DE3842125A1

DE3842125A1 - Immunoassay-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3842125A1
Application number: DE19883842125
Authority: DE
Inventors: Hiroko Makiguchi; Yasushi Nomura; Kyoko Imai
Original assignee: Hitachi Instruments Engineering Co Ltd; Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Instruments Engineering Co Ltd; Hitachi Ltd
Priority date: 1987-12-14
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 1989-06-29

Description

Die Erfindung betrifft ein Immunoassay-Verfahren und eine Vor richtung zur Durchführung des Verfahrens, die insbesondere zur Bestimmung von biologisch aktiven Bestandteilen in einer Pro be durch photoakustische Spektroskopie geeignet sind.

Wenn eine zu bestimmende Substanz in einer Probe, z.B. ein Antigen, Antikörper, Hapten, Hormon oder dergl., mit einem Antigen oder Antikörper, der mit der Substanz spezifisch rea gieren kann, umgesetzt wird, entsteht ein Immunkomplex. Seit längerer Zeit wird ein Verfahren angewandt, bei dem das Agglu tinationsmuster, die Trübung oder die Intensität der Licht streuung des Komplexes gemessen werden und dadurch die Konzen tration der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird. Dieses Verfahren ist jedoch in Bezug auf die Empfindlichkeit begrenzt und erlaubt keine Testdurchführung, wenn die Konzentration der zu bestimmenden Substanz nieder (10^-8 m oder weniger) ist.

Zur Bestimmung von derart niedrigen Konzentrationen der zu be stimmenden Substanz wird daher das RIA-Verfahren (Radioimmuno assay) unter Verwendung eines Radioisotops als Markierung an gewandt. Da derartige Isotopen jedoch schwierig handzuhaben sind, hat man ein Verfahren unter Verwendung einer fluoreszie renden Substanz oder eines Enzyms als Markierung anstelle von Isotopen entwickelt ("Koso Men-eki Sokuteiho (Enzym-Immuno assay)", Igakushoin, 1978). Insbesondere gilt der Enzym- Immunoassay (EIA) als ein zukunftsträchtiges Verfahren, das das RIA-Verfahren ablösen soll. EIA-Verfahren lassen sich grob in zwei Gruppen einteilen. Bei einer Gruppe handelt es sich um homogene EIA-Verfahren, die keine sogenannte B/F-Trennung erfordern, d.h. die Trennung zwischen einem gebundenen Komplex eines markierten Antigens und eines Antikörpers (gebunden) und von in nicht-umgesetztem Zustand verbliebenen markierten Anti gen (frei). Die homogenen EIA-Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie keine B/F-Trennung erforderlich machen, haben je doch im allgemeinen den Nachteil, daß sich keine große Nach weisempfindlichkeit erreichen läßt. Bei der anderen Gruppe handelt es sich um heterogene EIA-Verfahren. Ein typisches Bei spiel für ein heterogenes EIA-Verfahren ist das ELISA-Verfah ren, das eine B/F-Trennung erforderlich macht und daher in der Durchführung aufwendig und zeitraubend ist. Daher sind hete rogene EIA-Verfahren für routinemäßige klinische Untersuchun gen unzweckmäßig, weisen aber den Vorteil auf, daß sie im Ver gleich zu den vorerwähnten homogenen EIA-Verfahren eine höhere Empfindlichkeit ermöglichen. Unter den heterogenen EIA-Verfah ren, bei denen eine B/F-Trennung erforderlich ist, hat in letzter Zeit das Festphasen-Verfahren weite Verbreitung gefun den. Beim Festphasen-Verfahren wird eine zu bestimmende Sub stanz gemessen, indem man als feste Reaktionsphase einen festen Träger, z.B. inerte Kügelchen (Perlen) mit einem relativ großen Durchmesser in der Größenordnung von einigen Millimetern, oder die Innenwand eines Reaktors verwendet. Das Festphasen-Verfah ren wird nachstehend näher erläutert.

