DE3851265T2 - Hydrolyzable compounds that release electron-transfer agents and their analytical use. - Google Patents
Hydrolyzable compounds that release electron-transfer agents and their analytical use.Info
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Description
Diese Erfindung ist für das Gebiet der klinischen Chemie geeignet. Sie betrifft hydrolysierbare Verbindungen und analytische Zusammensetzungen und Elemente, die diese enthalten. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung von hydrolytischen Analyten unter Verwendung der hydrolysierbaren Substrate.This invention is applicable to the field of clinical chemistry. It relates to hydrolyzable compounds and analytical compositions and elements containing them. It further relates to a method for determining hydrolytic analytes using the hydrolyzable substrates.
Chemische Analysen von Flüssigkeiten, beispielsweise Wasser, Milch und biologischen Flüssigkeiten, sind oftmals erwünscht oder aus Gesundheitsgründen und für Diagnosezwecke sowie zur Behandlung von Krankheiten erforderlich. Es sind verschiedene Zusammensetzungen und Elemente zur Erleichterung derartiger Analysen bekannt. Derartige Materialien umfassen im allgemeinen eine Reagenszusammensetzung für die Bestimmung der zu analysierenden Substanz, die hier als Analyt bezeichnet wird. Der Analyt kann bestehend aus lebenden Zellen, wie zum Beispiel Hefe-Zellen, weißen Blutkörperchen, Bakterien oder anderen lebenden Organismen oder einer nicht lebenden chemischen Substanz, wie zum Beispiel einem Enzym. Die Reagenszusammensetzung liefert bei Kontakt mit dem Analyten eine feststellbare Veränderung (zum Beispiel eine Farbstoffbildung), die in bestimmter Weise quantifiziert werden kann.Chemical analyses of liquids, such as water, milk and biological fluids, are often desired or required for health and diagnostic purposes and for the treatment of disease. Various compositions and elements are known to facilitate such analyses. Such materials generally comprise a reagent composition for determining the substance to be analyzed, referred to herein as the analyte. The analyte may consist of living cells, such as yeast cells, white blood cells, bacteria or other living organisms, or a non-living chemical substance, such as an enzyme. The reagent composition, upon contact with the analyte, produces a detectable change (e.g., dye formation) that can be quantified in some manner.
Die Bestimmung von spezifischen hydrolytischen Enzymen in biologischen Flüssigkeiten kann für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten nützlich sein. Sie kann ferner für die Bestimmung des Vorhandenseins von bestimmten Mikroorganismen nützlich sein, da der Metabolismus der Mikroorganismen von dem Vorhandensein von bestimmten hydrolytischen Enzymen anhängt.The determination of specific hydrolytic enzymes in biological fluids can be useful for the diagnosis and treatment of diseases. It can also be useful for the determination of the presence of certain microorganisms, since the metabolism of microorganisms depends on the presence of certain hydrolytic enzymes.
Es ist eine Anzahl von analytischen Verfahren entwickelt worden, wobei ein Substrat für ein Enzym, das von Interesse ist, hydrolysiert wird unter Freisetzung eines bestimmbaren Restes. Diese Verfahren verwenden sowohl kolorimetrische wie auch fluorometrische Farbstoffe. Fluorometrische Bestimmungsverfahren sind im allgemeinen vorzuziehen, im Hinblick auf ihre im allgemeinen größere Empfindlichkeit. Andere bekannte Bestimmungsverfahren verwenden Diazoniumverbindungen, um bestimmbare Reste bei Vorhandensein von hydrolytischen Analyten zu bilden.A number of analytical methods have been developed whereby a substrate for an enzyme of interest is hydrolyzed to release a detectable moiety. These methods use both colorimetric and fluorometric dyes. Fluorometric assays are generally preferred in view of their generally greater sensitivity. Other known assays use diazonium compounds to form detectable moieties in the presence of hydrolytic analytes.
Die kanadische Patentschrift 670 378 beschreibt Phosphate von 2,3-Dimethoxy-5-methylhydrochinonen, die als Emulgatoren in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können. Es wird keine analytische Verwendung von derartigen Verbindungen beschrieben.Canadian Patent 670,378 describes phosphates of 2,3-dimethoxy-5-methylhydroquinones, which can be used as emulsifiers in pharmaceutical compositions. No analytical use of such compounds is described.
Weiterhin werden bestimmte ortho-Benzochinone als geeignete Fungizide in der US-A-3 504 054 beschrieben, doch wird keine analytische Anwendung derartiger Verbindungen erwähnt.Furthermore, certain ortho-benzoquinones are described as suitable fungicides in US-A-3 504 054, but no analytical application of such compounds is mentioned.
Ein beträchtlicher Fortschritt im Stande der Technik wird in der EP-Publikation 211 898 beschrieben. Diese Literaturstelle beschreibt geeignete reduzierbare Verbindungen, die, wenn sie durch ein Reduktionsmittel (wie zum Beispiel NADH) in einer Testprobe reduziert werden, eine bestimmbare Spezies liefern, wie zum Beispiel ein Chromogen oder Fluorogen. Viele der bestimmbaren Spezies, die auf diese Weise freigesetzt werden, weisen hohe Extinktions-Koeffizienten auf und zeigen somit eine hohe Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Analyt-Konzentrationen. Wünschenswert wäre es, wenn derartige Verbindungen zur Bestimmung von hydrolytischen Analyten, wie zum Beispiel hydrolytischen Enzymen, die in verschiedenen Organismen gefunden werden, eingesetzt werden könnten. Hydrolytische Enzyme und ihre Substrate sind jedoch nicht immer Reduktionsmittel für derartige reduzierbare Verbindungen.A significant advance in the art is described in EP publication 211 898. This reference describes suitable reducible compounds which, when reduced by a reducing agent (such as NADH) in a test sample, yield a detectable species, such as a chromogen or fluorogen. Many of the detectable species released in this way have high extinction coefficients and thus show high sensitivity to low analyte concentrations. It would be desirable if such compounds could be used to determine hydrolytic analytes, such as hydrolytic enzymes found in various organisms. However, hydrolytic enzymes and their substrates are not always reducing agents. for such reducible compounds.
Es hat sich gezeigt, daß die Reduktion von einigen reduzierbaren Verbindungen unerwünscht langsam verlaufen kann. In solchen Fällen kann-ein Elektronenübertragungsmittel zur Erleichterung der Reduktion der Verbindung eingesetzt werden. Selbst im Falle dieser Reaktionen jedoch wird nur ein Äquivalent der bestimmbaren Spezies für jedes Äquivalent von verwendetem Elektronenübertragungsmittel freigesetzt. Infolgedessen wäre es wünschenswert, wenn eine empfindlichere Bestimmungsmethode entwickelt werden könnte, d. h. eine Bestimmungsmethode, bei der mehr als ein Äquivalent der bestimmbaren Spezies von nur einem Äquivalent des Elektronenübertragungsmittels freigesetzt wird.It has been found that the reduction of some reducible compounds can be undesirably slow. In such cases, an electron transfer agent can be used to facilitate the reduction of the compound. Even in the case of these reactions, however, only one equivalent of the detectable species is released for each equivalent of electron transfer agent used. Consequently, it would be desirable if a more sensitive detection method could be developed, i.e., a detection method in which more than one equivalent of the detectable species is released from only one equivalent of the electron transfer agent.
Die im vorstehenden beschriebenen Probleme wurden durch diese Erfindung gelöst durch Verwendung einer hydrolysierbaren Verbindung, die durch die folgende Formel gekennzeichnet ist:The problems described above have been solved by this invention by using a hydrolyzable compound characterized by the following formula:
BLOCK-ETABLOCK ETA
worin bedeuten:where:
BLOCK steht für -CO-R*, Thioxophosphono oder ein Salz hiervon oder einen monovalenten Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid, Mono-, Oligo- oder Polysaccharid, worin R* steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, undBLOCK represents -CO-R*, thioxophosphono or a salt thereof or a monovalent radical derived from an amino acid, a peptide, mono-, oligo- or polysaccharide, wherein R* represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, and
ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einem Elektronenübertragungsmittel, das, wenn es freigesetzt wird, ein Phenazin, Naphthazin, Phenothiazin oder eine Phenazoniumverbindung oder ein substituiertes para-Benzochinon oder Naphthochinon in entweder seiner oxidierten oder reduzierten Form liefert, wobeiETA a group derived from an electron transfer agent which, when released, forms a Phenazine, naphthazine, phenothiazine or a phenazonium compound or a substituted para-benzoquinone or naphthoquinone in either its oxidized or reduced form, wherein
BLOCK und ETA durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind.BLOCK and ETA are connected to each other by the active redox part of the electron transfer agent.
Durch diese Erfindung wird ferner eine analytische Zusammensetzung bereitgestellt, die umfaßt:This invention further provides an analytical composition comprising:
a) entweder eine reduzierbare Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefert, oder eine oxidierbare Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge der Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefert, und(a) either a reducible compound which provides a determinable signal as a result of reduction by an electron transfer agent in its reduced form, or an oxidizable compound which provides a determinable signal as a result of oxidation by an electron transfer agent in its oxidized form, and
b) eine hydrolysierbare Verbindung, wobei die Zusammensetzung gekennzeichnet ist dadurch, daß die hydrolysierbare Verbindung der folgenden Formel entspricht:b) a hydrolysable compound, the composition being characterized in that the hydrolysable compound corresponds to the following formula:
BLOCK-ETABLOCK ETA
worin bedeuten:where:
BLOCK eine Gruppe der Formel -CO-R*, Phosphono oder Thioxophosphono oder ein Salz hiervon, oder einen monovalenten Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid, einem Mono-, Oligo- oder Polysaccharid, worin R* steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, undBLOCK is a group of the formula -CO-R*, phosphono or thioxophosphono or a salt thereof, or a monovalent radical derived from an amino acid, a peptide, a mono-, oligo- or polysaccharide, in which R* is hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, and
ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einem Phenazin, Naphthazin, Phenothiazin oder einer Phenazoniumverbindung, oder einem substituierten oder unsubstituierten Benzochinon oder Naphthochinon in entweder seiner oxidierten oder reduzierten Form, wobeiETA a group derived from a phenazine, naphthazine, phenothiazine or a phenazonium compound, or a substituted or unsubstituted benzoquinone or naphthoquinone in either its oxidized or reduced form, where
BLOCK und ETA miteinander durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind.BLOCK and ETA are connected to each other by the active redox part of the electron transfer agent.
Weiterhin umfaßt ein trockenes analytisches Element dieser Erfindung zur Bestimmung eines hydrolytischen Analyten ein absorbierendes Trägermaterial, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine hydrolysierbare Verbindung, wie oben beschrieben, für die analytische Zusammensetzung enthält.Furthermore, a dry analytical element of this invention for the determination of a hydrolytic analyte comprises an absorbent support material, the element being characterized by containing a hydrolyzable compound, as described above, for the analytical composition.
