DE3842473C2

DE3842473C2 - Improvements in organic systems

Info

Publication number: DE3842473C2
Application number: DE3842473A
Authority: DE
Inventors: Sietske Hoekstra; Arnoldus Johannes Kool; Maria Geertruida Nootebos; Mei-Lie Maria Constance Tan
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2008-12-17
Also published as: NL8803089A; NL195093C; FR2628601B1; DE3842473A1; GB2211205A; IT1233373B; HU204561B; HUT52665A; GB8829201D0; FR2628601A1; IT8822978A0; GB2211205B

Description

Die Erfindung betrifft CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen mit den Merkmalen des Anspruchs 1, also die Entwicklung neuer Elternlinien von Brassica oleracea. Die Elternlinien werden dazu verwendet, um Hybridsamen zu erzeugen. Insbesondere ermöglicht die Erfin dung einem Pflanzenzüchter, die zweckmäßige Qualität einer cytoplasmatischen männlichen Sterilität (CMS) in eine wirt schaftlich zweckmäßige Varietät von Brassica oleracea einzu führen.The invention relates to CMS-Brassica oleracea plants or cells with the features of claim 1, ie the development of new parent lines Brassica oleracea. The parent lines are used to To produce hybrid seeds. In particular, the Erfin enables a plant grower, the appropriate quality of a Cytoplasmic Male Sterility (CMS) in a host useful variety of Brassica oleracea to lead.

Die männliche Sterilität ist bei der Züchtung von Hybridsamen von Brassica oleracea von Bedeutung, weil normale Blüten selbstbestäubend (autogam) sind. Männlich sterile Linien er zeugen keine lebensfähigen Pollen und können sich nicht selbst bestäuben. Durch Eliminieren des Pollens einer Eltern varietät in einer Kreuzung stellt der Pflanzenzüchter sicher, daß er Hybridsamen von gleichmäßiger Qualität erhält. Zur Zeit ist eine cytoplasmatische männliche Sterilität bei Brassica oleracea-Varietäten nicht leicht erhältlich. Groß erzeuger von Hybridsamen bedienen sich zur Vermeidung von Selbstbestäubung während der Samenherstellung selbstinkom patibiler Kernsysteme (nuclear self-incompatability systems). Dieses System ist ungenau und führt zu unreinen Chargen von Hybridsamen. Außerdem ist es zeitraubend, arbeitsaufwendig und daher kostspielig, dieses genetische System in sämtliche Züchtungslinien einzuführen. In Raphanus sativus wurde ein Cytoplasma entdeckt, das männliche Sterilität verleiht. Dieses Cytoplasma ist als Ogura-CMS-Cytoplasma bekannt, und die DNA aus den Mytochondrien und Chloroplasten, die in dem Cytoplasma enthalten sind, unterscheidet sich genotypisch von der DNA in dem Cytoplasma fruchtbarer Brassica oleracea- Pflanzen. Das CMS-Cytoplasma vom Ogura-Typ kann in Brassica oleracea durch wiederholte Rückkreuzungen eingeführt werden. Bei den erzielten Ogura-CMS-Brassica oleracea-Pflanzen führen die Mytochondrien von Raphanus sativus zu einem CMS-Phänotyp. Die Anwesenheit von Chloroplasten von Raphanus sativus führt jedoch zur Chlorose, wenn die Pflanzen bei niedriger Tempera tur gezogen werden, was zu entsprechenden Ernteverlusten führt. Dies führt dazu, daß diese Art von Ogura-CMS-Brassica oleracea-Pflanzen von geringem Wert bei der Großherstellung von Hybridsamen ist.Male sterility is in the breeding of hybrid seeds of Brassica oleracea important because of normal flowers are self-pollinating. Male sterile lines he do not produce viable pollen and cannot pollinate yourself. By eliminating a parent's pollen variety in a cross, the plant grower ensures that he receives hybrid seeds of uniform quality. For Time is associated with cytoplasmic male sterility Brassica oleracea varieties not readily available. Great Hybrid seed producers use to avoid Self-pollination during seed production patibile core systems (nuclear self-incompatibility systems). This system is inaccurate and leads to impure batches of Hybrid seeds. It is also time consuming, labor intensive and therefore expensive, this genetic system in all Introduce breeding lines. In Raphanus sativus a Discovered cytoplasm that gives male sterility. This cytoplasm is known as the Ogura-CMS cytoplasm, and the DNA from the mytochondria and chloroplasts in the Cytoplasm is genotypically different from the DNA in the cytoplasm of fertile Brassica oleracea Plants. The Ogura-type CMS cytoplasm can be found in Brassica oleracea are introduced through repeated backcrosses. Lead to the Ogura-CMS-Brassica oleracea plants obtained the mytochondria from Raphanus sativus to a CMS phenotype. The presence of chloroplasts from Raphanus sativus leads however, to chlorosis if the plants are at a low temperature be pulled, resulting in corresponding crop losses leads. This leads to this type of Ogura-CMS-Brassica oleracea plants of little value in large-scale production of hybrid seeds.

Gegenstand der Erfindung sind CMS-Brassica oleracea-Pflanzen, die Mytochondrien von Ogura-CMS-Cytoplasma und Chloroplasten von normaler, fruchtbarer Brassica oleracea enthalten.The invention relates to CMS Brassica oleracea plants, the mytochondria of Ogura-CMS cytoplasm and chloroplasts of normal, fertile Brassica oleracea.

Pelletier et al. beschreiben in Mol Gen Genet 191, Seiten 244 bis 250, 1983, Fusionsversuche, bei denen nur eine einzige Pflanze, die von Interesse war, gefunden wurde, die männlich steril war und bei niedriger Temperatur eine normale grüne Farbe hatte. Diese Pflanze wurde mit Cybrid Linie 77 bezeichnet. Sie hatte 38 Chromosomen, was der Chromosomenzahl von B. napus entspricht, da es eine amphidiploide Pflanze ist. B. Napus ist durch sexuelle Hybridisierung zwischen B. oleracea (2n = 18) und B. campestris (2n = 20) entstanden. Dieser chromosomale Unterschied zwischen B. napus und B. oleracea hat einen wesentlichen Einfluß auf das Verhalten der Pflanzen. Bei B. napus würde eine weitere Polyploidisierung durch Protoplastenfusion eine biologisch instabile Chromosomenzahl (2n = 76) ergeben, während eine Polyploidisierung von B. oleracea (2n = 18) zu stabilen tetraploiden B. oleracea führt (2n = 36). Bei der Polyploidisierung von B. napus findet daher ein spontaner Verlust von chromosomalem Material statt. Chetrit et al. berichten in Theor Appl Genet 69, Seiten 361 bis 366, 1985, ebenfalls über Versuche mit B. napus-Pflanzen. Daß es mit der Stabilität der aus Pelletier et al. und Chetrit et al. beschriebenen amphidiploiden B. napus Pflanzen Probleme gibt, zeigt eine nachveröffentlichte Literaturstelle, nämlich "Protoplast Symposium Wageningen Book Proceedings", Seiten 169 bis 176, 1988, Seite 174.Pelletier et al. describe in Mol Gen Genet 191, pages 244 to 250, 1983, attempts to merge, in which only one Plant that was of interest was found the male was sterile and a normal green at low temperature Had color. This plant was designated Cybrid line 77. It had 38 chromosomes, which is the chromosome number of B. napus corresponds because it is an amphidiploid plant. B. Napus is due to sexual hybridization between B. oleracea (2n = 18) and B. campestris (2n = 20). This has chromosomal difference between B. napus and B. oleracea a significant influence on the behavior of the plants. At B. napus would undergo further polyploidization by protoplast fusion a biologically unstable number of chromosomes (2n = 76), while a polyploidization of B. oleracea (2n = 18) leads to stable tetraploid B. oleracea (2n = 36). At the polyploidization of B. napus is therefore spontaneous Loss of chromosomal material takes place. Chetrit et al. report in Theor Appl Genet 69, pages 361 to 366, 1985, also about experiments with B. napus plants. That it with the Stability of the from Pelletier et al. and Chetrit et al. described amphidiploid B. napus plants shows problems a post-published reference, namely "Protoplast Wageningen Book Proceedings Symposium ", pages 169 to 176, 1988, page 174.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Brassica oleracea-Pflanzen für die Hybridzüchtung bereitzustellen, die sowohl cytoplasmatische männliche Sterilität als auch - selbst bei niedrigen Temperaturen - grüne Blätter aufweisen.It was therefore an object of the present invention, Brassica to provide oleracea plants for hybrid breeding, the both cytoplasmic male sterility and - even at low temperatures - have green leaves.