Zunächst wird ein Antikörper an der Innenwand eines Glasröhr chens immobilisiert, und anschließend wird ein unmarkiertes Antigen, (ein Standard-Antigen oder eine Probe, z.B. ein anti genhaltiges Patientenserum) zugesetzt. Dadurch wird die Anti gen-Antikörper-Reaktion ausgelöst, wobei das Antigen in der Probe eine Bindung mit dem immobilisierten Antikörper eingeht. Anschließend wird der Überstand entfernt. Sodann wird ein mit einem Enzym markierter Antikörper zugesetzt, wobei die Antigen- Antikörper-Reaktion mit dem vorher an den immobilisierten Antikörper gebundenen Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper erfolgt. Der enzymmarkierte Antikörper geht dabei eine Bindung mit dem Antigen unter Bindung mit dem immobili sierten Antikörper ein. Sodann wird der Überstand, d.h. der restliche, enzymmarkierte Antikörper, der nicht an das Antigen gebunden ist, entfernt (B/F-Trennung). Hierauf wird eine enzy matische Reaktion unter Verwendung eines Substrats durchge führt. In diesem Fall hängt die enzymatische Aktivität von der Menge des enzymmarkierten, an das Antigen gebundenen Anti körpers ab, die wiederum von der Menge des am immobilisierten Antikörper gebundenen Antigens abhängig ist. Insgesamt ist die enzymatische Aktivität ein Maß für die Menge des ursprünglich in der Probe vorliegenden Antigens. Die enzymatische Aktivität wird gemessen, indem man die Abnahme der Substratmenge auf grund der enzymatischen Reaktion, die Menge des enzymatischen Reaktionsprodukts oder die Veränderung eines kuppelnden Co enzyms mißt.

Das Festphasen-Verfahren hat in letzter Zeit weite Verbreitung gefunden, da die Handhabung eines festen Trägers einfach ist. Das Festphasen-Verfahren ist empfindlicher als die vorerwähn ten homogenen EIA-Verfahren. Da man sich bei herkömmlichen Festphasen-Verfahren der Absorption oder Fluoreszenzintensität als Nachweismittel bedient, beträgt die Grenze der Nachweis empfindlichkeit für diese Verfahren etwa 10^-12 m.

Andererseits offenbart die JP-A 60-1 59 648 einen Festphasen- Immunoassay, bei dem eine zu bestimmende Substanz in einer Probe mit einem unmarkierten, an einer festen Phase immobili sierten Antikörper oder Antigen umgesetzt wird, der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase durch eine Freisetzungslösung freigesetzt wird, und anschließend die den Komplex enthaltende Freisetzungslösung durch photoakustische Spektroskopie bestimmt wird, so daß insgesamt eine Bestimmung der Substanz in der Probe erfolgt. Dieses Verfahren ist jedoch insofern nachteilig, als es noch eine geringe Nachweisempfind lichkeit aufweist und eine lange Testdauer erforderlich macht.

Wie vorstehend erwähnt, sind die herkömmlichen Festphasen- Verfahren insofern nachteilig, als sie aufgrund der Nachweis grenze eine geringe Nachweisempfindlichkeit aufweisen und eine lange Zeitspanne bis zur Erzielung der Ergebnisse erfor derlich machen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Immunoassay-Verfahren und eineVorrichtung hierfür bereitzustellen, die eine Verringe rung der Bestimmungszeit und eine Erhöhung der Nachweisempfind lichkeit ermöglichen. Diese Aufgabe läßt sich durch ein Immunoassay-Verfahren lösen, bei dem es sich um ein heteroge nes Festphasen-Immunoassay-Verfahren unter Verwendung eines Enzyms oder von feinen Ttilchen als Markierungsmittel handelt und bei dem die photoakustische Spektroskopie anstelle der Mes sung der Absorption oder Fluoreszenzintensität als Nachweismit tel für den Immunoassay eingesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Immunoassay-Verfahren, das gekennzeichnet ist durch

