit einem hitzeinaktivierten, gereinigten anti-HIV-Antikörper beschichtet wurde.
Der gereinigte anti-HIV-Antikörper wird von einem hochtitrigen Serum oder von einer hochtitrigen Plasmaquelle abgeleitet. Eine solche Quelle kann eine menschliche sein. Um eine Vertiefüng zu beschichten, wird der Säugetierantikörper, z.B. ein menschlicher anti-HIV-Antikörper, auf 2,5 Mikrogramm pro Milliliter in einem sogenannten "Auftragungspuffer" verdünnt. Der Auftragungspuffer umfaßt 250 mMol Kaliumphosphat bei pH 6,0. 250 ul des verdünnten Antikörpers werden in die Vertiefüng pipettiert und für etwa sechzehn Stunden bei 4ºC gelagert. Dann wird die Vertiefüng entleert und dreimal in einer mit Phosphat gepufferten Salz-(PBS)-Waschlösung gewaschen. Dann wird die Vertiefüng eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 330 ul eines Blockierungsreagens blockiert, welches 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Protease-frei), 5% Sucrose plus 1% Natriumethylmercurithiosalicylat in PBS, welches 1mal durch ein Filter mit 0,2 um filtriert wurde, umfaßt. Die Vertiefüng wird bis zu sechs Stunden bei 4ºC mit der Blockierungslösung bis zur Trockene gelagert. Die Vertiefing wird dann entleert, getrocknet unter schneller Anlegung eines Vakuums und bei 4ºC in einer Tasche mit einem Dryite-Trocknungsmittelbeutel gelagert.
Obwohl das Beschichtungsverfahren für eine einzelne Vertiefung beschrieben worden ist, sind herkömmliche Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen erhältlich. Auch eine Vorrichtung zum Beschichten einer Vielzahl von Vertiefüngen ist erhältlich. Der Immuntest, der die Erfindung verkörpert, kann unter Verwendung einer solchen erhältlichen Vorrichtung mit einer Vielzahl von Vertiefingen durchgeführt werden.
Zu der Testprobe von 200 ul in der Vertiefung werden 20 ul Lysierungspuffer zum Lysieren der infizierten Zellen und 20 ul menschliche Antigen-Arbeitslösung zugegeben, welche das Antigen-Reagens ist, welches mit dem Antigen-Verdünnungsmittel auf das vorgewählte 50 pg-Antigen pro 20 ul verdünnt ist. Dann wird die Vertiefüng abgedeckt und ein Mischen der Inhaltsstoffe wird eine Minute lang in einem geeigneten Schüttler vorgenommen. Dann werden die gemischten Materialien eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert.
Nach der Inkubierung wird die Vertiefüng belüftet und dreimal auf herkömmliche Weise mit Waschpuffer gewaschen. Das anti-HIV-Antikörper/Biotin, welches vorzugsweise in einem lyophilisierten Zustand vorliegt, wird rekonstituiert und mit Biotinreagens-Verdünnungsmittel auf eine 5%-Lösung verdünnt, und es werden 200 ul zur Vertiefüng zugegeben, und die Platte wird eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert.
Nach der Inkubierung wird die Vertiefung belüftet und dreimal gewaschen, wobei das Waschpufferreagens verwendet wird. Dann werden 200 ul Streptavidin/Peroxidase-Konjugat der Vertiefüng zugege ben, es wird abgedeckt und bei 37º dreißig Minuten inkubiert. Nach der Inkubierung wird die Vertiefüng beluftet und dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Dann werden 200 pl der TMB-Substratlösung in die Vertiefung eingebracht, sie wird abgedeckt und dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann werden 50 ul 2 Mol Schwefelsaure der Vertiefüng zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Dann wird die optische Dichte der Losung in der Vertiefüng an einem Mikrotiterplattenlesegerat bei einer Wellenlange von 450 Nanometer abgelesen, wobei 570 Nanometer als Bezug verwendet werden, wo eine Zweiwellenlängeneignung möglich ist. Falls die Zweiwellenlängeneignung nicht angewendet wird, kann die Platte bei beiden Wellenlängen abgelesen und die Ablesungen bei 450 Nanometer durch Subtrahieren der Ablesungen bei 570 Nanometer korrigiert werden.