Weiterhin umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines hydrolytischen Analyten die folgenden Stufen:Furthermore, a method for determining a hydrolytic analyte comprises the following steps:
A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der erwartet wird, daß sie einen hydrolytischen Analyten enthält, unter hydrolysierenden Bedingungen mit der hydrolysierbaren Verbindung, die oben für die analytische Zusammensetzung beschrieben wurde, wobei das Kontaktieren in Gegenwart von entweder einer reduzierbaren Verbindung durchgeführt wird, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefert oder in Gegenwart einer oxidierbaren Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefert, unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies, undA. Contacting a sample of a liquid expected to contain a hydrolytic analyte under hydrolyzing conditions with the hydrolyzable compound described above for the analytical composition, wherein the contacting is carried out in the presence of either a reducible compound that provides a detectable signal as a result of reduction by an electron transfer agent in its reduced form or in the presence of an oxidizable compound that provides a detectable signal as a result of oxidation by an electron transfer agent in its oxidized form to produce a detectable species, and
B. Bestimmung der bestimmbaren Spezies, die erzeugt wird entweder aufgrund der Reduktion oder Oxidation der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung.B. Determination of the detectable species produced due to either reduction or oxidation of the reducible or oxidizable compound.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Substrate bereit, die Elektronenübertragungsmittel durch Hydrolyse durch hydrolytische Analyte freisetzen. Diese freigesetzten Elektronenübertragungsmittel können entweder in einer reduzierten oder oxidierten Form vorliegen und erleichtern entweder die Reduktion von reduzierbaren Verbindungen oder die Oxidation von oxidierbaren Verbindungen unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies. Dies bedeutet, daß die Substrate in einem Bestimmungsverfahren für hydrolytische Analyte eingesetzt werden können, unter Gewinnung einer empfindlicheren und rascheren Bestimmung.The present invention provides novel substrates that release electron transfer agents upon hydrolysis by hydrolytic analytes. These released electron transfer agents can be in either a reduced or oxidized form and facilitate either the reduction of reducible compounds or the oxidation of oxidizable compounds to produce a detectable species. This means that the substrates can be used in a method for determining hydrolytic analytes to provide a more sensitive and rapid determination.
Im Falle einer Ausführungsform ist ferner ein stöchiometrischer Überschuß an einem Reduktionsmittel vorhanden, das dazu befähigt ist, das oxidierte Elektronenübertragungsmittel zu reduzieren. Dieses Reduktionsmittel reduziert das Elektronenübertragungsmittel mit einer viel größeren Geschwindigkeit als die reduzierbare Verbindung. Alternativ ist im Falle einer anderen Ausführungsform auch ein stöchiometrischer Überschuß eines Oxidationsmittels vorhanden, das dazu befähigt ist, das reduzierte Elektronenübertragungsmittel zu oxidieren. Dieses Oxidationsmittel oxidiert das Elektronenübertragungsmittel mit einer viel größeren Geschwindigkeit als die oxidierbare Verbindung. Als Folge hiervon kann ein Äquivalent des freigesetzten Elektronenübertragungsmittels recyclisiert werden unter Erzeugung von mehr als einem Äquivalent der bestimmbaren Spezies, wodurch ein verstärktes, hoch empfindliches Bestimmungsverfahren möglich wird.In one embodiment, there is also present a stoichiometric excess of a reducing agent capable of reducing the oxidized electron transfer agent. This reducing agent reduces the electron transfer agent at a much greater rate than the reducible compound. Alternatively, in another embodiment, there is also present a stoichiometric excess of an oxidizing agent capable of oxidizing the reduced electron transfer agent. This oxidizing agent oxidizes the electron transfer agent at a much greater rate than the oxidizable compound. As a result, one equivalent of the released electron transfer agent can be recycled to produce more than one equivalent of the detectable species, thereby enabling an enhanced, highly sensitive detection method.
Die Reaktion der reduzierbaren Verbindung mit dem Reduktionsmittel oder die Reaktion der oxidierbaren Verbindung mit dem Oxidationsmittel muß in Abwesenheit des Elektronenübertragungsmittels langsam verlaufen. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden, einschließlich auf elektrochemischem Wege durch Einstellung der Redoxpotentiale, oder durch Einstellung der physikalischen oder chemischen Reaktionsbedingungen (zum Beispiel Temperatur, pH-Wert, Konzentration der Reaktionskomponenten oder Immobilisierung von Reaktionskomponenten innerhalb von Mizellen).The reaction of the reducible compound with the reducing agent or the reaction of the oxidizable compound with the oxidizing agent must be slow in the absence of the electron transfer agent. This can be due to various ways, including electrochemically by adjusting the redox potentials, or by adjusting the physical or chemical reaction conditions (e.g. temperature, pH, concentration of the reaction components or immobilization of reaction components within micelles).
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, um qualitativ oder quantitativ einen hydrolytischen Analyten zu bestimmen (einen lebenden oder nicht lebenden Analyten). Der hier gebrauchte Ausdruck "hydrolytischer Analyt" bezieht sich auf eine Substanz (chemische Substanz, Enzym oder Organismus), die das Substrat dieser Erfindung zu hydrolysieren vermag, und zwar durch Abspaltung der BLOCK-Gruppe von dem Rest des Moleküls. Diese Erfindung eignet sich insbesondere zur Bestimmung von hydrolytischen Enzymen, wie zum Beispiel Acylasen, Esterasen, Amidasen, Glykosidasen, Phosphatasen und Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten, wie beispielsweise Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceaen oder Neisseriaceaen, einschließlich solchen Enzymen und Mikroorganismen, die aufgeführt sind in der PCT- Patentanmeldung 80/02433 (WO-A-8002433) . Das Substrat kann bestimmt sein, um mit der geeigneten BLOCK-Gruppe und Bindung einen speziellen Analyten zu bestimmen.The present invention can be used to determine qualitatively or quantitatively a hydrolytic analyte (a living or non-living analyte). The term "hydrolytic analyte" as used herein refers to a substance (chemical substance, enzyme or organism) capable of hydrolyzing the substrate of this invention by removing the BLOCK group from the rest of the molecule. This invention is particularly suitable for the determination of hydrolytic enzymes such as acylases, esterases, amidases, glycosidases, phosphatases and microorganisms containing these enzymes such as members of the Enterobacteriaceae or Neisseriaceae family, including those enzymes and microorganisms listed in PCT patent application 80/02433 (WO-A-8002433). The substrate may be designed to detect a specific analyte with the appropriate BLOCK group and bond.
Die Substrate dieser Erfindung können im Rahmen analytischer Bestimmungen von verschiedenen wäßrigen Flüssigkeiten verwendet werden, wie beispielsweise biologischen Flüssigkeiten (zum Beispiel Urin, cerebralen spinalen Flüssigkeiten, Blut, Lymphflüssigkeiten, einem Gewebe-Homogenat, Schleim, Speichel oder Stuhl-Sekretionen), Herstellungsverfahren, Abwässern oder Nahrungsmitteln. Die Bestimmungen können durchgeführt werden unter Anwendung einer einzelnen Reaktion oder einer Reaktionsfolge, bei der eine Hydrolyse des Substrates erfolgt und eine Freisetzung des Elektronenübertragungsmittels.The substrates of this invention can be used in analytical determinations of various aqueous fluids, such as biological fluids (e.g., urine, cerebral spinal fluids, blood, lymph fluids, tissue homogenate, mucus, saliva, or stool secretions), manufacturing processes, waste water, or food. The determinations can be carried out using a single reaction or a sequence of reactions involving hydrolysis of the substrate and release of the electron transfer agent.
Die Substrate dieser Erfindung sind gekennzeichnet durch die Formel:The substrates of this invention are characterized by the formula:
BLOCK-ETA.BLOCK ETA.
In dieser Formel steht BLOCK für jede geeignete hydrolysierbare Gruppe, die von dem Rest des Moleküls durch Hydrolyse abgespalten werden kann. Im Kontext dieser Anmeldung blockiert oder inhibiert die BLOCK-Gruppe die dem Elektronenübertragungsmittel (identifiziert als ETA) eigene Fähigkeit zur Elektronenübertragung durch eine Redox-Blockierung. Dies bedeutet, daß BLOCK an ETA durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittelmoleküls gebunden ist, so daß ETA inaktiv ist, wenn es an BLOCK gebunden ist und aktiv ist, wenn es freigesetzt worden ist. Der spezielle aktive Redoxteil eines jeden Elektronenübertragungsmittels ist einem fachkundigen Chemiker bekannt. Die Blockierungsgruppe kann ausgewählt werden aufgrund der gewünschten Analyt-Spezifität. Zu repräsentativen Blockierungsgruppen gehören zum Beispiel -CO-R*, Phosphono oder Thioxophosphono oder ein Salz hiervon, oder ein Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Mono-, Oligo- oder Polysaccharid.In this formula, BLOCK represents any suitable hydrolyzable group that can be cleaved from the rest of the molecule by hydrolysis. In the context of this application, the BLOCK group blocks or inhibits the inherent ability of the electron transfer agent (identified as ETA) to transfer electrons through redox blocking. This means that BLOCK is bound to ETA through the active redox portion of the electron transfer agent molecule, so that ETA is inactive when bound to BLOCK and active when released. The particular active redox portion of any electron transfer agent is known to a skilled chemist. The blocking group can be selected based on the desired analyte specificity. Representative blocking groups include, for example, -CO-R*, phosphono or thioxophosphono or a salt thereof, or a residue derived from an amino acid, a peptide or a mono-, oligo- or polysaccharide.
R* kann stehen für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (vorzugsweise von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Chloroethyl, Isopropyl, Benzyl oder Chlorobenzyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl (vorzugsweise von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Ethenyl, 2-Propenyl oder 4-Hexenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (vorzugsweise mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Phenyl oder Methoxyphenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl (vorzugsweise mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Cyclopentyl oder Cyclohexyl), oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe (vorzugsweise mit 6 bis 12 Kohlenstoff-, Schwefel-, Stickstoff- und Sauerstoffatomen, zum Beispiel Pyridyl oder Thienyl).R* can represent hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl (preferably from 1 to 20 carbon atoms, for example methyl, ethyl, chloroethyl, isopropyl, benzyl or chlorobenzyl), substituted or unsubstituted alkenyl (preferably from 2 to 20 carbon atoms, for example ethenyl, 2-propenyl or 4-hexenyl), substituted or unsubstituted aryl (preferably having 6 to 12 carbon atoms, for example phenyl or methoxyphenyl), substituted or unsubstituted cycloalkyl (preferably having 5 to 12 carbon atoms, for example cyclopentyl or cyclohexyl), or a substituted or unsubstituted heterocyclic group (preferably having 6 to 12 carbon atoms, sulfur, nitrogen and oxygen atoms, for example pyridyl or thienyl).