- Durchführen einer kompetitiven oder nicht-kompetitiven Reak tion auf der Grundlage eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase und unter Einsatz einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen, und eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Antigen oder dieser Antikör per in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen; oder
einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, und eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen; oder
einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und der gleichen Sub stanz wie die zu bestimmende Substanz;
- Messen der Aktivität des erhaltenen, mit dem Enzym oder den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobili sierten Antigen-Antikörper-Komplexes durch photoakustische Spektroskopie; und
- Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aufgrund des gemessenen Aktivitätswerts.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassay-Verfahren, die gekennzeichnet ist durch

- einen Reaktor, an dem ein Antigen oder Antikörper, die eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Substanz ein gehen, oder die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz immobilisiert sind oder einen Reaktor mit einem Gehalt an unlöslichen Kügelchen, an denen das Antigen oder der Antikörper oder die gleiche Substanz wie die zu bestim mende Substanz immobilisiert sind;
- eine Einrichtung zum Einspritzen einer Probe, die eine zu bestimmende Substanz enthält, in den Reaktor;
- eine Einrichtung zum Einspritzen eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers in den Reaktor, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub stanz einzugehen, oder zum Einspritzen der gleichen Sub stanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, in den Reaktor;
- eine Einrichtung zum Einspritzen eines Substrats für das Enzym oder einer Freisetzungslösung zum Freisetzen des am Re aktor immobilisierten und mit den feinen Teilchen markier ten Antigen-Antikörper-Komplexes in den Reaktor;
- eine photoakustische Zelle, in die Enzym-Substrat-Komplex- Lösung oder die Freisetzungslösung, die den mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex ent hält, eingeführt wird;
- eine Einrichtung zum Bestrahlen der Reaktionslösung oder Freisetzungslösung in der Zelle mit intermittierendem Licht;
- eine Einrichtung zum Nachweisen einer durch die Bestrahlung mit intermittierendem Licht erzeugten akustischen Welle; und
- eine Einrichtung zur Berechnung der Menge der zu bestimmen den Substanz aus der akustischen Welle.

Nachstehend wird die Erfindung auch unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Fließdiagramm zur Erläuterung einer Ausfüh rungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Immunoassay- Verfahrens; und

Fig. 2-11 jeweils Diagramme mit Eichkurven, die für das er findungsgemäße Immunoassay-Verfahren angewandt werden.

Die erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der La ge sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobolisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem enzymmarkierten Anti gen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Anti körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren dem Licht, Messen der dadurch erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge des zu bestimmenden Substrats in der Probe.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um ein hetero genes Festphasen-Verfahren, bei dem ein Enzym als Markierungs mittel verwendet wird, eine nicht-kompetive Reaktion auf der Basis eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase durchgeführt wird und die Menge der zu bestimmenden Sub stanz in einer Probe durch photoakustische Spektroskopie er mittelt wird.

Konkret wird dieses Verfahren auf die nachstehend beschriebe ne Weise durchgeführt. Ein Antikörper oder ein Antigen, das eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Substanz eingeht, wird an einer festen Phase immobilisiert, z.B. an inerten Kügelchen (Perlen) mit einem relativ großen Durchmes ser in der Größenordnung von einigen Millimetern oder an der Innenwand eines Reaktors. Eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probe wird zugesetzt, um einen an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten. An schließend werden ein Antigen oder ein Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmen den Substanz einzugehen, und die mit einem Enzym markiert sind, mit dem Komplex umgesetzt. Bei dieser Reaktion reagiert die zu bestimmende Substanz im Antigen-Antikörper-Komplex mit dem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper und es ergibt sich schließlich ein Antigen-Antikörper-Komplex, der an der festen Phase immobilisiert und mit dem Enzym markiert ist. Nicht-um gesetztes, enzymmarkiertes Antigen oder Antikörper werden entfernt (B/F-Trennung), wonach ein Substrat zum erhaltenen Antigen-Antikörper-Komplex zur Durchführung einer enzymati schen Reaktion zugesetzt wird. Die erhaltene Reaktionslösung wird durch photoakustische Spektroskopie analysiert, wobei die Menge der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird.

