DE3851399T2

DE3851399T2 - Transientes Expressionssystem zur Herstellung von rekombinantem Protein.

Info

Publication number: DE3851399T2
Application number: DE3851399T
Authority: DE
Inventors: Cornelia M Gorman
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-09-25
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2008-09-23
Also published as: ES2061671T3; CA1340480C; EP0309237B1; JPH01165395A; US5024939A; EP0309237A1; ATE111156T1; DE3851399D1; JP2738544B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie zur Entwicklung eines Expressionssystems, welches fähig ist, das gewünschte Protein innerhalb etwa eines Tages bis etwa zwei Wochen nach der Transfektion zu exprimieren. Weiters betrifft die Erfindung die Transformation einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der fähig ist, stabile, cytoplasmische mRNA zu erzeugen, um ein gewünschtes Protein und Vektoren zu exprimieren, die fähig sind, trans-aktivierende Faktoren und/oder bestimmte translationale Steuereffektoren zu exprimieren, um die transiente Herstellung des gewünschten Proteins zu bewirken. Die Erfindung betrifft außerdem die Transfektion von ausgewählten eukaryotischen Zellen mit solchen Vektoren, so daß eine transiente Herstellung des gewünschten Proteins erzielt wird.
In letzter Zeit wurde die rekombinante Technologie auf eukaryotische Zellen angewendet; es wurden genauer gesagt Säugetierzellen mit heterologer DNA transformiert, die für einen auswählbaren Phänotyp kodiert. Wigler M., et al., Cell 11: 223-232 (1977). Es wurde auch gezeigt, daß eukaryotische Zellen transformiert werden können, um Transformanten zu ergeben, deren heterologe DNA in die chromosomale DNA des eukaryotischen Zellkerns integriert ist.
Die erfolgreiche Transformation von eukaryotischen Zellkulturen und die Expression der für ein gewünschtes Protein kodierenden DNA-Sequenzen wurden geoffenbart. Siehe z. B. europäische Patentveröffentlichungen Nr. 73.659 und 73.656. Diese erfolgreichen Transformationen verwendeten Vektoren, um komplementäre DNA (cDNA's) zu exprimieren, die nur 5'-Steuersignale wie z. B. Verstärker (Gluzman, Y. und Shenk, T. (Hrsg) Enhancers and Eukaryotic Gene Expression (Cold Spring Harbor Laboratory, 1983)), Promotoren (Hamer, D.H. et al., Cell 21, 697 (1980)) und 3'-Polyadenylierungsstellen (Proudfoot, N.J. und Brownlee, G.G., Nature 263, 211 (1976)) benötigt.
1977 entdeckte man, daß in Eukaryoten die cytoplasmische mRNA nicht immer co-linear mit der DNA ist. Es stellte sich heraus, daß für Proteine kodierende DNA-Sequenzen durch Abschnitte nichtkodierender DNA unterbrochen waren. Es gibt lange Abschnitte von Basensequenzen in der DNA des Gens, die in der endgültigen mRNA nicht aufscheinen. Man konnte beobachten, daß die primären mRNA-Transkripte "gespleißt" waren, um die nichtkodierenden Sequenzen, d. h. jene Sequenzen, die kein Protein kodieren, zu entfernen. Diese nichtkodierenden Sequenzen in der DNA bezeichnet man allgemein als Introne (früher als intervenierende Sequenzen bezeichnet), während die kodierenden Sequenzen als Exone bekannt sind. Die RNA-Polymerase liefert ein primäres Transkript der gesamten DNA (sowohl der Exone als auch der Introne). Dieses Transkript wurde zur Entfernung der Introne verarbeitet, während zur gleichen Zeit alle Exone in der richtigen Reihenfolge miteinander verbunden wurden. Den Mechanismus, der das soeben angeführte Ergebnis erzielt, bezeichnet man als "Spleißen".
Es wurden zahlreiche gespaltene oder gespleißte Gene entdeckt. Introne bestehen tatsächlich in praktisch allen Säugetier- und Wirbeltiergenen und auch in den Genen eukaryotischer Mikroorganismen. Introne sind nicht auf den Kodierungsbereich einer Botschaft beschränkt. Man entdeckte beispielsweise zusätzlich zu Mehrfach-Spleißstellen an anderen Stellen im Gen ein Intron im Leaderbereich der Plasminogenaktivator-mRNA vor der Kodierungssequenz. Fisher R., et al., J.Biol.Chem. 260, 1122 (1985). Es gab viele Mutmaßungen, warum sich Introne entwickelten und zu einem solch allgemeinen Merkmal eukaryotischer Gene wurden. Crick, F., Science, 204, 264, 1979; und Sharp, P.A., Cell 23, 643-646 (1981).
Aufgrund der Allgegenwart von Intronen ist es nicht überraschend, daß man das Spleißen in Zusammenhang mit rekombinanter Technologie untersuchte. Es wurde z. B. ein SV40-Vektor konstruiert, der eine Kaninchen-β-Globin-cDNA, in der Transkriptionsinitiation und -termination beteiligte Bereiche, Spleißstellen aus einer 5' zur β-Globin-cDNA-Sequenz angeordneten, vielteiligen Leadersequenz und eine Polyadenylierungssequenz enthielt. Mulligan, R.C. et al., Nature 277, 108-114 (1979). Es stellte sich heraus, daß dieses rekombinante Genom bei seinem Infizieren in Affennierenzellen Hybrid-mRNAs erzeugte, welche den Leaderbereich für die 165 und 195 späte RNA und die β-Globinkodierungssequenz enthielten. Diese Hybrid-mRNA erzeugte beträchtliche Mengen des Kaninchen-β-Globinpolypeptids. Mulligan et al. besprechen einen Versuch, bei dem Mutanten, die einen Mangel an Spleißfähigkeit aufwiesen, keine diskreten mRNAs erzeugen konnten. Ebda, S. 109.
Um die physiologische Rolle des RNA-Spleißens bei der Genexpression festzustellen, manipulierten Hamer, D.H. und Leder, P., Cell 18, 1299-1302 (1979) die Stelle und/oder das Vorhandensein einer Spleißstelle in SV40-Rekombinanten, die in Affenzellen transfiziert waren. Hamer und Leder (oben) verwendeten eine Spleißstelle, die sich innerhalb des für das gewünschte Protein kodierenden Gens befand, oder verwendeten zwei Spleißstellensequenzen, wobei sich eine 5' zum und die zweite innerhalb des für das gewünschte Protein kodierenden Gens befand. Sie stellten fest, daß RNA durch all jene Viren transient produziert wurde, die zumindest eine funktionelle Spleißverbindungsstelle behielten. Sie schlossen daraus, daß das Spleißen eine Voraussetzung für eine stabile RNA-Bildung ist. Gruss, P. et al. PNAS (USA), 76, 4317-4321 (1979) bestätigten dieses Ergebnis und stellten fest, daß die Konstruktion eines SV40-Mutanten, der keine intervenierende Sequenz aufwies, kein nachweisbares Capsidprotein bewirkte. Diese zwei Artikel lassen vermuten, daß das RNA-Spleißen in einer rekombinanten Umgebung wichtig sein kann. Andere Untersuchungen gingen jedoch vom Spleißen ab, um Proteine nur unter Verwendung von 5'-Steuersignalen wie z. B. Verstärkern, sowie Promotoren und 3'-Polyadenylierungsstellen zu exprimieren. Reddy, U.B. et al. stellten tatsächlich in einer vor kurzen veröffentlichten Arbeit (Transcriptional Control Mechanisms, J.Cell.Biochem.Suppl., 10D, 154 (1986)) fest, daß der Einschluß von Intronen in einem Expressionsvektor die Menge des gewünschten exprimierten Proteins eigentlich verringerte.
Man kann nicht immer eine direkte Expression unter Verwendung von standardmäßigen rekombinanten Steuersignalen wie z. B. Verstärkern, Promotoren und 3'-Polyadenylierungsstellen erreichen. Der SV40-Promotor ohne eine Spleißstelle wurde zum Lenken der Expression von mehreren cDNAs verwendet. (β-Galaktosidase, Hall, C.V. et al., J.Mol.Applied Genetics 2; menschliches Interferon, Gray, P.W. et al., Nature 295, 503 (1982); Hämagglutinin, Gething, et al. Nature 293, 620 (1981); menschliche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, McLean, J., et al., PNAS 33, 2335 (1986); DHFR, Simonsen, C.C. et al., PNAS 80, 2495 (1983); menschliches Interleukin-2, Leonard, W.T. et al., Nature 311, 626 (1984); ras-2, Capon D.J. et al. Nature 304,1983; src, Snyder, M.A. et al., Cell 32, 891 (1983); und Hepatitis B-Oberflächenantigen, Crowley, C.W. et al., Mol.Cell.Biol. 3, 44-55 (1983)).
Transiente Expressionssysteme wurden als Hilfsmittel rekombinanter Technologie verwendet. Die Verwendung von transienten Expressionssystemen erleichterte z. B. die Analyse von Promotorsequenzen, die Wirkung von Verstärkern und die Demonstration von Transkriptionsregulierung. Ein gut charakterisiertes transientes Expressionssystem ist jenes für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (Gorman, C.M. et al., Mol.Cell.Biol.2 : 1044-1051 (1982)).
Es ist bekannt, daß verschiedene virale Proteine, die in durch DNA-Viren infizierten Zellen erzeugt werden, virale Gene aktivieren, die in späteren Phasen des zeitlich regulierten lytischen Lebenszyklus exprimiert werden (Keller, J.M. et al., Cell 36 : 381-389 (1984)). Diese Proteine enthalten das Affenvirus 40 (SV40) T-Antigen, das Adenovirus E1a- und E1b-Protein, die Herpesvirus-unmittelbar frühen (IE) Proteine sowie menschliche und Affen-Immunschwächeviren. (Benoist, C. und Chamber, P., Nature (Lond) 290 : 304-310 (1981)); Hearing, P. und Shenk, T., Cell 39: 653-662 (1983); Rosen, C. et al., Nature 319, 555-559 (1986)). Diese Proteine sind die Produkte von Genen, die wirksame, durch cis-wirkende Elemente aktivierte Promotoren enthalten. Jedes Protein kann auch durch Aktivieren der Expression anderer viraler Gene eine trans-aktivierende Funktion aufweisen, um es dem Virus zu ermöglichen, durch seinen lytischen Zyklus voranzukommen. Eine Transkriptionsaktivierungsfunktion durch Zunahme der Expression von anderen viralen Genen jedes dieser Proteine wurde in seinem jeweiligen Virensystem nachgewiesen. Da diese Transkriptionsaktivierung durch Cotransfektion eines getrennten Plasmids erfolgen kann, bezeichnet man diese Wirkung als "Trans-Aktivierung" (Berk, A.J. et al. Cell 17 : 935-944 (1979); Brady, J. et al. PNAS (USA) 81 : 2040-2044 (1984); Dixon, R.A.F. und Shaffer, P.A., J.Virol. 36: 189-203 (1980); Jones, N. und Shenk. T., PNAS (USA) 76 : 3665-3669 (1979)). Einige Daten über transiente Expression mit E1a- und den IE-Proteinen zeigen an, daß diese Proteine auch Promotoren trans-aktivieren können, die zu ihrem jeweiligen Virensystem nicht homolog sind. (Green, M.R. et al., Cell 35 : 137-148 (1983); Imperiale, M.R. et al., Cell 35 : 127-136 (1983)). Andere Daten lassen vermuten, daß E1a einige Verstärker unterdrückt. (Borelli, E.R. et al., Nature (Lond.) 312 : 608-612 (1984)).
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein verbessertes transientes Expressionssystem bereitzustellen, das fähig ist, ein gewünschtes Protein zu erzeugen; es wird z. B. die zur Erreichung einer kontinuierlichen Erzeugung notwendige Zeit eliminiert, um ein gewünschtes Protein zu erhalten; weiters werden geeignete Mengen eines gewünschten rekombinanten Proteins etwa einen Tag bis zwei Wochen nach der Transfektion bereitgestellt. Wie hierin beschrieben stellt die Erfindung unter anderem bestimmte trans-aktivierende Faktoren und/oder Translationssteuereffektoren bereit, welche fähig sind, die Ausbeuten eines gewünschten Proteins in einem transienten Expressionssystem durch Stabilisieren der transfizierten DNA zu verbessern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zur Erzeugung eines gewünschten heterologen Proteins in einer Wirtsnierenzelle bereit, das folgendes umfaßt: das Konstruieren eines ersten Expressionsvektors der einen CMV-Promotor, eine stabilisierende Sequenz, für ein gewünschtes heterologes Protein kodierende DNA und eine Polyadenylierungssequenz umfaßt; das Transfizieren der Wirtszelle mit dem ersten Expressionsvektor; das Transfizieren der Wirtszelle mit einem Vektor, der einen Adenovirus-trans-aktivierenden Proteineffektor erzeugt; und das Kultivieren der transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Erzeugung des gewünschten Proteins günstig sind; sowie das Gewinnen des gewünschten Proteins in geeigneten Mengen innerhalb von typischerweise etwa zwei Tagen bis etwa 14 Tagen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zusätzlich die Transfektion der Wirtszelle mit einem Vektor umfassen, der fähig ist, einen Translationssteuereffektor zu exprimieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung geeigneter Mengen eines gewünschten Proteins, ohne eine kontinuierliche Erzeugung schaffen zu müssen. Die vorliegende Erfindung bietet durch Vorsehen geeigneter Mengen eines gewünschten Proteins in einer relativ kurzen Zeitspanne bedeutende Vorteile. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die zur Herstellung brauchbarer Mengen eines gewünschten heterologen Proteins durch transiente Expression transfiziert ist. Die vorliegende Erfindung kann ein transientes Expressionssystem bereitstellen, das die Wechselwirkung zwischen spezifischen Vektorkomponenten und bestimmten trans-aktivierenden Proteinen optimiert und das die Expression in einem transienten System durch Transfektion mit Translationssteuereffektoren steigern kann.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 Konstruktion eines Faktor-VIII-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für Faktor VIII verwendet wird. pF8CIS.
Fig. 2 Konstruktion eines Faktor-VIII-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für Faktor VIII verwendet wird. pF8SCIS.
Fig. 3 Immunoperoxidase-Färben von Zellen nach der Transfektion (A) zeigt die Expression nach der Transfektion mit pF8CIS (B) zeigt die Expression nach der Transfektion mit pF8SCIS.
Fig. 4 Konstruktion eines Faktor-VIII-Variantenexpressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für die Faktor-VIII-Variante verwendet wird, pF8CIS9080.
Fig. 5 Konstruktion eines Expressionsvektors, der für Faktor VIII kodierende cDNA enthält, der durch das aktivierte Protein C gegenüber proteolytischem Spalten resistent ist. pF8CIS-336E.
Fig. 6 Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine cDNA enthält, die für ein Fusionsprotein von Faktor VIII kodiert, der durch das aktivierte Protein C gegenüber proteolytischem Spalten resistent ist. pF89080-336E.
Fig. 7 Konstruktion eines Prorelaxin-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für Prorelaxin verwendet wird. pCIHRX.
Fig. 8 Konstruktion eines Prorelaxin-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für Prorelaxin verwendet wird. pCISRX.
Fig. 9 Konstruktion eines t-PA-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für t-PA verwendet wird. pCIHt-PA.
Fig. 10 Sequenz eines Abschnitts von pF8CIS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors, der den Cytomegalovirus-Verstärker, Promotor (Nukleotide 1-732), die stabilisierende Sequenz, d. h. die Spleißdonorintronsequenz, das Intron des variablen Bereichs von Ig und die Spleißakzeptorsequenz (Nukleotide 733-900) enthält.
Fig. 11 Sequenz eines Abschnitts von pF8SCIS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors, der den SV40-Verstärker und Promotor (Nukleotide 1-360), die stabilisierende Sequenz, die den Cytomegalovirus-Donor und die Intronsequenz enthält, das Intron des variablen Bereichs von Ig und die Spleißakzeptorsequenz (Nukleotide 361-580) enthält.
Fig. 12 Sequenz eines Abschnitts von pF8CSSS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors, der den Cytomegalovirus-Verstärkerpromotor und Leader (Nukleotide 1-732), die stabilisierende Sequenz einschließlich des konstruierten Spleißdonors und der Akzeptorsequenz (Nukleotide 733-736) und den verbleibenden Leader enthält.
Fig. 13 Konstruktionen eines t-PA-Expressionsvektors, der zum Etablieren von Erzeugungszellinien für t-PA, pCIStPA verwendet wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Definitionen und Allgemeine Verfahren