Diese Aufgabe wird gelöst mit CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen mit Mitochondrien des Ogura-CMS-Cytoplasmas und Chloroplasten von normaler, fruchtbarer Brassica oleracea.This task is solved with CMS-Brassica oleracea plants or cells with mitochondria of the Ogura-CMS cytoplasm and Chloroplasts from normal, fertile Brassica oleracea.

Die Chloroplasten normaler fruchtbarer Brassica oleracea sind kältetolerant, so daß die Pflanzen gemäß der Erfindung cytoplasmatische männliche Sterilität aufweisen, jedoch nicht unter Chlorose leiden, wenn sie bei niedriger Temperatur ge zogen werden.The chloroplasts of normal fertile Brassica oleracea are cold-tolerant, so that the plants according to the invention are cytoplasmic have male sterility, but not suffer from chlorosis if they are at low temperature be drawn.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Her stellung von CMS-Brassica oleracea-Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß manThe invention further relates to a method for the manufacture position of CMS-Brassica oleracea plants, thereby is characterized in that one

a) Protoplasten von Brassica oleracea, die großzüchterisch erwünschte Merkmale aufweisen, mit inaktivierten Proto plasten oder kernfreien Protoplasten einer Ogura-CMS- Brassica oleracea-Pflanze verschmilzt und die so erhalte nen allogenen Zellen regeneriert unda) Protoplasts of Brassica oleracea, which are breeders have desired features, with inactivated proto plastic or core-free protoplasts of an Ogura CMS Brassica oleracea plant melts and so get it regenerated allogeneic cells and
b) die gemäß dem Schritt a) erhaltenen CMS-Brassica oleracea- Zellen oder -Pflanzen oder Nachkommen davon als Ausgangs material für die Herstellung von CMS-Brassica oleracea- Pflanzen gemäß Ansprüchen 1 bis 9 durch in-vitro und/oder Kreuzungstechniken verwendet.b) the CMS-Brassica oleracea- obtained according to step a) Cells or plants or progeny thereof as starting materials material for the production of CMS-Brassica oleracea- Plants according to claims 1 to 9 by in vitro and / or crossing techniques used.

Das so hergestellte Pflanzenmaterial besitzt cytoplasmatische männliche Sterilität sowie die großzüchterisch erwünschten Kernmerkmale, die beim Ziehen bei niedrigen Temperaturen keine Chlorose auftreten lassen.The plant material thus produced has cytoplasmic male sterility as well as those desired by large breeders Key features when pulling at low temperatures don't let chlorosis occur.

Gemäß der Erfindung läßt sich insbesondere cytoplasmatische männliche Sterilität in die folgenden Brassica oleracea- Varietäten einführen:According to the invention, in particular cytoplasmic male sterility in the following Brassica oleracea- Introducing varieties:

1. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. botrytis L. (Blumenkohl)1. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. botrytis L. (cauliflower)
2. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC (Weißkohl)2. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC (white cabbage)
3. Brassica oleracea L. convar. oleracea var. gemmifera DC (Rosenkohl)3. Brassica oleracea L. convar. oleracea var. gemmifera DC (Brussels sprouts)
4. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. sabellica L. (Grünkohl)4. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. sabellica L. (kale)
5. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. sabauda L. (Wirsing)5. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. sabauda L. (savoy cabbage)
6. Brassica oleracea L. convar capitata (L.) Alef. var. rubra DC. (Rotkohl)6. Brassica oleracea L. convar capitata (L.) Alef. var. rubra DC. (Red cabbage)
7. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. gongylodes (Kohlrabi)7. Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. gongylodes (kohlrabi)
8. Brassica oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch (Broccoli).8. Brassica oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. cymosa duch (broccoli).

Besonders bevorzugt ist die Herstellung von Blumenkohl, Weißkohl, Rosenkohl und Broccoli mit cytoplasmatisch männ licher Sterilität.The production of cauliflower is particularly preferred, White cabbage, Brussels sprouts and broccoli with cytoplasmic male sterility.

Generelle Hinweise zur Ausführung der ErfindungGeneral instructions for carrying out the invention

Der Ausdruck "Ogura-CMS-Cytoplasma", wie er im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, bezieht sich auf ein aus Raphanus sativus stammendes Cytoplasma, das mytochondrielle DNA enthält, die Pflanzen männliche Sterilität verleiht. Der Ausdruck "Ogura-CMS-Brassica oleracea-Pflanze oder -Pflanzen zelle", wie er im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, bezieht sich auf eine brassica-oleracea-Pflanze oder -Pflan zenzelle, die Ogura-CMS-Cytoplasma enthält.The term "Ogura CMS cytoplasm" as used herein Context used refers to a Raphanus sativus derived cytoplasm, the mytochondrial Contains DNA that gives plants male sterility. Of the Expression "Ogura-CMS-Brassica oleracea plant or plants cell ", as used in the present context, refers to a brassica oleracea plant or plant cell containing Ogura-CMS cytoplasm.

Die Protoplastenverschmelzung gemäß der Erfindung kann durch Verwendung von Polyethylenglykol (PEG), das Agglutinierung hervorruft, in Gegenwart eines Verschmelzungspuffers, durch geführt werden, das heißt einer Lösung von hohem pH-Wert, so daß die Membranen verschmelzen. Eine derartige somatische Hybridisierung kann unter den Bedingungen erzielt werden, wie sie von Sundberg et al. in Plant Science 43 (1986) 155 für die Herstellung von Hybriden aus verschiedenen Arten oder von Modifikationen davon beschrieben sind. Ein geeignetes Vor gehen ist das folgende:The protoplast fusion according to the invention can be carried out by Use of polyethylene glycol (PEG), the agglutination in the presence of a fusion buffer be carried out, that is, a solution of high pH, so that the membranes merge. Such a somatic Hybridization can be achieved under conditions such as it by Sundberg et al. in Plant Science 43 (1986) 155 for the production of hybrids of different types or of Modifications thereof are described. A suitable pre going is the following:

Die Protoplastenverschmelzung gemäß der Erfindung wird zweck mäßigerweise in einer Protoplastenfusionslösung (FS-1) vor genommen, die einen Puffer, wie beispielsweise Tris(hydroxy methyl)aminomethanhydrochlorid, ein Osmotikum, wie ein Kohlenhydrat, wie beispielsweise Mannit, Sorbit, Glucose oder Saccharose, sowie Calium- und Calciumsalze enthält. Der pH- Wert kann von 5,2 bis 10 variieren und beträgt vorzugsweise etwa 7,2. Die Protoplasten unterschiedlicher Herkunft werden vermischt und konzentriert, zweckmäßigerweise bis zu einer Enddichte von 10⁵ bis 10⁶ Protoplasten je ml.Protoplast fusion according to the invention is used moderately in a protoplast fusion solution (FS-1) taken a buffer such as Tris (hydroxy methyl) aminomethane hydrochloride, an osmotic, such as a Carbohydrates such as mannitol, sorbitol, or glucose Contains sucrose, as well as calcium and calcium salts. The pH Value can vary from 5.2 to 10 and is preferably about 7.2. The protoplasts are of different origins mixed and concentrated, suitably up to one Final density of 10⁵ to 10⁶ protoplasts per ml.

