DE3852104T2 - Thermophile äthanolproduktion. - Google Patents
Thermophile äthanolproduktion.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf Herstellung von Alkohol, d.h. Ethanol, durch Fermentation.
- Alkoholherstellung aus Abfall- oder Nebenprodukt-Zuckern, ob sie nun als solche anfallen oder aus Umwandlung von anderen Kohlenhydraten gewonnen werden, ist seit langem bekannt, ist aber gegenwärtig von wachsender Bedeutung. Derzeit billiges Öl, und ernste Nahrungsmittelknappheiten in bestimmten Regionen können nicht die grundlegende Unsicherheit des Sich-Verlassens auf nicht-erneuerbare Energiequellen verringern, wenn, richtig betrieben, Landwirtschaft Nahrungsmittel und Energie weltweit zur Verfügung stellen könnte.
- Wir haben bekannte Verfahren zur Alkoholherstellung, Großteils durch Hefen, untersucht, und gefolgert, daß eine Verbesserung mit Schlüsselstellung in einem wirtschaftlichen Arbeitsvorgang, wenn in der Praxis erreichbar, die Anwendung von Temperaturen ist, bei denen der Alkohol bequem direkt als Dampf aus dem Fermentationsmedium entfernt werden kann. Natürlich sind Hefen bei solchen Temperaturen nicht wachstumsfähig, und wir sind zu thermophilen Bakterien übergegangen.
- Hefen fermentieren nur Glucose, Maltose oder Saccharose, während einige Bakterien auch Cellobiose aus enzymatischer Hydrolyse von Cellulose oder Xylose und Arabinose aus Hydrolyse von Hemicellulose nutzen können. Die letzteren (Pentose) Zucker sind die Hauptbestandteile von Abfallströmen aus der Papierherstellung oder von Vorbehandlungen von Stroh, so wie Dampf-Explosion oder verdünnte Säurehydrolyse. Die Wirtschaftlichkeit der Ethanolherstellung aus Zuckerrohr würde z.B. stark verbessert werden, wenn die Zuckerrohrrückstände genau so gut wie der Saft verwendet werden könnten.
- Einige Thermophile, die all diese Zucker verwerten können, um hohe Ausbeuten an Ethanol zu erzeugen, sind beschrieben worden, z.B. Clostridium thermosaccharolyticum, Cl. thermohydrosulfuricum oder Thermoanaerobacter ethanolicus. Jedoch sind sie strikt anaerob und ihre berichteten Eigenschaften stehen unvorteilhaft im Vergleich mit den unten beschriebenen Stämmen von Bazillus stearothermophilus. Darüber hinaus haben wir gesehen, daß fakultativ Anaerobe zusätzliche Vorteile durch Zulassen eines neuen gemischten aerob-anaeroben Verfahrens haben, das erlaubt, daß Nebenprodukte der anaeroben Phase aerob genutzt werden können, um katalytische Biomasse zu regenerieren.
- Die meisten fakultativ Anaeroben produzieren keine hohen Ethanolausbeuten. In früheren Veröffentlichungen beschrieben wir eine 'metabolische Steuerungs' Strategie, wodurch Mutanten, die für Bazillus stearothermophilus NCA 1503 gehalten wurden, manipuliert werden können, um hohe Ausbeuten an Ethanol zu erzielen 1, 2. Diese Strategie schloß die Eliminierung von L-Lactat-Herstellung durch Auswahl von Mutationen in L-Lactat Dehydrogenase ein. Vom anfallenden Mutanten wurde die Bildung von Acetat, Ethanol und Formiat anaerob in Ausbeuten von 2:2:4 pro Mol Saccharose erwartet. Überraschenderweise jedoch waren die Ethanolausbeuten höher als dieses theoretische Maximum unter bestimmten Bedingungen, insbesondere geringer pH und höhere Temperaturen, und dies wurde einer katalytischen Umwandlung von Saccharose zu Ethanol + CO&sub2; während eines finalen nicht-Wachstums-Stadiums in Chargenkulturen zugeschrieben.
- Wir haben nun gefunden, daß die früher berichteten Ergebnisse bis zu dem Ausmaß fehlerhaft waren, daß der beschriebene Organismus nicht ein Derivat von B. stearothermophilus NCA 1503 (NCIB 8924) ist, wie wir angenommen hatten (Payton und Hartley ³), noch in der Tat von irgendeinem spezifischen bekannten thermophilen Bazillus. Stattdessen scheint er von einem neuen Stamm der Species Bazillus stearothermophilus abgeleitet zu sein, der Eigenschaften besitzt, die ihn bekannten Stämmen für die oben beschriebenen Ziele viel überlegener machen. Insbesondere hat er eine viel höhere Wachstumsrate als Stamm NCA 1503, sowohl aerob als auch anaerob bei Temperaturen über 60ºC, und wächst anaerob über 70ºC, eine Temperatur, bei welcher Wachstum mit Stamm NCA 1503 aufhört. Darüber hinaus verwertet er sowohl Cellobiose als auch die Pentose-Zucker, die in einer rohen verdünnten Säurehydrolyse von Weizenstroh, hergestellt durch das ICI-Verfahren beschrieben von Ragg und Fields &sup4;, gefunden werden.
- Daher, obwohl diese Erfindung nicht auf bestimmte Bakterien beschränkt ist, betrifft sie fakultativ Anaerobe so wie B. stearothermophilus Stamm LLD-R (Einzelheiten der NCIB-Hinterlegung nachfolgend) die rasch eine große Spanne von Zuckern, einschließlich Cellobiose und Pentosen, sowohl aerob als auch anaerob über 70ºC fermentieren. Solche Stämme würden normalerweise Lactat anaerob herstellen, aber dieser Weg ist durch Selektieren von Mutationen in an NAD-gebundene Lactat- Dehydrogenase eliminiert.