Der hierin verwendete Ausdruck "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die eine Reihe von Nukleotiden in einer 5' bis 3'-Phosphatdiesterverknüpfung umfaßt, die entweder eine RNA- oder eine DNA-Sequenz sein kann. Im Falle einer DNA kann die Nukleotidsequenz entweder ein- oder doppelstrangig sein. In ähnlicher Weise bezieht sich "DNA-Sequenz" sowohl auf ein- als auch auf doppelstrangige Ausführungsformen.
"Erwünschtes heterologes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das wünschenswerterweise in einer Wirtszelle exprimiert wird, das die Wirtszelle jedoch normalerweise selbst nicht oder nur in geringen Mengen produziert und das für den Fortbestand der Zelle normalerweise nicht erforderlich ist. Ein solches Protein enthält irgendein Molekül, das die prä- oder reife Aminosäuresequenz und Aminosäure oder Glykosylierungsvarianten (einschließlich natürlicher Allele) besitzt, die fähig sind, eine biologische Aktivität zeigen zu können, welche dem genannten gewünschten heterologen Protein entspricht. Beispiele solcher Proteine sind: Wachstumshormone, Insulin, Faktor VIII, Gewebeplasminogenaktivator, Tumornekrosefaktor alpha und beta, Lymphotoxin, Enkephalinase, menschliches Serumalbumin, Muller'sche Hemmsubstanz, Relaxin, Gewebefaktorprotein, Inhibin, Erythropoietin, Interferon alpha, beta und gamma, Superoxiddismutase, zerfallsbeschleunigender Faktor, virales Antigen, wie z. B. ein Abschnitt der AIDS-Hülle und Interleukin.
"Spleißen" bezieht sich auf den Mechanismus, durch den ein einzelnes funktionelles RNA-Molekül durch die Entfernung eines oder mehrerer innerer RNA-Abschnitte während des Verarbeitens des primären Transkripts erzeugt wird. Man ist der Ansicht, daß das Spleißen mit dem "Herausloopen" des Introns beginnt, so daß das 5'-Ende des Introns (wird als Donor bezeichnet) neben dem 3'-Ende des Introns (wird als Akzeptor bezeichnet) angeordnet ist. Ein Vergleich der Basensequenzen an Intron-Exon-Verbindungsstellen zeigt Konsenssequenzen, wobei die ersten zwei Basen am 5'-Ende jedes Introns GT und die letzten zwei Basen am 3'-Ende AG sind.
"Gespleißte mRNA" bezieht sich hierin auf mRNA, die entweder durch die Entfernung von einem oder mehreren inneren RNA-Abschnitten oder durch Konstruieren einer DNA erzeugt wird, die, wenn sie transkribiert wird, eine mRNA mit den gleichen Eigenschaften erzeugt wie eine mRNA, die dem Spleißen ausgesetzt, aus der aber tatsächlich keine Nukleotidsequenz entfernt wurde.
"Stabilisierende Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die eine gespleißte mRNA entstehen läßt, indem sie entweder für eine Spleiß- Donor-Intron-Akzeptorsequenz oder eine Sequenz kodiert, die eine volle Konsenssequenz oder einen Teil davon für die Donor- und Akzeptorsequenz und die geeigneten Nukleotide an der Donor/Akzeptor-Verbindungsstelle umfaßt, so daß die resultierende mRNA funktionell einer mRNA, die gespleißt worden ist, ähnelt. Die stabilisierende Sequenz wird in die Leadersequenz des für das gewünschte heterologe Protein kodierenden Gens eingesetzt. "Leadersequenz" bezieht sich auf jenen mRNA-Bereich, welcher im 5'-untranslatierten Bereich zwischen der CAP-Stelle und dem AUG-Translationsstartsignal ist.
"Konsenssequenz" bezieht sich hierin auf die Sequenzen CA AG/GTGA AGT, von denen man herausfand, daß sie an der Exon-Intron-Grenze (oder Donorsequenz) auftreten und auf (TC)nN CTAG/G, von denen man herausfand, daß sie an der Intron-Exon-Grenze (oder Akzeptorsequenz) auftreten. Siehe Mount, S.M., Nucleic Acids Research 10(2), 459-472 (1982). Analysen der Häufigkeit, mit der einzelne Basen an bestimmten Positionen auftreten, ergaben eine Konsenssequenz für die Donor- und Akzeptorsequenzen. Es ist auch bekannt, daß Introne mit GT beginnen und mit AG enden. Breathnach, R. et al., PNAS (USA) 75, 4853-4857 (1978). Es ist auch bekannt, daß bestimmte vielteilige Leadersequenzen, in denen Mehrfach-Spleißereignisse auftreten, möglicherweise zusätzliche Faktoren früher Genfunktion benötigen, um eine korrekte Verarbeitung zu erreichen. Siehe Babiss, L.E. et al., Mol. and Cell. Biol. 5 (10), 2552-2558 (1985). Ein Fachmann auf dem Gebiet, der das Wissen über die Donor- und Akzeptorkonsenssequenzen, vielteilige Leadersequenzen, in denen Mehrfach-Spleißereignisse auftreten, die eine frühe Genfunktion erfordern, und die Konsensspleißsequenzen-Regel in Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, ist in der Lage, eine bestimmte stabilisierende Sequenz für ein gewünschtes Protein auszuwählen.
"Steuerbereich" bezieht sich auf spezifische Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden von eukaryotischen Genen, die bei der Steuerung entweder der Transkription oder der Translation beteiligt sein können. Praktisch alle eukaryotischen Gene haben einen AT-reichen Bereich, der etwa 25 bis 30 Basen stromaufwärts von der Stelle angeordnet ist, an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromaufwärts vom Transkriptionsstart befindet, ist ein CXCAAT-Bereich, worin X ein beliebiges Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für das Hinzufügen des Polyadenylierungsschwanzes an das 3'-Ende der transkribierten mRNA sein kann.
"Promotor"bezieht sich auf das Nukleotidsegment, das von den RNA-Polymerase-Molekülen erkannt wird, die die RNA-Synthese in Gang setzen. Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckmäßig als ein Hind III E Restriktionsfragment erhalten. (Greenaway, P.J. et al., Gene 18,355-360 [1982]).
"Verstärker" bezieht sich auf cis-wirkende DNA-Elemente (üblicherweise von etwa 10-300 bp), die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen. Die Transkription einer DNA, die für ein gewünschtes heterologes Protein kodiert durch höhere Eukaryoten, wird durch Einsetzen einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Verstärker sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig; man stellte fest, daß sie sich 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky, M.L., et al., Mol.Cell Bio. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst (Osborne, T.F., et al., Mol.Cell Bio. 4, 1293 (1984)) befinden. Es ist bekannt, daß viele Verstärkersequenzen aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin) stammen. Typischerweise verwendet man jedoch einen Verstärker aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der Cytomegalovirus frühe Promotorverstärker, der Polyomaverstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirusverstärker.
Die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tierzellen sowie menschlichen oder nukleierten Zellen aus anderen multizellularen Organismen) verwendeten Expressionsvektoren enthalten auch jene Sequenzen, die für die Termination der Transkription erforderlich sind, welche die mRNA-Expression beeinflussen können. Diese Bereiche sind als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für das gewünschte heterologe Protein kodierenden mRNA transkribiert. Die 3'-untranslatierten Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminationsstellen.
Expressionsvektoren können auch ein Auswahlgen enthalten, das man auch als auswählbaren Marker bezeichnet. Ein Auswahlgen kodiert für ein Protein, das man manchmal ein sekundäres Protein nennt und das für das überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Beispiele geeigneter auswählbarer Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase oder Neomycin. Wenn solche auswählbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle übertragen werden, kann die transformierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie unter selektiven Druck gestellt wird. Es gibt zwei weitverbreitete, voneinander zu unterscheidende Kategorien selektiver Systeme. Die erste Kategorie beruht auf dem Zellmetabolismus und der Verwendung einer Mutantenzellinie, die nicht fähig ist, unabhängig von einem ergänzten Medium zu wachsen. Zwei Beispiele sind CHO DHFR&supmin;-Zellen und Maus-LTK&supmin;-Zellen. Diese Zellen sind nicht in der Lage, ohne die Zugabe von solchen Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da diese Zellen einige für einen vollständigen Nukleotidsyntheseweg erforderliche Gene nicht aufweisen, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist das Einsetzen eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, welche die jeweiligen Gene nicht aufweisen, wodurch sich ihre Wachstumserfordernisse ändern. Einzelne Zellen, die mit dem DHFR- oder TK-Gen nicht transformiert wurden, sind nicht fähig in einem nicht ergänzten Medium zu überleben. Daher erfordert eine direkte Auswahl dieser Zellen ein Zellwachstum in Abwesenheit von Ergänzungsnährstoffen.
Die zweite Kategorie ist die dominante Auswahl, die sich auf ein in einem beliebigen Zelltyp verwendetes Auswahlschema bezieht und die Verwendung einer Mutantenzellinie nicht erfordert. Diese Schemata sehen typischerweise die Verwendung eines Arzneimittels bzw. Medikaments zum Hemmen des Wachstums einer Wirtszelle vor. Diese Zellen, die ein neuartiges Gen aufweisen, würden ein Protein exprimieren, das Arzneimittelresistenz verleiht und die Auswahl überleben würde. In Beispielen einer solchen dominanten Auswahl werden die Arzneimittel Neomycin, Southern P. und Berg, P., J.Molec.Appl.Genet. 1, 327 (1982), Mycophenolsäure, Mulligan, R.C. und Berg, P. Science 209, 1422 (1980) oder Hygromycin, Sugden, B. et al., Mol.Cell.Biol. 5 : 410-413 (1985) verwendet. Diese drei soeben angeführten Beispiele sehen den Einsatz von bakteriellen Genen unter eukaryotischer Steuerung vor, um Resistenz gegenüber dem jeweils geeigneten Arzneimittel Neomycin (G418 oder Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) oder Hygromycin zu verleihen. In den folgenden Versuchen ist das gewählte selektive Agens am öftesten G418 Geneticin, soferne nicht spezifisch auf CHO-DHFR&supmin;-Zellen Bezug genommen wird. In diesem Fall wurde die direkte Auswahl zur DHFR-Erzeugung verwendet.
"Verstärkung" bezieht sich auf die Zunahme oder Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Die Verstärkung wird unter Verwendung eines Auswahlagens erreicht, z. B. durch Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert. Die Verstärkung oder das Herstellen aufeinanderfolgender Kopien des DHFR-Gens führt zu größeren Mengen an DHFR, die angesichts größerer MTX-Mengen produziert werden. Der Verstärkungsdruck wird trotz des Vorhandenseins endogener DHFR durch Zugabe von noch mehr MTX zum Medium angelegt. Die Verstärkung eines gewünschten Gens kann durch Cotransfizieren einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid, das eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA aufweist, und dem DHFR oder dem Verstärkungsgen erreicht werden, so daß eine Cointegration eintreten kann. Man stellt sicher, daß die Zelle mehr DHFR benötigt, wobei dieses Erfordernis durch die Replikation des Auswahlgens erfüllt wird, indem nur jene Zellen ausgewählt werden, die in aufeinanderfolgenden Durchgängen immer höherer MTX-Konzentrationen wachsen können. Solange ein für ein gewünschtes heterologes Protein kodierendes Gen mit dem verstärkbaren Gen cointegriert, führt die Replikation dieses Gens zur Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Dies hat zur Folge, daß vermehrte Kopien des Gens, d. h. ein verstärktes Gen, das für das gewünschte heterologe Protein kodiert, mehr gewünschtes heterologes Protein exprimieren.
Bevorzugte geeignete Wirtsnierenzellen zum Exprimieren der gewünschten heterologen Proteine in höheren Eukaryoten enthalten irgendeine Zellinie, welche die trans-wirkenden Proteine E1a und E1b herstellt, wie z. B. die menschliche Embryonennierenlinie (293, Graham, F.L. et al. J.Gen.Virol. 36, 59 (1977); ein Klon von 293 Zellen, die angepaßt sind, in Joklicks-Medien in Suspension zu wachsen, wird als 293s bezeichnet) und JW2 (Whittaker, J.L. et al., M.C.B 4 : 110-116 (1984)). Während diese zwei Zellinien transformiert wurden, um die transaktivierenden Proteine E1a und E1b endogen zu erzeugen, wird auch erwogen, daß auch andere Wirtsnierenzellen mit diesen oder gleichwertigen trans-wirkenden Proteinen transformiert werden, so daß man die Wirtszelle in Einklang mit den Lehren der vorliegenden Erfindung verwenden kann. Zu solchen Wirtszellen gehören: Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Affennierenzellen (CVI ATCC CCL 70); Afrikanische Grüne Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad.Sci. 383, 44-68 (1982)); und menschliche KB-Zellen (Babiss, L.E. et al., J.Virol 46 : 454-465 (1983)). Wirtszellen wurden in F12: DMEM (Cibco) 50 : 50 mit hinzugefügtem Glutamin und ohne Antibiotika kultiviert.