Der Immunassay, der die Erfindung verkörpert, sieht vor, daß eine abgemessene Patientenprobe einschließlich einer vorbestimmten Menge eines Zusatzes eines inaktivierten viralen HIV-Antigens, welches bei einer festgelegten Pikogrammempfindlichkeit nachweisbar ist, in eine mit Antikörper beschichtete Mikrotitervertiefung eingebracht wird. Es folgen verschiedene übliche Inkubierungen, wobei vorbeschriebene menschliche Entwicklungsmittel angewendet werden, wie z.B. Biotin, welches an einen von einer Säugetierart abgeleiteten anti-HIV-Antikörper, wie zum Beispiel einer, der vom Menschen abgeleitet ist, kovalent gekoppelt ist. Dem Koppeln folgt ein Schritt zum Bilden eines mit Peroxidase konjugierten Biotin/Avidin-Komplexes, nach welchem das TMB-Substrat zugegeben wird, um eine kolorimetrische Sichtbarmachung der Reaktion vorzusehen. Ein besonders günstiger Empfindlichkeitsgrad für den Test wurde bemerkt wenn das HIV-Antikörper/Biotin-Konjugat ein Langkettenbiotin aufwies. Die Konzentration des Zusatz-Antigens und des Antigens in der Patientenprobe, welche in die Vertiefung gegeben wurde, welches Antigen an die mit dem Abfangantikörper beschichteten Wände der Vertiefung bindet, wird dann vom Anti-HIV-Antikörper, welcher biotinyliert ist, erkannt, und der Komplex dann mit der Avidin-Peroxidase und dem TMB-Substrat zur Sichtbarmachung der Umsetzung umgesetzt wird. Nach dem Stoppen der Reaktion können die EIA-Ablesungen genommen werden, um gegen die auf die Kontrolle gerichteten Ablesungen zu vergleichen.
Die von der Patiententestprobe erhaltene Ablesung wird mit den Kontrollablesungen verglichen, wie z.B. jenen, die mit normalem menschlichen Plasma, welches frei ist von HIV-Antigen, anti-HIV- Antikörper oder nicht-infektiösem Virus und dem Immunassayverfahren unterworfen wurde, erhalten werden. Wir haben den Bezugspunkt für ein Testergebnis aufgestellt, wobei wir eine Patientenprobe als eine Zunahme oder eine Abnahme von etwa 30% verwendeten. Falls daher eine Ablesung der optischen Dichte mehr als 30% von der OD des Zusatzes abnimmt, ist die Bestimmung Antikörper-positiv. Falls die Ablesung mehr als 30% zunimmt, ist die Bestimmung Antigen-positiv.
Während ein ELISA unter Verwendung einer Kombination aus einem Ligand und einem Rezeptor, d.h. ein Biotin/Avidin-Protokoll zum Vorsehen eines nachweisbaren Signals für die immunologischen Reaktionen in der bevorzugten Methodik beschrieben worden ist, wird anerkannt werden, daß zahlreiche andere Methodiken zur Sichtbarmachung der resultierenden immunologischen Reaktionen angewendet werden können. In dieser Hinsicht können andere Labels oder Marker zum Sichtbarmachen der resultierenden immunologischen Reaktionen angewendet werden, wie z.B. Radionuklide, andere Enzyme, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Enzymsubstrate, Partikel, z.B. magnetische Partikel, eine Kombination von Liganden und Rezeptoren anders als Biotin und Avidin.
Gemaß dem oben beschriebenen verbesserten ELISA Protokoll wurde zur gleichzeitigen Bestim mung in einer einzigen Testvertiefüng von sowohl einem HIV-Antigen als auch/oder einem anti-HIV- Antikorper eine Testserie durchgeführt. Die Tests wurden mit Plasma und Serum durchgeführt, welche von Blutproben stammten, die von fünf medizinischen Instituten von Patienten erhalten wurden, welche unter Verdacht standen, daß sie HIV-exponiert waren, bei welchen diagnostiziert wurde, daß sie ARC hatten oder vermutlich hatten, oder bei welchen diagnostiziert wurde, daß sie AIDS hatten. In der Testserie wurden drei Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verwendet, um 99 Assays durchzuführen.