Das Protoplastengemisch muß danach mindestens 10 Minuten un gestört gelassen werden, damit sich die Zellen am Boden der Petrischale absetzen können. Danach wird das Gemisch mit Polyethylenglykol (PEG), das vorzugsweise ein Molekularge wicht von 1500 bis 6000 besitzt, behandelt. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse erzielt, wenn beispielsweise eine wäßrige Lösung verwendet wird, die 40 Gewichtsprozent PEG (FS-2) enthält, und das Volumenverhältnis von FS-1 zu FS-2 10 : 1 bis 1 : 1 beträgt. FS-2 enthält zweckmäßigerweise ein Osmotikum und ein Calciumsalz. Die Zellen werden in FS-2 1 bis 20 Minuten lang je nach der Zerbrechlichkeit der Zellen bebrütet.The protoplast mixture must then at least 10 minutes be left disturbed so that the cells at the bottom of the To be able to place a petri dish. Then the mixture with Polyethylene glycol (PEG), which is preferably a molecular weight important from 1500 to 6000. In general good results are achieved if, for example, a aqueous solution is used, the 40 weight percent PEG (FS-2) contains, and the volume ratio of FS-1 to FS-2 10: 1 to 1: 1. Conveniently, FS-2 contains one Osmotic and a calcium salt. The cells are in FS-2 For 1 to 20 minutes depending on the fragility of the cells incubated.

Die Verschmelzung wird vervollständigt, indem man mit Fusionslösungen, die PEG in einer niedrigeren Konzentration, als es bei FS-2 der Fall ist, ein Osmotikum (beispielsweise Glucose oder Sorbit) in einer Konzentration, die eine niedri gere Osmolarität ergibt, als sie FS-2 besitzt, sowie ein Magnesiumsalz enthalten, wäscht, beispielsweise zweimal.The merger is completed by using Fusion solutions containing PEG in a lower concentration, than is the case with FS-2, an osmotic (e.g. Glucose or sorbitol) in a concentration that is low lower osmolarity than FS-2, and a Contains magnesium salt, washes, for example twice.

Die Temperaturen, bei denen die Verschmelzung vorteilhafter weise durchgeführt wird, liegen im Bereich von 20 bis 24°C, insbesondere bei 22°C.The temperatures at which the merger is more advantageous is carried out in the range of 20 to 24 ° C, especially at 22 ° C.

Die Konzentration an PEG in den "Waschlösungen" wird bei jedem nachfolgenden Waschschritt allmählich verringert (ver gleiche beispielsweise Beispiel 9 und die Fusionslösungen 3 und 4).The concentration of PEG in the "wash solutions" will decrease each subsequent wash step gradually reduced (ver same as example 9 and the fusion solutions 3 and 4).

Jeder Waschschritt muß mindestens zwei Minuten dauern, damit die Protoplasten langsam auf die niedrigere Osmolarität des Mediums gebracht werden und somit ein Platzen der Zellen ver mieden wird.Each wash step must take at least two minutes for this the protoplasts slowly to the lower osmolarity of the Bring medium and thus a burst of the cells ver is avoided.

Nach den Waschschritten werden die verschmolzenen Proto plasten in ein geeignetes Kulturmedium eingebracht. Die Dichte der Protoplasten muß im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ Protoplasten je ml liegen.After the washing steps, the fused proto plastic into a suitable culture medium. The Protoplast density must be in the range of 10⁵ to 10⁶ Protoplasts per ml.

Alternativ kann eine Protoplastenverschmelzung durch Anwenden von elektrischem Strom durchgeführt werden. Alternatively, protoplast fusion can be applied be carried out by electric current.

Bei dieser Elektrofusion werden Ketten von Protoplasten, die aus Linien von maximal 8 Zellen, beispielsweise 5 Zellen, bestehen, einem Gleichstrompuls mit beispielsweise 400 bis 1000 V/cm und einer Pulsdauer von beispielsweise 10 bis 50 µs unterworfen. Die auf diese Weise verschmolzenen Protoplasten werden zweckmäßigerweise einige Zeit, beispielsweise 1 bis 2 Sekunden lang, in dem elektrischen Feld belassen, bevor das elektrische Feld abgeschaltet und den Protoplasten einige Zeit gegeben wird, damit sie ihre runde Form wiedergewinnen können.In this electrofusion, chains of protoplasts that are from lines of a maximum of 8 cells, for example 5 cells, exist, a DC pulse with, for example, 400 to 1000 V / cm and a pulse duration of 10 to 50 µs, for example subject. The protoplasts fused in this way expediently some time, for example 1 to 2 Leave in the electric field for seconds before that electric field turned off and the protoplasts some Time is given so that they regain their round shape can.

Die Ketten von Protoplasten können in bekannter Weise herge stellt werden, indem man die Protoplasten einem Wechselstrom feld aussetzt. Optimale Bedingungen werden ermittelt, indem man die Wechselstromfeldfrequenz, beispielsweise um 1 MHz, sowie die Spannung bis zu 150 V/cm variiert, so daß die Zellen innerhalb weniger Minuten aufgereiht werden.The chains of protoplasts can be produced in a known manner be made by alternating the protoplasts field exposes. Optimal conditions are determined by the AC field frequency, for example around 1 MHz, and the voltage varies up to 150 V / cm, so that the Cells are lined up within a few minutes.

Die auf diese Weise erhaltenen Verschmelzungsprodukte können in Gegenwart von nicht verschmolzenen Elternprotoplasten oder nach optischer Selektion aus der Kultur regeneriert werden. Eine derartige optische Selektion kann durch Mikromanipu lation der Zellen durchgeführt werden, beispielsweise gemäß der Vorschrift in Patnaik et al., Plant Science Letters 24 (1982) 105, für die manuelle Isolierung und Identifizierung von pflanzlichen Heterokaryons oder durch Verwendung eines Zellsortierers (cell sorter), beispielsweise gemäß der Vor schrift in Glimelius et al., Plant Science 45 (1986) 133, für die Selektion und Anreicherung von pflanzlichen Protoplasten heterokaryons durch Zellsortierung.The fusion products obtained in this way can in the presence of unmelted parent protoplasts or can be regenerated from the culture after optical selection. Such an optical selection can be done by micromanipu lation of the cells are carried out, for example according to the regulation in Patnaik et al., Plant Science Letters 24 (1982) 105, for manual isolation and identification of vegetable heterokaryons or by using a Cell sorter, for example according to the pre in Glimelius et al., Plant Science 45 (1986) 133, for the selection and enrichment of plant protoplasts heterokaryons by cell sorting.

Bei Anwendung der Selektionsstrategie werden die Elternproto plasten beispielsweise mit fluoreszierenden Farbstoffen, wie beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat, angefärbt, wodurch im Falle, daß einer der Fusionspartner aus einem Blatt stammt, die Autofluoreszenz des Chlorophylls für die Selek tion verwendet werden kann. When using the selection strategy, the parent prototype plasticize with fluorescent dyes such as for example, fluorescein isothiocyanate, stained, whereby in the event that one of the merger partners from one sheet the autofluorescence of chlorophyll for the Selek tion can be used.

Die auf diese Weise erhaltenen Fusionsprodukte werden in einem geeigneten Kulturmedium gezogen, das einen gut aus gewogenen Nahrungsmittelvorrat für das Wachstum von Proto plasten enthält, unter anderem Mikro- und Makroelemente, Vitamine, Aminosäuren und geringe Mengen an Kohlenhydraten, wie beispielsweise verschiedene Zucker, wie Glucose. Glucose dient als Kohlenstoffquelle sowie zugleich als Osmotikum. Das Kulturmedium enthält Pflanzenhormone (Auxine und Cytokinine), die in der Lage sind, die Zellteilung und die Triebregenera tion (shoot regeneration) zu steuern. Beispiele für geeignete Auxine sind Naphthylessigsäure (NAA), 2,4-Dichlorphenoxy essigsäure (2,4-D) und Indolessigsäure (IAA). Beispiele für geeignete Cytokinine sind Benzylaminopurin (BAP) und Zeatin (Zea). Im allgemeinen werden NAA und 2,4-D in Kombination mit BAP verwendet, um die Zellteilung zu initiieren. Das Verhält nis von Auxin zu Cytokinin muß dann hoch sein, beispielsweise größer als 1.The fusion products obtained in this way are shown in a suitable culture medium, which is good weighed food supply for the growth of proto contains plastics, including micro and macro elements, Vitamins, amino acids and small amounts of carbohydrates, such as various sugars such as glucose. glucose serves as a carbon source as well as an osmotic. The Culture medium contains plant hormones (auxins and cytokinins), that are capable of cell division and drive regeneration tion (shoot regeneration) to control. Examples of suitable ones Auxins are naphthylacetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) and indole acetic acid (IAA). examples for suitable cytokinins are benzylaminopurine (BAP) and zeatin (Zea). Generally NAA and 2,4-D are used in combination with BAP used to initiate cell division. The relationship Then from auxin to cytokinin must be high, for example greater than 1.