"Trans-aktivierende Faktoren" beziehen sich auf Adenovirus frühe virale Proteine, wie z. B. Adenovirus E1a- und E1b-Protein (Loeken M.R. (1986) ebda; Triesmar, R., (1983) oben; Gaynor, R.B. et al., PNAS 81: 1193 (1984); Imperiale, M.J. et al., oben). Diese Proteine sind die Produkte von Genen, die wirksame Promotoren enthalten. Die Transkriptionsaktivierungsfunktion jedes trans-aktivierenden Faktors besteht darin, die Expression von anderen viralen Genen zu erhöhen. Diese trans-aktivierenden Faktoren können auch Promotoren aktivieren, die zu ihren viralen Genen nicht homolog sind.
"Translationssteuereffenktoren" bezieht sich auf eine bestimmte RNA, wie z. B. eine virus-assoziierte RNA, wobei diese Effektoren eine Translation von RNA bewirken, die für ein gewünschtes heterologes Protein kodiert. Es gibt ähnliche RNA-Polymerase III (pol III) Transkripte, die im Epstein Barr-Virus (EBV) (Bhat, R.A. und Thimmappaya, B., J.Virol 56, 750 (1985)) und dem HBV (AuFiero, B. et al., Abstract Conference on SV40 Polyoma and Adenovirus (Cambridge, England, Juli 1987) S.88) vorhanden sind, die ähnliche Translationssteuerwirkungen aufweisen können (Thimmappaya, B. et al., Cell 31 : 543 (1982); Svenson, C. & Akusjarvi, G., EMBO J. 4 : 957 (1985); Svenson, C. und Akusjarvi, G., EMBO J. 4 : 957 (1985); Schneider, R. et al., Cell 37: 291 (1984)). Der vorgeschlagene Wirkungsmechanismus einer solchen RNA wurde beschrieben. (Reichel, P.A. et al., Nature, 313: 196 (1985); Kitajewski, J. et al., Cell 45: 195 (1986); und O'Malley, R. et al., Cell 44 : 391 (1986).
"Transformation" bedeutet das Einsetzen von DNA in einen Organismus, so daß die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Soferne nicht anders angegeben ist das hierin angewendete Verfahren zur Transformation der Wirtszellen das Verfahren von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52, 456-457 (1973).
Wirtszellen können mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert werden, die zum Induzieren von Promotoren, Auswählen von Transformanten oder Verstärken von Genen in geeigneter Weise modifiziert werden. Die Kultivierungsbedingungen wie z. B. Temperatur, pH-Wert u. a. sind die gleichen wie jene, die vorher für die zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet werden; sie sind für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob nun irgendwelche Kodierungssequenzen tatsächlich exprimiert sind oder nicht. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, z. B. CaPO&sub4; und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion erkennt man im allgemeinen daran, wenn irgendein Anzeichen des Wirkens dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine erfolgreiche Transfektion jedoch auf die stabile kontinuierliche Expression eines gewünschten heterologen Proteins durch eine Wirtskultur über mehrere Generationen.
"Transiente Expression" bezieht sich auf eine nichtverstärkte Expression unter Verwendung des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung innerhalb von etwa einem Tag bis zwei Wochen nach der Transfektion. Die optimale Zeit für die transiente Expression eines bestimmten gewünschten heterologen Proteins kann variieren und hängt von mehreren Faktoren ab, darunter vom jeweils gewünschten heterologen Protein, dem transwirkenden Protein, dem Translationssteuereffektor und der Wirtszelle. Die transiente Expression tritt ein, wenn das bestimmte Plasmid, das transfiziert wurde, funktioniert, d. h. transkribiert und translatiert ist, um das gewünschte Protein zu erzeugen. Während dieser Zeit wird die in die Zelle eingetretene DNA zum Kern übertragen. Die DNA befindet sich in einem nicht-integrierten Zustand und ist innerhalb des Kerns frei. Die Transkription des durch die Zelle aufgenommenen Plasmids tritt während dieses Zeitraums ein. Vektoren, die als fähig identifiziert wurden, das gewünschte heterologe Protein transient zu erzeugen, können dann zum Etablieren einer stabilen kontinuierlichen Erzeugungszelle verwendet werden. Die transiente Expression bezieht sich auf einen kurzen Zeitraum nach der Transfektion, der etwa einen Tag bis etwa zwei Wochen, vorzugsweise einen Tag bis etwa sieben Tage und am bevorzugtesten etwa einen Tag bis etwa vier Tage beträgt, obwohl dies möglicherweise von den oben erörterten Faktoren abhängt. Nach der Transfektion kann die Plasmid-DNA durch Zellteilung abgebaut oder verdünnt werden. Es tritt eine Zufallsintegration innerhalb des Zellchromatins ein. Die erfindungsgemäße transiente Expression erzeugt transformierte Zellen mit stabiler transfizierter DNA, die fähig ist, brauchbare Mengen eines gewünschten Proteins zu erzeugen.
Man entwickelte einen Assay, der auf der Immunoperoxidase-Färbung einer transfizierten Zelle beruht, um rasch festzustellen, ob ein gewünschtes heterologes Protein exprimiert wurde (Gorman, C.M. et al., Cell 42: 519-522 (1985)). Monoklonale Antikörper, die für das gewünschte heterologe Protein spezifisch sind, wurden zur Verwendung in diesem Assay gescreent. Den Vektor enthaltende Wirtszellen wurden gefärbt und mit Elternzellinien zum Screenen von Zellen verglichen, die ein spezielles Protein erzeugen. Ein monoklonaler Antikörper wurde ausgewählt, der das stärkste Signal mit der geringsten Menge an Hintergrund ergab. Transiente Transfektionen wurden durchgeführt, um Vektoren auf die Fähigkeit zu überprüfen, ein gewünschtes Protein zu erzeugen. Zellen (Cos, 293, CHO, BHK, TM4) wurden mittels des CaPO&sub4;-Verfahrens transfiziert. (Graham und van der Eb modifiziert durch Gorman, C.M. et al., Science 221, 551-553 (1983)). Die Autoren der vorliegenden Erfindung verwendeten 10 Mikrogramm pro Milliliter Niederschlag des speziellen, zu prüfenden Proteinvektors. Die Niederschläge wurden 3-4 Stunden auf den Zellen gelassen. Die Zellen wurden durchschnittlich eine Minute lang Glyzerin-schockbehandelt. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton-Methanol (50 : 50) fixiert und mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gewaschen. Das Färben erfolgte entweder mittels eines monoklonalen unverdünnten Antikörperüberstandes oder eines gereinigten Antikörpers, der in 10% fötales Kalbsserum enthaltender PBS 1 : 3000 verdünnt war. Dieser erste Antikörper blieb 2 Stunden lang auf den Zellen. Während dieser Zeit wurden Platten auf eine Langsam-Schüttelvorrichtung gelegt. Ober einen Zeitraum von 10 Minuten wurden Zellen fünfmal gewaschen. Der zweite verwendete Antikörper war Kaninchen-Antimaus-IgG (Dakopatts). Dieser wurde in PBS und fötalem Kalbsserum mit einer Verdünnung von 1 : 150 verdünnt. Nach einer zweistündigen Inkubation fand eine Reihe Waschungen statt. Zur Entwicklung des Peroxidasereagens wurde Ortho-Diansidin als Substrat verwendet. Eine äthanolgesättigte Lösung von Ortho-Diansidin wurde 1 : 100 in PBS mit einer 1:10.000-Verdünnung von Wasserstoffperoxid verdünnt. Dieses Substrat wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC auf den Zellen gelassen.
Durch dieses Verfahren wurde eine Vielfalt von Vektoren, die für das gewünschte Protein kodieren, rasch hinsichtlich der Fähigkeit gescreent, die Proteinexpression zu lenken.
Zur Vereinfachung der folgenden Beispiele seien bestimmte oft auftretende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben.
"Plasmide" werden durch ein kleingeschriebenes p gekennzeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin angeführten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich erhältlich oder können aus verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahren erzeugt werden. Weiters sind äquivalente Plasmide zu den hierin beschriebenen auf dem Gebiet bekannt und sind für den Fachmann offenkundig.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf das katalytische Spalten der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen, Restriktionsstellen, in der DNA wirkt. Die hierin verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse wurden so verwendet, wie sie für einen Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Zu analytischen Zwecken wird typischerweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Zum Isolieren von DNA-Fragmenten für die Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 10 ug DNA mit 20 bis 40 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen digeriert. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angegeben. Es werden Inkubationszeiten üblicherweise von etwa einer Stunde bei 37ºC verwendet, diese Zeiten können jedoch je nach Anweisungen der Lieferfirmen variieren. Nach der Digestion fand die Reaktion direkt auf einem Gel statt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
"Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, daß die zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments "ringschließen" oder eine geschlossene Schleife bilden, die das Einsetzen eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Die Verfahrensweisen und Reagentien zur Dephosphorylierung sind herkömmliche. Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning, S. 133-134. Reaktionen unter Verwendung von BAP erfolgen in 50 mM Tris bei 68ºC, um die Aktivität jeglicher Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Reaktionen dauerten eine Stunde. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.
"Oligonukleotide" bezieht sich auf ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide kurzer Länge, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgels gereinigt werden.
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren des Bildens von Phosphodiesterbindungen zwischen doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., ebda., S. 146). Soferne nicht anders angegeben kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und bekannter Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
"Auffüllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf Verfahrensweisen, durch die das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer Restriktionsenzym-gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dies beseitigt den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Hilfsmittel zum Umwandeln eines restriktionsgeschnittenen Endes, das kohäsiv sein kann, wobei die Enden nur durch eines oder einige wenige andere Restriktionsenzyme gebildet werden, zu einem Terminus, der mit jeder beliebigen stumpfschneidenden Restriktionsendonuklease oder einem anderen aufgefüllten kohäsiven Terminus kompatibel ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2-15 ug der Ziel-DNA in einem 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH-Wert 7,5) Puffer bei etwa 37ºC in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 uM jedes der vier Desoxynukleosidtriphosphate. Die Inkubation ist im allgemeinen nach 30-minütiger Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolausfällung abgeschlossen.
"Northern"-Blotting ist ein Verfahren, mit dem das Vorhandensein einer zellularen mRNA durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet Northern-Analyse (soferne nicht anders angegeben) die elektrophoretische Trennung der mRNA auf 1%iger Agarose in Gegenwart eines Denaturierungsmittels (Formaldehyd 7%) und die Übertragung zur Nitrozellulosehybridisierung mit dem markierten Fragment, wie dies durch Maniatis, T. et al., ebda, S. 202 beschrieben ist.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen lediglich die beste bekannte Durchführungsart der Erfindung, soll sie aber in keiner Weise einschränken.