Hinsichtlich der Mikrotiterplatte 1 wurden 32 Tests durchgeführt und 50 pg pro 20 ul Zusatz verwendet, um die Basislinie der optischen Dichte aufzustellen, welche eine optische Dichte (OD) aufwies, die gleich 0,894 ± 0,061 war. Unter Verwendung einer willkürlichen Richtlinie von 30% Abweichung in der optischen Dichte unter und über 0,894 wurde für die Zwecke des Assays aufgestellt, daß eine OD von < 0,626 anti-HIV-Antikörper-positiv und eine OD von> 1,16 HIV-Antigen-positiv gleichzusetzen ist.
Ähnlich wurden mit Bezug auf die Platte 2 34 Tests durchgeführt, und der 50 pg Zusatz hatte eine OD von 0,715 ± 0,56. Eine OD-Ablesung von < 0,500 wurde als anti-HIV-Antikörper-positiv angesehen, und eine OD von> 0,93 wurde als HIV-Antigen-positiv angesehen.
Mit der gleichen Logik wurden hinsichtlich der Platte 3 33 Tests durchgeführt, und der 50 pg Zusatz hatte eine OD von 0,655 ± 0,59, wodurch eine OD von < 0,459 als anti-HIV-Antikörper-positiv angesehen wurde und eine OD von> 0,852 als HIV-Antigen-positiv angesehen wurde.
Alle Proben wurden mittels einer anderen ELISA-Technik als jene der vorliegenden Erfindung einem Screening-Test unterworfen und wurden auch einem Bestätigungstest unterworfen, wobei eine Western-Blot-Technik zur Analyse und Identifizierung der HIV-Proteine P24 und P120 angewendet wurde, bevor der Probe ein positiver oder negativer "Treffer" zugeordnet wurde. Es wurde festgestellt, daß von den 99 Proben 70 oder 70,7% entweder auf HIV-Antigen oder auf anti-HIV-Antikörper positiv waren und daß 29 oder 29,3% auf entweder HIV-Antigen oder anti-HIV-Antikörper negativ waren. Von den 70 Proben, die positiv gefunden wurden, wurde gefunden, daß 6 Proben oder etwa 6, 1% sowohl HIV-Antigen- als auch anti-HIV-Antikörper-positiv waren. Die besondere Bedeutung des Immunassays, der die vorliegende Erfindung umfaßt, wird jedoch aus der Tatsache erkannt werden, daß gefunden wurde, daß 17 der Proben, welche "positiv" bestimmt wurden, lediglich hinsichtlich des HIV-Antigens positiv waren.
Es ist ein beträchtlicher Fortschritt im Immunassay, die Möglichkeit zu haben, eine Probe einer physiologischen Flüssigkeit in einem einzigen Testgefaß sowohl auf Antigen als auch auf Antikörper eines Einzelbindungspaares zu prüfen. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ermöglicht dies ein gleichzeitiges Screening durch Verwendung einer einzigen Testvertiefüng einer Testprobe von Plasma oder Serum von gespendetem Blut auf sowohl anti-HIV-Antikörper als auch auf HIV-Antigen oder noch bedeutender auf das Vorhandensein von lediglich HIV-Antigen. Der kritische Bedarf, gespendetes Blut, welches lediglich HIV-Antigen enthält, während der Zeitspanne zwischen der Infektion einer Person mit HIV und wenn Antikörper auf HIV entwickelt oder auf einen ausreichenden, mit einem Screening-Test nachzuweisenden Pegel entwickelt wurden, zu identifizieren, braucht kaum hervorgehoben zu werden.
Es scheint, daß die Testdaten, die als Ergebnis der durchgeführten Western-Blot-Bestätigungstests zusammengetragen wurden, angeben, daß etwa 10% der Tests, welche mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, ein falsch positives Ergebnis zeigen und daß etwa 15% eine falsche negative Bestimmung zeigen. Es wird anerkannt werden, daß der Prozentsatz an falschen Ergebnissen Faktoren zuzuschreiben sein kann, welche nicht bestimmt wurden, wie z.B. menschlichem Versagen beim Ausführen des Tests oder beim Ablesen des Ergebnisses. Der Prozentsatz an scheinbar falschen Ergebnissen ist daher nicht eine wahre Wiedergabe der Wirksamkeit des beispielhaften Testdurchgangs, der hier beschrieben wird.