Nach 7 bis 10 Tagen wird die Konzentration an Auxinen zweck mäßigerweise durch Zugabe desselben Kulturmediums, jedoch ohne Auxine oder mit wesentlich weniger Auxinen, verdünnt. Typische sternförmige Mikrocalli haben sich dann im allge meinen nach 3 bis 4 Wochen entwickelt. Derartige Mikrocalli werden dann auf ein Regenerationsmedium übertragen, um die Sproß- oder Triebbildung zu initiieren, vorzugsweise nach An passung an die Unterschiede in der Zusammensetzung und den physikalischen Eigenschaften zwischen dem Kulturmedium und dem Regenerationsmedium in einem Zwischenregenerationsmedium.After 7 to 10 days, the concentration of auxins is used moderately by adding the same culture medium, however without auxins or with significantly fewer auxins, diluted. Typical star-shaped micro calli have then in general mine developed after 3 to 4 weeks. Such micro calli are then transferred to a regeneration medium to the To initiate shoot or shoot formation, preferably according to An fit the differences in composition and the physical properties between the culture medium and the regeneration medium in an intermediate regeneration medium.

Für die Sproß- oder Triebbildung muß das Verhältnis von Auxin zu Cytokinin in dem Regenerationsmedium zweckmäßigerweise niedrig sein und beispielsweise unter 1 : 10 liegen. Im all gemeinen ist es bevorzugt, das Auxin IAA in Kombination mit den Cytokininen Zea und BAP für die Sproßregenerierung zu verwenden. For the shoot or shoot formation, the ratio of auxin to cytokinin in the regeneration medium expediently be low and for example less than 1:10. In all it is generally preferred to use the auxin IAA in combination with the cytokinins Zea and BAP for shoot regeneration use.

Die Regenerationsmedien BR-1 und BR-2 sind im Vergleich zu dem Kulturmedium verhältnismäßig arme Medien. Sie enthalten weniger Vitamine, der Gehalt an Kohlenstoffquellen ist niedriger, sie enthalten allein Saccharose und Xylose als Kohlenstoffquelle, und sie enthalten keine Aminosäuren und Kokosnußmilch. Die Regenerationsmedien besitzen außerdem eine höhere Viskosität als das Kulturmedium. BR-1 ist halbfest und enthält die Wachstumsregulatoren NAA, 2,4-D und BAP, wobei das Verhältnis von Auxin zu Cytokinin unter 1 liegt. BR-2 enthält Zea und BAP und gewünschtenfalls IAA.The regeneration media BR-1 and BR-2 are compared to the culture medium relatively poor media. They contain less vitamins, the content of carbon sources lower, they contain sucrose and xylose alone as Carbon source, and they contain no amino acids and Coconut milk. The regeneration media also have one higher viscosity than the culture medium. BR-1 is semi-solid and contains the growth regulators NAA, 2,4-D and BAP, whereby the ratio of auxin to cytokinin is less than 1. BR-2 contains Zea and BAP and, if desired, IAA.

Nach 4 bis 6 Wochen Regeneration im BR-1-Medium werden Calli von etwa 3 mm Durchmesser in das BR-2-Regenerationsmedium, das eine niedrige Saccharosekonzentration aufweist, über führt. Auf dieser Stufe pflegen sich Sprosse innerhalb von 2 bis 3 Wochen zu entwickeln.After 4 to 6 weeks of regeneration in BR-1 medium, calli about 3 mm in diameter into the BR-2 regeneration medium, which has a low sucrose concentration, over leads. At this level, rungs groom themselves within To develop 2 to 3 weeks.

Die erhaltenen Sprosse werden dann auf einem basischen Medium ohne zusätzliche Hormone zur Wurzelbildung veranlaßt.The rungs obtained are then on a basic medium causes root formation without additional hormones.

Die Kern-DNA und die zellorganelle DNA der auf diese Weise erhaltenen Pflänzchen kann danach in bekannter Weise identi fiziert werden, beispielsweise unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen und durch Vergleichen des auf diese Weise erhaltenen DNA-Abbau-Musters (DNA digest pattern) der Fusionsprodukte mit dem der Elternlinien.The core DNA and the cell organelle DNA in this way plant obtained can then identi in a known manner be infected, for example using suitable Restriction endonucleases and by comparing this to them DNA digest pattern obtained in this way Fusion products with that of the parent lines.

Protoplasten von Brassica oleracea sowie inaktivierte oder kernfreie Protoplasten einer Ogura-CMS-Brassica oleracea- Pflanze, die im vorliegenden Falle als Ausgangsmaterialien verwendet werden, können in bekannter Weise aus den ent sprechenden Pflanzenzellen erhalten werden.Protoplasts from Brassica oleracea and inactivated or core-free protoplasts of an Ogura-CMS-Brassica oleracea- Plant that in the present case as starting materials can be used in a known manner from the ent speaking plant cells can be obtained.

Zellwandfreie Zellen, das heißt Protoplasten, werden aus grünem Pflanzenmaterial, beispielsweise Blattmaterial, und beziehungsweise oder aus weißem Pflanzenmaterial, beispiels weise im Dunklen gezogenen Sämlingen, Zellsuspensionskultu ren, Wurzeln oder gebleichtem Pflanzenmaterial, nach her kömmlichen Verfahren erhalten, beispielsweise gemäß dem Ver fahren von Glimelius, Physiologia Plantarum 61 (1984) 38 zur Regeneration von Hypocotylprotoplasten.Cell wall-free cells, i.e. protoplasts, are made green plant material, for example leaf material, and or or from white plant material, for example wise seedlings grown in the dark, cell suspension cult or roots or bleached plant material afterwards Get conventional methods, for example according to Ver drive from Glimelius, Physiologia Plantarum 61 (1984) 38 to Regeneration of hypocotyl protoplasts.

In den Fällen, in denen eine optische Selektion der Ver schmelzungsprodukte beabsichtigt ist, werden die Ausgangs materialien zweckmäßigerweise von einer grünen Pflanze selektiert, oder in den Fällen, in denen sie von weißem Pflanzenmaterial stammen, werden sie vorteilhafterweise angefärbt, um die Selektion zu erleichtern.In cases where an optical selection of the ver melting products is intended to be the starting materials conveniently from a green plant selected, or in cases where it is white Plant material originate, they will be advantageous stained to facilitate selection.

Die inaktivierten oder kernfreien Protoplasten einer Ogura- CMS-Brassica oleracea-Pflanze werden in bekannter Weise aus entsprechenden Ogura-CMS-Brassica oleracea-Pflanzenzellen oder -Protoplasten erhalten, beispielsweise durch Bestrahlung oder bekannte Standardverfahren zur Entfernung des Kerns aus Zellmaterial, wie beispielsweise Zentrifugieren.The inactivated or core-free protoplasts of an ogura CMS Brassica oleracea plants are made in a known manner corresponding Ogura-CMS-Brassica oleracea plant cells receive or protoplasts, for example by irradiation or known standard procedures for removing the core Cell material such as centrifugation.

Die Inaktivierung des Kerns durch Bestrahlung kann mit Hilfe von Gamma-, UV- oder Röntgenstrahlen erfolgen.The inactivation of the core by radiation can be done with the help by gamma, UV or X-rays.

In den Fällen, in denen die Bestrahlung mit Hilfe einer Röntgenstrahlenquelle durchgeführt wird, wird die Kerninakti vierung im allgemeinen durch Anwendung einer Dosis von bei spielsweise 10 krad/min während 3 bis 20 Minuten erzielt.In cases in which the radiation with the help of a X-ray source is carried out, the nuclear inactivity vation generally by application of a dose of achieved, for example, 10 krad / min over 3 to 20 minutes.