Als Enzyme für das vorerwähnte Immonoassay-Verfahren kommen beliebige Enzyme in Frage, sofern sie für übliche Enzym- Immunoassay-Verfahren geeignet sind. Beispiele für derartige Enzyme sind alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukoamylase und β-Galactosidase.

Fig. 1 zeigt ein Fließdiagramm zur Erläuterung einer Ausfüh rungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungs gemäßen Immunoassay-Verfahrens gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform. Diese Ausführungsform wird nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 näher erläutert.

Eine Probennehmerdüse 2 ist mit einer automatischen Probenneh mervorrichtung 1, in der sich eine Vielzahl von Proben befin det, und mit einem Reaktor 4 verbunden. Ein Antikörper 3 ist an der Innenwand des Reaktors 4 immobilisiert. Eine Reaktions lösung 11 befindet sich im Reaktor 4. Der Reaktor 4 ist über einzelne Schläuche mit einer Flasche 5 für Pufferlösung, einer Flasche 8 für enzymmarkierten Antikörper, einer Flasche 9 für Substrat und einer Flasche 10 für Beendigungslösung verbunden. Der Reaktor 4 befindet sich in einer Inkubationsvorrichtung 6. Der Reaktor 4 ist über eine Leitung 30 mit einer photoakustischen Zelle 12 verbunden. Ferner ist der Reaktor 4 durch eine Leitung mit einer Entleerungs flasche 7 verbunden. Die Entleerungflasche 7 ist mit der photoakustischen Zelle 12 verbunden.

Die photoakustische Zelle 12 ist mit einem Drucksensor 16 aus gerüstet. Der Drucksensor 16 ist mit einem Verstärker 17 ver bunden. Der Verstärker 17 ist einzeln mit einer Datenverarbei tungsvorrichtung 18 und einem Transmitter 19 verbunden.

Ferner sind eine Laserlichtquelle 13 sowie ein Zerhacker 14 und eine Linse 15 vorgesehen. Der Zerhacker 14 ist mit dem Transmitter 19 verbunden. Nachstehend wird die Funktionsweise der Vorrichtung näher erläutert.

Die einzelnen, in der automatischen Probennehmervorrichtung 1 befindlichen Proben werden durch die Probennehmerdüse 2 ange saugt und in den Reaktor 4, an dessen Innenwand vorher der Antikörper 3 immobilisiert worden ist, gebracht. Ferner wird eine Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gebracht, wonach der Re aktor 4 in der Schüttelinkubationsvorrichtung 6 inkubiert wird. Sodann wird die Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gebracht, um die feste Phase damit zu waschen. Diese Pufferlösung wird anschließend in das Entleerungsgefäß 7 abgesaugt und sodann aus dem System entfernt.

Hierauf wird der enzymmarkierte Antikörper 8 in den Reaktor 4 gebracht. Eine erneute Inkubation wird durchgeführt. Sodann wird wieder Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gegeben, um die feste Phase zu waschen. Anschließend wird die Pufferlösung in das Entleerungsgefäß 7 entleert. Sodann wird ein Substrat 9 zugesetzt, um die enzymatische Reaktion einzuleiten. Nach Durchführung einer Inkubation wird die Reaktion durch eine Be endigungslösung 10 beendet. Die Reaktionslösung 11 wird nach Beendigung der Reaktion in die photoakustische Zelle 12 ge saugt. Licht aus der Laserlichtquelle 13 wird mittels des Zer hackers 14, der ein Signal vom Transmitter 19 empfangen hat, in intermittierendes Licht umgewandelt. Das intermittierende Licht wird durch die Linse 15 auf die photoakustische Zelle 12 geworfen. In der Zelle absorbiert die Probe das durchtretende Licht unter Erzeugung eines akustischen Signals, das mittels des Drucksensors 26 nachgewiesen wird. Das nachgewiesene Sig nal erfährt im Verstärker 17 eine Verbesserung des Rauschab stands, wird der Datenverarbeitungseinrichtung 18 zugeführt und sodann ausgegeben.