BESTE ART DER AUSFÜHRUNG DIESER ERFINDUNG

Diese Erfindung wendet die einzelnen Verfahren, Reagentien und Apparate zu einem wesentlichen Ausmaß an, welches in der Anwendung, auf welche Bezug genommen wurde, beschrieben ist. Es gibt jedoch gewisse Reagentien, die verwendet und nicht verwendet werden, welche wichtige Abweichungen vom Assayprotokoll der betreffenden Anmeldung darstellen und welche zur Verwirklichung des neuen Immunassays zum Nachweis von HIV-Antigenen in einem Patienten beitragen, welcher Immunassay diese Erfindung verkörpert.
Das Festphasen-Trägermedium ist eine Mikrotiterplatte, welche für den Assay hergestellt wird, indem die Vertiefungen mit einem neuen monoklonalen Antikörper beschichtet werden, welcher ein gemeinsames Epitop bestimmter Kernantigene und keine Hüllen-HIV-Antigene in einer menschlichen physiologischen Testprobe erkennt. Dieser monoklonale Antikörper wurde aus einem Hybridom oder einer Zellinie hergestellt, welche in den Laboratorien des gemeinsamen Anmelders durch gemeinsame Erfinder, welche mit jenen dieser Assay-Erfindung identisch sind, entwickelt wurden. Der monoklonale Antikörper wird als der monoklonale Antikörper KC-57 identifiziert, welcher ein gemeinsames Epitop der HIV- Antigene P55, P24 und der Teilbruchstückprodukte P39 und P33 erkennt. Der Antikörper KC-57 bindet nicht an das Kernantigen P18 oder an irgendein anderes mit HIV assoziiertes Antigen.