- Die Erfindung ist breit definiert als Herstellung von Ethanol durch ein Verfahren, in dem ein Stamm von Bazillus stearothermophilus oder anderem thermophilen, fakultativ anaeroben Bakterium ausgewählt wird nach den Merkmalen des Fermentierens von Zuckern, sowohl aerob als auch anaerob, und des Aktivseins in anaerober Fermentation bei 70ºC oder darüber und
- (i) die anaerobe Fermentation mit fortlaufender Entfernung von Ethanol bei 70ºC oder darüber ausgeführt wird
- (ii) die fermentative Aktivität des Bakteriums aufrechterhalten wird durch Abziehen eines Teils des anaeroben Fermentations-Mediums auf einer fortlaufenden Basis, vorzugsweise mit Entfernen von Ethanol und Ermöglichung der aeroben Vermehrung der Bakterien darin, unter Verwendung von in dem Medium gegenwärtigen Restzuckern oder Metaboliten, vor der Rückführung zur anaeroben Fermentation.
- Wünschenswerterweise wird das Bakterium nach dem weiteren Merkmal des Eintretens, nach einer aeroben oder anaeroben Wachstumsphase, in eine nicht- Vermehrungs- aber metabolisch aktive anaerobe Phase, worin im wesentlichen nur Ethanol hergestellt wird, ausgewählt, und die anaerobe Fermentation wird im wesentlichen in dieser Phase ausgeführt.
- Weiterhin kann Acetat-Herstellung durch physiologische Steuerung wie sauren pH, höhere Temperaturen oder hohe Werte von extrazellulärem Acetat, oder durch weitere genetische Veränderung in Enzymen des Acetat-Wegs unterdrückt werden. Dies führt zu einem Kanalisieren von anaerobem Metabolismus via Pyruvat-Dehydrogenase, was zu einer Umwandlung von Zuckern zu Ethanol und CO&sub2; führt. Die anfallenden Zellen mögen nicht anaerob wachsen, aber die Umwandlung von Zuckern zu Ethanol ohne Wachstum katalysieren.
- Daher ist ein Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren, in dem solche Zellen in einem katalytischen anaeroben Herstellungs-Stadium verwendet werden, ernährt mit Zuckern, aber das Wachstum minimalisierend. Das meiste Ethanol wird automatisch in die Dampfphase über 70ºC entfernt, so daß die Herstellungsphase mit hohen Zuckerkonzentrationen ernährt werden kann, ohne die Ethanol-Toleranz des Organismus (ca. 4% G/V) zu überschreiten. Wir haben gesehen, daß diese Eigenschaften sich selbst zu einem neuen fortlaufenden Verfahren verhelfen, in dem die optimale Fermenter-Produktivität durch fortlaufendes Zell-Recycling nach Entfernen wässriger Phasenprodukte durch Zentrifugation oder Filtration erreicht wird.
- Die minimale Wachstumsrate, die notwendig ist, um katalytische Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten, kann durch Abziehen von einem kleinen Teil von Zellen während Recycling erzielt werden; dies resultiert in Umwandlung eines equivalenten Teils des einfließenden Zuckers in frische Biomasse. Alternativ wird das zurückbleibende Ethanol der wässrigen Phase entfernt, bevor verbrauchte Zellen, unhydrolysierte Zucker, Restspuren von Ethanol und Nebenprodukte, wie Acetat und Formiat, zu einem aeroben 'Biomasse' Stadium rückgeführt werden. Die aeroben Zellen werden dann zu dem katalytischen "Herstellungs"-Stadium zurückgeführt, wenn notwendig über ein anaerobes "Adaptations"-Zwischenstadium. Ein attraktives Merkmal einer solchen Reaktorkonformation ist, daß automatische Verfahrenssteuerung zur Optimierung der Ethanolausbeute durch Minimieren von aerobem CO&sub2; und Maximieren von anaerobem CO&sub2; aufrechterhalten werden kann.
- Spezifische vorteilhafte Merkmale können sein:-
- i) Verwendung von Verfahrensbedingungen, so eingestellt, um das Verhältnis von anaerob zu aerob hergestellten CO&sub2; zu maximieren, somit die Ethanolausbeute maximierend.
- ii) Verwendung von Bakterien, spezifisch auf Fehlen NAD-gebundener Lactat- Dehydrogenase-Aktivität ausgewählt.
- iii) Verwendung von Bakterien, spezifisch auf Ethanolherstellung, im wesentlichen durch Pyruvat-Dehydrogenase-Weg-Aktivität, ausgewählt, und insbesondere Bakterien, in denen, während der Fermentation, Pyruvat-Formiat- Lyase-Weg-Fluß aufgrund Mutation oder durch Bedingungen, die intrazellulare Akkumulation von Metaboliten verursachen, unterdrückt ist.
- Bazillus stearothermophilus Stamm LLD-15 (Einzelheiten der NCIB-Hinterlegung nachfolgend) trat auf während Versuchen, Mutanten von Bazillus stearothermophilus Stamm NCA 1503, denen L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität fehlt, durch Auswählen für Suicid-Substrat Resistenz (Payton und Hartley ³) zu erhalten. Es wurde natürlich angenommen, daß es ein Mutant des letzteren Stammes sei, aber tatsächlich wird es für von einem neuen extrem thermophilen, Bazillus stearothermophilus Stamm LLD-R abgeleitet gehalten. Stamm LLD-R tritt spontan und reproduzierbar aus Stamm LLD-15 auf und wird auf Platten ausgewählt oder während fortlaufender Kulturen, unter denen er schneller wächst, z.B. bei geringem pH in Medien, die Zucker + Acetat und Formiat enthalten. Er stellt L-Lactat anaerob her und enthält hohe Werte von L-Lactat- Dehydrogenase, so ist es eindeutig ein 'Wild-Typ'-Atavist der LLD-15 Veränderung.