ETA ist eine Gruppe, die sich von einem Elektronenübertragungsmittel ableitet, die, wenn sie freigesetzt ist, eine Phenazin-, Naphthazin-, Phenothiazin-, Phenazoniumverbindung oder ein substituiertes Benzo- oder Naphthochinon in entweder oxidierter oder reduzierter Form liefert. Unter einem Elektronenübertragungsmittel ist hier eine Verbindung zu verstehen, die ein Redox-Potential aufweist, derart, daß sie dazu befähigt ist, sowohl ein oder mehrere Elektronen in Gegenwart von entweder reduzierbaren oder oxidierbaren Verbindungen aufzunehmen und abzugeben.ETA is a group derived from an electron transfer agent which, when released, provides a phenazine, naphthazine, phenothiazine, phenazonium compound or a substituted benzo- or naphthoquinone in either oxidized or reduced form. By an electron transfer agent is meant here a compound which has a redox potential such that it is capable of both accepting and donating one or more electrons in the presence of either reducible or oxidizable compounds.
ETA ist an BLOCK durch eine einzelne Bindung gebunden oder durch eine verbindende Gruppe, die Teil des ETA-Restes ist. Zu derartigen verbindenden Gruppen gehören Oxy, Thio oder Imino [-NR-, worin R steht für Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Methyl, Chloromethyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Decyl oder Benzyl), substituiertes oder unsubstituiertes Cyclohexyl (zum Beispiel Cyclohexyl oder 4-Methylcyclohexyl), substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl (Phenyl, Chlorophenyl oder p-Methoxyphenyl), Sulfonyl (-SO&sub2;R', worin R' steht für Alkyl oder Phenyl, wie für R angegeben), oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, wie oben definiert, beispielsweise Pyridyl oder Thienyl]. Vorzugsweise ist ETA an BLOCK durch eine Oxy- oder Iminogruppe gebunden, in der R steht für Wasserstoff oder ein kurzkettiges substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.ETA is linked to BLOCK by a single bond or by a linking group that is part of the ETA moiety. Such linking groups include oxy, thio or imino [-NR-, where R is hydrogen or substituted or unsubstituted alkyl having 1 to 10 carbon atoms (for example, methyl, chloromethyl, ethyl, propyl, isopropyl, decyl or benzyl), substituted or unsubstituted cyclohexyl (for example, cyclohexyl or 4-methylcyclohexyl), substituted or unsubstituted phenyl (phenyl, chlorophenyl or p-methoxyphenyl), sulfonyl (-SO₂R', where R' is alkyl or phenyl as indicated for R), or a substituted or unsubstituted heterocyclic group as defined above, for example, pyridyl or thienyl]. Preferably, ETA is bonded to BLOCK through an oxy or imino group in which R is hydrogen or a short chain substituted or unsubstituted alkyl having 1 to 3 carbon atoms.
Zu repräsentativen Elektronenübertragungsmitteln, von denen sich ETA ableitet, gehören die Phenazine, wie zum Beispiel Phenazinmethosulfat und Phenazinethosulfat, die Naphthazine, wie zum Beispiel Roseinduline 2G, die Phenothiazine, wie zum Beispiel Thionin, die Phenazoniumverbindungen, wie zum Beispiel Cresyl blue (und andere, die beschrieben werden von Furst & Mitarbeitern in Anal. Chim. Acta, 140, S. 1-18, 1982, Tabelle 2), und substituierte o- oder p-Benzo- und Naphthochinone, von denen einige ganz allgemein beschrieben werden in der EP-Publikation 190 740 und in EP-A-0 255 679. Zu besonders geeigneten Verbindungen für die Praxis dieser Erfindung gehören Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat und die oben erwähnten o- oder p-Benzo- und Naphthochinone.Representative electron transfer agents from which ETA is derived include the phenazines, such as Phenazine methosulfate and phenazine ethosulfate, the naphthazines such as roseinduline 2G, the phenothiazines such as thionine, the phenazonium compounds such as cresyl blue (and others described by Furst & coworkers in Anal. Chim. Acta, 140, pp. 1-18, 1982, Table 2), and substituted o- or p-benzo- and naphthoquinones, some of which are described more generally in EP Publication 190 740 and in EP-A-0 255 679. Particularly suitable compounds for the practice of this invention include phenazine methosulfate, phenazine ethosulfate and the above-mentioned o- or p-benzo- and naphthoquinones.
Ganz allgemein sind die geeignetsten Elektronenübertragungsmittel jene, die der Struktur (I) entsprechen: In general, the most suitable electron transfer agents are those corresponding to the structure (I):
Im Falle dieser Struktur stehen R&sup7; und R&sup8; unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxy, Halogen (zum Beispiel Fluoro, Chloro, Bromo oder Jodo), Cyano, Nitro, Carboxy, Carboxyalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (zum Beispiel Carboxymethyl oder Carboxyethyl), Carboxamido (d. h. -CONR'R'', worin R' und R'' unabhängig voneinander stehen für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl, wie unten definiert), Sulfonamido (d. h. -SO&sub2;NR'R'', worin R' und R'' die oben angegebene Bedeutung haben), Trihaloalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (wie beispielsweise Trichloromethyl, Tribromomethyl oder Trifluoromethyl), Sulfonyl (d. h. -SO&sub2;R''', worin R''' steht für Alkyl oder Aryl, wie unten definiert), Carboxaldehyd, Carbonylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (wie zum Beispiel Acetyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Chloromethyl, 2-Propenyl, n-Hexyl oder Decyl und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxy (definiert entsprechend Alkyl), substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder 2- Hydroxyisopropyl, worin der Alkylanteil weiter substituiert sein kann und vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist), substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkoxy (definiert entsprechend Hydroxyalkyl), substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen im Alkylteil des Moleküls, der definiert werden kann, wie für Alkyl oben angegeben, zum Beispiel Acetoxymethyl oder Acetoxyethyl und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkoxy (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen im Alkoxyteil des Moleküls und definiert ähnlich wie oben für Acetoxyalkyl angegeben, und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxyalkyl oder Oxyalkylenalkoxy (jeweils im allgemeinen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkoxy- und Alkylanteile des Moleküls wie oben beschrieben definiert sind und der Alkylenrest 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist), substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Xylyl, Methylnaphthyl oder p-Methoxyphenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkaryl (im allgemeinen mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkyl- und Arylanteile der Moleküle definiert sind entsprechend wie oben für Alkyl und Aryl angegeben, zum Beispiel Benzyl, Phenylethyl oder p-Methoxyphenylethyl), heterocyclische oder alkyl-heterocyclische Gruppen (im allgemeinen mit 5 bis 12 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen im Ring, mit, falls erwünscht, einem oder mehreren Substituenten, wie zum Beispiel Morpholino, Piperidino oder Methylpiperidino).In this structure, R&sup7; and R&sup8; independently represent hydrogen, hydroxy, halogen (for example fluoro, chloro, bromo or iodo), cyano, nitro, carboxy, carboxyalkyl wherein the alkyl group has 1 to 10 carbon atoms (for example carboxymethyl or carboxyethyl), carboxamido (ie -CONR'R'' wherein R' and R'' independently represent hydrogen, alkyl or aryl as defined below), sulfonamido (ie -SO₂NR'R'' wherein R' and R'' have the meaning given above), trihaloalkyl wherein the alkyl group has 1 to 10 carbon atoms (such as trichloromethyl, tribromomethyl or trifluoromethyl), sulfonyl (ie -SO₂R''' wherein R''' represents alkyl or aryl as defined below), carboxaldehyde, carbonylalkyl wherein the alkyl group has 1 to 10 carbon atoms (such as acetyl), substituted or unsubstituted alkyl or alkenyl (in generally having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl, ethyl, chloromethyl, 2-propenyl, n-hexyl or decyl and preferably having 1 to 5 carbon atoms), substituted or unsubstituted alkoxy (defined accordingly for alkyl), substituted or unsubstituted hydroxyalkyl (generally having 1 to 10 carbon atoms, such as hydroxymethyl, hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl or 2-hydroxyisopropyl, wherein the alkyl moiety may be further substituted and preferably has 1 to 5 carbon atoms), substituted or unsubstituted hydroxyalkoxy (defined accordingly for hydroxyalkyl), substituted or unsubstituted acetoxyalkyl (generally having 1 to 10 carbon atoms in the alkyl part of the molecule, which can be defined as given for alkyl above, for example acetoxymethyl or acetoxyethyl and preferably having 1 to 5 carbon atoms), substituted or unsubstituted acetoxyalkoxy (generally having 1 to 10 carbon atoms in the alkoxy part of the molecule and defined similarly as given above for acetoxyalkyl, and preferably having 1 to 5 carbon atoms), substituted or unsubstituted alkoxyalkyl or oxyalkylenealkoxy (each generally having 2 to 10 carbon atoms, the alkoxy and alkyl parts of the molecule being defined as described above and the alkylene radical having 1 to 5 carbon atoms), substituted or unsubstituted aryl (generally having 6 to 12 carbon atoms, such as phenyl, naphthyl, xylyl, methylnaphthyl or p-methoxyphenyl), substituted or unsubstituted alkaryl (generally having 7 to 10 carbon atoms, the alkyl and aryl parts of the molecules being defined as given above for alkyl and aryl, for Example benzyl, phenylethyl or p-methoxyphenylethyl), heterocyclic or alkyl-heterocyclic groups (generally having 5 to 12 carbon, nitrogen, oxygen or sulphur atoms in the ring, with, if desired, one or more substituents such as morpholino, piperidino or methylpiperidino).
In der Struktur I stehen ferner R&sup9; und R¹&sup0; unabhängig voneinander für Gruppen, wie für R&sup7; und R&sup8; beschrieben, oder sie stehen gemeinsam für die Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome, die erforderlich sind zur Vervollständigung eines 4- bis 8-gliedrigen kondensierten substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen oder heterocyclischen Ringes, der an den Chinonkern gebunden ist (zum Beispiel unter Vervollständigung eines Cyclopentan-, Dihydrofuran- oder bicyclischen Ringes, wie beispielsweise eines Bicyclo[2.2.2]octan-, Benzo- oder eines Bicyclo[2.2.1]heptanringes).Furthermore, in structure I, R9 and R10 independently represent groups as described for R7 and R8, or together represent the carbon, nitrogen, oxygen or sulfur atoms required to complete a 4- to 8-membered fused substituted or unsubstituted carbocyclic or heterocyclic ring attached to the quinone nucleus (for example, completing a cyclopentane, dihydrofuran or bicyclic ring such as a bicyclo[2.2.2]octane, benzo or bicyclo[2.2.1]heptane ring).
Mindestens einer der Substituenten R&sup7;, R&sup8;, R&sup9; und R¹&sup0; hat nicht die Bedeutung von Wasserstoff, sondern steht für eine der oben definierten Gruppen oder bildet gemeinsam mit einem anderen Substituenten einen der angegebenen definierten ankondensierten Ringe.At least one of the substituents R⁷, R⁸, R⁹⁰ and R¹⁰ does not represent hydrogen, but represents one of the groups defined above or, together with another substituent, forms one of the specified defined fused rings.