BEISPIEL 1

Allgemeine Verfahren für ein transientes Expressionssystem

a) Für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierende Plasmide

Der gesamte Bereich, der den CMV-Verstärkerpromotor und den unten angeführten Spleißdonorbereich enthält (beschrieben in Beispiel 3, Unterabsatz 1 (a) (1)) wurde in pUC8 (New England Biolabs) geklont. Der CMV-Promotor wurde aus dem pUC8-Konstrukt durch einen HpaII stumpfen-BamHI-Linker und ein HindIII-Digest entfernt, das in pUC19 (New England Biolabs) (bezeichnet als pUC.CMV) geklont wurde, um die verfügbaren Klonierungsstellen zu vermehren und die 120 bp 3' von der Capstelle angeordnete Spleißdonorsequenz zu entfernen. Der CAT-Kodierungsbereich, einschließlich der t-Spleißung des SV40-T Antigens und der Polyadenylierungsstelle wurde aus pSV2CAT (Gorman, C. et al., Mol.Cell.Biol. oben) als ein HindIII-BamHI-Fragment subgeklont und in den pUC.CMV-Vektor eingesetzt, um pUC.CMVCAT zu ergeben. pCMVpro, ein Vektor, bei dem ein Großteil des CMV-Verstärkers entfernt ist, wurde durch Schneiden von pUC.CMVCAT mit AatII konstruiert. Dieser 3'-Überhang wurde mit polI aufgefüllt und der Vektor mit BamHI geschnitten. Dieses Fragment wurde in pUC18 (New England Biolabs) an den SmaI- und BamHI-Stellen subgeklont. Dieser Vektor enthält 100 bp stromaufwärts vom CMV TATA-Boxbereich, so daß die CAAT-Box und der GC-reiche Bereich auch bewahrt werden. Zum Vergleich wurden auch die Vektoren, die den SV40-Verstärker und Promotor (pSV2cat) enthielten (Gorman, C. et al., Mol.Cell.Biol. oben) oder der SV40-Promotor alleine (pSV1cat) (Gorman, C. et al., ebda) verwendet. Es wurden zwei zusätzliche Vektoren, die den CMV-Verstärker und den SV40-Promotor enthielten (pCMVSVcat-Konstruktion ist unten beschrieben), sowie ein Vektor konstruiert, der den SV40-Verstärker und den CMV-Promotor enthielt (pSVCMVcat-Konstruktion ist unten beschrieben). Ein inneres Steuerplasmid, das während der CAT-Transfektionsversuche verwendet wurde, umfaßt die für hGH kodierende DNA (über ein in pUC8 geklontes EcoRI-Fragment; siehe US PS 4.342.832), die 3' von RSV LTR geklont war. Die poly A-Hinzufügungsstelle des Hepatitis-Oberflächenantigens wurde in diesem Vektor, pRSVhGH, verwendet.
Zur Konstruktion von pSVCMVcat, der den SV40-Verstärker und den CMV-Promotor enthielt, gingen die Autoren der vorliegenden Erfindung vom oben beschriebenen pCMVpro-Vektor aus. Die einzige KpnI-Stelle von pUC18 wurde geschnitten und der 3'-Überhang wie bereits beschrieben durch DNA-Polymerase I abgestumpft. In diese stumpfe Stelle, die sich unmittelbar 5' zum CMV-Promotor befindet, wurde der SV40-Verstärker eingesetzt. Man erhielt diesen Verstärker als ein 234 bp NcoI-PvuII-Fragment aus pSV2cat. Nachdem der 5'-Überhang des NcoI-Endes durch eine Klenow-Reaktion abgestumpft wurde, ergab eine Stumpfendligation den Vektor pSVCMVcat.
Um das Plasmid zu konstruieren, das den CMV-Verstärker und den SV40-Promotor enthielt, wurde pSV2cat (Gorman, C. et al., 1982 oben) mit SphI und AccI digeriert. Die resultierenden 3' überhängenden Enden wurden mittels der Exonukleaseaktivität abgestumpft, die im Holoenzym der DNA-Polymerase I vorhanden war. Ein 482 bp-Stück der den CMV-Verstärker enthaltenden DNA wurde in diesen Bereich gerade 5' zum SV40-Promotor eingesetzt. Um dieses Stück mit 482 bp zu erhalten, wurde pUC.CMV mit BanI und HindIII digeriert. Nach einer Klenow-Reaktion zum Abstumpfen der BamI-Stelle wurde das Fragment mit dem Fragment aus pSU2cat ligiert, um pCMVSVcat zu ergeben.
Für hohe Werte transienter Expression in 293 Zellen wurde eine Reihe von CMV-angetriebenen hGH-Vektoren konstruiert. Der Prototypvektor pF8CIS, weiter unten in Beispiel 3 beschrieben, wurde modifiziert, indem die Faktor VIII cDNA mit einem Polylinker versehen wird, der für die Restriktionsenzymerkennungsstellen für ClaI, XbaI, XhoI, NotI und HpaI kodiert. Die DNA für hGH wurde als ein abgestumpftes EcoRI-Fragment in eine abgestumpfte XhoI-Stelle subgeklont. Der erste Vektor in dieser Reihe, pCIShGH, enthält die SV40 poly A Hinzufügungsstelle 3' der hGH-cDNA gefolgt von einer SV40-Maus-Dihydrofolatreductase (DHFR)-Transkriptionseinheit. In pCIS4hGH ist der gesamte SV40 frühe Promotor-Ursprungs-DHFR-Bereich entfernt, so daß sich dieser Vektor in Gegenwart eines SV40 T-Antigens in Säugetierzellen nicht mehr replizieren kann. In pCIS5hGH ist der SV40-Ursprung noch vorhanden, doch die cDNA für DHFR und die Hepatitis-oberflächenantigen-Poly-A-Hinzufügungsstelle sind entfernt. Die Expression wurde durch Entfernung des DHFR-Gens erhöht, während der SV40-Ursprung zum Ermöglichen der Replikation beibehalten wurde.

b) Adenovirale Genvektoren

Die E1a-DNA (Zerler, B. et al., M.C.B. 7: 821 (1987) wurde aus Adenovirus-DNA in pUC8 subgeklont, um pUC.E1A zu ergeben. Die Plasmide enthielten die cDNA für die 12S und 13S Botschaften von E1a. Das die E1b-DNA enthaltende Plasmid ist durch Ruley, H.E. Nature 304 : 602 (1983) beschrieben. pUC.VA wurde durch Subklonen eines SmaI-HindIII-Fragments eines Adenovirus, das die VA RNA-Gene enthält (bei New England Biolabs erhältlich), in pUC19 hergestellt.
SV40 T-Antigen (beschrieben in Rio, D.C. et al., Science 227 : 23 (1985)) wurde für Replikationsuntersuchungen verwendet. Das Plasmid wurde durch pRSVTs markiert.

c) Transfektion

Zur Transfektion wurde das CaPO&sub4;-Verfahren angewendet. CAT-Transfektionen verwendeten insgesamt 5 Mikrogramm DNA für 0,5 ml Niederschlag zur Transfektion von 60 mm-Schalen. Von diesen 5 Mikrogramm waren 0,5 bis 1 Mikrogramm für CAT kodierende DNA, 100 Nanogramm waren pRSVhGH und die verbleibende DNA war ein aus pUC-Plasmid zusammengesetzter Träger. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Überstande durch den ImmunoRadioMetrischen Assay (IRMA-Assay) (im Handel bei Hybritech erhältlich) hinsichtlich hGH-Werten geprüft, und die Zellen wurden zur Herstellung von Zellysaten für den CAT-Assay geerntet. Cat-Aktivität wurde mittels C¹&sup4;-Chloramphenicol (CM), wie dies durch Gorman et al., beschrieben ist, oder durch das Verfahren unter Verwendung von H³-Natriumacetat (de Crombrugghe, et al., Nature 241: 237 (1973)), modifiziert durch Nordeen, S.K. et al., DNA 6 : 173 (1987) geprüft. CAT-Aktivität wurde hinsichtlich der Unterschiede in der Transfektionswirksamkeit gemäß dem Basiswert von in jeder Probe geprüftem hGH normiert.
Transiente Herstellung von hGH in 100 mm Schalen durch Transfektion mit 1 ml Niederschlag, der 10 Mikrogramm hGH-Plasmide und 105 Mikrogramm pUC.VA-DNA enthielt. Ein Zeitverlauf der Expression wurde durch Prüfen der Überstände zwischen 4 und 72 Stunden nach dem Glycerinschock bestimmt. Diese Überstände wurden durch IRMA geprüft.

Beispiel 2

Auswirkung des trans-aktivierenden Faktors auf die Expression

Die Expression des SV40-Verstärkerpromotor-Bereichs in 293 Zellen scheint verstärkerunabhängig zu sein. Durch den Einschluß des SV40-Verstärkers läßt sich keine zusätzliche Auswirkung auf die RNA-Synthese feststellen. Trans-aktivierende Faktoren, die sowohl den SV40 als auch den Polyoma-Immunoglobinverstärker binden und zu unterdrücken scheinen, sind in E1a enthaltenden Zellen vorhanden (Borelli, E. et al., Nature 312: 608 (1984); Velcich, A. und Ziff, E., Cell 40 : 705 (1985); Hen, R. et al., Science 230: 1391 (1985); Hen, R. et al., Nature 321: 249 (1986)). Die Transkription aus der Rous Sarcoma-Virus (RSV) langen terminalen Wiederholung (LTR) wird auch in 293 und JW2-Zellen oder in Gegenwart von E1a unterdrückt. Es ist bekannt, daß die RSV-LTR die Initiation der RNA-Synthese in Primatenzellen sehr wirkungsvoll lenkt (Gorman, C. et al., PNAS 79: 6777 (1982); Gorman, C. et al., Science 221 : 551 (1983)). Es ist jedoch aus Tabelle 1 ersichtlich, daß der relative Wert der CAT-Expression im Vergleich zur Expression in anderen Primatenlinien viel geringer aus dem RSV-Promotor in 293- und JW2-Zellen ist. Bei Cotransfektionsversuchen mit pRSVhGH, die in CV1-Zellen mit und ohne E1a durchgeführt wurden, nahmen die hGH-Werte in Gegenwart von E1a um das Zwanzigfache ab. Der Durchschnittswert von in CV-1-Zellen geprüftem hGH, die mit 100 ng pRSVhGH transfiziert sind, beträgt 58 ng/ml. Wenn 1 Mikrogramm plasmidhaltiges E1a in diesen Transfektionen einbezogen ist, fällt dieser Wert auf 3 ng/ml ab. Tabelle 1 Analyse der Speziespräferenz des CMV-Promotors Zelltyp Verstärker Promotor Hela
Tabelle 1. CAT-Aktivitätsdaten wurden durch das C¹&sup4;-Chloramphenicolverfahren bestimmt (Gorman et al., 1982), und die relative CAT-Expression in jeder Zellinie wird durch Extrakte von Zellen, die durch Plasmide transfiziert sind, welche das CMV- Verstärkerpromotor-Transkriptionselement enthalten, mit dem Prozentsatz von acetyliertem CM verglichen. Diese Daten stellen Wiederholungen von vier getrennten Transfektionen dar. Aufgrund von potentiellen Unterschieden in der Transfektionswirksamkeit zwischen den verwendeten Zellinien sollte sich der Vergleich auf die Expressionswerte aus den verschiedenen Vektoren innerhalb einer bestimmten Zellinie beschränken.
Es wurde gezeigt, daß der CMV-Verstärker in einer breiten Vielfalt von Zelltypen ein starker Verstärker ist (Boshart et al., 1985 oben). Überraschenderweise stellten die Autoren der vorliegenden Erfindung fest, daß der CMV-Promotor sehr wohl eine hohe Speziesspezifität aufweist, wobei sie in Hamsterzellen besonders schwach und in Primatenlinien, insbesondere in menschlichen Zellen (Tabelle 1) besonders stark ist. Mit dem z. B. in Zeilen 2 und 4 vorhandenen SV40-Verstärker ist der SV40-Promotor viermal wirksamer in Hamsterzellinien als der CMV-Promotor. Dies wird durch die Daten in Zeilen 1 und 3 von Tabelle 1 bestätigt. Der CMV-Promotor ist in allen drei dargestellten menschlichen Zellinien, d. h. 293, Hela und JW2, wirksam. Die absolute Menge an CAT-Aktivität variiert zwischen den Zelltypen. Die Expression ist in 293-Zellen größer als in CV1-, CHO- oder BHK-Zellen. Diese große Menge an CAT-Protein ist nicht einfach auf Unterschiede in der Transfektionswirksamkeit zurückzuführen, da alle CHO-, CV1- und 293-Zellen mit der relativ gleichen Wirksamkeit transfiziert wurden.
Die Auswirkung von trans-aktivierenden Faktoren der frühen adenoviralen Gene auf die Expression des CMV-Verstärkers und Promotors wurde untersucht. Man konnte keine konsequente Unterdrückung der CMV-Verstärkerpromotoreinheit wie bei SV40, Polyoma oder RSV beobachten (Tabelle 2). Man konnte jedoch beobachten, daß der CMV-Promotor durch Cotransfektion mit E1a trans-aktiviert wird. Dies erhöhte die Expression durchschnittlich um das Zwölffache. Tabelle 2 Auswirkung von E1a auf den Verstärker und Promotor Ela Versuch Verstärker Promotor
Tabelle 2. CAT-Aktivitäten wurden in einem regenerierenden Assay für tritiiertes Acetyl Co A unter Verwendung von H³-Natriumacetat bestimmt. Die Assays dauerten 1 Stunde lang, wobei nach 30 Min und 1 Stunde Aktivierungsbestimmungen durchgeführt wurden, um Linearität sicherzustellen. Die Daten sind als relative CAT-Einheiten im Vergleich zur CMV-Steuereinheit in CV-1 ohne hinzugefügtes E1a ausgedrückt. Dieser Wert wird auf 100 eingestellt. In Versuch 1 bezieht sich dieser Wert auf 155.828 cpm und in Versuch 2 auf 555.300 cpm. Die Veränderung der Expression beim Cotransfizieren dieser Plasmide ist in der ganz rechten Spalte angeführt ( ). (< ) zeigt eine Nettoabnahme der Expression und (> ) zeigt eine Nettozunahme der Expression an.
Der E1a-Bereich kodiert für fünf (5) getrennte Botschaften, d. h. Proteine. (Perricoudet, M.G. et al., Nature 281, 694 (1979); Ulfendall, P.J. et al., (1987) oben auf S. 130; Stephens, C. und Harlow, E., Abstract, Polyoma and Adenovirus Conference (Cambridge, England, 1987)). Die durch zwei dieser Botschaften kodierten Proteine wurden hinsichtlich ihrer Transkriptionsaktivierungsauswirkungen untersucht. Die Auswirkung des gesamten E1a-Bereichs und die getrennten Auswirkungen der 12S und 13S kodierten Proteine wurden untersucht. CV1-Affennierenzellen wurden mit einer Vielfalt an für CAT-kodierenden Plasmiden und Plasmiden transfiziert, welche den gesamten E1a-Bereich oder die cDNA's für die 12S- oder 13S-Botschaft enthielten. (Roberts, B.E. et al., J.Virol. 56, 406 (1985)). Eine kleine Menge eines inneren, das hGH-Gen enthaltenden Steuerplasmids wurde wie bereits beschrieben einbezogen. Die Cotransfektion von CV1-Zellen mit Plasmiden, die für die 12S- und 13S-Botschaften von E1a getrennt kodieren, führte dazu, daß das für 12S kodierende Protein beim Vorhandensein des CMV-Verstärkers eine geringe Auswirkung auf die Expression hat. Es wurde gezeigt, daß diese Botschaft einige Verstärker unterdrückt. Tabelle 3 zeigt, daß die Cotransfektion der 13S-cDNA eine starke positive Auswirkung auf die CMV-gerichtete Transkription aufweist, indem die CAT-Aktivität um das 7- bis 15-fache gesteigert wird. Die größte Expressionszunahme läßt sich beim Verstärker minus Konstrukt feststellen - eine 15-fache Zunahme allein auf dem Promotor. Wenn der gesamte E1a-Bereich in die Transfektion einbezogen wird, kann man eine marginale Auswirkung auf die Verstärker+Promotorkombination von CMV beobachten. Unter diesen Bedingungen tritt jedoch allein auf dem Promotor eine 16-fache Zunahme ein. Tabelle 3 Analyse der Auswirkung der spezifischen E1a-Proteine auf den CMV-Verstärker und Promotor A. CV1-Zellen, co-transfiziert mit: Verstärker+Promotor Promotor gesamte E1a
Tabelle 3. In den obigen Versuchen wurde pCMVcat verwendet, um die Auswirkung der Coexpression der E1a-Proteine auf den CMV- Verstärker+Promotorbereich zu untersuchen; pCMVpro wurde verwendet um die Auswirkung auf den CMV-Promotor alleine zu untersuchen. A. CV1-Zellen wurden mit 500 Nanogramm CAT-Plasmid, 2,5 Mikrogramm des geeigneten E1a-Plasmids, 100 Nanogramm pRSVhGH und pUC19-DNA cotransfiziert, um 5 Mikrogramm DNA herzustellen. 25 Mikroliter von 100 Mikroliter Extrakt wurden unter Verwendung des H³-Natriumacetatverfahrens hinsichtlich CAT-Aktivität geprüft. Die Assays dauerten 40 Minuten lang. 100-124899 cpm.
Die Versuche über Trans-aktivierung in 293 Zellen konzentrierten sich auf die Rolle von E1a. Es ist jedoch bekannt, daß diese Zellen auch E1b-Proteine exprimieren. (Graham, F. et al., oben 1977). Um zu bestimmen, welche Rolle die E1b-Proteine bei der Expression spielen könnten, führten die Autoren der vorliegenden Erfindung Cotransfektionsversuche eines E1b-exprimierenden Plasmids durch. Bei diesen Versuchen wurden wiederum CV1-Zellen verwendet und hinsichtlich der CAT-Aktivität geprüft. Davor wurde(n) jedes der beiden CAT-Plasmide alleine, mit E1b cotransfizierte CAT-Plasmide oder schließlich die sowohl mit E1a als auch E1b cotransfizierten CAT-Plasmide transfiziert. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich steigert die Cotransfektion mit E1b alleine die CAT-Werte um das 4-10-fache. Man stellte wiederum die größte Zunahme bei der pCMVpro-Konstruktion fest, welche den CMV-Promotor ohne den Verstärker zur Lenkung der CAT-Expression verwendet. Und im Gegensatz zu den obigen Ergebnissen, wo E1a alleine eine negative Auswirkung auf einige Vektoren ausübte (Tabelle 2), hatte das Coexprimieren von E1a und E1b eine positive Auswirkung auf alle Vektoren (Tabelle 4). Eine auffällige additive Wirkung läßt sich feststellen, wobei sich die Vektoren, welche die CMV-Promotor-gerichtete Expression verwenden, vom 6- bis auf das 30-fache steigern. Tabelle 4 Auswirkung des E1b-Bereichs auf die CAT-Expression Verstärker Promotor Alleine E1b E1a+E1b
Tabelle 4. CV1-Zellen wurden mit 1 Mikrogramm CAT-DNA, 100 Nanogramm pRSVhGH und pUC19-DNA auf eine Gesamtmenge von 5 Mikrogramm transfiziert. Für das H³-Natriumacetatverfahren verwendeten die Autoren der vorliegenden Erfindung 20 Mikroliter eines 100-Mikroliter-Extrakts. Der Assay dauerte 60 Minuten. Die Daten werden relativ zur Expression des pCMVcat-Vektors ausgedrückt. 100-155.828 cpm. In ( ) ist das Vielfache der Änderung ersichtlich, die man nach der Cotransfektion mit den Adenovirusgenen bei jedem Vektor feststellen kann.