- Sowohl der Mutantenstamm B. stearothermophilus Stamm LLD15 und der Wild-Typ, Stamm LLD-R, sind Gram-positive, Sporen-bildende Stäbchen, die der breiten Klasse Bazillus stearothermophilus in Morphologie und Wachstums-Temperaturbereich ähneln. Jedoch unterscheiden sie sich in einer Reihe von biochemischen und Wachstumstests (Tabelle 1) von B. stearothermophilus NCA 1503 und allen anderen verwandten Stämmen in der extensiven Sammlung von Sharp et. al. J. Gen. Microbiol. 117 201 (1980). Diese Eigenschaften verdienen eine generelle Klassifikation als Bazillus stearothermophilus nach Donk, L. (1920) J. Bacteriol. 5 373, aber der Wachstums-Temperaturbereich ist deutlich höher als der für Stamm NCA 1503, aus dem sich, wie angenommen wurde, der Mutant ableitet. Daher wurden beide Organismen als neue Art Stämme Bazillus stearothermophilus LLD-R (NCIB 12403) und Bazillus stearothermophilus LLD-15 (NCIB 12428) mit der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research station, P.O. Box 31, Aberdeen, AB9 8DG, Scotland, hinterlegt. Die jeweiligen Daten der Hinterlegung sind 10. Februar 1987 und 9. April 1987.
- Stämme LLD-R und LLD-15 wachsen gut auf einem reichen BST Medium (g/l): Trypton (Oxoid) 20,0; Hefeextrakt (Oxoid) 10,0; K&sub2;SO&sub4;, 1,3; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,27; MnCl&sub2;.4H&sub2;O, 0,015; FeCl&sub3;.6H&sub2;O, 0,007; Zitronensäure, 0,32; ergänzt mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle und auf den benötigten pH mit KOH oder H&sub2;SO&sub4; eingestellt. Jedoch haben wir auch ein voll definiertes Medium BST-MM entwickelt (g/l): C-Quelle variabel; K&sub2;SO&sub4;, 0,3; Na&sub2;HPO&sub4;, 1,0; MgSO&sub4;, 0,4; MnCl&sub2;.4H&sub2;O, 0,003; CaCl&sub2;, 0,005; NH&sub4;Cl, 1,0; Zitronensäure, 0,16; Methionin, 0,2; (mg/l): Nicotinsäure, 10; Biotin, 10; Thiamin, 10; ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,4; Borsäure, 0,01; CoCl&sub2;.6H&sub2;O, 0,05; CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 0,2; NiCl&sub3;.6H&sub2;O, 0,01; EDTA, 0,25. TABELLE 1. Vergleich von neuen Stämmen mit anderen thermophilen Bazillen B. stearo B. caldotenax B. caldovelox B. caldolyticus B. coagulans Starke-Hydrolyse Casein-Hydrolyse Gelatine-Hydrolyse Citrat-Verwendung Katalase Oxidase Wachstum in 3% physiologischer Kochsalzlösung Zucker-Fermentationen: Galactose Glycogen Mannitol Raffinose Starke Trehalose Xylose
- Die Tests wurden parallel gemäß Sharp, R.J., Bown, K.J. und Atkinson R. (1980) an B. stearothermophilus Stamm LLD-15, LLD-R und NCA 1503 und B. caldotenax durchgeführt. Die anderen Daten sind von dieser Referenz; R, beschränkt; +, positiv; w, schwach positiv; -, negativ; .., nicht getestet.
- Der Text bezieht sich auf Figuren 1-6, die sind wie folgt:-
- Fig. 1 Anaerobe Wege und theoretische Ausbeuten in Bazillus stearothermophilus Stamm LLD-15
- Fig. 2 Stationärzustands-Werte in fortlaulenden Kulturen bei pH 7, D = 0,2 h&supmin;¹ an Saccharose 10 g/l anaerob, oder 5 g/l aerob (gestrichelte Linie), 0,5 % Trypton, 0,25 % Hefeextrakt
- a) Biomasse: ( ) Stamm NCA 1503, ( ) Stamm LLD-R, ( ) Stamm LLD-15
- b) Produkte mit Stamm LLD-15
- Fig. 3 Fortlaufende Kulturen von Stamm LLD-15 an verschiedenen Konzentrationen von Weizenstroh-Hydrolysat (Ragg und Fields, 1986) bei 70ºC,D=Q2 h&supmin;¹,pH7.
- Fig. 4 Ein fortlaufendes zwei-stufiges Reaktorsystem fiir Ethanolherstellung.
- Fig. 5 Fortlaufende Fermentation mit teilweisem Zell-Recycling, Anlage.
- Fig. 6 Fortlaufende Fermentation mit teilweisem Zell-Recycling, Beziehungen.