HINTERLEGUNGSANGABE

Eine Zellinie, welche den monoklonalen Antikörper KC-57 produziert, welcher jenem entspricht, der in dieser Erfindung verwendet wird, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852 am 6. November 1987 gleichzeitig mit dem Einreichen dieser Anmeldung hinteriegt worden. Die Zellinie wurde mit A.T.C.C. Nr. HB 9585 bezeichnet.
Das Beschichten einer oder mehrerer Mikrotitervertiefungen mit dem monoklonalen Antikörper KC-57 wird auf im wesentlichen die gleiche Weise durchgeführt, wie sie in der betreffenden Anmeldung beschrieben ist. Der Antikörper KC-57 wird auf 2,5 Mikrogramm pro Milliliter im sogenannten "Auftragungspuffer" verdünnt. 250 Mikroliter des verdünnten monoklonalen Antikörpers wird in die Vertiefung pipettiert, gelagert, gewaschen, blockiert, getrocknet, schnell entleert und erneut, wie oben beschrieben, gelagert. Es kann eine Vielzahl von Vertiefungen beschichtet werden, wobei ein im Handel erhältliches automatisiertes Pipettiergerät verwendet wird.
Es wird eine Patientenprobe von 200 Mikroliter getestet, wobei die Probe menschliches Serum oder Plasma ist, welche von Vollblutserum oder Kulturzellen stammen. Die 200 Mikroliter-Probe wird in eine Vertiefung pipettiert, und 20 ul des Lysierungspuffers zum Lysieren der infizierten Zellen werden zugegeben. Die Vertiefung wird abgedeckt und dann eine Stunde bei 37ºC inkubiert.
Nach Inkubierung wird die Vertiefung beluftet und dreimal auf herkömmliche Weise mit einem Waschpuffer gewaschen. 200 ul eines anti HIV Antikorper/Biotin Komplex Reagens, vorzugsweise lyophilisiert, wird in einem rekonstituierten Zustand zugegeben. Der anti-HIV-Antikörper stammt vorzugsweise von einer menschlichen Quelle, d.h. ein hochtitriges Serum oder eine hochtitrige Plasmaquelle. Dieses Reagens wird auf ein vorbestimmtes Volumen rekonstituiert, so daß 200 ul des rekonstituierten Reagens in eine Vertiefung eingebracht werden können. Die Platte wird eine Stunde bei 37ºC inkubiert.
Danach wird die Vertiefung belüftet und dreimal unter Verwendung eines Waschpufferreagens gewaschen. Das Verfahren des Zugebens des Streptavidin/Peroxidase-Konjugates, das Inkubieren und das Zugeben der 200 ul der TMB-Substratlösung ist so, wie es in der betreffenden Anmeldung beschrieben ist. Dann werden 50 ul einer molaren Schwefelsäure einer Vertiefung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und dann wird die optische Dichte der Losung auf einem Mikrotiterplattenablesegerät bei einer Wellenlänge von 450 Nanometer unter Verwendung von 570 Nanometer als Referenz, wo eine Zweiwelleneignung möglich ist, abgelesen. Falls eine Zweiwellenlängeneignung nicht verwendet wird, kann die Platte bei beiden Wellenlängen abgelesen und die Ablesungen bei 450 Nanometer durch Subtrahieren der Ablesungen bei 570 Nanometer korrigiert werden.
Die genommenen EIA-Ablesungen können gegen die auf die Kontrolle gerichteten Ablesungen verglichen werden, wie z.B. jene, die erhalten wurden von normalem menschlichen Plasma oder von Serum, welches frei ist von HIV-Antigen, in einer mit dem monoklonalen Antikörper KC-57 beschichteten Vertiefung, welche als negative Kontrolle dient, oder jene, welche von einer solchen beschichteten Vertiefung erhalten werden, in welche 50 ul eines Virusantigen-Reagens eingebracht wurden. Das letztere Verfahren wurde eine positive Kontrolle vorsehen. Vorzugsweise würde der Assay, der die Erfindung verkörpert, ein Paar positiver Kontrollvertiefungen verwenden. 200 ul Patientenprobe würden in jedem der obigen Kontrollvertiefungsverfahren verwendet werden.
Wie in der betreffenden Anmeldung ausgeführt ist, ist ein ELISA-Immunassay nicht der einzige, der in dieser Erfindung angewendet werden kann. Andere Methodiken, wie sie hier aufgezählt werden, werden daher als anwendbar betrachtet. TABELLE 1 ZUSAMMENFASSUNG DES HIV-ANTIGEN-ASSAY-ERGEBNISSES HIV-NEGATIV # Gestest Anfänglich falsch positiv Wiederholbar falsch positiv Normal Rheumafaktor Bilirubin Chlamydien Toxoplasmose HSV Legionaire EBV CMV Hepatitis Mycoplasmen Subtotal HIV-POSITIV # Getestet Antigen-positiv % Positiv Diagnostiziertes AIDS* Blutbank Subtotal * Einige Proben von Patienten mit AZT-Therapie.