Die geeignete Röntgenstrahlendosierung kann beispielsweise festgelegt werden, indem man die Mindeströntgenstrahlung er mittelt, durch die 100% der Protoplastenpopulation abgetötet werden: Der Prozentsatz an toten Zellen wird abgeschätzt, indem man die Zahl von nach 10 bis 20 Tagen in der Kultur gebildeten Kolonien ermittelt. Um optimale Bedingungen für die Entwicklung von Zellkolonien bei niedriger Dichte zu er halten, ist es zweckmäßig, eine Ernährungsschicht (feeder layer), ein vorkonditioniertes Kulturmedium oder ein geeigne tes Zellrettungsverfahren (cell rescue procedure) anzuwenden. Nach Bestimmung der Mindestdosis, die für die Inaktivierung von Zellteilungen erforderlich ist, werden die Protoplasten 5 bestimmten Werten an Röntgenstrahlung ausgesetzt: Der Min destdosis sowie Dosen, die jeweils 10 und 20 krad oberhalb bzw. unterhalb der Mindestdosis liegen. Die auf diese Weise erhaltenen Protoplasten werden dann dem Verfahren gemäß der Erfindung unterworfen.The suitable X-ray dosage can be, for example can be determined by using the minimum X-ray radiation averaged, by which 100% of the protoplast population was killed the percentage of dead cells is estimated by looking at the number after 10 to 20 days in culture colonies formed. To optimal conditions for the development of low-density cell colonies it is advisable to keep a nutritional layer (feeder layer), a preconditioned culture medium or a suitable to use the cell rescue procedure. After determining the minimum dose required for inactivation of cell divisions is required, the protoplasts 5 exposed to certain values of X-rays: the min least dose and doses, each 10 and 20 krad above or below the minimum dose. That way Protoplasts obtained are then the method according to the Subject invention.

Eine ausreichende Kerninaktivierung wird im allgemeinen auch dadurch erzielt, daß man Gammastrahlung von ⁶⁰Co mit einer Dosis von 3 bis 30 krad zur Anwendung bringt.Adequate core inactivation will generally also by achieving gamma radiation of ⁶⁰Co with a Dose of 3 to 30 krad.

Die Kerneliminierung kann auch dadurch durchgeführt werden, daß man Protoplasten in einem Medium mit hoher Osmolarität bebrütet, um auf diese Weise kernfreie Subprotoplasten zu erhalten.The kernel removal can also be carried out by that protoplasts are in a medium with high osmolarity incubated in this way to produce nucleus-free subprotoplasts receive.

Eine geeignete Methode zur Entfernung von Kernen durch Ultra zentrifugieren, die sich auch zur Herstellung des kernfreien Protoplasten-Ausgangsmaterials gemäß der Erfindung eignet, ist aus Spangenberg, European Journal of Cell Biology 39 (1985) 41-45 bekannt. Vorteilhafterweise wird Cytochalasin-B zugesetzt, um die Abgabe der Kerne aus den Zellen zu erleich tern.A suitable method for removing cores by Ultra centrifuge, which is also used to produce the seedless Protoplast starting material is suitable according to the invention, is from Spangenberg, European Journal of Cell Biology 39 (1985) 41-45. Advantageously, cytochalasin-B added to facilitate the release of the nuclei from the cells tern.

Pflanzen von Ogura-CMS-Brassica oleracea können durch klassi sche Aufzuchttechniken aus Brassica oleracea und CMS Raphanus sativus erhalten werden, wie oben dargelegt.Plants of Ogura-CMS-Brassica oleracea can be classified by breeding techniques from Brassica oleracea and CMS Raphanus sativus can be obtained as set out above.

Brassica-Pflanzen gemäß der Erfindung können als Ausgangs material für die Herstellung von anderen Brassica oleracea- Varietäten, die die gewünschten Mytochondrien des Ogura-CMS- Cytoplasmas sowie die Chloroplasten von normaler, fruchtbarer Brassica oleracea sowie gewünschtenfalls zusätzliche erwünschte Merkmale aufweisen, nach in-vitro- und beziehungsweise oder Kreuzungstechniken verwendet werden. Derartige in-vitro- und Kreuzungstechniken sind dem Züchter bekannt.Brassica plants according to the invention can be used as starting material for the production of other Brassica oleracea Varieties that have the desired mytochondria of the Ogura-CMS Cytoplasm as well as the chloroplasts of normal, more fertile Brassica oleracea and, if desired, additional desired ones Have characteristics according to in vitro and respectively or crossing techniques are used. Such in vitro and crossbreeding techniques are known to the breeder.

In den Beispielen verwendete Lösungen:Solutions used in the examples:

a) TVL-Lösung
0,3 m Sorbit
0,05 m CaCl₂ · 2 H₂O
pH=5,6-5,8 a) TVL solution
0.3 m sorbitol
0.05 m CaCl₂ · 2 H₂O
pH = 5.6-5.8
b) Enzymlösung
0,6-1% Cellulysin
0,1% Macerase
gelöst in BR-1, jedoch mit dem doppelten der Saccharosekonzentration, Nichtvorhandensein von Agarose und 10facher Konzentration an 2,4-D
pH=5,6-5,8 b) enzyme solution
0.6-1% cellulysin
0.1% macerase
dissolved in BR-1, but with twice the sucrose concentration, absence of agarose and 10 times the concentration of 2,4-D
pH = 5.6-5.8
c) W5-Lösung (1L)
18,4 g CaCl₂ · 2 H₂O
9,0 g NaCl
1,0 g Glucose
0,8 g KCl
pH=5,6-5,8 c) W5 solution (1L)
18.4 g CaCl₂ · 2 H₂O
9.0 g NaCl
1.0 g glucose
0.8 g KCl
pH = 5.6-5.8
d) CPW16s (1L)
16% Saccharose
0,0272 g KH₂PO₄
0,1010 g KNO₃
1,4800 g CaCl₂ · 2 H₂O
0,2460 g MgSO₄ · 2 H₂O
0,00016 g KI
0,000025 g CuSO₄ · 5 H₂O
pH=5,5-5,8 d) CPW16s (1L)
16% sucrose
0.0272 g KH₂PO₄
0.1010 g KNO₃
1.4800 g CaCl₂ · 2 H₂O
0.2460 g MgSO₄ · 2 H₂O
0.00016 g AI
0.000025 g CuSO₄.5 H₂O
pH = 5.5-5.8
e) Fusionslösung 1 (FS-1)
0,15 m Sorbit
0,03 m CaCl₂ · 2 H₂O
0,075 m KCl
0,05 m Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid
pH=7,2 e) Fusion solution 1 (FS-1)
0.15 m sorbitol
0.03 m CaCl₂ · 2 H₂O
0.075 m KCl
0.05 M tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride
pH = 7.2
f) Fusionslösung 2 (FS-2)
30-40% PEG (MG 1500)
0,3 m Glucose
50 mMol CaCl₂ · 2 H₂O f) Fusion solution 2 (FS-2)
30-40% PEG (MG 1500)
0.3 m glucose
50 mmol CaCl₂ · 2 H₂O
g) Fusionslösung 3 (FS-3)
13,3% PEG (MG 1500)
0,1 m Glucose
0,067 m Sorbit
0,067 m CaCl₂ · 2 H₂O g) Fusion solution 3 (FS-3)
13.3% PEG (MG 1500)
0.1 m glucose
0.067 m sorbitol
0.067 m CaCl₂ · 2 H₂O
h) Fusionslösung 4 (FS-4)
6,7% PEG (MG 1500)
0,05 m Glucose
0,083 m Sorbit
0,083 m CaCl₂ · 2 H₂Oh) Fusion solution 4 (FS-4)
6.7% PEG (MG 1500)
0.05 m glucose
0.083 m sorbitol
0.083 m CaCl₂ · 2 H₂O

Tabelle I Table I

Zusammensetzung der Medien (mg/l) Media composition (mg / l)

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Samensterilisierung und -KeimungSemen sterilization and germination