- Unsere ursprünglichen Experimente wurden überwiegend bei 60ºC in Chargenkultur an 2,35 % (G/V) Saccharose/BST Medium geführt, da dies die optimale Temperatur für Stamm NCA 1503 ist, der für den Vorfahr des Mutanten-Stammes LLD-15 gehalten wurde. In anaeroben Chargenkulturen von Stamm NCA 1503 oder Stamm LLD-R ist das Endprodukt überwiegend L-Lactat, wobei Stamm LLD-15 ergibt (Mole/Mol Saccharose): Ethanol (1,8), Acetat (1,8) und Formiat (3,2) bei pH 7,9. Dies ist im Einklang mit Metabolismus via den Pyruvat-Formiat-Lyase-Weg (PFL) (Fig. 1), da die Mutation L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität abschafft. Jedoch steigt bei saurerem pH das Verhältnis von Ethanol zu Acetat, und wird bei pH 6,2: Ethanol (2,9), Acetat (0,2) und Formiat (1,3). Dies zeigt an, daß ein neuer Weg, der zu 2 Ethanol + CO&sub2; aus jedem Glucoserest führt, auch in Betrieb ist, und wir glauben, daß dies via Pyruvat- Dehydrogenase (PDH) geschieht, was im allgemeinen als anaerob nicht funktiornerend angesehen wird. Zusammenfassend sind die Produkte in Fig. 1 : Weg Produkte (Mole/Mol Zucker) Ethanol Acetat Formiat Glucose: Glycolyse Entner-Doudoroff Xylose: Pentose-Zyklus Phosphoketolase
- Der Wechsel vom PFL- auf den PDH-Weg tritt in den späteren Stadien anaerober Chargen-Fermentationen mit Stamm LLD-15 auf, und ist verbunden mit einer Verlangsamung in der Wachstumsrate und dem Auftreten von Spuren von Pyruvat in dem Medium. Der Effekt ist am meisten ausgeprägt während Chargen-Fermentationen an hohen Zuckerkonzentrationen, z.B. 5 % (G/V) Saccharose, wobei das Wachstum aufhört, lange bevor der gesamte Zucker verwertet worden ist, aber die nichtwachsenden Zellen fahren fort, die Saccharose quantitativ in Ethanol + CO&sub2; umzuwandeln. Daher können in solch einer Chargen-Fermentation Ethanolausbeuten 3,64 Mole/Mol Saccharose (91 % theoretisch) erreichen. Höhere Temperatur (70ºC) begünstigt auch einen Wechsel zu dem PDH-Weg.
- Der Wechsel von dem PFL- zu dem PDH-Weg ist aufgrund der Akkumulation von Acetat und Formiat in dem Medium, und nicht aufgrund der Ethanol-Akkumulation, wie durch Zusatz dieser Produkte zu dem Medium in den frühen Stadien einer Chargen- Fermentation gezeigt. Pyruvat-Sekretion wird immer beobachtet, wenn der PDH-Weg signifikant beschritten wird. Zellen, die unter solchen Bedingungen gewachsen sind, zeigen Werte von Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität in zellfreien Extrakten, die sogar höher als die in vollständig aeroben Zellen sind, wobei der Wild-Typ sehr geringe anaerobe PDH-Werte zeigt. Es gibt keine erkennbare Pyruvat-Decarboxylase oder Formiat-Dehydrogenase-Aktivität, die einen alternativen Weg für Ethanol und CO&sub2; Herstellung geliefert haben könnte. Der Wechsel in Wegen kann ein Phänomen vor der Sporenbildung sein, da Biomasse zum Ende von Chargen-Fermentationen hin abnimmt und Sporen beobachtet werden.
- Der wahrscheinliche Grund für den Wechsel in Wegen ist wie folgt. Der Wild-Typ- Organismus ist an rasches Wachstum angepaßt, sowohl aerob als auch anaerob, hat somit rasch wirkende Zuckeraufhahme und Glykolysesysteme. Er scheidet normalerweise L-Lactat unter anaeroben Bedingungen ab, aber wenn der Weg blockiert ist, wird der Pyruvat-Metabolismus auf den PFL-Weg umgeleitet. Jedoch wird dann die Ausscheiderate von Acetat und Formiat der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für den Energie-Metabolismus, insbesondere in der Gegenwart von externem Acetat und Formiat oder bei saurem pH, wobei Ausscheidung gegen einen Anionen- oder Protonen-Gradienten die Ausflußrate verringert. Daher akkumuliert Pyruvat in der Zelle und induziert die Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität zu Werten, die sogar höher als in vollständig aeroben Zellen sind. Der Fluß durch Pyruvat-Dehydrogenase ist jedoch immer noch unzureichend, um die hohe Wachstumsrate zu erhalten, die bei alkalischem pH oder bei geringer Zuckerkonzentration in der Abwesenheit von Acetat und Formiat beobachtet wird, und die Zellen erreichen einen stationären Zustand, in dem Zucker quantitativ zu Ethanol und CO&sub2; ohne Wachstum umgewandelt werden.
- Vorläufige Experimente, um Wild-Typ (Stamm LLD-R) und Stamm LLD-15 zu vergleichen, wurden ausgeführt mit 2-3 % Saccharose in BST-Medium bei 60ºC (Verdünnungsrate 0,25 h&supmin;¹). Wie erwartet, stellten die Wild-Typ-Zellen überwiegend L-Lactat her, im Bereich von 3,13 Mole/Mol Saccharose, aufgenommen bei pH 8, bis 3,50 bei pH 6,35, und Y-Werte (g Zellen/g Saccharose) waren um 0,07. Mit dem Mutanten-Stamm bei pH 7 war Ethanol das Hauptprodukt (2,3 Mole/Mol Saccharose) und der Y-Wert war höher (0,10). Jedoch war Stamm LLD-15 instabil in fortlaufenden Kulturen bei saurem pH oder bei hohen Zuckerkonzentrationen, und Übernahme durch Atavisten zu L-Lactat-Produktion (Stamm LLD-R) war üblich. Dies spiegelt den mächtigen Selektionsdruck fiir erhöhte Energieeffizienz wieder, der durch solche fortlaufende Kulturen ausgeübt wird, und veranschaulicht einen potentiellen Defekt eines fortlaufenden Verfahrens. Jedoch ist dieser Atavismus weniger häufig in fortlaufenden Kulturen bei 70ºC auf geringeren Zuckerkonzentrationen und kann ausgeschlossen werden durch Reselektion von Stamm LLD-R eines nicht-atavistischen Mutanten (Arbeitsweise von Payton und Hartley³).