Bezugnehmend auf Tabelle 1 sind getestete normale und abnormale HIV-negative Serumproben angeführt und ist die Anzahl der getesteten Proben notiert. Die Gesamtzahl der getesteten Proben war 360, von welchen gesehen wurde, daß die anfänglich falschen positiven Werte mit acht in der Zahl waren. Wiederholte Tests der acht Proben zeigten an, daß sie tatsächlich negativ waren. Obwohl 25% der 12 einen Rheumafaktor enthaltenden Sera in diesem Assay anfänglich positiv waren, waren sie nicht wiederholbar. Es wird angenommen, daß das kontaminierende Material in diesen Seren einen falschen Eindruck einer hohen Häufigkeit von anfänglich positiven Ergebnissen schuf.
Hinsichtlich der angegebenen Daten HIV-POSITIV wurden Sera von 98 Menschen, von denen durch Western-Blot-Analyse bekannt war, daß sie serologisch positiv waren, sowohl asymptomatische als auch diagnostizierte AIDS-Patienten, getestet. Der Prozentsatz positiver Bestimmungen ist in jeder getesteten Serumkategorie angegeben. 44% der diagnostizierten AIDS-Proben waren auf das zirkulierende p24-Antigen positiv. In Deborah A. Paul et al., J. Med. Virol., 22:357:363 (1987) wurde gefunden, daß 69% der diagnostizierten AIDS-Patienten zirkulierendes HIV-Antigen aufweisen. Der Unterschied zwischen diesen zwei Bestimmungen kann der AZT-Therapie ("Zidovudin", früher bekannt als Azidothymidin) zugeschrieben werden, von welcher angenommen wird, daß sie für einen raschen Abfall der Pegel an zirkulierendem HIV-Antigen verantwortlich ist. Die 16% asymptomatischer Individuen, welche als positiv gefunden wurden, korrelieren gut mit der Bestimmung von 19% in Deborah A. Paul, oben. TABELLE 2 HIV-ANTIGENASSAY - PROBENERGEBNISSE MIT p24-ZUSATZ P24-Antigen-positiv Masse/200 ul Anzahl durchgeführt Anzahl positiv Berechnete Rückgewinnung (%)
Tabelle 2 gibt Daten wieder, die entwickelt wurden, um die Genauigkeit des Assays zu zeigen, der diese Erfindung verkörpert. Es wurden normales menschliches Serum und normales menschliches Serum, welchem das Kernantigen p24 zugegeben war (als "mit Zusatz" bezeichnet), getestet. Die Pegel der p24- Zusatze werden für jede Kategorie des ausgeführten Tests spezifiziert. Bei 25 Pikogramm (pg) und bei 6,25 pg pro 200 Mikroliter Zusatzpegel waren 100% positiv. Bei einem Pegel von 1,56 pg waren 87% positiv. Normales menschliches Serum war in 156 durchgeführten Assays nicht positiv. TABELLE 3 KC-57 HIV-ANTIGEN-ABFANGELISA HIV-ISOLAT REGION ISOLIERT ERGEBNISSE LAV Frankreich BAGAL New York City 1265D13 Atlanta Z34 Zaire SDR San Francisco 2153 D16 New York City 121886-1 Bethesda 1272D21 Chicago
Tabelle 3 zeigt daß der HIV-Antigenassay, welcher den monoklonalen Antikörper KC-57 als Abfangphase und den menschlichen anti-HIV-Antikörper als die Nachweisphase verwendete, alle angegebenen Stämme auf HIV-Antigengehalt positiv identifizierte. TABELLE 4 SPEZIFITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS KC-57 Infektiöses Agens # Getestet # Positiv EBV HTLVI HSVI CMV Chlamydien
Die obige Tabelle zeigt die Reaktivität des Antikörpers KC-57 gegen andere infektiöse Agentien, wenn diese im HIV-Antigenassay verwendet werden. Bei keinem dieser Agentien wird eine Reaktivität festgestellt.
Es wurden Standardkurven von Assays entwickelt, wobei normales menschliches Serum verwendet wurde, welches mit Kulturmedium versetzt war, das aus menschlichen Lymphozytenkulturen genommen wurde, welche mit zwei Isolaten von HIV, BAGAL und LAV infiziert waren, und gereinigtes Antigen p24 aus einer mit LAV-infizierten menschlichen T-Zellenlinie. Die Konzentrationen an Antigen p24 wurden unter Verwendung von p24 RIA von DuPont aufgestellt. Die Absorption (450/570) wurde bei verschiedenen Konzentrationen gemessen (p24-Äquivalent/0,2 ml Plasma), und die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt. Es wird gezeigt, daß die Empfindlichkeit für jede Präparation geringer als 10 pg/ml ist. TABELLE 5 VERGLEICH VON HIV-ISOLATEN, DIE NORMALEM MENSCHLICHEN PLASMA ZUGESETZT WURDEN Konzentration an HIV-Antigen (pg/0,2 ml) Antigen-Typus (Absorption) p24 LAV Beutel Anstieg y-Abschnitt Korrelation Empfindlichkeit (pg/0,2 ml)
Der Assay wurde verwendet, um das Antigen p24 in normalem menschlichen Plasma zu analysieren. Es wurden Daten mit sechs einzelnen Assays gesammelt, welche an getrennten Tagen gefahren wurden. Es wurde ein positiver Wert, das Zweifäche der Hintergrundabsorption, bei 1,2 pg/Vertiefung oder 6 pg/ml erhalten. Die Interassayvariation reichte von 11-26%. Die Absorption (450/570) wurde bei einer Reihe von p24-Konzentrationen gemessen, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 P24, NORMALEM MENSCHLICHEN PLASMA ZUGESETZT p24 (p/g 0,2ml) Absorption X±S.D. %CV Anstieg y-Abschnitt Korrelationskoeffizient Empfindlichkeit 6Assays