Samen von Brassica oleracea, Typ Delira-Blumenkohl mit CMS-Plasma von Raphanus sativus-CMS-Ogura, im folgenden als Brassica oleracea A 61043 bezeichnet, werden kurz in 20%igen Alkohol getaucht und 20 Minuten lang in einer 1%igen Natriumhypochloritlösung auf einer Drehschüttelmaschine bei 160 UpM und 22°C sterilisiert. Danach ist eine extensive Spülung mit sterilem, destilliertem Wasser erforderlich. Die Samen werden auf das MS-Nährmedium (Tabelle I), das 1% Saccharose und keine Hormone enthält, aufgebracht. Um grüne sterile Pflänzchen zu erhalten, werden die Samen auf Reproduktionsplatten (replica plates) 16 Stunden lang bei 22°C im Licht (3000 Lux) gezogen. Sterile Sprosse werden unter denselben Bedingungen in Kunststoffbehältern in einer Nebenkultur weitergezogen. Um weißes Gewebe für eine Isolierung von Protoplasten zu erhalten, beispielsweise Hypocotyle, werden die Samen in Petrischalen im Dunklen bei 22°C gezogen.Brassica oleracea seeds, type Delira cauliflower with CMS plasma by Raphanus sativus-CMS-Ogura, hereinafter referred to as Brassica oleracea A 61043, are briefly in 20% Dipped alcohol and in a 1% sodium hypochlorite solution for 20 minutes on a rotary shaker at 160 rpm and sterilized at 22 ° C. After that, an extensive flush is included sterile, distilled water required. The seeds will to the MS culture medium (Table I) containing 1% sucrose and contains no hormones. Around green, sterile plants to get the seeds on reproductive plates (replica plates) for 16 hours at 22 ° C in the light (3000 lux) drawn. Sterile rungs are made under the same conditions grown in plastic containers in a secondary culture. To white tissue for isolation of protoplasts too obtained, for example Hypocotyle, the seeds are in Petri dishes drawn in the dark at 22 ° C.

Beispiel 2Example 2

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden Samen von Brassica oleracea, Kulturrasse SG 121 (Blumenkohl), am 8. Dezember 1987 unter der Nummer ATCC 40399 bei der American Type Culture Collection hinterlegt, sterilisiert und keimen gelassen.According to the procedure of Example 1, Brassica seeds oleracea, cultivated breed SG 121 (cauliflower), on December 8th 1987 with the American Type under the number ATCC 40399 Culture Collection deposited, sterilized and left to germinate.

Beispiel 3Example 3 Isolierung von ProtoplastenIsolation of protoplasts

Vier Wochen alte sterile Sprosse des Pflanzenmaterials gemäß Beispiel 1 werden in kleine Stücke geschnitten und etwa 1 Stunde lang in TVL-Lösung im Dunklen der Vorplasmolyse unterworfen.Four week old sterile shoot of the plant material according to Example 1 are cut into small pieces and about 1 Subject to pre-plasmolysis in the dark in TVL solution for one hour.

Die TVL-Lösung wird entfernt und das Pflanzenmaterial auf bakterielle Verunreinigung untersucht, indem man einen Teil der bebrüteten TVL-Lösung über Nacht in einem Bakterienmedium bei 22°C kultiviert.The TVL solution is removed and the plant material is opened bacterial contamination is examined by looking at a part the incubated TVL solution overnight in a bacterial medium cultivated at 22 ° C.

Das Material wird mit einer Enzymlösung, die 0,6 bis 1% Cellulysin und 0,1% Macerase enthält, versetzt und 16 Stunden lang im Dunklen bei 22°C bebrütet.The material is mixed with an enzyme solution that contains 0.6 to 1% Contains cellulysin and 0.1% macerase, added and 16 hours incubated long in the dark at 22 ° C.

Die Suspension wird anschließend durch Nylongewebe mit einer Maschenweite von 70 µm filtriert und mit dem halben Volumen CPW16s-Lösung durch Zentrifugieren bei 750 UpM während 7 Minuten gewaschen. Dies führt zu dem Aufschwimmen (floatation) der intakten Protoplasten. Die Protoplasten werden gesammelt und zunächst mit W5-Lösung gespült und anschließend 5 Minuten bei 500 UpM mit Fusionslösung 1 durch Zentrifugieren gewaschen. The suspension is then passed through nylon fabric with a Filtered mesh of 70 µm and with half the volume CPW16s solution by centrifugation at 750 rpm for 7 minutes washed. This leads to the floatation of the intact protoplasts. The protoplasts are collected and first rinsed with W5 solution and then 5 minutes washed at 500 rpm with fusion solution 1 by centrifugation.

Beispiel 4Example 4

Acht Tage alte Hypocotyle des Pflanzenmaterials gemäß Beispiel 1 werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 isoliert mit der Abweichung, daß während der Enzymbehandlung ein 1 µg/ml Fluoresceinisothiocyanat zugesetzt werden. Auf diese Weise werden angefärbte Protoplasten erhalten, die sich für eine Selektion von Hand oder durch eine Maschine eignen.Eight day old hypocotyls of the plant material according to the example 1 are isolated according to the procedure of Example 3 with the difference that during enzyme treatment a 1 µg / ml fluorescein isothiocyanate can be added. To this Stained protoplasts are obtained which are suitable for a selection by hand or by a machine.

Beispiel 5Example 5

Samen von Brassica oleracea, Kulturrasse SG 121 (Blumenkohl) werden nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 sterilisiert und keimen gelassen. Vier Wochen alte sterile Sprosse davon werden dann gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 behandelt, und man erhält Protoplasten von Brassica oleracea, Kulturrasse SG 121.Brassica oleracea seeds, cultivated variety SG 121 (cauliflower) are sterilized according to the method of Example 1 and germinated. Four week old sterile shoots of it are then treated according to the procedure of Example 3, and protoplasts of Brassica oleracea, culture breed, are obtained SG 121.

Beispiel 6Example 6

Samen von Brassica oleracea, Kulturrasse SG 121 (Blumenkohl) werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 sterilisiert und keimen gelassen. Acht Tage alte Hypocotyle davon werden danach gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 behandelt mit der Abweichung, daß während der Enzymbehandlung 1 µg/ml Fluoresceinisothiocyanat zugesetzt werden, um angefärbte Protoplasten zu erhalten, die sich zur Selektion von Hand oder mit der Maschine eignen.Brassica oleracea seeds, cultivated variety SG 121 (cauliflower) are sterilized according to the procedure of Example 1 and germinated. It becomes eight day old hypocotyls then treated according to the procedure of Example 3 with the Deviation that during the enzyme treatment 1 µg / ml fluorescein isothiocyanate added to stained protoplasts to get yourself selected by hand or with the machine.

Beispiel 7Example 7 Bestrahlung von ProtoplastenIrradiation of protoplasts

Gemäß Beispiel 3 frisch isolierte Protoplasten werden in einer 6-cm-Petrischale in 2 ml W5-Lösung eingebracht. Die Protoplasten werden unter Verwendung einer Röntgenstrahlenquelle (Baltobloc CE 100) mit einer Dosis von 10 krad/min 5 bis 20 Minuten lang bestrahlt. Nach der Bestrahlung werden die inaktivierten Protoplasten in Fusionslösung 1 verdünnt, bevor sie für Fusionsversuche verwendet werden.According to Example 3 freshly isolated protoplasts are in a 6 cm petri dish in 2 ml of W5 solution. The Protoplasts are made using an X-ray source (Baltobloc CE 100) at a dose of 10 krad / min 5 irradiated for up to 20 minutes. After the radiation diluted the inactivated protoplasts in fusion solution 1, before they are used for fusion experiments.

Beispiel 8Example 8 Cytoplastenisolierung durch UltrazentrifugierungCytoplast isolation by ultracentrifugation

Es wird eine Gradientenflüssigkeit hergestellt, indem man 10 ml Wasser mit Saccharose sättigt und obenauf eine Schicht von 4 ml 1,5-molarer Sorbitlösung, die 0,5% Dimethylsulfoxid (DMSO) sowie 30 µg/ml Cytochalasin B enthält, aufbringt und darauf 2 ml (=1×10⁶) Protoplasten gemäß Beispiel 3 in Fusionslösung 1 dichtet. Das Material wird 15 Minuten bei 25°C und 40 000 g zentrifugiert, und man erhält kernfreie Cytoplasten von Brassica oleracea A 61043.A gradient fluid is made by: 10 ml of water saturated with sucrose and on top of a layer of 4 ml of 1.5 molar sorbitol solution containing 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 30 µg / ml cytochalasin B contains, applies and then 2 ml (= 1 × 10⁶) protoplasts according to Example 3 in Fusion solution 1 seals. The material is at 15 minutes Centrifuged at 25 ° C and 40,000 g, and you get core-free Brassica oleracea A 61043 cytoplasts.