- Fig. 2a zeigt die Stationärzustands-Biomasse in fortlaufenden Kulturen von Stämmen NCA 1503, LLD-R und LLD-15 anaerob gewachsen auf 1 % (G/V) Saccharose oder aerob auf 0,5 % Saccharose, 0,5 % Trypton, 0,25 % Hefeextrakt bei pH 7,0, Verdünnungsrate 0,2 h&supmin;¹, bei verschiedenen Temperaturen. Sowohl die neuen Stämme als auch Stamm NCA 1503 zeigen effizienten aeroben und anaeroben Metabolismus, aber Stamm NCA 1503 stirbt anaerob über 70ºC, wobei sowohl der Wild-Typ (LLD-R) und der Mutant (LLD-15) signifikanten anaeroben Metabolismus bis zu 75ºC behalten. Diese Temperatur ist näher am Siedepunkt von wäßrigem Ethanol und ist daher signifikant für die hier beschriebenen Verfahren.
- Die Produkte von den anaeroben fortlaufenden Kulturen von Stamm LLD-15 sind in Fig. 2b gezeigt. Es ist klar, daß Ethanol-Produktivität (mMol/A&sub6;&sub0;&sub0;) mit steigender Temperatur zunimmt, und mit Pyruvat-Ausscheidung verbunden ist.
- Stamm NCA 1503 wächst nicht auf Xylose, aerob oder anaerob, aber sowohl LLD-R als auch LLD-15 tun dies. Die Ergebnisse mit Saccharose können mit fortlaufenden Kulturen auf 1 % Xylose bei 70ºC in analogen Bedingungen (Tabelle 2) verglichen werden. Stationärzustände können wieder aufrechterhalten werden, und Alkoholausbeuten sind wieder höher bei saurem pH.
- Tabelle 2. Fortlaufende anaerobe Kulturen von Stamm LLD-15 auf Xylose (10 g/l), Trypton (5 g/l), Hefeextrakt (2,5 g/l), BST Salzen bei 70ºC, D = 0,2 h&supmin;¹ Produkte: Zellen Rest-Xylose (Mole/Mol Xylose, g/g Zellen/h) Ethanol Acetat Formiat
- Die Stationärzustands-Biomasse bei pH 7 ist weniger als die mit der halben Konzentration an Saccharose, somit ist der Xylose-Metabolismus weniger effizient. Von Saccharose wird angenommen, daß es zu zwei Hexose-phosphaten via eine relevante Kinase + Phoshporylase metabolisiert wird, ein ATP benötigend. Im Gegensatz dazu werden zwei ATP für nötig gehalten, um zwei Pentose-phosphat- Moleküle herzustellen. Daher ist Saccharose wirklich ein besseres Energiesubstrat.
- Die Produkte der fortlaufenden Xylose-Fermentationen zeigen, daß ein merklicher Teil des Trypton-Hefeextrakts für Energieproduktion metabolisiert wird. Nichtsdestoweniger zeigen die Produktverhältnisse bei pH 8 an, daß der Metabolismus via den Pentose-phosphat-Weg, Glycolyse und den PFL-Weg erfolgt. Die Ethanolausbeuten sind geringer als auf Saccharose, was auf einen kleinen Fluß durch den PDH-Weg hindeutet. Jedoch wird angenommen, daß Fermentationen auf höheren Zuckerkonzentrationen bei höheren Temperaturen und geringerem pH den Fluß durch den letzteren Weg, wie für Saccharose, und Mutationen in Acetat-Kinase oder Phosphotransacetylase erhöhen, um ähnlich einen nicht-wachsenden Stamm herzustellen, der Xylose quantitativ in Ethanol und CO&sub2; umsetzt.
- Daher ist der neue Stamm und Derivate davon ein Organismus der Wahl für Ethanol- Herstellung aus Hydrolysaten von Lignocelluloseabfällen. Fortlaufende Kulturen wurden auf rohen Hydrolysaten von Weizenstroh, hergestellt durch das ICI Hydrolyse- Verfahren, beschrieben durch Ragg und Fields&sup4;, durchgeführt. Dies ist tatsächlich ein Abfallstrom, reich an Xylose und Lignin, hergestellt durch einen kurzen Hydrolyse- Schritt mit verdünnter Säure, entworfen um Hemicellulosen zu entfernen, und dadurch die nachfolgende Ligninentfernung zu erleichtern. Das Rohmaterial wird auf pH 7,0 gebracht und in fortlaufender Kultur mit dem neuen Stamm bei 70ºC, D = 0,2 h&supmin;¹ bei verschiedenen Verdünnungen, wie in Fig. 3 gezeigt, getestet. Der Abfallstrom liefert alle notwendigen Nährstoffe für fortlaufende Kultur des Organismus, und alle Zucker werden in gewissem Umfang verwertet. Ethanolausbeuten steigen bei geringerem pH, und die Produktverhältnisse stimmen mit dem Metabolismus via den Pentose-phosphat- Weg, Glycolyse und PFL plus PDH überein (s. Fig. 1).
- Die Eigenschaft quantitativer Umwandlung von Zuckern zu Ethanol ohne Wachstum ist ein signifikanter potentieller Vorteil des neuen Stammes. Er kann maximiert werden durch weitere Manipulation physiologischer Beschränkungen, wie oben veranschaulicht, oder durch Selektion weiterer Mutationen. Figur 1 zeigt, daß Zellen, denen Acetat-Kinase oder Acetyl CoA-Phosphotransacetylase fehlt, kein Acetat herstellen können. Da Acetat-Ausscheidung notwendig ist, um anaeroben Fluß durch PFL zu erhalten, bleibt nur der PDH-Weg offen für Pyruvat-Metabolismus, resultierend in Ethanol und CO&sub2;. Solche Zellen mögen nicht anaerob wachsen, aber können aerob hergestellt und anaerob verwendet werden, um Zucker zu Ethanol katalytisch umzuwandeln.