Analyse der Plasmidstabilität

Nur wenige Berichte wiesen E1b alleine bei der Transkriptionsaktivierung eine Rolle zu. Darüber hinaus wurde jedoch gezeigt, daß die E1b-Proteine, genauer gesagt das 19K-Protein, die Stabilität sowohl der Wirtszelle als auch der viralen DNA bewirken. (White, E. et al. 1986, MCB 6: 3763; Pilder, S.J. et al. 1984, J.Virol. 52 : 664; Subramanian, T. et al. 1984, J.Virol. 52 : 336; Takemori, N. et al., 1984, J.Virol. 52 : 793). Man weiß nur wenig über dieses Verfahren; es ist komplex und erfordert, daß die Coexpression von E1a-Proteinen bezüglich dieser Auswirkung nachgewiesen wird. Die Autoren der vorliegenden Erfindung untersuchten demnach die Frage, ob Plasmid-DNA auch in Gegenwart eines oder beider dieser frühen Adenovirusgene Abbau gegenüber resistenter ist.
Nach der Transfektion von pRSVhGH-DNA in zwei E1a und E1b enthaltende Zellinien und in Zellen, welche diese Gene nicht aufweisen (wie z. B. CV1-, Cos7-, Hela- oder KB-Zellen), wurden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten von 4 Stunden bis zu 80 Stunden zur Isolierung von Plasmid-DNA durch das Hirt-Verfahren geerntet. (Hirt, B.I. Mol.Biol. 26, 365 (1967)). Die auf der Außenfläche der Zellen verbliebene DNA wurde durch die Behandlung mit DNase entfernt. Das Vorhandensein von pRSVhGH-DNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurde durch Southern-Blot mit einer hGH-spezifischen Sonde ermittelt. Die beiden Affennierenzellinien, CV1 und ihr Derivat Cos7, wiesen Plasmid- DNA auf, die 24 Stunden lang durch das Hirt-Verfahren nachweisbar war. Interessanterweise hatte die Expression des T-Antigens in Cos7-Zellen auf die Aufrechterhaltung dieser Plasmid-DNA bei einem Fehlen der Replikation keine Auswirkung. Die Plasmid-DNA war in Hela-Zellen 4 Stunden lang stabil. Plasmid-DNA wurde bis zu 72 Stunden lang in 293, 293s und JW2-Zellen nachgewiesen. Alle diese Zellen exprimieren sowohl die E1a- als auch die E1b-Bereiche des Adenovirus. Da ihr morphologischer Phänotyp sehr unterschiedlich ist, sind die in diesen Zellen vorhandenen adenoviralen Proteine möglicherweise für die erhöhte Stabilität episomaier DNA in diesen Zellinien verantwortlich.

Beispiel 3

Expressionsvektorfaktor VIII

1. Konstruktion von Expressionsvektoren

Die für den menschlichen Faktor VIII kodierende cDNA wurde bei der Konstruktion von Plasmiden verwendet, welche die Expression von Faktor VIII-Protein in transfizierten Säugetierzellen lenken würden (Wood, W. et al., Nature (Lond.) 312 : 330-337 (1984)). Diese transformierten Säugetierzellen sekretierten etwa 0,14 mE/ml Faktor VIII. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht die kontinuierliche Erzeugung von Faktor VIII mit bedeutend größeren Ausbeuten vor.

a) pF8CIS

Es wurde der Vektor pF8CIS konstruiert, der den Cytomegalovirus- Verstärker (Boshart, M. et al., Cell 41, 520 (1985)) und Promotor (Thomsen, D.R. et al., PNAS 81, 659-663 (1984)), die Cytomegalovirus Spleißdonorstelle und einen Abschnitt eines Introns (Sternberg, R.M. et al. T. of Virol. 49, 190-199 (1984)), die Intron- und Spleißakzeptorstelle des variablen Bereichs von Ig, die für Faktor VIII kodierende cDNA und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt.
Fig. 1 zeigt die Schritte des Konstruierens des Faktor VIII-Expressionsvektors, der zur Etablierung der Erzeugungszellinien für Faktor VIII verwendet wurde. Die drei Teile der Konstruktion sind nachstehend erläutert.
1) Der Ampicillinresistenz-Marker und der Replikationsursprung des endgültigen Vektors wurden aus dem Ausgangsplasmid pUC13pML, einer Variante des Plasmids pML hergeleitet (Lusky, M. und Botchen, M., Nature 293, 79 (1981)). pUC13pML wurde durch Übertragen des Polylinkers von pUC13 (Veira, J. und Messing, J., Gene 19 : 259 (1982)) auf die EcoRI- und HindIII-Stellen von pML konstruiert. Ein zweites Ausgangsplasmid pUC8CMV war die Quelle der CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorsequenz. pUC8CMV wurde durch Einfügen der in Fig. 17 dargestellten Nukleotide 1 bis 732 für die CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorsequenz in die abgestumpften PstI- und SphI-Stellen von pUC8 konstruiert. Veira, J. und Messing, J. oben. Synthetische BamHI-HindIII-Linker (kommerziell erhältlich bei New England Biolabs) wurden mit dem kohäsiven BamHI-Ende ligiert, wodurch eine HindIII-Stelle entstand. Nach dieser Ligierung erfolgte ein HindIII-HincII-Digest. Dieses Digest ergab ein Fragment von etwa 800 bp, das die CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorstelle enthielt. Nach der Gelisolierung wurde dieses Fragment mit 800 bp mit einem 2900 bp-Stück von pUC13pML ligiert. Das für die Konstruktion von pF8CIS erforderliche Fragment wurde durch Digerieren des obigen Zwischenplasmids mit SalI und HindIII erhalten.
Dieses 3123 bp-Stück enthielt den Resistenzmarker für Ampicillin, den Replikationsursprung von pUC13pML und die Steuersequenzen für CMV einschließlich der Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorstelle.
2) Die Intron- und Spleißakzeptorsequenz des variablen Bereichs von Ig wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligomers konstruiert, wie dies im Mittelabschnitt von Fig. 1 ersichtlich ist. Ein 99 mer und ein 30 mer wurden chemisch synthetisiert und wiesen die folgende Sequenz für die IgG-Intron- und Spleißakzeptorstelle auf (Bothwell et al., 1981):
DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) füllte das synthetische Stück ein und bildete ein doppelstrangiges Fragment. Wartell, R.M. und W.S. Reznikoff, Gene 9, 307 (1980). Daran schloß sich ein Doppeldigest von PstI und HindIII. Dieser synthetische Linker wurde an den PstI- und HindIII-Stellen in pUC13 geklont (Veira, J. und Messing, J., Gene 19, 259 (1982)). Das Klon, welches das synthetische Oligonukleotid, markierten/s pUCIg.10, enthielt, wurde mit PstI digeriert. Eine ClaI-Stelle wurde durch Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers diesem Fragment hinzugefügt. Nach der Digestion mit HindIII wurde ein 118 bp-Stück, das einen Teil des Ig-Introns und des Spleißakzeptors des variablen Bereichs von Ig enthielt, gelisoliert.
3) Im dritten Teil des Konstruktionsschemas wurde das Hepatitisoberflächenantigen-3'-Ende mit der Polyadenylierungsstelle und der Transkriptionsterminationsstelle des frühen Bereichs von SV40 ersetzt. Ein Vektor, pUC.SV40, der die SV40-Sequenzen enthielt, wurde an der BamHI-Stelle in pUC8 eingesetzt, wie dies in Viera, J. und Messing, J., oben, beschrieben ist. pUC.SV40 wurde danach mit EcoRI und HpaI digeriert. Ein Fragment mit 143 bp, das nur die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt, wurde aus diesem Digest gelisoliert. Zwei zusätzliche Fragmente wurden nach der Digestion von pSVE.8c2D gelisoliert. Europäische Patentanmeldung Nr. 160.457. Das durch EcoRI- und ClaI-Digest erzeugte Fragment mit 4,8 kb enthält die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsursprung von pML und den Ampicillinresistenz-Marker. Das nach der Digestion mit ClaI und HpaI erzeugte Fragment mit 7,5 kb enthält die cDNA für Faktor VIII. Eine dreiteilige Ligation ergibt pSVE.8c24D. Dieses Zwischenplasmid wurde durch ClaI und SalI digeriert, um ein Fragment mit 9611 bp zu ergeben, das die cDNA für Faktor VIII mit einer SV40-Polyadenylierung und Transkriptionsterminationsstellen vor der SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthält.
Die endgültige dreiteilige Ligation zur Bildung von pF8CIS verwendete: a) das SalI HindIII-Fragment mit 3123 bp, das den Replikationsursprung, den Ampicillinresistenzmarker und den CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonor enthielt; b) das HindIII-ClaI-Fragment mit 118 bp, das den Ig Intron- und Spleißakzeptor enthielt; und c) ein ClaI-SalI-Fragment mit 9611 bp, das die cDNA für Faktor VIII, die SV40-Polyadenylierungsstelle und die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthielt. Ein Abschnitt dieser Sequenz des Expressionsvektors pF8CIS ist in Fig. 10 dargestellt.

b) pF8CSSS.