Die hydrolysierbaren Substrate dieser Erfindung werden nach dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt: Herstellung oder Kauf des Elektronenübertragungsmittels mit anschließender Umsetzung mit einem geeigneten Blockierungsrest. Der Blockierungsrest oder blockierende Rest kann erworben oder hergestellt werden unter Anwendung üblicher chemischer Methoden. Vor Umsetzung mit einem Elektronenübertragungsmittel werden die reaktiven Gruppen am blockierenden Rest mit schützenden Gruppen geschützt, so daß eine Reaktion mit dem Elektronenübertragungsmittel nur an einer Position erfolgt. Hat die Umsetzung stattgefunden, so werden die schützenden Gruppen entfernt.The hydrolyzable substrates of this invention are prepared by the following general procedure: Prepare or purchase the electron transfer agent followed by reaction with a suitable blocking moiety. The blocking moiety can be purchased or prepared using conventional chemical techniques. Prior to reaction with an electron transfer agent, the reactive groups on the blocking moiety are protected with protecting groups so that reaction with the electron transfer agent occurs at only one position. Once reaction has occurred, the protecting groups are removed.
Ein hydrolytischer Analyt wird gemäß dieser Erfindung bestimmt durch Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, mit sowohl dem oben beschriebenen hydrolytischen Substrat sowie entweder einer reduzierbaren Verbindung oder einer oxidierbaren Verbindung. Das Substrat und die reduzierbare oder oxidierbare Verbindung können separat oder gemeinsam in einer analytischen Zusammensetzung geliefert werden.A hydrolytic analyte is determined according to this invention by contacting a sample of a liquid suspected of containing the analyte with both the hydrolytic substrate described above and either a reducible compound or an oxidizable compound. The substrate and the reducible or oxidizable compound may be supplied separately or together in an analytical composition.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform wird ein hydrolytischer Analyt bestimmt durch Kontaktieren einer Flüssigkeitsprobe, von der angenommen wird, daß den Analyten enthält, mit dem hydrolytischen Substrat, einer reduzierbaren Verbindung und überschüssigem Reduktionsmittel oder einer oxidierbaren Verbindung und überschüssigem Oxidationsmittel. Das Substrat und die reduzierbare oder oxidierbare Zusammensetzung können separat oder gemeinsam als analytische Zusammensetzung bereitgestellt werden.In a preferred embodiment, a hydrolytic analyte is determined by contacting a liquid sample suspected of containing the analyte with the hydrolytic substrate, a reducible compound and excess reducing agent, or an oxidizable compound and excess oxidizing agent. The substrate and the reducible or oxidizable composition may be provided separately or together as an analytical composition.
Im Falle der Reduktions-Ausführungsform werden reduzierbare Verbindungen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, breit definiert als organische Verbindungen, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefern. Ein derartiges Signal kann erzeugt werden durch die Verbindung selbst oder einen Teil hiervon, der in geeigneter Weise freigesetzt wird. Zu repräsentativen reduzierbaren Verbindungen gehören Tetrazoliumsalze, Leucofarbstoffe, 2,6-Dichloroindophenol und andere bekannte Verbindungen, die dem Fachmann bekannt sind.In the case of the reduction embodiment, reducible compounds suitable for the practice of this invention are broadly defined as organic compounds that provide a determinable signal as a result of reduction by an electron transfer agent in its reduced form. Such a signal can be generated by the compound itself or a portion thereof that is suitably released. Representative reducible compounds include tetrazolium salts, leuco dyes, 2,6-dichloroindophenol, and other known compounds known to those of skill in the art.
Besonders geeignete reduzierbare Verbindungen sind die reduzierbaren Verbindungen, die in der EP-Publikation 0 211 898 beschrieben werden. Diese Verbindungen enthalten eine verschiebbare bestimmbare Spezies, die bei einem physiologischen pH-Wert (d. h. bei 9 oder weniger) reduziert werden kann, unter Freisetzung der verschiebbaren bestimmbaren Spezies. Die Bezeichnung "verschiebbare bestimmbare Spezies" ist wie folgt definiert: (1) einen Chromogenrest, der eine erste spektrale Absorptionsbande aufweist, während er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, und eine zweite spektrale Absorptionsbande, wenn er freigesetzt wird, oder einen Fluorogenrest, der erste spektrale Absorptions- und Emissionsbanden aufweist, während er gebunden ist und zweite spektrale Absorptions- und Emissionsbanden, wenn er freigesetzt ist, (2) einen chemisch oder biologisch geeigneten Rest, der inaktiv ist, blockiert oder in anderer Weise nicht zugänglich, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, jedoch aktiv, entblockiert oder zugänglich ist, wenn er freigesetzt ist, oder (3) einen chemisch oder biologisch geeigneten Rest, der aktiv oder zugänglich ist, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, jedoch inaktiv oder in anderer Weise unzugänglich ist, wenn er freigesetzt wird.Particularly suitable reducible compounds are the reducible compounds described in EP publication 0 211 898. These compounds contain a shiftable detectable species which can be reduced at a physiological pH (i.e. at 9 or less) to release the shiftable detectable species. The term "shiftable detectable species" is defined as follows: (1) a chromogen moiety which has a first spectral absorption band while being the reducible compound and a second spectral absorption band when released, or a fluorogen moiety that has first spectral absorption and emission bands while bound and second spectral absorption and emission bands when released, (2) a chemically or biologically suitable moiety that is inactive, blocked, or otherwise inaccessible when bound to the reducible compound but active, unblocked, or accessible when released, or (3) a chemically or biologically suitable moiety that is active or accessible when bound to the reducible compound but inactive or otherwise inaccessible when released.
Infolgedessen kann eine verschiebbare bestimmbare Spezies ein Rest sein, der eine erste spektrale Absorptionsbande aufweist, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, vor einer Reduktion und Freisetzung, der jedoch eine zweite spektrale Absorptionsbande während der analytischen Bestimmung aufweist. Die bestimmbare Spezies ist chemisch modifiziert, wenn sie an den Kern der reduzierbaren Verbindung gebunden ist, derart, daß die spektrale Absorptionsbande der reduzierbaren Verbindung "verschoben wird" von der Bande, die die Spezies aufweist, wenn sie freigesetzt wird. Im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, wird die Bande zu wesentlich kürzeren Wellenlängen relokalisiert, wenn die Spezies ein Teil der reduzierbaren Verbindung ist. In sämtlichen Fällen überlappen sich die zwei Banden nicht in einem ins Gewicht fallenden Ausmaß. Der Wechsel von einer spektralen Absorptionsbande zu einer anderen kann die Folge sein der bloßen Freisetzung des Restes von der reduzierbaren Verbindung, oder alternativ er kann verursacht werden durch eine solche Freisetzung, gekoppelt mit entweder eine Reaktion des freigesetzten Restes mit Metallionen oder einem Beizmittel, oder gekoppelt mit einer Veränderung in der Bestimmungsumgebung (zum Beispiel einer Veränderung des pH-Wertes).Thus, a shiftable detectable species may be a moiety that exhibits a first spectral absorption band when bound to the reducible compound prior to reduction and release, but that exhibits a second spectral absorption band during analytical determination. The detectable species is chemically modified when bound to the core of the reducible compound such that the spectral absorption band of the reducible compound is "shifted" from the band exhibited by the species when released. Generally, but not necessarily, the band is relocalized to substantially shorter wavelengths when the species is part of the reducible compound. In all cases, the two bands do not overlap to any significant extent. The change from one spectral absorption band to another may be the result of the mere release of the residue from the reducible compound, or alternatively it may be caused by such release coupled with either a reaction of the released residue with metal ions or a mordant, or coupled with a change in the detection environment (for example a change in pH value).
Wie oben beschrieben, können verschiebbare bestimmbare Spezies auch chemisch oder biologisch geeignete Reste sein, die, wenn sie an die reduzierbare Verbindung gebunden sind, inaktiv oder blockiert sind oder in anderer Weise unzugänglich sind, die jedoch, wenn sie bei einem physiologischen pH-Wert freigesetzt werden, biologisch oder chemisch aktiv sind oder für eine weitere Reaktion zugänglich sind. Die freigesetzten aktiven Spezies können selbst bestimmt werden oder sind für eine oder mehrere nachfolgende chemische, physikalische oder biologische Reaktionen geeignet unter Bildung einer bestimmbaren Spezies. Die Praxis dieser Erfindung liefert ein Mittel für die Freisetzung solcher Reste, wie beispielsweise von Enzymen, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Ko-Faktoren, Katalysatoren oder Reaktionskomponenten durch Reduktion der reduzierbaren Verbindung, vorzugsweise bei einem physiologischen pH-Wert, für eine Vielzahl von chemischen oder biologischen Zwecken.As described above, displaceable detectable species may also be chemically or biologically suitable moieties which, when bound to the reducible compound, are inactive, blocked or otherwise inaccessible, but which, when released at a physiological pH, are biologically or chemically active or accessible for further reaction. The released active species may themselves be detectable or suitable for one or more subsequent chemical, physical or biological reactions to form a detectable species. The practice of this invention provides a means for releasing such moieties, such as enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, cofactors, catalysts or reaction components, by reduction of the reducible compound, preferably at a physiological pH, for a variety of chemical or biological purposes.
Ferner kann eine verschiebbare bestimmbare Spezies ein chemisch oder biologisch geeigneter Rest sein, der, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, aktiv oder in anderer Weise zugänglich ist für eine oder mehrere nach folgenden chemischen, physikalischen oder biologischen Reaktionen, der jedoch, wenn er bei einem physiologischen pH-Wert freigesetzt wird, inaktiv oder in anderer Weise unzugänglich für solche Reaktionen wird.Furthermore, a displaceable determinable species can be a chemically or biologically suitable moiety which, when bound to the reducible compound, is active or otherwise accessible to one or more subsequent chemical, physical or biological reactions, but which, when released at a physiological pH, becomes inactive or otherwise inaccessible to such reactions.
Die reduzierbaren Verbindungen, die für diese Erfindung besonders geeignet sind, entsprechen der Struktur The reducible compounds particularly suitable for this invention correspond to the structure
worin CAR- steht für einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Kern oder Chinonkern, worin R¹ steht für einen Rest, umfassend eine verschiebbare bestimmbare Spezies, wie oben definiert, und worin n steht für 1 oder 2. Beispiele für derartige Kerne werden unten angegeben. Wird ferner R¹ ersetzt durch H, so hat wherein CAR- represents a substituted or unsubstituted aromatic nucleus or quinone nucleus, wherein R¹ represents a radical comprising a displaceable determinable species as defined above, and wherein n represents 1 or 2. Examples for such nuclei are given below. Furthermore, if R¹ is replaced by H,
ein Reduktionspotential (E1/2) von entweder mindestens +100 mV, gemessen in Wasser, oder von mindestens -650 mV, gemessen in Acetonitril. Dieser E1/2-Wert erleichtert die Reduktion und die nachfolgende Freisetzung der verschiebbaren bestimmbaren Spezies von der Verbindung. Derartige Messungen erfolgen nach üblichen elektrochemischen Methoden unter Anwendung von entweder einer Differential-Impuls-Polarographie oder einer cyclischen Voltametrie.a reduction potential (E1/2) of either at least +100 mV, measured in water, or at least -650 mV, measured in acetonitrile. This E1/2 value facilitates the reduction and subsequent release of the shiftable determinable species from the compound. Such measurements are made by conventional electrochemical methods using either differential pulse polarography or cyclic voltammetry.