- Darüber hinaus haben wir gesehen, daß Mutationen, die intrazellular Pyruvat- Dehydrogenase-Aktivität erhöhen, Ethanol-Produktivität erhöhen werden, da PDH den Energie-Fluß zu begrenzen scheint. Solche Mutationen werden ausgewählt, entweder spontan oder nach Mutagenese, durch Wachstum in fortlaufender Kultur oder auf Platten unter Bedingungen, in denen intrazellular Acetat- und Formiat-Akkumulation auftritt, d.h. auf Zuckern bei geringem pH + zugesetztem Acetat und Formiat. Alternativ können zusätzliche Kopien der PDH-Gene durch Gentechnologie- Arbeitsvorschriften eingeführt werden.
- Da die maximale Ethanol-Produktivität mit der Wachstumseinstellung verbunden ist, sind konventionelle anaerobe Chargen-Kulturen ungeeignet für Ethanolherstellung durch solche Stämme. Chargen-Herstellung kann erreicht werden unter Verwendung einer großen Impfkultur von aerob in den anaeroben Reaktor hineingewachsenen Zellen, oder unter Durchführen von Chargen-Fermentationen unter Bedingungen teilweiser Anaerobiose, wobei die Gesamt-Biomasse von dem zugeführten Sauerstoffwert abhängt.
- Darüber hinaus ist ein unbestimmt fortlaufendes Verfahren, katalysiert durch nichtwachsende Zellen, eindeutig unmöglich; eine minimale Aufnahme von Zucker (Erhaltungskoeffizient, m&sub3;) wird benötigt, um Zell-Lebensfähigkeit zu erhalten. Wir haben gesehen, daß dies in einem ein-stufigen anaeroben Reaktor mit teilweisem Zellrecycling erreicht werden kann, so wie in Fig. 5 veranschaulicht, ohne Recycling oder Ablassen; das System arbeitet als eine konventionelle ein-stufige fortlaufende Kultur durch das Werte-Steuersystem. Wenn dies blockiert ist, und das Recycling beginnt, steigen die Biomasse-Werte zu einem Maximum, das durch den Erhaltungskoeffizienten diktiert wird. Danach wird alles Substrat zu Produkten umgewandelt. Dies ist deutlich vorteilhaft für Produktionszwecke, aber wird in der Praxis zu stetig abnehmender reaktiver Produktivität führen. Wenn jedoch eine kleine Ablaßmenge von dem Reaktor (Fx) genommen wird, tritt Stationärzustands-Wachstum in einer Rate u = Fx/V (wobei V = Reaktorvolumen) auf. Dies kann minimiert werden um schwindende Reaktorproduktivität auszugleichen. In der Figur werden Zucker und Nährstoffe in einer Rate Fi hereingepumpt. Eine konstante Ablaßmenge Fx, (Fx< < Fi) bestimmt die Zell-Wachstumsrate u = Fx/V (V = Fermentervolumen). Die zurückbleibende Brühe wird re-zirkuliert durch eine Hohlfaser- Ultrafiltrationsmembran, betrieben bei ihrer maximalen Kapazität. Der Filtrat-Ausstoß Ff wird durch ein Werte-Steuersystem kontrolliert; das Überschuss-Filtrat wird zum Fermenter zurückgeführt.
- Figur 6 zeigt die Ergebnisse eines Modellsystems mit Stamm LLD-15 auf 1 % Saccharose/BST AM bei 70ºC, pH 7. Die Figur zeigt die Beziehung zwischen volumetrischer Ethanol-Produktivität, Zellkonzentration und Gesamt-Verdünnungsrate, D = F&sub1;/V. So = 1 %, T 70ºC, 400 upm, pH 7,0 Bazillus stearothermophilus LLD-15. Zellwachstumsrate u = Fx/V = 0,l h&supmin;¹. Die Wachstumsrate wurde durch Festsetzen der Ablaßrate Fx konstant gehalten bei 0,1 h&supmin;¹. Die Gesamtverdünnungsrate D wurde erhöht durch Erhöhen der Zucker- und Nährstoff-Zufuhrrate Fi. Saccharoseverbrauch (nicht gezeigt) war immer über 97 %, was eine hohe Stabilität des Systems anzeigt. Die volumetrischen Ethanol-Produktivitäten waren signifikant höher als konventionelle einstufige fortlaufende Fermentationen (z.B. 0,6 g Ethanol/l-h). Dies war hauptsächlich aufgrund des proportionalen Ansteigens in Zelldichte, erreicht bei hohen Verdünnungsraten.
- Solche Reaktorsysteme sind durchführbar für Ethanolherstellung durch diese Stämme, aber wir haben gesehen, daß die speziellen Eigenschaften eines fakultativ Anaeroben für die Ethanolherstellung in der neuen Reaktorkonfiguration, veranschaulicht in Fig. 4, maximiert werden können. Zusammenfassend werden Zucker in den anaeroben Reaktor A mit einer Rate V&sub2; gepumpt. Dampfphasen-Ethanol wird von CO&sub2; durch Wasserabsorption getrennt. Ein Teil von erschöpften Zellen wird entfernt durch Zentrifugation (C) und Ethanol aus dem ausfließenden Strom destilliert. Die Restzucker und Ethanol werden mit Nährstoffen (N) mit einer Rate Vn ergänzt und verwendet, um aerob katalytische Biomasse (B) zu erzeugen. Die anfallenden Zellen werden nach Zentrifugation zum Reaktor A zurückgeführt. Detaillierter werden Zucker wie Rohrsaft, Molassen, Stroh-Hydrolysate, etc. mit einer Rate Ds einem anaeroben Reaktor zugeführt, der durch Zellen mit einer Rate Vr versorgt wird. Um dies zu veranschaulichen, ist der Reaktor A ein einfacher gerührter Tank (Volumen VA) in dem Temperatur und pH gesteuert werden, um Ethanolausbeute und -produktivität zu maximieren. Ethanol in der Dampfphase wird von CO&sub2; durch Absorption mit Wasser vor fortlaufender Destillation getrennt. Jedoch ist einer der Hauptvorteile einer thermophilen Fermentation der, daß, da man sich dem Siedepunkt von wäßrigem Ethanol nähert, es fortlaufend und ökonomisch von der wässrigen Phase entfernt werden kann, um Ethanol-Hemmung von Wachstum und/oder Produktivität zu beseitigen (im Fall von Stamm LLD-15 hört das Wachstum über 4 % (G/V) Ethanol bei 60ºC auf). Dies erlaubt die Verwendung von höheren Konzentrationen von Zuckern als Ausgangsmaterial, wie Molassen. Daher kann der anaerobe Reaktor vorteilhaft einer sein, der die Rate von Ethanol-Entfernung in die Dampfphase, so wie Vakuumfermentation, Durchperlen mit recyceltem CO&sub2; oder fortlaufendes Recycling durch einen Vakuum-Blitzverdampfer, maximiert.