Es wurde der Vektor pF8CSSS konstruiert, der den Cytomegalovirusverstärker und -promotor, eine konstruierte stabilisierende Sequenz, die für Faktor VIII kodierende cDNA und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt. Der gesamte Intronbereich einschließlich der Donor- und Akzeptorsequenzen wurde gelöscht und durch eine konstruierte stabilisierende Sequenz ersetzt. Die stabilisierende Sequenz ist ein synthetisches, doppelstrangiges Oligomer mit einer Sequenz der reifen mRNA nach dem Spleißen. Die stabilisierende Sequenz wurde zwischen die einzigartigen SacII-ClaI-Stellen von pF8CIS eingefügt. Die Sequenzen der synthetischen Oligomeren sind wie folgt:
Die synthetischen Oligomeren umfassen die geeigneten Nukleotide der Donor- und Akzeptor-Konsensspleißsequenzen. Das Nebeneinanderliegen der Spleißdonorsequenz und der Spleißakzeptorsequenz ist durch die Unterstreichung angezeigt. Dieser Vektor ähnelt dem oben besprochenen PF8CIS-Vektor, mit der Ausnahme der Löschung des Intronabschnitts und seiner Ersetzung mit einer konstruierten stabilisierenden Sequenz. Diese Konstruktion eliminiert das eigentliche Spleißen des nichtkodierenden Bereichs aus der kürzlich transkribierten mRNA. Ein Abschnitt der Sequenz des Expressionsvektors pF8CSSS, der die konstruierte stabilisierende Sequenz enthält, ist in Fig. 12 dargestellt.

c) pF8SCIS

Es wurde der Vektor pF8SCIS konstruiert, der den SV40-Verstärker und Promotor, die Cytomegalovirus-Spleißdonorstelle und einen Abschnitt der Intron-, der Ig-Intron- und der Spleißakzeptorstelle, die für Faktor VIII kodierende cDNA und die SV40-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstellen enthielt.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von pF8SCIS.
Dieser Vektor wurde unter Verwendung einer dreiteiligen Ligation konstruiert. Die Herstellung jedes dieser drei in dieser Ligation verwendeten DNA-Fragmente ist nachstehend beschrieben.
Das erste Fragment enthielt den SV40 frühen Bereichspromotor und -verstärker und einen halben Ampicillinresistenz-Marker, der aus Plasmid-pML gewonnen wurde. Das Ausgangsplasmid für das erste der drei Fragmente war pAML3P.8C1. EP-A Nr.160.457. Dieses Plasmid wurde mit SacI geschnitten. Unter Verwendung der gesamten Enzym-DNA Polymerase I wurde dieser durch SacI gebildete 3'-Überhang abgestumpft. Nach dieser Reaktion wurde das Plasmid mit PvuI geschnitten. Das gewünschte Fragment mit 434 bp wurde aus einem Acrylamidgel isoliert.
Die zweiten und dritten in dieser Konstruktion verwendeten Fragmente wurden aus dem oben beschriebenen Plasmid pF8C15 isoliert.
Fragment 2 enthielt den Spleißdonor aus dem CMV unmittelbar frühen Gen und einen Teil des folgenden Introns sowie den synthetisch wie oben beschrieben hergestellten Intron- und Spleißakzeptor. pF8CIS wurde mit SacII geschnitten und der resultierende 3'-Überhang durch Verwendung von DNA-Polymerase I abgestumpft. Nach dieser Reaktion erfolgte das Spalten mit ClaI. Da die die ClaI-Stelle in pF8CIS umgebende Sequenz das Spalten verhindert, wenn das Plasmid in einer Methlyation plus Stamm gezüchtet wird, wurde pF8CIS aus dam Stamm GM48 hergestellt. Marinus, M.G. und Maris,N.R., Bacteriol. 114, 1143-1150 (1973) und Geier, G.E. und Madrid, P., J.Biol.Chem. 254, 1408-1413 (1979). Da sowohl SacII als auch CIaI in diesem Vektor einzigartige Stellen sind, wurde das Fragment mit 231 bp aus einem Agarosegel leicht isoliert.
Das dritte Fragment enthält die cDNA für Faktor VIII, die SV40 frühe Bereichpolyadenylierungsstelle, eine SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsursprung von pML und die Hälfte des Ampicillingens. Das Fragment von 11308 bp wurde durch Digerieren von pF8CIS (dam&supmin;) mit ClaI und PvuI hergestellt.
Die pF8SCIS erzeugende Dreiteil-Ligation zerstört die SacI- und SacII-Stellen, bewahrt die ClaI-Stelle und baut das ampr-Gen an der PvuI-Stelle wieder auf. Ein Abschnitt der Nukleotidsequenz des Expressionsvektors pF8SCIS ist in Fig. 11 dargestellt.

Beispiel 4

Transiente Expression

Faktor VIII-Expression wurde auf der Grundlage der Immunoperoxidase-Färbung von transfizierten Zellen geprüft. Gorman et al., Cell 42, 519-526 (1985). Mithilfe dieses Assays wurden Vektoren hinsichtlich der Expression von Faktor VIII geprüft. 12 monoklonale, für Faktor VIII spezifische Antikörper wurden zur Verwendung in diesem Assay gescreent. BHK 31A3B-Zellen (europäische Patentveröffentlichung Nr. 160.457) wurden gefärbt und mit der Stamm-BHK-Linie verglichen, um Zellen zu screenen, die Faktor VIII erzeugen. Es stellte sich heraus, daß der monoklonale Antikörper BH6 das stärkste Signal mit der Mindest- Hintergrundmenge abgab. Es erfolgten Transfektionen, und die transiente Expression von Faktor VIII wurde bewertet. Zellen (Cos, 293, CHO, BHK, TM4) wurden mittels des CaPO&sub4;-Verfahrens transfiziert. 10 Mikrogramm pro Milliliter Faktor VIII-Vektorniederschlag wurden geprüft. Die Niederschläge wurden 3-4 Stunden lang auf den Zellen gelassen. Die Zellen wurden dann durchschnittlich eine Minute lang mit Glyzerin schockbehandelt. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton-Methanol (50 : 50) fixiert und mit einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden entweder unter Verwendung eines unverdünnten BH6 Überstands oder eines gereinigten BH6-Antikörpers, in PBS, das 10% fötales Kalbsserum enthielt, 1 : 3000 verdünnt, gefärbt. Dieser erste Antikörper blieb 2 Stunden lang auf den Zellen. Die Platten wurden während dieses Zeitraumes auf einen Langsam-Schüttelapparat gestellt. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten fünfmal gewaschen. Ein zweiter Antikörper von Kaninchen-Antimaus-IgG (Dakopatts) wurde in PBS und fötalem Kalbsserum in einer Verdünnung von 1 : 150 verdünnt. Nach einer zweistündigen Inkubation erfolgte eine weitere Reihe von Waschungen. Ortho-Diansidin (Sigma) wurde als Substrat zum Entwickeln des Peroxidasereagens verwendet. Eine Aethanol-gesättigte Lösung von Ortho-Dianisidin wurde in PBS mit einer 1:10.000-Verdünnung von Wasserstoffperoxid 1 : 100 verdünnt. Dieses Substrat wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden oder über Nacht bei 4ºC auf den Zellen gelassen.
Dieses Verfahren stellte einen Screen für jene Faktor VIII-Vektoren bereit, welche die stattgefundene Faktor VIII-Expression lenkten. Dieses Verfahren zeigte diese transiente Faktor VIII-Expression. Das Färben 36 Stunden nach der Transfektion gibt Aufschluß darüber, ob der Vektor transkribiert und die mRNA translatiert wurde.
pF8CIS lenkte die transiente Expression von Faktor VIII in zumindest 5 verschiedenen Zellinien: COS, 293, CHO, TM4 und BHK. Fig. 3A zeigt die transiente Expression des Vektors pF8CIS in CHO-Zellen.
Es stellte sich heraus, daß pF8SCIS die transiente Expression von Faktor VIII genauso wirkungsvoll lenkte wie pF8CIS. Fig. 3B zeigt die transiente Expression des Vektors pF8SCIS in CHO-Zellen. Da der CMV-Verstärker und Promotor vollständig durch den analogen SV40-Verstärker und Promotor ersetzt werden können, hängt die Faktor VIII-Erzeugung nicht vom spezifischen Transkriptionsstartsignal, sondern von anderen Teilen des Steuerbereichs ab, wie z. B. von der stabilisierenden Sequenzstelle im Vektor.
Während die Zellen zum Etablieren einer Erzeugungszellinie transfiziert wurden, wurde eine Schale jedes Zelltyps hinsichtlich transienter Expression geprüft. Die Ergebnisse des transienten Expressionsscreens für Faktor VIII ergaben zwei Zellklassen: jene Zelltypen, die 36 Stunden nach der Transfektion positiv für Faktor VIII färbten (Kategorie 1), sowie jene Zelltypen, die keine nachweisbare transiente Expression von Faktor VIII aufweisen (Kategorie 2). Die jede einzelne Kategorie umfassenden Wirtszellen sind nachstehend angeführt:
Kategorie 1 Kategorie 2 CHO MDCK
293 BRL
BHK Hela
TM4 Vero
HTC W138
COS CV1
HepG2
TR1
Wie bereits erörtert führte das Löschen der Intron-, Donor- und Akzeptorstellen des variablen Bereichs von Ig bei Bewahrung der anderen Steuerbereiche zu einer Ausschaltung der transienten Expression von Faktor VIII. Aus diesen Daten scheint für die Expression zumindest eine Spleißdonor-Intronakzeptorsequenz erforderlich zu sein.
Zusätzliche Versuche zeigen, daß die Anordnung der stabilisierenden Sequenz wichtig ist. Das Anordnen eines Introns 3' zur für Faktor VIII kodierenden cDNA führte beispielsweise zu keiner Expression von Faktor VIII. Auch Vektoren, die konstruiert waren, um native Faktor VIII-Spleißstellen, d. h. Spleißstellen innerhalb des Kodierungsbereichs, zu enthalten, erwiesen sich als erfolglos. Die Spleißdonor-Akzeptoranordnung, welche die CMV-Spleißdonorsequenz und ein schimäres Intron enthält, das CMV-Sequenzen und das Intron und den Akzeptor des variablen Bereichs von synthetisiertem Ig umfaßt, ist ein Beispiel einer stabilisierenden Sequenz, die zur Etablierung einer Zellinie führt, die für eine kontinuierliche Erzeugung von Faktor VIII sorgt.

Beispiel 5

Expressionsvektorvariantenfaktor VIII

Ein Ansatz zum Schaffen eines wirkungsvolleren Proteins ist das Proteinkonstruieren. Das heißt durch das Einführen von Änderungen innerhalb des Gens auf Ebene der DNA können Varianten in Zellkultur erzeugt werden, um eine spezifische Modifizierung der Proteinfunktion zu ermöglichen. Es wurden 3 Varianten konstruiert. Das Nativfaktor VIII einkettige Protein mit 300.000 Dalton wird zu Untereinheiten von 90.000 und 80.000 Dalton gespalten, die wiederum zu aktiven Untereinheiten von 50.000, 43.000 und 73.000 Dalton gespalten werden. Die B Domäne zwischen Aminosäure 742 bis 1648 hat keine definierte Funktion. Vehar, G.A. et al., Nature 312, 330-337 (1984). Die gleichen Zellsysteme, die bezüglich der Expression des rekombinanten Faktor VIII-Proteins voller Länge beschrieben wurden, wurden zur Expression des Mutanten verwendet.

pF8CIS9080

Der zur Expression des Faktor VIII-Fusionsproteins verwendete eukaryotische Expressionsvektor enthielt: den Verstärker (Boshart et al., oben) und Promotor (Thomsen et al., oben) des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) unmittelbar frühen Gens; die 3' von der Transkriptionsinitiationsstelle dieses Gens angeordnete Spleißdonorsequenz (Boshart et al., oben, Stenberg et al., oben); und eine synthetische Spleißakzeptorstelle vom variablen Bereich von Mäuse-Immunoglobulin (Bothwell et al., oben). Der neue Kodierungsbereich wird auf dem 3'-Ende durch die SV40 frühe Polyadenylierungssequenz und Transkriptionsterminationsstelle flankiert (Fiers et al., oben). Der Vektor enthält einen verstärkbaren Marker, die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit.
Die Konstruktion des Expressionsvektors pF8CIS9080, der für das Faktor VIII-Fusionsprotein 90 kd + 142 aa + 80 kd kodiert, ist in Fig. 4 dargestellt. Ausgehend vom Plasmid pSVE.8cID (europäische Patentveröffentlichung Nr. 160.457) wurde durch Schneiden mit SstII, Abstumpfen der kohäsiven Enden mit S1, weiters Spalten mit HpaI und erneutes Ligieren der zwei stumpfen Enden zur Erzeugung von pSVE.8c9 eine kurze Löschung im 3'-untranslatierten Bereich vorgenommen. Dieses Plasmid wurde mit ClaI und SalI gespalten und das Fragment mit 10031 bp in SalI, ClaI geklont. Ein Promotor mit 6761 bp, der das Fragment von pAML3P.D22 enthielt (europäische Patentveröffentlichung Nr. 160.457). Die Fusion im Faktor VIII-Gen erfolgte durch Ligieren der eingefüllten Tth111 I und BamHI (Aminosäure 1563) Stellen innerhalb des Faktor VIII-Gens. Fig. 4 zeigt die Ligation eines Fragments mit 2516 bp von pAML3P.8c1 (europäische Patentveröffentlichung 160.457) und ein 11991 bp-Fragment von pAML3P.8c9, um das den fusionerten Bereich enthaltende pAML3P.8L19 zu konstruieren. Diese Fusion wurde durch die DNA-Sequenz bestätigt. Ein 4722 bp ClaI-XbaI-Fragment, das den Fusionsbereich enthielt, wurde in ein 5828 bp ClaI-XbaI-Fragment von pF8CIS geklont, das den CMV-Promotor-Verstärkerexpressionsvektor enthält. Das CMV-Fragment wurde aus einem dam&supmin; Stamm von E.coli gewonnen, wo die Methylation das Schneiden an der ClaI-Stelle nicht verhindert.