Die oxidierbaren Verbindungen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, lassen sich breit definieren als organische Verbindungen, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefern. Ein solches Signal kann erzeugt werden durch die Verbindung selbst oder einen Teil hiervon, der in bestimmter Weise freigesetzt wird. Zu repräsentativen oxidierbaren Verbindungen gehören substituierte und unsubstituierte Hydrochinone, Aminophenole, Phenylendiamine und andere, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Materialien sind entweder im Handel erhältlich oder leicht herstellbar unter Anwendung bekannter Verfahren und Ausgangsmaterialien.The oxidizable compounds useful in the practice of this invention can be broadly defined as organic compounds that provide a detectable signal as a result of oxidation by an electron transfer agent in its oxidized form. Such a signal can be generated by the compound itself or a portion thereof released in a certain manner. Representative oxidizable compounds include substituted and unsubstituted hydroquinones, aminophenols, phenylenediamines, and others known to those skilled in the art. These materials are either commercially available or readily prepared using known procedures and starting materials.
Im Falle einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung durchgeführt mit einem stöchiometrischen Überschuß an einem Reduktionsmittel, das dazu befähigt ist, die oxidierte Form des Elektronenübertragungsmittels nach seiner Reaktion mit der reduzierbaren Verbindung zu reduzieren. Alternativ wird die Erfindung im Falle einer anderen Ausführungsform mit einem stöchiometrischen Überschuß an einem Oxidationsmittel durchgeführt, das dazu befähigt ist, die reduzierte Form des Elektronenübertragungsmittels zu oxidieren, nach seiner Reaktion mit der oxidierbaren Verbindung. In Gegenwart von überschüssigem Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel wird das freigesetzte Elektronenübertragungsmittel somit recyclisiert, bis sämtliche reduzierbare oder oxidierbare Verbindung umgesetzt worden ist.In one embodiment, the present invention is practiced with a stoichiometric excess of a reducing agent capable of reducing the oxidized form of the electron transfer agent after its reaction with the reducible compound. Alternatively, in another embodiment, the invention is practiced with a stoichiometric excess of an oxidizing agent capable of oxidizing the reduced form of the electron transfer agent after its reaction with the oxidizable compound. In the presence of excess reducing agent or oxidizing agent, the The released electron transfer agent is thus recycled until all reducible or oxidizable compounds have been converted.
Infolgedessen wird jede Verbindung, die ein oxidiertes Elektronenübertragungsmittel reduziert, als Reduktionsmittel betrachtet und kann in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden. Ein besonders geeignetes Reduktionsmittel ist Nicotinamidadenindinukleotid in der reduzierten Form (NADH). Ebenfalls geeignete Reduktionsmittel sind Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, in reduzierter Form (NADPH), Flavinadenindinukleotid in reduzierter Form (FADH), Ascorbinsäure oder Salze hiervon, Cytochrome und Ubichinol.Consequently, any compound that reduces an oxidized electron transfer agent is considered a reducing agent and can be used in the practice of this invention. A particularly suitable reducing agent is nicotinamide adenine dinucleotide in the reduced form (NADH). Also suitable reducing agents are nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, in the reduced form (NADPH), flavin adenine dinucleotide in the reduced form (FADH), ascorbic acid or salts thereof, cytochromes and ubiquinol.
Umgekehrt wird jede Verbindung, die ein reduziertes Elektronenübertragungsmittel oxidiert, als Oxidationsmittel betrachtet und kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Zu repräsentativen geeigneten Oxidationsmitteln gehören Wasserstoffperoxid, Ferricyanid, Persulfat, Ferrichlorid und Bleidioxid.Conversely, any compound that oxidizes a reduced electron transfer agent is considered an oxidizing agent and can be used in this invention. Representative suitable oxidizing agents include hydrogen peroxide, ferricyanide, persulfate, ferric chloride, and lead dioxide.
In Abhängigkeit von ihren Wasserlöslichkeiten können die hydrolytischen Substrate und anderen Komponenten der Zusammensetzungen dieser Erfindung entweder direkt in Puffern gelöst werden oder in einer Kombination eines Puffers und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, oder es können Lösungen hergestellt werden, die ein Substrat, Puffer, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel und ein oberflächenaktives Mittel enthalten.Depending on their water solubilities, the hydrolytic substrates and other components of the compositions of this invention can be dissolved either directly in buffers or in a combination of a buffer and water-miscible organic solvents, or solutions can be prepared containing a substrate, buffer, a water-miscible organic solvent and a surfactant.
Bei Verwendung zur Bestimmung von Enzymen oder Organismen wird die Zusammensetzung dieser Erfindung abgepuffert auf den besonderen pH-Wert, der für ein bestimmtes Bestimmungsverfahren erforderlich ist. Geeignete Puffer lassen sich von einem Fachmann leicht bestimmen und zu ihnen gehören Phosphate, Borate und organische Puffer, wie sie beschrieben werden von Good & Mitarbeitern in Biochem., 5, 467 (1966) und in Anal. Biochem. 104, 300 (1980). Zu oberflächenaktiven Mitteln, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, gehören beliebige oberflächenaktive Mittel, die die Hydrolyse der Verbindung nicht inhibieren. Im allgemeinen sind für die Bestimmung von lebenden Zellen die geeigneten oberflächenaktiven Mittel nicht ionogene oberflächenaktive Mittel.When used to determine enzymes or organisms, the composition of this invention is buffered to the particular pH required for a particular assay. Suitable buffers are readily determined by one skilled in the art and include phosphates, borates and organic buffers as described by Good & coworkers in Biochem., 5, 467 (1966) and in Anal. Biochem. 104, 300 (1980). Surfactants suitable for the practice of this invention include any surfactant that does not inhibit hydrolysis of the compound. In general, for the determination of living cells, suitable surfactants are nonionic surfactants.
Eine Zusammensetzung kann in der folgenden allgemeinen Weise hergestellt werden, wobei die besonderen Details einer solchen Herstellungsweise in dem folgenden Beispiel 4 beschrieben werden. Das hydrolytische Substrat wird in dem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einer Konzentration gelöst, die abhängt von seinem Molekulargewicht, die jedoch im allgemeinen bei 0,1 bis 20, und vorzugsweise bei 1 bis 10 mg/ml Lösungsmittel liegt. Bei Bestimmungsverfahren in Lösung ist die Menge an hydrolytischem Substrat, das vorliegt, mindestens 0,01 und vorzugsweise 10 bis 100 millimolar. Eine reduzierbare oder oxidierbare Verbindung kann in einer mindestens 0,001 und vorzugsweise 0,01 bis 1 millimolaren Menge vorliegen. Die Menge an Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel, die in der Zusammensetzung vorliegt oder zugegeben wird zum Zeitpunkt der Bestimmung, kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden, solange ein stöchiometrischer Überschuß in Beziehung zu der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung vorliegt.A composition may be prepared in the following general manner, with the specific details of such a preparation being described in Example 4 below. The hydrolytic substrate is dissolved in the water-miscible solvent at a concentration which depends on its molecular weight, but is generally from 0.1 to 20, and preferably from 1 to 10, mg/ml of solvent. In solution assays, the amount of hydrolytic substrate present is at least 0.01, and preferably from 10 to 100 millimolar. A reducible or oxidizable compound may be present in an amount of at least 0.001, and preferably from 0.01 to 1 millimolar. The amount of reducing agent or oxidizing agent present in the composition or added at the time of determination can be easily determined by one skilled in the art, as long as there is a stoichiometric excess in relation to the reducible or oxidizable compound.
Die Bestimmung von lebenden Zellen, und insbesondere von bakteriellen Zellen erfolgt oftmals in Gegenwart eines Nährstoffes für diese Zellen, obgleich seine Gegenwart nicht wesentlich ist. Jedes beliebige Nährmedium kann eingesetzt werden, das nützliche Kohlenstoff- und gegebenenfalls Stickstofflieferanten enthält. Geeignete Nährmedien mit geeigneten Bestandteilen und pH-Werten sind dem Fachmann bekannt.The determination of living cells, and in particular bacterial cells, is often carried out in the presence of a nutrient for these cells, although its presence is not essential. Any nutrient medium can be used that contains useful carbon and, if necessary, nitrogen sources. Suitable nutrient media with suitable components and pH values are known to the person skilled in the art.
Einige Enzymanalyte erfordern einen Inducer, d. h. ein Material oder eine Kombination von Materialien, die die Bildung des Enzymes in der Zelle fördern. Der Typ des Inducers oder des Induktionsmediums, das angewandt wird, hängt von dem Enzym ab, das gebildet und bestimmt wird. In einigen Fällen können sowohl ein Inducer als auch ein Nährmittel oder ein Nährmedium benötigt werden, um die Bildung zu fördern.Some enzyme analytes require an inducer, i.e. a material or combination of materials that stimulate the formation of the enzymes in the cell. The type of inducer or induction medium used depends on the enzyme being produced and identified. In some cases, both an inducer and a nutrient or nutrient medium may be needed to promote production.
Die vorliegende Erfindung ist anwendbar auf Bestimmungen in Lösung wie auch auf Trockenbestimmungen. Im Falle von Bestimmungsverfahren in Lösung wird eine Zusammensetzung, die in hydrolytisches Substrat enthält, durch Vermischen mit einer flüssigen Testprobe, die lebende Zellen oder einen hydrolytischen Analyten enthält, der bestimmt werden soll, in Kontakt gebracht. Im allgemeinen wird das Substrat mit der Testprobe in einem geeigneten Behälter vermischt. Die erhaltene Lösung wird vorsichtig vermischt und kann, falls erwünscht, für eine relativ kurze Zeitspanne bei einer Temperatur, die für den speziellen Analyten optimal ist, inkubiert werden. Die Testprobe wird dann untersucht durch Messung der erhaltenen bestimmbaren Spezies mittels einer geeigneten Bestimmungsvorrichtung.The present invention is applicable to both solution and dry determinations. In the case of solution determination methods, a composition containing a hydrolytic substrate is contacted by mixing with a liquid test sample containing living cells or a hydrolytic analyte to be determined. Generally, the substrate is mixed with the test sample in a suitable container. The resulting solution is gently mixed and, if desired, can be incubated for a relatively short period of time at a temperature optimal for the particular analyte. The test sample is then assayed by measuring the resulting detectable species using a suitable assay device.
Die Bestimmung in Lösung kann ferner durchgeführt werden durch Kontaktieren eines porösen absorbierenden Materials, wie beispielsweise eines Papierstreifens, der die Testprobe enthält, mit einer Dispersion des Substrates. Der Analyt in der Testprobe kann aus dem porösen Material in die Dispersion wandern und die analytischen Reaktionen auslösen, die für die Bestimmung benötigt werden.The determination in solution can also be carried out by contacting a porous absorbent material, such as a paper strip containing the test sample, with a dispersion of the substrate. The analyte in the test sample can migrate from the porous material into the dispersion and initiate the analytical reactions required for the determination.