Beispiel 9Example 9 Verschmelzung (Fusion)Merger

Protoplasten gemäß Beispiel 5 und 7 werden im Verhältnis 1 : 1 zu einer Endkonzentration von 5×10⁵ Protoplasten (pps)/ml Fusionslösung 1 in einer sterilen Kammer unter sterilem Luftstrom vermischt.Protoplasts according to Examples 5 and 7 are in the ratio 1: 1 to a final concentration of 5 × 10⁵ protoplasts (pps) / ml of fusion solution 1 in a sterile chamber sterile air flow mixed.

Tröpfchen von 200 µl werden in eine unbedeckte Petrischale (5 bis 7 Tröpfchen je 6-cm-Petrischale) eingebracht und 15 Minuten absetzen gelassen. (Der Strom von steriler Luft wird in dieser Zeit abgestellt, um eine Störung des Absetzens der Protoplasten zu verhindern.) Danach wird Fusionslösung 2 (25 bis 100 µl je Tröpfchen) zugesetzt, um während 3 bis 7 Minuten Agglutination zu induzieren.Droplets of 200 µl are placed in an uncovered petri dish (5 to 7 droplets per 6 cm petri dish) and 15 Let sit for minutes. (The flow of sterile air will turned off during this period to a failure to discontinue the To prevent protoplasts.) Thereafter, fusion solution 2 (25 to 100 µl per droplet) added to for 3 to 7 minutes To induce agglutination.

Der Strom steriler Luft wird wieder angestellt, und die Lösung wird durch Fusionslösung 3-5 Minuten lang ersetzt. Danach wird die Lösung 5 Minuten lang durch Fusionslösung 4 ersetzt. Schließlich werden die Fusionslösungen durch 1,5 ml Kulturmedium BC-1 ersetzt. The flow of sterile air is turned on again, and the Solution is replaced with fusion solution for 3-5 minutes. The solution is then passed through fusion solution 4 for 5 minutes replaced. Finally, the fusion solutions are replaced by 1.5 ml Culture medium BC-1 replaced.

Beispiel 10Example 10 Selektion und Wachstum der VerschmelzungsprodukteSelection and growth of the merger products

Die verschmolzenen Zellen, die visuell durch die Anwesenheit von Doppelfluoreszenz erkannt werden können, werden mit einem Mikromanipulator aufgenommen.The fused cells, visually by the presence of double fluorescence can be recognized with a Micromanipulator added.

Hybride oder Cybride werden in Biopor-Filtermembranen von 1,1 oder 3 cm Durchmesser und Porenweiten von 0,45 bis 3 µm kultiviert, wobei in 1 ml Kulturmedium 1 100 bis 10⁵ Zellen enthalten sind. Die Filter werden in eine Petrischale eingebracht, die 2 bis 2,5 ml Nährzellen (feedercells) (10⁵ je ml) enthält, und das Material wird bei 22°C im Dunklen bebrütet.Hybrids or cybrids are in Biopor filter membranes from 1.1 or 3 cm in diameter and pore sizes from 0.45 to 3 µm, being 1 100 to 10⁵ cells in 1 ml of culture medium are included. The filters are placed in a petri dish, the 2 to 2.5 ml nutrient cells (feedercells) (10⁵ each ml), and the material is incubated at 22 ° C in the dark.

Wenn sich 20% der Zellen teilen, wird Kulturmedium 2 zugesetzt.When 20% of the cells divide, culture medium 2 is added.

Wenn typische sternförmige Mikrocalli entwickelt sind, werden sie in das Regenerationsmedium 1 (BR-1) in bedeckten Petrischalen überführt und 4 bis 6 Wochen bei 22°C und 500 Lux kultiviert.When typical star-shaped micro calli are developed into regeneration medium 1 (BR-1) in covered petri dishes transferred and 4 to 6 weeks at 22 ° C and 500 lux cultured.

Beispiel 11Example 11

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 angefärbte Hypocotylprotoplasten werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 bestrahlt. Die auf diese Weise erhaltenen inaktivierten, angefärbten Protoplasten werden mit den Protoplasten gemäß Beispiel 5 verschmolzen, und die verschmolzenen Protoplasten werden danach unter Verwendung eines Zellsortierers, der mit einer Quecksilberlampe (HB 100) zum Fluoreszenzsortieren nach zwei Parametern ausgerüstet ist, selektiert.Hypocotyl protoplasts stained according to the procedure of Example 4 are irradiated according to the procedure of Example 7. The inactivated, stained so obtained Protoplasts are made with the protoplasts according to the example 5 fused, and the fused protoplasts are then sorted using a cell sorter a mercury lamp (HB 100) for fluorescence sorting two parameters is selected.

Der Fluoreszenzerregungsstrahl des Zellsortierers wird zwischen 488 und 500 nm eingestellt. Der Emissionsstrahl aus den angeregten Zellen wird durch "dichroistische" Spiegel in zwei Lichtstrahlen aufgespalten: einen mit Wellenlängen zwischen 560 und 610 nm, der die Autofluoreszenz der Chloroplasten repräsentiert, und einen anderen mit Wellenlängen zwischen 500 und 560 nm, der die Fluoreszenz des Fluoresceinisothiocyanats repräsentiert. Zwei Photomultiplier werden zum Messen dieser Signale verwendet. Das Umhüllungsfluid (sheath fluid), das heißt das in dem Zellsortierer zur Verdünnung der Protoplastenprobe zu einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom verwendete Trägerfluid, enthält ein einer Autoklavenbehandlung unterzogenes und entgastes W5-Medium.The fluorescent excitation beam of the cell sorter is set between 488 and 500 nm. The emission beam from the excited cells are reflected by "dichroistic" levels in split two beams of light: one with wavelengths between 560 and 610 nm, which is the autofluorescence of the chloroplast represents, and another with wavelengths between 500 and 560 nm, which is the fluorescence of fluorescein isothiocyanate represents. Two photomultipliers become Used to measure these signals. The coating fluid (sheath fluid), that is, in the cell sorter to dilute the Protoplast sample to a continuous fluid flow Carrier fluid used contains an autoclave treatment subjected and degassed W5 medium.

Das Sortieren beruht auf dem Prinzip, daß die Fluoreszenz von nicht verschmolzenen Elternzellen nur eine einzige Fluoreszenz ist (rote Fluoreszenz von Blattmesophyllprotoplasten oder durch Fluoresceinisothiocyanat hervorgerufene gelbe/grüne Fluoreszenz der angefärbten Hypocotylprotoplasten), während verschmolzene Zellen eine Doppelfluoreszenz aufweisen (rot und gelb/grün).The sorting is based on the principle that the fluorescence of non-fused parent cells only a single fluorescence (red fluorescence from leaf mesophyll protoplasts or yellow / green caused by fluorescein isothiocyanate Fluorescence of the stained hypocotyl protoplasts), while fused cells have double fluorescence (red and yellow / green).

Die sortierten Hybride oder Cybride werden in gleicher Weise kultiviert, wie die Zellen, die durch Mikromanipulation selektiert worden sind.The sorted hybrids or cybrids are made in the same way cultivated like the cells by micromanipulation have been selected.

Beispiel 12Example 12

Das gesamte Fusionsgemisch gemäß Beispiel 9 wird in der Petrischale gehalten, in der die Verschmelzung durchgeführt worden war, und im Dunklen bei 22°C kultiviert. Nach 1 bis 2 Tagen werden die Zellen pipettiert und in eine bedeckte Petrischale überführt. Nach etwa 7 bis 14 Tagen, wenn sich 10% der Zellen teilen, werden zwei Volumina Kulturmedium 2 (BC-2) zugesetzt. Nach 10 Tagen wird ein weiteres Volumen BC-2 zugesetzt. Die Zellen werden immer noch im Dunklen bei 22°C kultiviert. Nach 2 bis 4 Wochen, wenn die Zellen typische sternförmige Mikrocalli gebildet haben, werden sie in das Regenerationsmedium 1 überführt. Die Mikrocalli werden mit geringer Lichtintensität (500 Lux) 16 Stunden bei 22°C kultiviert.The entire fusion mixture according to Example 9 is in the Petri dish held in which the merger was carried out had been cultivated in the dark at 22 ° C. After 1 to The cells are pipetted for 2 days and placed in a covered one Petri dish transferred. After about 7 to 14 days, if 10% of the cells share two volumes of culture medium 2 (BC-2) added. After 10 days there will be another volume BC-2 added. The cells are still in the dark Cultivated at 22 ° C. After 2 to 4 weeks if the cells they have formed typical star-shaped micro calli transferred into the regeneration medium 1. The micro calli will with low light intensity (500 lux) for 16 hours Cultivated at 22 ° C.