Beispiel 6

Expressionsergebnisse

Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde für die Expression der Faktor VIII-Variante angewandt, welche Nukleotide 796 bis 1562 löschte, pF8CIS9080. Das 90 kd + 142aa + 80 kd Fusionsprotein wird bei höheren Werten als das Protein voller Länge exprimiert. Hinsichtlich der Fähigkeit, das Fusionsprotein zu exprimieren, bestehen jedoch beträchtliche Variationen unter den Zelltypen.
Die folgenden Daten zeigen auf, daß die Auswahl der geeigneten Wirtszelle für eine kontinuierliche Erzeugung des gewünschten Fusionsproteins in kommerziell nützlichen Mengen sorgt. Mit pF8CIS9080 transfizierte TM4-Zellen zeigten sowohl eine transiente als auch stabile Expression des Fusionsproteins. Mit pF8CIS9080 transfizierte TM4-Zellen zeigten eine fünffache Zunahme der Werte des Fusionsproteins im Vergleich zum Faktor VIII voller Länge. Bei 100 nM Methotrexat gepoolte Klonen des Fusionsfaktors VIII ergaben 12mE/10&sup4; Zellen/Tag. HTC-Zellen zeigten eine ähnliche Verbesserung der Expression des Fusionsfaktors VIII im Vergleich zum Faktor VIII voller Länge.
Die Expression des Fusionsproteinfaktors VIII ist im Vergleich zur Expression von Faktor VIII voller Länge in 293 Zellen ziemlich hoch. In den mit dem Fusionsproteinvektor pF8CIS9080 transformierten 293 Zellen wurden die unverstärkten Populationswerte von 85 mE/10&sup4; Zellen/Tag üblicherweise erreicht. Die Expressionswerte von Faktor VIII voller Länge waren niedriger als der Fusionsfaktor VIII, der 2,5 mE/10&sup4; Zellen/Tag ergab. Da die Steuersignale in pF8CIS und pF8CIS9080 identisch sind, muß der Unterschied der Expressionswerte mit der Fähigkeit der Zelle in Zusammenhang stehen, eine Botschaft und/oder ein Protein voller Länge zu erzeugen.

Beispiel 7

Expressionsvektor der Faktor VIII-Variante

Gegenüber dem aktivierten Protein C resistent

Es hat sich gezeigt, daß das aktivierte Protein C (APC) - ein Plasmaprotein - den menschlichen Faktor VIII durch beschränkte Proteolyse inaktiviert. Eine mögliche Stelle dieser Inaktivierungsspaltung ist bei Arginin an Position 336. Das Arginin an Position 336 kann zu einer anderen Aminosäure, z. B. Lysin oder Glutaminsäure geändert werden. Zwei Vektoren, pF8CIS336E und pF8cIS9080-336E, wurden konstruiert, um zu bestimmen, ob Position 336 eine Inaktivierungsstelle ist. Unter Verwendung von in vitro-Mutagenese (Norris, K. et al., Nucleic Acids Research, 11, 5103-5112 (1983)) wurde das Arginin an Position 336 zu einer Glutaminsäure mutiert (Fig. 5).
Für die Mutagenese wurde ein 792 bp-HindIII-KpnI-Fragment aus pF8CIS in die HindIII-KpnI-Stellen von m13 eingefügt. Das unten dargestellte 18 bp-Oligomer wurde zur Mutagenisierung dieses Fragments verwendet.
Nach der Strangextension wurde das doppelstrangige mutagenisierte M13-Klon mit AccI und KpnI geschnitten. Ein 778 bp-Fragment wurde gelgereinigt. Das Plasmid pF8CIS wurde in einem dam&supmin; Stamm von E.coli, GM48 gezüchtet. Aufgrund der Sequenz des in Fig. 1 dargestellten PstI-ClaI-Linkers schneidet die ClaI-Stelle von pF8CIS nicht, wenn das Plasmid in einer Methylation plus Bakterienstamm gezüchtet wird, wie dies weiter oben erörtert wurde. Zwei Fragmente wurden aus der dam&supmin; pF8CIS DNA isoliert, ein 10 kb KpnI, partielles ClaI-Fragment und ein 1108 bp ClaI-AccI-Fragment. Eine Dreiteil-Ligation war erforderlich, um die Nativfaktor VIII-Sequenz mit der mutagenisierten Sequenz zu ersetzen. Siehe Fig. 5.
Die Konstruktion von pF89080-336E erfolgte durch eine weitere dreiteilige Ligation, wie dies in Fig. 6 dargestellt ist. Ein SpeI-BglII-Fragment mit 1115 bp, das die 336E Variantenaminosäure enthielt, wurde übertragen, um ein weiteres Variantenfusionsprotein durch Ligieren mit einem 891 bp SacII-SpeI-Fragment und einem aus pF8CIS9080 isolierten 8564 bp BglII-SacII-Fragment zu bilden.
Beide dieser Proteinvarianten wurden in 293 Zellen exprimiert. Faktor VIII voller Länge wurde mit dieser Mutation bei 2,8 mE/10&sup4; Zellen/Tag exprimiert, während die Fusionsvariante bei 15 mE/10&sup4; Zellen/Tag exprimiert wurde.

Beispiel 8

Expressionsvektor Prorelaxin

1. pCIHRX

Der Vektor pCIHRX enthielt den Cytomegalovirus-Verstärker und Promotor, die Cytomegalovirus-Spleißdonorstelle, die Spleißakzeptorstelle des variablen Bereichs von Ig, die für Präprorelaxin kodierende cDNA und die Hepatitisoberflächenantigen-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstellen. Fig. 7 zeigt die Schritte zum Konstruieren des Prorelaxinvektors. Es wurde die gleiche Intron- und Spleißakzeptorsequenz aus dem variablen Bereich von Ig beibehalten, die bereits beschrieben wurde. 677 bp der Präprorelaxin-cDNA folgten diesen 5'-Verarbeitungssignalen. Während die 5'-Steuersignale mit pF8CIS identisch waren, stammten die Polyadenylierungsbereich- und Terminationssequenzsignale aus dem Hepatitisoberflächenantigengen und nicht aus SV40.
Zuerst wurde ein Zwischenplasmid pCIaRX konstruiert. Das Plasmid pSVERX (siehe gleichzeitig anhängige europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 0260148) wurde mit HindIII geschnitten, um ein 1700 bp Fragment zu isolieren, das die Präprorelaxin-cDNA gefolgt von der Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg) 3'-Polyadenylierungsstelle enthielt. Eine KpnI-Stelle war 3' zur HBsAg-Polyadenylierungsstelle und 5' zum Start des SV40 frühen Promotors angeordnet, der in diesem Vektor verwendet wurde, um die Expression der DHFR-cDNA voranzutreiben.
Dieses HindIII-Fragment wurde in pML eingesetzt, das an der HindIII-Stelle linearisiert war. Wiederzusammenschlüsse wurden durch die Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) minimiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden gescreent, um Klone zu isolieren, die ein eingesetztes Prä-Prorelaxingen aufwiesen, so daß das 5'-Ende des Gens neben der ClaI-Stelle von pML angeordnet war.
Das Zwischenplasmid pCIARX wurde mit ClaI und KpnI geschnitten, um ein Fragment mit 1360 bp zu isolieren, welches das Prä-Prorelaxingen gefolgt von den Hepatitisoberflächenantigen 3' Polyadenylierungssequenzen enthielt. Dieses Fragment wurde mit dem 5143 bp-Fragment ligiert, das durch Schneiden von pF8CIS dam&supmin; mit ClaI und KpnI entstand.

2. pCISRX

Da es bekannt ist, daß die Wahl der Polyadenylierungssequenzen das 5'-Verarbeiten von Boten-RNA beeinflußt (Wilson & Nevins, oben), wurde die 3'-Hepatitispolyadenylierungssequenz in pCIHRX mit der pSV40 Polyadenylierungssequenz ersetzt. Die Schritte zum Konstruieren von pCISRx sind in Fig. 8 dargestellt. Die zwei Ausgangsvektoren für diese Konstruktion sind pCIHRX und pF8CIS. Der letztere Vektor hat die gleichen 5'-Steuerungen wie pCIHRX, enthält aber cDNA für Faktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle. SacII wurde verwendet, um 3' von der cDNA zu spalten. Der resultierende 3'-Überhang wurde durch T4-Polymerase abgestumpft. pCIHRX wurde dann mit BamHI geschnitten. Diese Stelle trennt das chimäre Intron vom 5'-Ende des Relaxingens. Ein 861 bp-Fragment wurde von der BamHI-Behandlung gelisoliert. Die SV40-Polyadenylierungsstelle, DHFR, die Transkriptionseinheit, der bakterielle Replikationsursprung und das ampr-Gen sowie der CMV-Verstärker und Promotor und Spleißdonor wurden aus pF8CIS isoliert. Diese Elemente wurden in zwei Fragmente isoliert, in ein 2525 bp SalI-BamHI-Fragment und ein HpaI-SalI 3113 bp-Fragment. Eine dreiteilige Ligation des BamHI-SacII (abgestumpften) Fragments mit dem HpaI-SalI-Fragment und SalI zum BamHI-Fragment ergibt pCISRX.

Beispiel 9

Expressionsprorelaxin

Die Expressionsfähigkeit der zwei Relaxinexpressionsvektoren pCIHRX und pCISRX wurden unter Verwendung verschiedener Antirelaxin-Antikörper in dem oben beschriebenen Immunoperoxidaseverfahren geprüft. Drei Kaninchen-polyklonale und drei Mäuse-monoklonale Antikörper wurden auf mit pSVERX transfizierten COS-Zellen getestet. Es stellte sich heraus, daß ein monoklonaler RX-I eine intensive Färbung ohne Hintergrund ergab.
Die zwei erfindungsgemäßen Vektoren pCIHRX und pCISRX wurden hinsichtlich der Prorelaxinexpression getestet und mit pSVERX verglichen. pCIHRX und pCISRX-Vektoren unterschieden sich in der Polyadenylierungssequenz. pCIHRX enthielt die Hepatitisoberflächenantigen-Polyadenylierungssequenz, während pCISRX die SV40 frühe Bereichspolyadenylierungssequenz enthielt.
293, TM4- und CHO-Zellen wurden mit 10 ug Gesamt-DNA transfiziert, die 1 ug pRSVneo, 5 ug Lachsspermaträger und 4 ug der Plasmide pSVERX, pCIHRX und pCISRX enthielt. Die Zellen wurden mit Glyzerin schockbehandelt, wie dies oben beschrieben ist. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit IH6 gefärbt, um transformierte, Prorelaxin erzeugende Zellen zu identifizieren. Man stellte positiv färbende Zellen in 293 und TM4-Zellen fest, die mit pCIHRX und pCISRX transfiziert waren. Doppelplatten von CHO-, 293 und TM4-Zellen wurden geteilt und der oben beschriebenen Färbungsvorschrift unterworfen, um hinsichtlich der Prorelaxin-erzeugenden Zellen zu screenen.
Die in nachstehenden Tabellen angeführten Expressionsergebnisse zeigen, daß die Vektoren, welche die stabilisierende Sequenz 5' von der für Prorelaxin kodierenden DNA enthielten, bedeutend höhere Prorelaxinwerte als das Referenzplasmid pSVERX erzeugten. Im Falle stabiler Expression ging der Medienassay hinsichtlich Prorelaxin von der allgemeinen Zellpopulation aus. Transientes Expressionsprorelaxin Zelltyp Plasmid Proteinmenge (ng/ml) CHO pSVERX

Beispiel 10

Expressionsvektor t-PA

1. pCIHt-PA

Es wurde der Vektor pCIHt-PA konstruiert, der den Cytomegalovirusverstärker und -promotor, die Cytomegalovirusspleißdonorstelle und das Intron, die Spleißakzeptorstelle des variablen Bereichs von Ig, die für t-PA kodierende cDNA (Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)) und die Hepatitisoberflächenantigen-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstelle enthielt.
Fig. 9 zeigt die Schritte der Konstruktion des t-PA-Vektors.
Die t-PA-cDNA wurde zuerst in pML geklont, um eine ClaI-Stelle am 5'-Ende des Gens bereitzustellen. Dafür wurde ein 3238 bp-HindIII-Fragment aus pSVpa-DHFR (ansonsten als pETPFR in der GB-PS 2.119.804 B bezeichnet) in die HindIII-Stelle von pML eingefügt.
Kolonien wurden hinsichtlich Klonen gescreent, bei denen das 5'-Ende der cDNA neben der ClaI-Stelle angeordnet ist. Das als pCLAt-PA markierte Zwischenplasmid ist in Fig. 9 dargestellt. Eine t-PA-cDNA gefolgt vom 3'-Polyadenylierungsbereich wurde als ein ClaI-KpnI-Fragment mit 2870 bp isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 5146 bp-Fragment von pF8CIS ligiert. Dieses ClaI-KpnI-Fragment des CIS-Vektors lieferte den 5'-Steuerbereich, eine SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, das Ampicillinresistenzgen und den Ursprungsbereich von pML. pCIHt-PA ist, wie bereits besprochen, mit Ausnahme der für das gewünschte heterologe Gen kodierenden cDNA, zu pCIHRX analog.
Die Expressionswerte von t-PA wurden durch Transfizieren von CHO- und 293 Zellen mit pSVpaDHFR, pCMVt-PA und pCIHt-PA verglichen. Die ersten zwei Vektoren enthielten keine stabilisierende Sequenz und dienten somit als Steuerungen für den Vektor pCIHt-PA, der die cDNA enthielt, die für den erfindungsgemäß konstruierten t-PA kodiert. Medien aus jeder der kultivierten, transformierten 293 Zellen wurden geprüft und die folgenden Ergebnisse erzielt: pSVpaDHFR ergab 30 ng/ml; pCMVt-PA ergab 200 ng/ml t-PA; und pCIHt-PA ergab 420 ng/ml t-PA.