Alternativ kann das Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung eines trockenen analytischen Elementes durchgeführt werden. Ein solches Element kann ein absorbierendes Trägermaterial sein, d. h. ein dünnes Blatt oder ein dünner Streifen eines selbsttragenden absorbierenden oder aufsaugenden Materials, wie beispielsweise eines Filterpapieres oder Streifens, das das hydrolysierbare Substrat enthält, oder einen getrockneten Rest einer Zusammensetzung mit demselben.Alternatively, the method of this invention may be carried out using a dry analytical element. Such an element may be an absorbent support material, i.e. a thin sheet or strip of a self-supporting absorbent or wicking material, such as a filter paper or strip, containing the hydrolysable substrate, or a dried residue of a composition containing the same.
Bei Verwendung in trockenen analytischen Elementen kann das Substrat in ein geeignetes absorbierendes Trägermaterial eingeführt werden durch Aufsaugen oder durch Imprägnieren oder es kann auf ein geeignetes absorbierendes Trägermaterial aufgeschichtet werden. Alternativ kann das Substrat dem Element während einer Bestimmung zugeführt werden. Geeignete Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Urin oder Serum, exponiert werden. Geeignete Trägermaterialien können hergestellt werden aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, Cellulose, porösen Polymerfilmen, Glasfasern oder gewebten und nicht gewebten Textilien (synthetischer oder nicht synthetischer Art).When used in dry analytical elements, the substrate may be incorporated into a suitable absorbent support material by soaking or impregnation, or it may be coated onto a suitable absorbent support material. Alternatively, the substrate may be introduced into the element during a determination. Suitable support materials are insoluble and retain their structural integrity when exposed to water or physiological fluids such as urine or serum. Suitable support materials may be made from paper, porous particulate structures, cellulose, porous polymer films, glass fibers, or woven and nonwoven fabrics (synthetic or non-synthetic).
Ein trockenes Bestimmungsverfahren kann in besonders vorteilhafter Weise unter Verwendung eines analytischen Elementes durchgeführt werden, das aufweist einen Träger, auf dem sich mindestens eine poröse Ausbreitzone, wie dem absorbierenden Trägermaterial, befindet. Das Substrat kann sich in der Ausbreitzone befinden oder in einer hiervon verschiedenen Zone (zum Beispiel einer Reagens-, Registrier- oder hydrophilen Zone). Die Ausbreitzone kann aus beliebigen geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Materialien oder Mischungen von beiden hergestellt werden.A dry determination method can be carried out particularly advantageously using an analytical element comprising a support having thereon at least one porous spreading zone, such as the absorbent support material. The substrate can be in the spreading zone or in a different zone (for example a reagent, recording or hydrophilic zone). The spreading zone can be made of any suitable fibrous or non-fibrous materials or mixtures of both.
Das trockene analytische Element dieser Erfindung weist vorzugsweise einen geeigneten nicht porösen Träger auf, der das absorbierende Trägermaterial trägt. Ein solcher Träger kann aus einer beliebigen geeigneten, dimensionsstabilen und vorzugsweise transparenten (d. h. für Strahlung durchlässigen) Folie oder blattförmigem Material bestehen, die bzw. das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester, Polycarbonate, Celluloseester und andere aus dem Stande der Technik bekannte Materialien.The dry analytical element of this invention preferably comprises a suitable non-porous support carrying the absorbing support material. Such a support may consist of any suitable, dimensionally stable and preferably transparent (ie, radiation-permeable) film or sheet material which absorbs electromagnetic radiation of a wavelength between 200 and 900 nm. Suitable support materials include polystyrene, polyester, polycarbonates, cellulose esters and other materials known in the art.
In den Elementen dieser Erfindung kann die Menge an dem hydrolytischen Substrat weitestgehend variiert werden, liegt jedoch im allgemeinen bei einer Beschichtungsstärke von mindestens 0,001 und vorzugsweise von 0,05 bis 1 g/m². Die reduzierbare oder oxidierbare Verbindung kann in das Element eingeführt werden während der Herstellung oder während des Bestimmungsverfahrens in einer Beschichtungsstärke von mindestens 0,01, und vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 g/m². Weiterhin können das Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel in entsprechender Weise zugegeben werden, um einen stöchiometrischen Überschuß bezüglich der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung zu liefern. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Elementen, abhängig von dem Bestimmungsverfahren, kann gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Elemente können in einer Vielzahl von Formen hergestellt werden, einschließlich in Form länglicher Bänder jeder gewünschten Breite, in Form von blattförmigen Materialien, Slides oder Chips.In the elements of this invention, the amount of the hydrolytic substrate can be varied widely, but is generally at a coverage of at least 0.001, and preferably from 0.05 to 1 g/m². The reducible or oxidizable compound can be introduced into the element during manufacture or during the assay process at a coverage of at least 0.01, and preferably from 0.05 to 0.5 g/m². Furthermore, the reducing agent or oxidizing agent can be added in an appropriate manner to provide a stoichiometric excess of the reducible or oxidizable compound, respectively. A variety of different elements, depending on the assay process, can be prepared according to the present invention. The elements can be prepared in a variety of forms, including in the form of elongated ribbons of any desired width, in the form of sheet materials, slides or chips.
Das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung kann manuell oder in automatisierter Form durchgeführt werden. Im allgemeinen erfolgt bei Verwendung der trockenen Elemente eine Bestimmung eines Analyten oder von lebenden Zellen dadurch, daß das Element von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einem anderen Vorratsbehälter entnommen wird und physikalisch in Kontakt gebracht wird mit einer Probe (zum Beispiel bis zu 200 ul) der zu testenden Flüssigkeit, derart, daß die Probe mit den Reagentien in dem Element vermischt wird. Ein solcher Kontakt kann in jeder beliebigen geeigneten Weise erfolgen, beispielsweise durch Eintauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Auftröpfeln von einem oder mehreren Tropfen der Probe mit der Hand oder maschinell mittels einer geeigneten Abgabevorrichtung. Praktisch gleichzeitig können alle anderen benötigten Reagentien, wie reduzierbare Verbindung, Reduktionsmittel, oxidierbare Verbindung oder Oxidationsmittel zu dem Element oder der Testprobe zugegeben werden, wenn sie nicht bereits in dem Element enthalten sind.The assay method of this invention may be performed manually or in an automated form. In general, using the dry elements, assay of an analyte or of living cells is accomplished by removing the element from a supply roll, chip pack or other supply container and physically contacting it with a sample (for example, up to 200 µl) of the liquid to be tested such that the sample is mixed with the reagents in the element. Such contact may be accomplished in any suitable manner, for example by immersing the element in the sample or, preferably, by dropping one or more drops of sample by hand or mechanically using a suitable dispensing device. Virtually simultaneously, all other required reagents such as reducible compound, reducing agent, oxidizable compound or oxidizing agent may be added to the element or test sample if they are not already contained in the element.
Im allgemeinen erfolgt die Bestimmung (in Lösung oder im Trockenen) unter Bedingungen derart, daß eine Hydrolyse des hydrolytischen Substrates durch das hydrolytische Enzym gefördert wird. Zu solchen hydrolysierenden Bedingungen gehören die Bedingungen des pH-Wertes, die ionische Stärke und Temperatur, welche für die Hydrolyse zweckdienlich sind. Im allgemeinen variiert der pH-Wert von einem Analyten zum anderen, liegt jedoch im Falle der meisten biologischen Analyte bei weniger als 9 und vorzugsweise weniger als 8. Die Temperatur ist nicht kritisch, liegt jedoch im allgemeinen bei weniger als 50ºC.Generally, the determination (in solution or in the dry state) is carried out under conditions such that hydrolysis of the hydrolytic substrate by the hydrolytic enzyme is promoted. Such hydrolyzing conditions include conditions of pH, ionic strength and temperature appropriate for hydrolysis. Generally, the pH varies from one analyte to another, but in the case of most biological analytes is less than 9 and preferably less than 8. The temperature is not critical but is generally less than 50ºC.
Die Bestimmung eines Analyten oder einer lebenden Zelle wird erreicht, wenn das hydrolytische Substrat hydrolysiert wird, unter Freisetzung eines Elektronenübertragungsmittels, das mit der reduzierbaren oder oxidierbaren Verbindung reagiert unter Freisetzung einer bestimmbaren Spezies oder eines Restes, der an einer oder mehreren zusätzlichen Reaktionen teilnimmt, unter Lieferung einer bestimmbaren Spezies. Diese bestimmbare Spezies kann in geeigneter Weise unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung bestimmt werden. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform wird das oxidierte (oder reduzierte) Elektronenübertragungsmittel reduziert (oxidiert) durch das Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), wodurch es für die Reaktion mit zusätzlicher reduzierbarer (oder oxidierbarer) Verbindung zur Verfügung steht. Dieser Recyclinprozeß setzt sich fort, bis sämtliche reduzierbare (oder oxidierbare) Verbindung erschöpft ist. Die Bestimmung kann entweder aus einer Geschwindigkeits(rate)-Bestimmung bestehen oder einer Endpunkt-Bestimmung.Determination of an analyte or living cell is accomplished when the hydrolytic substrate is hydrolyzed, releasing an electron transfer agent which reacts with the reducible or oxidizable compound to release a detectable species or a moiety which participates in one or more additional reactions to yield a detectable species. This detectable species can be suitably determined using a suitable device. In a preferred embodiment, the oxidized (or reduced) electron transfer agent is reduced (oxidized) by the reducing agent (oxidizing agent), making it available for reaction with additional reducible (or oxidizable) compound. This recycling process continues until all of the reducible (or oxidizable) compound is exhausted. The determination can be either a rate determination or an endpoint determination.
Die hier und in den Ansprüchen gebrauchte Abkürzung I.E. steht für Internationale Einheiten der Enzymaktivität, wobei eine I.E. die Menge an Enzymaktivität ist, die erforderlich ist, um die Umwandlung von einem Mikromol Substrat pro Minute unter Standard-pH- und Temperaturbedingungen für das Enzym zu katalysieren. Beispiel 1: Herstellung des hydrolytischen Substrates I Substrat IThe abbreviation IE as used herein and in the claims stands for International Units of Enzyme Activity, where one IE is the amount of enzyme activity required to catalyze the conversion of one micromole of substrate per minute under standard pH and temperature conditions for the enzyme. Example 1: Preparation of Hydrolytic Substrate I Substrate I
Eine Mischung von Pentaacetyl-β-D-galactopyranose, 15 g, 38 mMol 2,3,5-Trimethylhydrochinon, umkristallisiert aus Toluol, 17,5 g, 115 mMol sowie frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (1,5 g, 9 mMol) wurden 24 Stunden lang in 150 ml Toluol in einer Vorrichtung auf Rückflußtemperatur erhitzt, um das anfallende Wasser und Essigsäure abzudestillieren. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 200 ml Wasser gegossen und die organische Phase wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Toluol (100 ml) gewaschen und die organischen Extrakte wurden miteinander vereinigt und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest wurde durch Kolonnenchromatographie gereinigt (Kieselsäure, 80 : 20, Toluol:Ethylacetat) unter Gewinnung von 7,1 g Produkt. Nach zweimaliger Umkristallisation aus einem Gemisch aus Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 wurde das reine β-Anomer erhalten, Fp. 160-161ºC. Kohlenstoff- und Wasserstoff- NMR-Analysen bestätigten die Struktur.A mixture of pentaacetyl-β-D-galactopyranose, 15 g, 38 mmol, 2,3,5-trimethylhydroquinone recrystallized from toluene, 17.5 g, 115 mmol, and freshly distilled phosphorus oxychloride (1.5 g, 9 mmol) was heated in 150 mL of toluene in a reflux apparatus for 24 hours to distill off the resulting water and acetic acid. After cooling to room temperature, the reaction mixture was poured into 200 mL of water and the organic phase was separated. The aqueous phase was washed twice with toluene (100 mL) and the organic extracts were combined and dried. The solvent was removed and the residue was purified by column chromatography (silica, 80:20, toluene:ethyl acetate) to give 7.1 g of product. After two recrystallizations from a mixture of 1:1 methanol:water, the pure β-anomer was obtained, m.p. 160-161 °C. Carbon and hydrogen NMR analyses confirmed the structure.