GLOSSAR DER REAGENTIENÄNDERUNGEN

ANTIGENRFAGENS

HIV-Antigengehalt, ausreichend, wenn mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnt, welcher eine Antigenreagens-Konzentration von 25 pg p24 pro 50 ul vorsieht. Eine Zugabe von 50 ul Antigenreagens zu 0,2 ml normalem menschlichen Plasma, menschlichem Serum oder Kulturmedium wird eine positive Kontrolle mit einem ungefähren Absorptionswert (450/570) von 1,00 ± 0,250 vorsehen.

BIOTINREAGENS (4 X KONZENTRAT) 125 ML

Triton X-100 2,0%
Tween 20 0,8%
Normales menschliches Serum (hitzeinaktiviert) 2,0%
Nicht-fette Trockenmilch 20,0%
Thiomersal 0,25 g
10 x PBS (100 mMol, 1,45 Mol NaCl) 50,0 ml
anti-HIV-Antikörper/Biotin-Komplex 0,3125 mg
Destilliertes Wasser QS 125,0 ml

TMB-VERDÜNNUNGSPUFFER

Na&sub2;HPO&sub4;.7H&sub2;O 24,13 g
Zitronensäuremonohydrat 11,38 g
Chloracetamid 1,0g
Destilliertes H&sub2;O QS 11
Auf pH 4,4 einstellen
0,15 ml 30%H&sub2;O&sub2; zugeben
Um die Konsistenz oder Wiederholbarkeit des HIV-Antigentests der Erfindung zu demonstrieren, wurde eine Serie von sechs Assays während einer Zeitspanne von drei Tagen durchgeführt. Nullpegel oder negative Kontrollen und 25 Pikogramm Kernantigen P24 waren die getesteten Proben. Der Durehschnitt und die Standardabweichung (X ± S.D.) der negativen Kontrolle war 0,069 ± 0,013 mit einer Interassay- Variabilität von 18%. Die Interassay-Variabilität war 20% mit einem Durchschnitt und einer Standardabweichung (X ± S.D.) von 0,069 ± 0,017. Der Pegel bei 25 Pikogramm zeigte eine Intraassay-Variabilität von 1% mit einem Durchschnitt und einer Standardabweichung (X ± S.D.) von 1,149 ± 0,012. Die Interassay-Variabilität war 11% mit einem Durchschnitt und einer Standardabweichung (X ± S.D.) von 1,149 ± 0,128.
Der Immunassay, der diese Erfindung verkörpert, erzielt wichtige Vorteile. Die Stabilität der Enzymfarbreaktion für einen Test ist bis zu vier (4) Stunden. Dies bedeutet, daß keine Bedenken hinsichtlich des Prüfens einer Farbbestimmung vorhanden sind, nachdem ein Test beendet ist, da eine Wiederholung bis zu vier Stunden danach möglich ist. Mit einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, welche in einem Kit mit den erforderlichen Reagentien zum Durchfuhren des Assays vorgesehen ist, und unter Verwendung von fünf (5) Vertiefungen als Kontrollvertiefungen können 90-91 Tests innerhalb einer Zeitspanne von annähernd vier Stunden durchgeführt werden, da die Vertiefungen bereits mit dem monoklonalen Antikörper KC-57 beschichtet sind. Den Anmeldern ist kein HIV-Antigenassay bewußt der diese Produktivität in einer so kurzen Zeitspanne bilden kann. Die Empfindlichkeit und die Wiederholbarkeit der mit diesem Assay erzielten Ergebnisse ist im Stand der Technik, wie er den Anmeldern bekannt ist, ohne früheres Beispiel.

Claims

1. Immunassay zum Nachweis von HIV-Antigenen in einer Testprobe einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, welche Zellen enthält, und welche Probe ein zirkulierendes Antigen aufweisen kann, wobei der Assay umfaßt:

(a) Inkontaktbringen eines vorbestimmten Volumens der Testprobe mit einer festen Oberfläche, an welche eine bekannte Menge eines monoklonalen Antikörpers gebunden ist, der in der Lage ist, an ein gemeinsames Epitop der HIV-Kernantigene p55, p24, p39 und p33 zu binden, ohne an das HIV-Kernantigen p18 und an die HIV-Hüllenantigene zu binden;

(b) Inkubieren der mit der Oberfläche in Kontakt befindlichen Testprobe, um resultierende Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden; und

(c) Inkubieren der erhaltenen Komplexe und Unterwerfen derselben einem markierten menschlichen anti-HIV-Antikörper-Konjugat, welches in der Lage ist, ein quantitativ meßbares Signal zu liefern, welches mit dem Signal für eine normale negative Testprobe korreliert ist, um entweder Antigen-positiv oder -negativ für die Testprobe bei einer Pikogramm-Empfindlichkeit von mindestens etwa 7,8 Pikogramm pro Milliliter Testprobe innerhalb einer Zeitspanne von annähernd vier Stunden ab dem Zeitpunkt des Beginns des Immunassays anzuzeigen.

2. Immunassay nach Anspruch 1, welches den Schritt des Einbringens eines Lysierungsreagens in die Testprobe und an die Oberfläche von Schritt (a) aufweist, um Antigene, die von den Zellen während der Inkubierung erhältlich sind, gleichförmig freizusetzen.

3. Immunassay nach Anspruch 1, in welchem der Antikörper von Schritt (c) mit einem Enzym markiert ist, welches in der Lage ist, das Signal zu erzeugen, wenn es mit einem Enzymsubstrat kontaktiert wird.

4. Immunassay nach Anspruch 1, in welchem der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper KC-57 ist, der von einer Hybridom-Zellinie produziert wird, welche die identifizierenden Charakteristiken der Proben der Zellinie der Hinterlegung bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, mit der zugeteilten A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer HB 9585, aufweist, welche monoklonale Maus-IgG1-Antikörper für das Antigen KC-57 produziert.

5. Immunassay nach Anspruch 1, in welchem das markierte menschliche anti-HIV-Antikörper- Konjugat von Schritt (c) ein Glycoprotein-gebundenes Antikörper-Konjugat ist, welches mit einem Enzym markiert ist, das in der Lage ist, ein Farbnachweissignal zu erzeugen, wenn es mit einem Enzymsubstrat in Kontakt gebracht wird.