Beispiel 13Example 13 PflanzenregenerationPlant regeneration

Die Calli gemäß Beispiel 10 und Beispiel 12 haben sich bis zu einer Größe von 2 bis 5 mm Durchmesser entwickelt und werden in das Regenerationsmedium 2 (BR-2) überführt und in einer 16-stündigen Belichtungsperiode bei 22°C und 3000 Lux kultiviert. Sprosse von etwa 1 cm werden in ein MS-Medium mit 1% Saccharose und ohne Hormone überführt und auf demselben MS-Medium Wurzeln gelassen.The Calli according to Example 10 and Example 12 have up to with a size of 2 to 5 mm in diameter transferred into the regeneration medium 2 (BR-2) and in one 16 hour exposure period cultivated at 22 ° C and 3000 lux. Shoots of about 1 cm are placed in an MS medium 1% sucrose and transferred without hormones and on the same MS medium left roots.

Beispiel 14Example 14 Molekularanalyse der VerschmelzungsprodukteMolecular analysis of the merger products a) Zusammensetzung der Kern-DNAa) Composition of the core DNA

Die Charakterisierung der Kernzusammensetzung der Verschmelzungsprodukte wird durch Verwendung spezifischer DNA-Sonden durchgeführt. Ein 0,9 kb großes Kpn I/Bam HI-Fragment des β-Tubulingens von Arabidopsis thaliana hybridisiert mit verschiedenen Banden in einem Endonucleaseabbaumuster von Kern-DNA des CMS-Donors, Brassica oleracea A 61043. Dieses Muster ist spezifisch für Brassica oleracea A 61043 und unterscheidet sich von den Brassica oleracea-Züchtungslinien, die als Akzeptor für das CMS-Merkmal verwendet werden (Fig. 1A).The core composition of the fusion products is characterized using specific DNA probes. A 0.9 kb Kpn I / Bam HI fragment of the Arabidopsis thaliana β-tubulin gene hybridizes with different bands in an endonuclease degradation pattern of core DNA of the CMS donor, Brassica oleracea A 61043. This pattern is specific for Brassica oleracea A 61043 and differs from the Brassica oleracea breeding lines used as an acceptor for the CMS trait ( Fig. 1A).

b) Zusammensetzung der Mytochondrien-DNAb) Mytochondrial DNA composition

Die Charakterisierung wird mit pBO-604-DNA, einem Clon, der ein 1,5 kbp großes Sac-I-Fragment der mytochondriellen DNA von Ogura-CMS-Cytoplasma von Raphanus sativus enthält, durchgeführt. Dieser Clon gibt Hybridisierungssignale mit durch Restriktionsendonuclease hervorgerufenen Abbaupro dukten von mytochondrieller DNA von Ogura-CMS-Cytoplasmen von Brassica oleracea A 61043, jedoch nicht mit Mytochon drien DNA von fruchtbarem Cytoplasma von Bezüchtungslinien von Brassica oleracea (Fig. 1B).Characterization is performed with pBO-604 DNA, a clone containing a 1.5 kbp Sac I fragment of the mytochondrial DNA from Ogura-CMS cytoplasm from Raphanus sativus. This clone gives hybridization signals with restriction endonuclease degradation products of mytochondrial DNA from Ogura CMS cytoplasm from Brassica oleracea A 61043, but not with mytochronous DNA from fertile cytoplasm from breeding lines from Brassica oleracea ( Fig. 1B).

c) Zusammensetzung der Chloroplasten-DNAc) Composition of the chloroplast DNA

Die in den gegenüber Chlorose empfindlichen Chloroplasten des Ogura-CMS-Cytoplasmas vorhandene DNA wird mit der Sonde (probe) Lambda Bcp 17 charakterisiert. Dieser Clon enthält ein 4,5 kpb großes Xho-I/Sac-I-Fragment von Ogura- CMS-Chloroplasten-DNA. Der Clon hybridisiert mit einer 57,5 kpb-Bande in dem Sal-I-Abbauprodukt (digest) von Ogura-CMS-Chloroplasten-DNA und mit einer 9,9 kbp-Bande in dem Sal-I-Abbauprodukt von Chlorplasten-DNA aus fruchtbaren Cytoplasmen in Züchtungslinien von Brassica oleracea (Fig. 1C).The DNA present in the chloroplasts of the Ogura-CMS cytoplasm, which are sensitive to chlorosis, is characterized with the probe (probe) Lambda Bcp 17. This clone contains a 4.5 kpb Xho-I / Sac-I fragment of Ogura-CMS chloroplast DNA. The clone hybridizes with a 57.5 kpb band in the Sal-I degradation product (digest) from Ogura-CMS chloroplast DNA and with a 9.9 kbp band in the Sal-I degradation product from chloroplast DNA fertile cytoplasm in cultivation lines of Brassica oleracea ( Fig. 1C).

Die Fig. 1A, 1B und 1C sind genaue handgezeichnete Kopien von Photographien. Figures 1A, 1B and 1C are accurate hand-drawn copies of photographs.

Claims

1. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen mit Mytochondrien des Ogura-CMS-Cytoplasmas und Chloroplasten von normaler, fruchtbarer Brassica oleracea.1. CMS-Brassica oleracea plants or cells with mytochondria of the Ogura-CMS cytoplasm and chloroplasts from normal, fertile Brassica oleracea.

2. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Blumenkohl-Pflanzen oder -Zellen sind.2. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they have cauliflower plants or Cells are.

3. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Weißkohl-Pflanzen oder -Zellen sind.3. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are white cabbage plants or Cells are.

4. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Rosenkohl-Pflanzen oder -Zellen sind.4. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they have Brussels sprouts plants or Cells are.

5. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Grünkohl-Pflanzen oder -Zellen sind.5. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are kale plants or Cells are.

6. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Wirsing-Pflanzen oder -Zellen sind.6. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are savoy or Cells are.

7. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Rotkohl-Pflanzen oder -Zellen sind.7. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are red cabbage plants or Cells are.

8. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kohlrabi-Pflanzen oder -Zellen sind. 8. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are kohlrabi plants or Cells are.

9. CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Broccoli-Pflanzen oder -Zellen sind.9. CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claim 1, characterized in that they are broccoli plants or Cells are.

10. Verfahren zur Herstellung von CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Protoplasten von Brassica oleracea, die großzüchterisch erwünschte Merkmale aufweisen, mit inaktivierten Protoplasten oder kernfreien Protoplasten einer Ogura- CMS-Brassica oleracea-Pflanze verschmilzt und die dabei erhaltenen allogenen Zellen regeneriert und
b) die nach dem Verfahrensschritt a) erhaltenen CMS-Brassica oleracea-Zellen oder -Pflanzen oder deren Nachkommen als Ausgangsmaterial für die Herstellung von CMS-Brassica oleracea-Pflanzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 durch in-vitro- und/oder Kreuzungstechniken verwendet.

10. A process for the preparation of CMS-Brassica oleracea plants or cells according to claims 1 to 9, characterized in that

a) Protoplasts of Brassica oleracea, which have characteristics desired in large-scale breeding, fuse with inactivated protoplasts or seed-free protoplasts of an Ogura-CMS-Brassica oleracea plant, and the allogeneic cells obtained are regenerated and regenerated
b) the CMS-Brassica oleracea cells or plants or their progeny obtained according to process step a) are used as starting material for the production of CMS-Brassica oleracea plants according to claims 1 to 9 by in vitro and / or crossing techniques.

11. Hybridsamen von CMS-Brassica oleracea-Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus CMS-Brassica oleracea-Pflanzen oder -Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 erhalten wurden.11. Hybrid seeds of CMS-Brassica oleracea plants, thereby characterized that they are from CMS-Brassica oleracea plants or cells obtained according to one of claims 1 to 9 were.