2. pCISt-PA

Es wurde der Vektor pCISt-PA konstruiert, der den Cytomegalovirusverstärker und -promotor, die Cytomegalovirusspleißdonorstelle und das Intron, die Spleißakzeptorstelle des variablen Bereichs von Ig, die für t-PA kodierende cDNA und die pSV40-Polyadenylierungssequenz enthielt.
Die Ausgangsvektoren für diese Konstruktion sind pCIHt-PA und pF8CIS (siehe Fig. 13). Der letztere Vektor hat die gleichen 5'-Steuerungen wie pCIHt-PA, enthält aber die cDNA für Faktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle. SacII wurde verwendet, um 3' der t-PA-cDNA zu spalten. Der resultierende 3'-Überhang wurde durch T4-Polymerase abgestumpft. pCIHt-PA wurde dann mit ClaI geschnitten. Diese Stelle trennt das chimäre Intron vom 5'-Ende des t-PA-Gens. Ein 2870 bp-Fragment wurde von der ClaI-Behandlung gelisoliert. Die SV40-Polyadenylierungsstelle, DHFR, die Transkriptionssteuerung, der bakterielle Replikationsursprung und das ampr-Gen sowie der CMV-Verstärker und Promotor und Spleißdonor wurden aus pF8CIS isoliert. Diese Elemente wurden als ein 2525 bp SalI-ClaI-Fragment und ein HpaI-SalI 3113-Fragment in Fragmente isoliert. Eine Dreiteil-Ligation des SacII (abgestumpften)-CIaI-Fragments mit dem HpaISalI-Fragment und dem SalI-ClaI-Fragment ergibt pCISt-PA.
Die Expressionswerte von t-PA wurden durch Transfizieren von 293 und CHO-Zellen mit pCIHt-PA und pCISt-PA verglichen. Die Medien aus jeder der kultivierten, transformierten Zellen wurden geprüft und die folgenden Ergebnisse erzielt: Transient Beispiel 11 a

Transiente Expression von Erzeugungswerten von Protein

Angesichts der hohen Werte von CAT-Aktivität, die durch die CMV-angetriebenen CAT-Vektoren in 293 Zellen erzeugt wird, wurde dieses System verwendet, um brauchbare Mengen der gewünschten heterologen Proteine innerhalb einiger Tage ab Transfektion zu erzeugen. Transiente Werte der Proteinproduktion wurden unter Verwendung zweier Parameter manipuliert. Durch gesteigerte Replikation konnte eine höhere Plasmidkopienzahl in den 293- und 293s-Zellen erreicht werden. Adenovirus VA RNA-Gene, ein Translationssteuereffektor, diente der Steigerung der Translation einer Botschaft, die für ein gewünschtes Protein in diesen Zellen kodierte (Thimmappaya, B. et al., oben, 1982).
Aufgrund der Expressionsdaten in Cos7-Zellen und CV1-Zellen wurden Versuche durchgeführt, um die Expression durch Erhöhung der Kopiezahl zu steigern. Es ist bekannt, daß sich SV40-Ursprung enthaltende Plasmide zu einer hohen Kopienzahl in 293 Zellen replizieren. (Lebokowski, J.S. et al., Nature 317, 169 (1985); Lewis,E.D. und Manley, J,. Nature 317, 172 (1985)). Während der Replikation von SV40-Vektoren in 293 Zellen tritt aus dem SV40 frühen Promotor sehr wenig Transkription auf. Die Autoren der vorliegenden Erfindung untersuchten, ob die Steuerung der Replikation und Transkription getrennt werden könnte, was zu einem brauchbaren replikativen Expressionssystem in 293 Zellen führen würde. Die von den Autoren erzielten Ergebnisse bestätigten, daß bei einer Verbindung von Transkription mit Replikation unter Verwendung eines SV40 frühen Promotors keine Transkription eintrat und sehr wenig Protein nachgewiesen wurde. Dies galt für Vektoren, welche ungeachtet des verwendeten Verstärkers den SV40 Promotorursprungsbereich verwendeten. Weder die SV40-SV40 noch die oben beschriebenen CMV-SV40-Vektoren ergaben beim Cotransfizieren mit pRSVTs meßbare Proteinwerte. Es konnte in diesen Cotransfektionen eine sehr hohe Plasmid-Kopienzahl erreicht werden, doch ohne die Expression von Protein. Wenn der SV40-Replikationsursprung jedoch von der Transkriptionsstelle getrennt wurde, wie z. B. in den Vektoren pCIShGH oder pCIS5hGH, nahm die Plasmidkopie zu, und die Expression von hGH wurde leicht nachgewiesen. Tabelle 5 zeigt einen Vergleich der Expression von hGH in CV1- und 293 Zellen mit und ohne Replikation. Diese Daten beschreiben die hohen Werte des innerhalb einiger Tage ab der Transfektion erzeugten hGH-Proteins. Bis zum Tag 3 sind in den Medien der 293 Zellen 10-15 Mikrogramm/ml hGH exprimiert. Während der Zeitverlauf und die Obergrenze der Expression beim Vorhandensein eines T-Antigens in diesem Versuch etwas unterschiedlich ist, hängen diese hohen Werte der Proteinproduktion nicht von der Replikation in den 293 Zellen ab. In den CV1-Zellen beträgt der höchste erzielte hGH-Titer 2 Mikrogramm/ml, und dieser Expressionswert ist mit T-Antigen-abhängiger Replikation verbunden. Die Analyse von Southern Blots Hirt-extrahierter DNA aus 293 Zellen zeigt, daß die Menge an Plasmid-DNA aufgrund der Replikation deutlich zunahm. Der hohe Wert der Proteinproduktion scheint jedoch mit dieser zunehmenden Kopiezahl nicht anzusteigen sondern abzuflachen. Tabelle 5 Vergleich der Expression mit T-Antigen-Cotransfektion Zelltyp Tag
Tabelle 5. hGH-Werte sind in Nanogramm/ml als durch IRMA ermittelte Werte ausgedrückt. Für diese Daten wurden 100 mm-Schalen mit 10 Mikrogramm pCIShGH transfiziert. Zellen wurden in 10 ml Medien aufrechterhalten und 100 Mikroliter Aliquote für den Assay entnommen.
Die Versuche wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob 293 Zellen mit einer DNA-Menge gesättigt waren, die transkribiert werden könnte. Die höhere Stabilität der transfizierten DNA mit den erfindungsgemäßen Vektoren könnte für die DNA-Sättigung verantwortlich sein. Es wurde die Menge an Gesamt-DNA untersucht, die zur Sättigung der Transfektionseffizienz in verschiedenen Zelltypen notwendig ist. Alle hierin beschriebenen Zellinien benötigten zur optimalen Expression 10 Mikrogramm/ml Niederschlag an Gesamt-DNA. Die 293 und 293s-Zellen unterschieden sich hinsichtlich dieses zur erfolgreichen Transfektion erforderlichen DNA-Grundwertes nicht von anderen Zelltypen. Jedoch muß nur eine geringe Menge dieser 10 Mikrogramm/ml hGH-spezifische DNA zur Sättigung der hGH-Erzeugung sein. Tabelle 6 zeigt, daß hohe hGH-Werte erzeugt werden, wenn 293s-Zellen mit nur 0,6 Mikrogramm der gesamten 10 Mikrogramm transfiziert werden, die den pCIShGH-Vektor darstellen. Bei diesem DNA-Wert wurden zwei Tage nach der Transfektion 4,5 Mikrogramm/ml hGH sekretiert. Da die eingegebene DNA in den 293 Zellen so stabil ist, ist für eine kontinuierliche Sättigung der Expressionswerte relativ wenig DNA erforderlich. Tabelle 6 Einfluß der DNA-Konzentration auf die Expressionswerte von hGH DNA-Menge (Mikrogramm) Tag
Tabelle 6. hGH-Werte sind Nanogramm/ml. 100 mm-Schalen von 293 oder 293s-Zellen wurden mit einer konstanten Menge von 10 Mikrogramm an Gesamt-DNA transfiziert. Die Menge von pCIShGH variierte, wie dies aus der Tabelle ersichtlich ist; pUC19-DNA wurde als Träger verwendet, um die 10 Mikrogramm zu vervollständigen.
Versuche wurden durchgeführt, um die Menge an Protein zu erhöhen, das durch Cotransfizieren mit den VA RNA-Genen des Adenovirus transient erzeugt wird. Es wurde gezeigt, daß in transienten Transfektionen, insbesondere in 293 Zellen, die Translation von transient erzeugter RNA durch das Hinzufügen dieser Gene erleichtert werden kann. Es ist aus Tabelle 7 ersichtlich, daß die hGH-Werte durch das Hinzufügen der VA RNA-Gene tatsächlich von 10 Mikrogramm/ml auf 19 Mikrogramm/ml erhöht werden können. Die optimale Menge an VA RNA DNA, die um diesen Expressionswert zu erreichen benötigt wird, beträgt 5 ug/ml Niederschlag. Diese Obergrenze der hGH-Expression, die durch Cotransfektion der VA RNA-Gene festgestellt wird, ähnelt den höchsten Werten an hGH, das in Gegenwart eines T-Antigens erzeugt wird. Interessanterweise stellte sich heraus, daß die Auswirkungen des T-Antigens und der VA RNA-Gene nicht additiv sind. Die Menge des durch dieses transiente System erzeugten Proteins ist ausreichend, um eine Analyse von Mutantenproteinen einige Tage nach der Transfektion zu ermöglichen. Ahnliche Versuche wurden mit Faktor VIII-Varianten und t-PA durchgeführt, wie dies aus Tabelle 7 ersichtlich ist. Tabelle 7 Auswirkung von VA RNA auf die Expression Gewünschtes heterologes Protein Tag Faktor
Faktor VIII Assays mE/ml
tPA und hGH ng/ml

Claims

1. Verfahren zur verstärkten transienten Expression eines gewünschten Proteins in einer Wirtsnierenzelle, umfassend:

(a) das Transfizieren einer Wirtsnierenzelle mit einem Vektor, der ein Adenovirus-transaktivierendes Protein exprimiert;

(b) das Transfizieren der Wirtsnierenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine doppelstrangige DNA-Sequenz aufweist, die die folgenden Elemente umfaßt:

(i) eine stabilisierende Sequenz stromabwärts eines CMV-Promotors, wobei die stabilisierende Sequenz entweder

eine Spleißdonorsequenz und eine Spleißakzeptorstelle und wahlweise ein intervenierendes Intron oder

eine Konsenssequenz für die Donor- und Akzeptorsequenzen und die geeigneten Nukleotide an der Donor/Akzeptor-Verbindungsstelle umfaßt, so daß die resultierende mRNA funktionell mRNA ähnlich ist, die gespleißt worden ist;

(ii) DNA, die für die Aminosäuresequenz des gewünschten heterologen Proteins stromabwärts der genannten stabilisierenden Sequenz und gesteuert vom genannten CMV-Promotor kodiert;

(iii) eine poly-A-Sequenz und stromabwärts davon eine Transkriptionsterminationsstelle;

(c) das Züchten der transfizierten Zellen unter Bedingungen, die für die Produktion des gewünschten Proteins günstig sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das gewünschte Protein innerhalb etwa eines Tages bis etwa 14 Tage nach der Transfektion gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die stabilisierende Sequenz von der CMV-Spleißdonorsequenz und der Spleißakzeptorsequenz des variablen Bereichs von Immunoglobulin abgeleitet ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das transaktivierende Protein E1b ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder .3, worin das transaktivierende Protein E1a ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das transaktivierende Protein eine Mischung aus E1a und E1b ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem T-Antigen vorhanden ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der genannte CMV-Promotor vom unmittelbaren frühen Gen von menschlichem Cytomegalovirus stammt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die genannte Wirtsnierenzelle eine menschliche embryonale Nierenzelle ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die genannte menschliche embryonale Nierenzelle die Nierenzelle 293 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die genannte menschliche embryonale Nierenzelle die Nierenzelle JW2 ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich das Transfizieren der genannten Wirtsnierenzelle mit einem Vektor umfaßt, der einen translationalen Steuereffektor erzeugt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der translationale Steuereffektor VA RNA ist.

14. Wirtsnierenzelle, die zur Erzeugung eines gewünschten heterologen Proteins fähig ist, worin die Wirtsnierenzelle endogen ein Adenovirustransaktivierendes Protein erzeugt und mit einem Vektor transfiziert wird, der DNA umfaßt, die für das genannte gewünschte Protein unter der Steuerung eines CMV-Promotors kodiert, mit einer intervenierenden stabilisierenden Sequenz, die entweder

eine Konsenssequenz für die Donor- und Akzeptorsequenzen und die geeigneten Nukleotide an der Donor/Akzeptor-Verbindungsstelle, so daß die resultierende mRNA funktionell mRNA ähnlich ist, die gespleißt worden ist;

und stromabwärts von der kodierenden Sequenz eine poly-A-Sequenz gefolgt von einer Transkriptionsterminationsstelle umfaßt.

15. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 14, worin die stabilisierende Sequenz von der CMV-Spleißdonorsequenz und der Spleißakzeptorsequenz des variablen Bereichs von Immunoglobulin abgeleitet ist.

16. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 14 oder 15, worin das genannte transaktivierende Protein E1a ist.

17. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 14 oder 15, worin das genannte transaktivierende Protein E1b ist.

18. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 14 oder 15, worin das genannte transaktivierende Protein eine Mischung aus E1a und E1b ist.

19. Wirtsnierenzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin T-Antigen vorhanden ist.

20. Wirtsnierenzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 19, die eine menschliche embryonale Nierenzelle ist.

21. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 20, die von JW2 abgeleitet ist.

22. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 22, die von 293 abgeleitet ist.

23. Wirtsnierenzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 22, worin der genannte CMV-Promotor ein unmittelbarer früher Promotor ist.

24. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 23, worin der genannte CMV-Promotor der unmittelbare frühe Promotor von menschlichem Zytomegalovirus ist.

25. Wirtsnierenzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 24, die weiters mit einem Vektor transfiziert ist, der einen translationalen Steuereffektor erzeugt.

26. Wirtsnierenzelle nach Anspruch 25, worin der genannte translationale Steuereffektor VA RNA ist.