6. Immunassay nach Anspruch 5, in welchem das Konjugat ein biotinylierter Antikörper ist.

7. Kit zur Verwendung bei der Durchführung eines Immunassays zum Nachweis von HIV-Antigenen in der Testprobe einer physiologischen Flüssigkeit, wobei der Kit in Kombination umfäßt:

(a) eine feste Oberfläche, an welche eine bekannte Menge eines monoklonalen Antikörpers gebunden ist, der in der Lage ist, an ein gemeinsames Epitop der HIV-Kernantigene p55, p24, p39 und p33 zu binden und welcher nicht spezifisch an das HIV-Kernantigen p18 und an die HIV-Hüllenantigene bindet;

(b) ein Behälter, welcher eine Menge eines markierten menschlichen anti-HIV-Antikörper- Konjugats enthält, um ein brauchbares nachweisbares Signal für eine Testprobe zur Verfügung zu stellen;

(c) einen Behälter, welcher eine Menge eines Lysierungsmittels enthält, um virale Antigene, welche in den Zellen einer Testprobe vorhanden sein können, gleichförmig freizusetzen; und

(d) Behälter für Inkubierungs- und Waschreagentien, die zum Sichtbarmachen von Reaktionen notwendig sind, die von der Anwendung des Kit beim Durchführen des Immunassays resultieren, welche Kombination quantitativ gewählt wird, um solche sichtbaren immunologischen Reaktionen bei einer Pikogrammempfindlichkeit von mindestens etwa 7,8 pg/ml Testprobe innerhalb einer Zeitspanne von etwa vier oder weniger Stunden ab dem Zeitpunkt des Beginns des Immunassays zu erhalten.

8. Kit, wie in Anspruch 7 beschrieben, in welchem der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper KC-57 ist, der von einer Hybridom-Zellinie produziert wurde, welche die indentifizierenden Charakteristiken der Proben der Hybridom-Zellinie aufweist, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt wurde und der die A.T.C.C.-Hinterlegungsnr. HB 9585 zugeteilt wurde.

9. Immunassay zum Nachweis von HIV-Antigenen in einer Testprobe einer menschlichen physiologischen Flüssigkeit, welche Zellen enthält, und welche Probe ein zirkulierendes Antigen aufweisen kann, wobei der Assay umfaßt:

(a) Inkontaktbringen eines vorbestimmten Volumens der Testprobe mit einer festen Oberfläche, an welche eine bekannte Menge eines monoklonalen Antikörpers gebunden ist, der in der Lage ist, an ein gemeinsames Epitop der HIV-Kernantigene p55, p24, p39 und p33 zu binden, ohne an das HIV-Kernantigen p18 und an die HIV-Hüllenantigene zu binden, und einer bekannten Menge eines lysierenden Reagens zum einheitlichen Freisetzen von Antigenen, die von den Zellen während des Inkubierens erhaltlich sind,

(b) Inkubieren der Testprobe und des lysierenden Reagens in Kontakt mit der Oberfläche, um resultierende Antigen/Antikorper Koniplexe zu bilden, und

(c) Inkubieren der erhaltenen Komplexe und Unterwerfen derselben einem markierten menschlichen anti-HIV-Antikörper-Konjugat, welches in der Lage ist, ein quantitativ meßbares Signal bei einer Pikogramm-Empfindlichkeit von mindestens etwa 7,8 Pikogramm pro Milliliter Testprobe zu liefern, welches mit dem Signal für eine normale negative Testprobe korreliert ist, um entweder Antigen-positiv oder -negativ für die Testprobe innerhalb einer Zeitspanne von annähernd vier Stunden ab dem Zeitpunkt des Beginns des Immunassays anzuzeigen.

10. Immunassay nach Anspruch 9, in welchem das menschliche anti-HIV-Antikörper-Konjugat von Schritt (c) mit einem Enzym markiert ist, welches in der Lage ist, das Signal zu erzeugen, wenn es mit einem Enzymsubstrat in Kontakt gebracht wird.

11. Immunassay nach Anspruch 9, in welchem der monoklonale Antikörper die Bindungsspezifitätscharakteristiken des monoklonalen Antikörpers besitzt, der von der Hybridom-Zellinie produziert wird, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, A.T.C.C.-Hinterlegungsnr. HB 9585, hinterlegt ist.

12. Immunassay nach Anspruch 9, in welchem das Konjugat ein biotinylierter Antikörper ist.