Eine Mischung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosid (2,9 g, 6 mMol) in 50 ml Wasser freiem Methanol und 6 ml einer frisch zubereiteten 1 molaren Natriummethoxidlösung wurde 2 Stunden lang bei 20ºC gerührt, worauf 750 mg eines AMBERLYST 15 (H&spplus;)-Ionenaustauschharzes zugegeben und die Mischung zusätzliche 1,5 Stunden lang gerührt wurde. Die Mischung wurde filtriert, das Harz wurde abgetrennt und mit Methanol gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, unter Gewinnung von 1,9 g Produkt. Das Material wurde aus einer Mischung von Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 umkristallisiert, unter Gewinnung des reinen Produktes, Fp. 217-219ºC. Massen-spektroskopische Analysen und Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur. Berechnet für C &sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;O&sub7;:A mixture of 4-hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranoside (2.9 g, 6 mmol) in 50 mL of anhydrous methanol and 6 mL of a freshly prepared 1 molar sodium methoxide solution was stirred at 20 °C for 2 hours, after which 750 mg of AMBERLYST 15 (H + ) ion exchange resin was added and the mixture was stirred for an additional 1.5 hours. The mixture was filtered, the resin was separated and washed with methanol, and the filtrate was concentrated in vacuo to give 1.9 g of product. The material was recrystallized from a 1:1 mixture of methanol:water to give the pure product, mp 217-219 °C. Mass spectroscopic analysis and carbon and hydrogen NMR analyses confirmed the structure. Calculated for C 15 H 22 O 7 :
C: 57,3, H: 7,1, O: 35,6. Gefunden: C: 57,3; H: 6,9, O: 35,2. Beispiel 2: Herstellung des hydrolytischen Substrates II Substrat IIC: 57.3, H: 7.1, O: 35.6. Found: C: 57.3; H: 6.9, O: 35.2. Example 2: Preparation of hydrolytic substrate II Substrate II
Eine Mischung von Pentaacetyl-β-D-glucopyranose, 15 g, 38 mMol, 2,3 ,5-Trimethylhydrochinon (umkristallisiert aus Toluol, 17,5 g, 115 mMol) sowie frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (1,5 g, 9 mMol) wurde in 150 ml Toluol in einer Vorrichtung 24 Stunden lang auf Rückflußtemperatur erhitzt, um das anfallende Wasser und Essigsäure abzudestillieren. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 200 ml Wasser gegossen und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Toluol (100 ml) gewaschen, worauf die organischen Extrakte miteinander vereinigt und getrocknet wurden. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde durch Kolonnenchromatographie gereinigt (Kieselsäure, 80 : 20, Toluol:Ethylacetat) unter Gewinnung eines Öles. Nach Kristallisation und Umkristallisation (4 ·) aus einem Gemisch aus Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 wurde das reine β-Anomer erhalten, Fp. 96-97,5ºC. Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur.A mixture of pentaacetyl-β-D-glucopyranose, 15 g, 38 mmol, 2,3,5-trimethylhydroquinone (recrystallized from toluene, 17.5 g, 115 mmol) and freshly distilled phosphorus oxychloride (1.5 g, 9 mmol) in 150 ml of toluene was heated to reflux temperature in an apparatus for 24 hours to distill off the resulting water and acetic acid. After cooling to room temperature, the reaction mixture was poured into 200 ml of water and the organic layer was separated. The aqueous phase was washed twice with toluene (100 ml) and the organic extracts were combined and dried. The solvent was removed and the residue was purified by column chromatography (silica, 80:20, toluene:ethyl acetate) to give an oil. After crystallization and recrystallization (4 x) from a 1:1 mixture of methanol:water, the pure β-anomer was obtained, m.p. 96-97.5 °C. Carbon and hydrogen NMR analyses confirmed the structure.
Eine Mischung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid (1,53 g, 3,2 mMol) in 50 ml wasserfreiem Methanol und 3,2 ml frisch zubereiteter 1 molarer Natriummethoxidlösung wurde 1,5 Stunden lang bei 20ºC gerührt. Dann wurden 500 mg AMBERLYST 15(H&spplus;)-Ionenaustauschharz zugegeben und die Mischung wurde für weitere 1,5 Stunden gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert, das Harz wurde abgetrennt und mit Methanol gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert unter Gewinnung des Produktes. Dieses Material wurde aus 50 ml eines Methanol:Wasser-Gemisches im Verhältnis 1 : 1 umkristallisiert, unter Gewinnung von 500 mg weißer Nadeln, Fp. 222-223ºC. Massen-spektroskopische Analysen sowie Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur. Beispiel 3: Herstellung des hydrolytischen Substrates III Substrat IIIA mixture of 4-hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (1.53 g, 3.2 mmol) in 50 mL of anhydrous methanol and 3.2 mL of freshly prepared 1 molar sodium methoxide solution was stirred at 20 °C for 1.5 hours. Then 500 mg of AMBERLYST 15(H + ) ion exchange resin was added and the mixture was stirred for an additional 1.5 hours. The mixture was then filtered, the resin was separated and washed with methanol, and the filtrate was concentrated in vacuo to give the product. This material was recrystallized from 50 mL of a 1:1 methanol:water mixture to give 500 mg of white needles, m.p. 222-223 °C. Mass spectroscopic analyses as well as carbon and hydrogen NMR analyses confirmed the structure. Example 3: Preparation of the hydrolytic substrate III Substrate III
Eine Lösung von 10 g Phenazinmethosulfat in 20 ml Essigsäureanhydrid und 20 ml Eisessig wurde geschüttelt mit einem 10% Palladium-Kohle-Katalysator unter Wasserstoff in einer Hydriervorrichtung 1,5 Stunden lang bei 25ºC. Das Schütteln wurde dann eingestellt und die Mischung wurde 18 Stunden lang bei 25ºC stehengelassen. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde in 1 l Eis und Wasser gegossen, worauf 5 g Natriumbicarbonat zugegeben und die Mischung eine Stunde lang gerührt wurde. Die ausgefallene feste Masse wurde durch Filtration abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen an der Luft wog das Produkt 2,14 g, Fp. 139-141ºC. Das Material wurde durch Chromatographie auf Kieselsäure gereinigt (die Probe wurde in Methylenchlorid gelöst und mit Methylenchlorid und 10% Diethylether eluiert) und nach Umkristallisation aus Diethylether/ Ligroin wurde das reine Produkt erhalten, 1,57 g, Fp. 141-142ºC. IR- und NMR-Analysen bestätigten die Struktur.A solution of 10 g of phenazine methosulfate in 20 ml of acetic anhydride and 20 ml of glacial acetic acid was shaken with a 10% palladium-carbon catalyst under hydrogen in a hydrogenator for 1.5 hours at 25°C. Shaking was then stopped and the mixture was allowed to stand at 25°C for 18 hours. The catalyst was removed by filtration and the filtrate was poured into 1 liter of ice and water, 5 g of sodium bicarbonate was added and the mixture was stirred for one hour. The precipitated solid was separated by filtration and washed thoroughly with water. After drying in air, the product weighed 2.14 g, m.p. 139-141°C. The material was purified by chromatography on silica (the sample was dissolved in methylene chloride and eluted with methylene chloride and 10% diethyl ether) and after recrystallization from diethyl ether/ligroin the pure product was obtained, 1.57 g, m.p. 141-142ºC. IR and NMR analyses confirmed the structure.
Eine analytische Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wurde hergestellt mit 20 ml hydrolytischem Substrat I, 10 mmolar in Methanol, wobei das Elektronenübertragungsmittel, das freigesetzt wurde, bestand aus 2,3,5-Trimethylhydrochinon, 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung I (hergestellt durch Lösen von 14,6 mg der reduzierbaren Verbindung I in 500 ml N,N-Dimethylformamid, Zusatz von 1 ml TRITON X-100® als oberflächenaktivem Mittel und Zugabe der erhaltenen Lösung zu 50 ml von 0,1 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5), 30 ul NADH, 10 mmolar in Wasser, 10 ml Diaphorase, 1 mg/ml Wasser, enthaltend 2% Rinderserumalbumin; und 30 ml Magnesiumchlorid (0,1 molar in Wasser). Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde auf 7,5 mit 1,4 ml eines 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffers eingestellt. Die reduzierbare Verbindung I hatte die folgende Struktur: An analytical composition according to this invention was prepared with 20 ml of hydrolytic substrate I, 10 mmolar in methanol, the electron transfer agent released being 2,3,5-trimethylhydroquinone, 1.5 ml of a dispersion of reducible compound I (prepared by dissolving 14.6 mg of reducible compound I in 500 ml of N,N-dimethylformamide, adding 1 ml of TRITON X-100® as a surfactant and adding the resulting solution to 50 ml of 0.1 molar potassium phosphate buffer, pH 7.5), 30 µl of NADH, 10 mmolar in water, 10 ml of diaphorase, 1 mg/ml water containing 2% bovine serum albumin; and 30 ml of magnesium chloride (0.1 molar in water). The pH of the composition was adjusted to 7.5 with 1.4 ml of 0.1 molar potassium phosphate buffer. The reducible compound I had the following structure:
worin DYE steht für where DYE stands for
Diese Zusammensetzung wurde dazu verwendet, um zwei verschiedene Konzentrationen von β-Galactosidase (von Escherichia coli, Grade VI) zu bestimmen, durch Messung der Menge an bestimmbarem Farbstoff, der aus der reduzierbaren Verbindung freigesetzt wurde. Die Farbstoffdichte wurde bei 635 nm nach 30 Minuten bei 37ºC gemessen.This composition was used to determine two different concentrations of β-galactosidase (from Escherichia coli, grade VI) by measuring the amount of detectable dye released from the reducible compound. The dye density was measured at 635 nm after 30 minutes at 37ºC.