- Die meisten Zellen in dem Abwasser von A werden durch fortlaufende Zentrifugation konzentriert und recycliert. Dann wird Ethanol aus dem Überstand durch fortlaufende Destillation entfernt. Der Strom, der in den aeroben Reaktor B eintritt, wird verbrauchte Zellen (oder Sporen), Rest-Ethanol, unverwertete Zucker und Nebenprodukte, wie Acetat und Formiat, enthalten. Die meisten von ihnen können als aerobe Substrate für Stamm LLD-15 dienen. Daher wird der Strom mit notwendigen Nährstoffen ergänzt, um maximale Umwandlung dieser Abfall-Kohlenstoffquellen in Biomasse zu erlauben.
- Diese Biomasse wird durch Zentrifugation konzentriert und zu dem anaeroben Reaktor (Volumen B) zurückgegeben. Es gibt das Problem, daß eine Verzögerungsphase beobachtet werden kann, bevor aerobe Zellen dem anaeroben Metabolismus angepaßt werden. Daher kann es vorteilhaft sein, Reaktor B unter Sauerstoffbegrenzung zu betreiben, oder eine intermediäre 'anaerobe Adaptations'-Reaktorzufuhr mit wenig Zuckern bei optimalem Wachstums-pH dazwischenzuschalten, bevor die Zellen zum katalytischen Stadium zurückkehren.
- Die Verfahrensvariablen in solch einer Reaktorkonfiguration sind komplex, aber das System hat ein ausgleichendes Merkmal. Optimale Ausbeute von Ethanol für jede gegebene Zufuhrzusammensetzung und -rate (Vs) tritt ein, wenn anaerobe CO&sub2; (= Ethanol)-Herstellung maximal, und aerobes CO&sub2; (unter Annahme vollständiger Zuckeroxidation) minimal ist. Optimale Produktivität ist durch Maximierung von Vs gegeben. Daher, durch Verwendung von CO&sub2;-Sensoren zur Steuerung der Pumpraten, pH und Temperatur in jedem Gefäß, gewährt sich das System Selbstoptimierung. Dies ist ein beträchtlicher Vorteil in der Minimierung der Entwicklungsarbeit einer Pilotanlage mit jedem bestimmten Substrat, und ein noch größerer Vorteil bei Anlagenmaßstab unter Einsatz von Ausgangsmaterialien variabler Zusammensetzung.
- In ihrer bevorzugten Form, nun zusammengefaßt aber unbeschadet der Ansprüche, verwendet die vorliegende Erfindung Mutanten eines extrem thermophilen fakultativ Anaeroben, so wie den neuen Bazillus stearothermophilus Stamm LLD-R (NCIB 12403), fähig zu raschem aeroben und anaeroben Wachstum un&oder Metabolismus über 70ºC mit einer großen Spanne von Zuckern, einschließlich Pentosen und Cellobiose, die aus Hydrolyse von Lignocellulose entstehen. Die Mutanten, so wie Stamm Bazillus stearothermophilus LLD-15 (NCIB 12428), sind wünschenswerterweise ausgewählt, um anaerobe Wege überwiegend zur Ethanolherstellung hin zu wechseln. Diese sind die hinterlegten Stämme, auf die hier Bezug genommen wird.
- Stamm LLD-R wächst rasch auf einer großen Spanne von Zuckern bis zu 75ºC, aber das anaerobe Hauptprodukt ist L-Lactat. Der Mutantenstamm LLD-15 wächst gleich schnell via zwei Haupt-Energiewegen: den Pyruvat-Formiat-Lyase(PFL)-Weg, der 1 Mol Ethanol, 1 Acetat und 2 Formiat/Mol Glucoserest erzeugt, und einen zuvor unerkannten Pyruvat-Dehydrogenase(PDH)-Weg, der 2 Ethanol + 2 CO&sub2;/Mol Glucose erzeugt.
- Der metabolische Fluß in Stamm LLD-15 kann durch den PDH-Weg durch Manipulation von physiologischen Bedingungen, insbesondere einen Aufbau von Pyruvat, verursacht durch Wachstum bei saurem pH oder durch Anwesenheit von Acetat und Formiat in dem Medium, gelenkt werden. Höhere Temperaturen begünstigen auch den PDH-Weg. Die Zellen mögen nicht unter solchen Bedingungen wachsen, aber fahren fort, Zucker in Ethanol umzuwandeln. Alternativ kann der PDH- Fluß durch weitere Mutationen erhöht werden; zum Beispiel Mutationen, die Acetatherstellung unterdrücken. Andere wünschenswerte Mutationen sind solche, die die anaerobe Pyruvat-Dehydrogenase-Gesamtaktivität erhöhen, da dies Ratenlimitierend für Ethanol-Produktivität ist.