Der gleiche Analyt wurde ferner unter Anwendung eines standardisierten colorimetrischen Bestimmungsverfahrens als Vergleich bestimmt. Im Falle dieses Bestimmungsverfahrens wurde o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2,3 · 10&supmin;³ molar, unten als ONPG identifiziert) als Substrat verwendet. Die Reaktion enthielt ferner Magnesiumchlorid (10&supmin;³ molar) sowie Kaliumphosphatpuffer (0,1 molar, pH 7,5). Die freigesetzte Farbstoffdichte wurde bei 410 nm nach 30 Minuten bei 37ºC gemessen. Tabelle I zeigt die Verbesserung (erhöhte optische Dichte), die erhalten wurde bei Verwendung einer Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung. Die Daten für die optische Dichte ("Test Absorbance") sind die Daten nach Abzug des Hintergrundes. TABELLE I Analyt-Konzentration optische Dichte (20 Min.) Vergleich TestThe same analyte was further determined using a standard colorimetric determination procedure as a control. In this determination procedure, o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (2.3 x 10-3 molar, identified below as ONPG) was used as the substrate. The reaction also contained magnesium chloride (10-3 molar) and potassium phosphate buffer (0.1 molar, pH 7.5). The released dye density was measured at 410 nm after 30 minutes at 37°C. Table I shows the improvement (increased optical density) obtained using a composition according to this invention. The optical density ("Test Absorbance") data are the data after subtraction of background. TABLE I Analyte Concentration Optical Density (20 min.) Comparison Test
Es wurde eine analytische Zusammensetzung hergestellt mit 100 ul des hydrolytischen Substrates II (10 mmolar) in einem 0,1 molaren Natriumphosphatpuffer, 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung II (hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben), NADH (30 ul, 10 mmolar in Wasser), 10 ul Diaphorase (1 mg/ml Wasser), enthaltend 2% Rinderserumalbumin, und 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer (1,3 ml, pH 6,5). Die reduzierbare Verbindung II hatte die folgende Struktur: An analytical composition was prepared with 100 µl of hydrolytic substrate II (10 mmolar) in 0.1 molar sodium phosphate buffer, 1.5 mL of a dispersion of reducible compound II (prepared as described in Example 4), NADH (30 µl, 10 mmolar in water), 10 µl of diaphorase (1 mg/mL water) containing 2% bovine serum albumin, and 0.1 molar sodium phosphate buffer (1.3 mL, pH 6.5). Reducible compound II had the following structure:
Diese Zusammensetzung wurde verwendet zur Bestimmung des Vorhandenseins von verschiedenen Mengen des hydrolytischen Substrates β-Glucosidase durch Messung des freigesetzten Farbstoffes bei 635 nm, wie in Beispiel 4 oben beschrieben. In Tabelle II unten sind die Analyt-Konzentrationen und der erhaltene Farbstoff, freigesetzt nach 30 Minuten Reaktionsdauer (identifiziert als Veränderung der optischen Dichte, ΔOD) bei 37ºC angegeben.This composition was used to determine the presence of various amounts of the hydrolytic substrate β-glucosidase by measuring the released dye at 635 nm as described in Example 4 above. In Table II below, the analyte concentrations and the resulting dye released after 30 minutes of reaction time (identified as the change in optical density, ΔOD) at 37°C are given.
β-Glucosidase-Konzentration (I.E./ml) ΔOD (bei 635 nm)β-Glucosidase concentration (I.U./ml) ΔOD (at 635 nm)
0 0,0350 0.035
33 0,36533 0.365
66 0,41866 0.418
90 0,45490 0.454
Dieses Beispiel vergleicht die vorliegende Erfindung mit einem Standard-Bestimmungsverfahren für Schweineleberesterase.This example compares the present invention with a standard method for determining porcine liver esterase.
Eine analytische Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wurde hergestellt mit dem hydrolytischen Substrat 111 (100 ul von einer 3 mg/ml methanolischen Lösung), 1,5 ml einer Dispersion einer reduzierbaren Verbindung II (4 mg reduzierbare Verbindung, 500 ul TRITON X-100® als nicht ionogenem oberflächenaktivem Mittel, 25 ul eines 0,05 molaren Phosphatpuffers, pH 7,5 und 250 ul angesäuertem N,N-Dimethylformamid), 1,4 ml zusätzlichem Phosphatpuffer und 24 ul NADH (4 mg/ml wäßriger Lösung).An analytical composition according to this invention was prepared with the hydrolytic substrate III (100 µl of a 3 mg/ml methanolic solution), 1.5 ml of a dispersion of a reducible compound II (4 mg of reducible compound, 500 µl of TRITON X-100® as non-ionic surfactant, 25 µl of a 0.05 molar phosphate buffer, pH 7.5, and 250 µl of acidified N,N-dimethylformamide), 1.4 ml of additional phosphate buffer, and 24 µl of NADH (4 mg/ml aqueous solution).
Die Zusammensetzung wurde in einer Küvette mit 10 ul einer Esteraselösung, wie in Tabelle III unten angegeben, vermischt und der erhaltene Farbstoff wurde bei 635 nm gemessen unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers bei 28ºC in Zwei- Minuten-Intervallen.The composition was mixed in a cuvette with 10 µl of an esterase solution as indicated in Table III below and the resulting dye was measured at 635 nm using a standard spectrophotometer at 28°C at two-minute intervals.
Eine titrimetrische Vergleichsbestimmung wurde unter Verwendung von Ethylbutyrat als Substrat durchgeführt nach dem Verfahren, das beschrieben wird von Stotz in Methods in Enzymology, Band 1, S. 657, beruhend auf einer Methode von Harrier & Mitarbeitern, beschrieben in J. Biol. Chem., 138, S. 111 (1941). Natriumhydroxid (0,1 normal) wurde als Titrierlösung und Bromothymolblau als Indikator verwendet. Tabelle III zeigt ferner die Ergebnisse an, die im Falle dieser Vergleichsbestimmung erhalten wurden. Offensichtlich ist, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine mindestens 100-fache Steigerung der Bestimmung im Vergleich zum Vergleichsverfahren ermöglicht. TABELLE III Vergleichsbestimmung Enzym-Konzentration Ausgangs-Lösung Verdünnung Beispiel 3 ΔOD bei 365 nm nach 30 Minuten)A comparative titrimetric determination was carried out using ethyl butyrate as substrate according to the procedure described by Stotz in Methods in Enzymology, Volume 1, p. 657, based on a method by Harrier & co-workers, described in J. Biol. Chem., 138, p. 111 (1941). Sodium hydroxide (0.1 normal) was used as titrant and bromothymol blue as indicator. Table III also shows the results obtained in this comparative determination. It is evident that the method of the present invention enables at least a 100-fold increase in the determination compared to the comparative method. TABLE III Comparison Determination Enzyme Concentration Starting Solution Dilution Example 3 ΔOD at 365 nm after 30 minutes)
* Ausgangs-Lösung wurde hergestellt durch Zugabe von 10 ul Esterase zu 1 ml destilliertem Wasser.* Starting solution was prepared by adding 10 μl esterase to 1 ml distilled water.
NA = nicht gemessen.NA = not measured.
Im Falle dieses Beispieles wurde eine Zusammensetzung dieser Erfindung zur Bestimmung eines Acylase-Enzymes verwendet.In this example, a composition of this invention was used to determine an acylase enzyme.
Es wurde eine analytische Zusammensetzung hergestellt mit einer Dispersion einer reduzierbaren Verbindung II (1,5 ml, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben), hydrolytischem Substrat 111 (100 ul einer 3 mg/ml methanolischen Lösung), 0,05 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5 (1,3 ml), NADH (25 ul von 4 mg/ml Pufferlösung), und Enzym (100 ul von 10 mg/ml Pufferlösung von Acylase I, Grade I von Schweinenieren, Sigma Chemical Co.). Eine Vergleichslösung enthielt alle Reagentien mit Ausnahme des Enzyms. Die optischen Dichten wurden bei 635 nm bei 37ºC abgelesen und die Veränderung in der optischen Dichte (ΔA) wurde nach 30 Minuten bestimmt.An analytical composition was prepared with a dispersion of a reducible compound II (1.5 ml, prepared as described in Example 6), hydrolytic substrate III (100 μl of a 3 mg/ml methanolic solution), 0.05 molar potassium phosphate buffer, pH 7.5 (1.3 ml), NADH (25 μl of 4 mg/ml buffer solution), and enzyme (100 μl of 10 mg/ml buffer solution of Acylase I, Grade I from porcine kidney, Sigma Chemical Co.). A control solution contained all reagents except the enzyme. Optical densities were read at 635 nm at 37ºC and the change in optical density (ΔA) was determined after 30 minutes.
Lösung ΔA, 635 nm 30 Minuten, 37ºCSolution ΔA, 635 nm 30 minutes, 37ºC
Vergleich (kein Enzym) 0,182Comparison (no enzyme) 0.182
Vergleich (kein Substrat) 0,091Comparison (no substrate) 0.091
Test 2,208Testing 2,208
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Substrat und eine Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung unter Verwendung von Ascorbat als Reduktionsmittel zur Bestimmung eines Acylase- Enzyms.This example illustrates a substrate and composition according to this invention using ascorbate as a reducing agent for the determination of an acylase enzyme.
Die folgenden Lösungen wurden in 2 Küvetten eingebracht:The following solutions were placed in 2 cuvettes:
Küvette 1 : 1,3 ml eines 0,1 molaren 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffers, 25 ml Acylase I von Schweinenieren, und 200 ul des hydrolytischen Substrates 111 (3 mg/ml methanolische Lösung).Cuvette 1: 1.3 ml of a 0.1 molar 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid buffer, 25 ml of acylase I from pig kidney, and 200 μl of the hydrolytic substrate 111 (3 mg/ml methanolic solution).
Küvette 2 : 1,3 ml des 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffers und 200 ul des hydrolytischen Substrates III.Cuvette 2: 1.3 ml of the 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid buffer and 200 μl of the hydrolytic substrate III.
Jede Küvette wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung II bei einem pH-Wert von 6,5, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, und 25 ul von 4 mg/ml destillierter Wasserlösung von Natriumascorbat zu jeder Küvette zugegeben. Die optischen Dichten wurden bei 635 nm abgelesen und die Veränderung in der optischen Dichte (ΔA) wurde nach 30 Minuten bestimmt.Each cuvette was incubated for 15 minutes at 37ºC. Then 1.5 ml of a dispersion of reducible compound II at pH 6.5, prepared as described in Example 6, and 25 µl of 4 mg/ml distilled water solution of sodium ascorbate was added to each cuvette. The optical densities were read at 635 nm and the change in optical density (ΔA) was determined after 30 minutes.
Lösung ΔA, 635 nm 30 Minuten, 37ºCSolution ΔA, 635 nm 30 minutes, 37ºC
Hintergrund-Vergleich (Küvette 2) 0,250Background comparison (cuvette 2) 0.250
Beispiel-Test (Küvette 1) 1,223Example test (cuvette 1) 1.223
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