- Solche Stämme sind optimal für eine zwei-stufige Fermentation, in der katalytische Biomasse zuerst in einem aeroben Keimstadium aufgezogen, und nachfolgend anaerob in einer Ethanolherstellungsstufe ohne Wachstum verwendet wird. Dies kann in einem ein-stufigen Chargen- oder Zufuhr-Chargen-Reaktor erreicht werden, mit fortlaufender Ethanolentfernung in der Dampfphase, um die Verwendung von konzentrierten Zucker- Ausgangsmaterialien zu erlauben. Herkömmliche Ausgangsmaterialien, wie Glucose, Saccharose oder Maltose, können verwendet werden, aber auch Zucker, die aus Hydrolyse von Lignocelluloseabfällen entstehen, einschließlich Pentosen und Cellobiose.
- Die Stämme sind nicht sehr geeignet für herkömmliche ein-stufige fortlaufende Kulturen, aber können vorteilhaft in einem ein-stufigen System mit teilweisem Zellrecycling, oder in einem zwei-stufigen fortlaufenden System, in dem Zucker einem anaeroben katalytischen Reaktor mit fortlaufender Ethanolentnahme im Dampf zugeführt wird, verwendet werden. Das verbleibende Ethanol wird aus dem wässrigen Ausfluß aus diesem Reaktor abgezogen, und die restlichen Kohlenstoffquellen werden verwendet, um neue katalytische Biomasse in einer aeroben Biomasse-Stufe zu erzeugen. Dadurch werden tatsächlich alle potentiellen Substrate in den Ausgangsmaterialien entweder anaerob oder aerob verwertet. Darüber hinaus verleiht sich dieses System automatisierte Selbstoptimierung für die Ethanolherstellung durch Maximieren von anaerob-hergestelltem CO&sub2; (equivalent zur Biomasseherstellung). Dies kann ein besonderer Vorteil sein, wenn gemischte und variable Ausgangsmaterialien verwendet werden.
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- 2. Hartley, B.S. und Shama, G. (1987) In 'Utilisation of Cellulosic Wastes' (Herausg. Hartley, B.S., Broda, P.M.A., und Senior, P.), The Royal Society, London.
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- 4. Ragg, P.L. und Fields, P.R. In 'Utilisation of Lignocellulosic Wastes' (Herausg. Hartley, B.S., Broda P.M.A. und Senior, P.), The Royal Society, London.
Claims (10)
1. Herstellung von Ethanol durch ein Verfahren, in dem ein Stamm von Bacillus
stearothermophilus oder ein anderes thermophiles, fakultativ anaerobes Bakterlum für die
Merkmale, Zucker sowohl aerob als auch anaerob zu fermentieren und in anaerober
Fermentation bei 70ºC oder darüber aktiv zu sein, ausgewählt wird, und
(i) anaerobe Fermentation mit fortlaufender Entfernung von Ethanol bei 70ºC
oder darüber durchgeführt wird
(ii) die fermentative Aktivität des Bakteriums aufrechterhalten wird durch
Abziehen eines Anteils des anaeroben Fermentationsmediums auf einer
fortlaufenden Basis vorzugsweise mit Entfernen von Ethanol und Ermöglichen
aerober Vermehrung der Bakterien darin unter Verwendung von im Medium
anwesenden Restzuckern oder deren Metaboliten, vor der Rückführung zur
anaeroben Fermentation.
2. Herstellung von Ethanol gemäß Anspruch 1, bei der das Bakterium ausgewählt wird
für das weitere Merkmal des Eintretens, nach einer aeroben oder anaeroben Wachstumsphase,
in eine nicht vermehrende, aber metabolisch aktive anaerobe Phase, in der im wesentlichen
nur Ethanol erzeugt wird, und die anaerobe Fermentation im wesentlichen in dieser Phase
durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem anaerobe und aerobe CO&sub2;-Erzeugung
überwacht und das Verhältnis von anaerobem CO&sub2; zu aerobem CO&sub2; für jede der
angewandten Verfahrensbedingungen maximiert wird.
4. Herstellung von Ethanol gemäß irgend einem vorhergehenden Anspruch, bei der
speziell das Bakterium ausgewählt wird, dem im wesentlichen NAD-gebundene
Lactatdehydrogenase-Aktivität fehlt.
5. Herstellung von Ethanol gemäß irgend einem vorhergehenden Anspruch, bei der
speziell das Bakterlum ausgewählt wird, das das Ethanol im wesentlichen durch
Pyruvatdehydrogenase-Weg-Aktivität herstellt.
6. Herstellung von Ethanol gemäß Anspruch 5, bei der speziell das Bakterium als ein
solches ausgewählt wird, in dem während der Fermentation der Pyruvat-formiat-Lyase-Weg-
Fluß durch Mutation oder durch Bedingungen, die intrazelluläre Akkumulation von
Metaboliten verursachen, unterdrückt wird.
7. Herstellung von Ethanol gemäß irgend einem vorhergehenden Anspruch, bei der die
Zucker Pentosen oder Cellobiosen einschließen.
8. Herstellung von Ethanol gemäß irgend einem vorhergehenden Anspruch, speziell
durch einen Stamm von Bacillus stearothermophilus.
9. Herstellung von Ethanol gemäß Anspruch 8, bei der speziell B. stearothermophilus
LLD-R (NCIB 12403) oder B. stearothermophilus LLD-15 (NCIB 12428) oder Varianten
davon, die dieselbe Funktion wie der Ausgangsstamm besitzen, verwendet werden.
10. Bacillus stearothermophilus LLD-R (NCIB 12403) oder Bacillus stearothermophilus
LLD-15 (NCIB 12428) und Ethanol-herstellende Varianten davon.
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