Obgleich im vorstehenden Beispiel die Bestimmung durch Immobi lisierung eines Antikörpers an der Innenwand des Reaktors 4 durchgeführt wird, kann dies auch auf die vorstehend beschrie bene Weise vorgenommen werden, indem man anstelle des Anti körpers ein Antigen, das eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht, verwendet.

Nachstehend wird die in diesem Beispiel eingesetzte photoakusti sche Spektroskopie näher erläutert.

Wenn eine durch die enzymatische Reaktion in der Reaktionslö sung erzeugte Substanz Licht absorbiert, nimmt sie Lichtener gie auf, und die die Substanz bildenden Atome oder Moleküle werden angeregt. Aufgrund der von den Atomen oder Molekülen aufgenommenen Lichtenergie setzen die Atome oder Moleküle bei der Rückkehr in ihren Grundzustand Energie frei (Fluoreszenz, sichtbares Licht oder Wärme). Bei diesem Vorgang wird eine akustische Welle erzeugt. Dieses akustische Signal wird durch den Verstärker 17 verstärkt und zur Ausgabe an die Datenver arbeitungseinrichtung 18 gesendet. Das photoakustische Signal wird durch den Drucksensor 16, z.B. ein akustischer Sensor, wie ein Mikrophon, nachgewiesen. Bei Proben für klinische Untersuchungen, d.h. Proben von lebenden Organismen, handelt es sich im allgemeinen um Flüssigkeiten, wie Blut oder Serum. Im Fall der Untersuchung dieser flüssigen Proben durch photo akustische Spektroskopie, wird eine photoakustische Zelle für die flüssige Probe eingesetzt. Dabei dient als photoakusti sche Zelle 12 ein kleiner, luftdichter Behälter, in dem ein Gas eingeschlossen ist. Eine Probe wird in den Behälter gege ben, und die in der Probe erzeugte Wärme wird in eine Druck änderung des Gases umgewandelt, die mittels eines hochempfind lichen Mikrophons nachgewiesen wird. Eine hochempfindliche Bestimmung kann auch durchgeführt werden, indem man eine Probe selbst als Druckmedium verwendet und die in der Probe erzeugte Wärme in eine Druckänderung umwandelt, wobei man ein kerami sches Druckelement auf Zirkon-Blei-Titanat-Basis (PTZ) oder dergl. als Detektor verwendet.

Wenn Licht aus der Lichtquelle 13 als einfallendes Licht oder als Streulicht durch ein Fenstermaterial oder die Innenwand der Zelle absorbiert wird, ergibt sich dadurch ebenfalls ein photoakustisches Signal. Daher ist insbesondere bei der Be stimmung von Proben, die einen niedrigen Absorptionskoeffizien ten aufweisen und in optischer Hinsicht stark verdünnt sind, darauf zu achten, Hintergrundrauschen zu beseitigen. Ein Hin tergrundrauschen, das auf von der Probe abweichende Substan zen zurückzuführen ist, sollte ebenfalls vom photoakustischen Signal abgezogen werden. In einem derartigen Fall wird die Be stimmung nicht nur in Gegenwart, sondern auch in Abwesenheit der Probe durchgeführt. Die Differenz der beiden Meßwerte wird mittels der Datenverarbeitungseinrichtung 18 ermittelt, wo durch man ein nur auf die Probe zurückzuführendes photoakusti sches Spektrum erhält. Ein photoakustisches Spektrometer vom Doppelstrahl-Typ wird nicht nur dann verwendet, wenn sich die Intensität der Lichtquelle mit der Zeit verändert, sondern auch, wenn ein geringer Unterschied von Spektren von zwei ver schiedenen Proben (eine davon als Kontrollprobe) innerhalb kurzer Zeit gemessen werden soll. Diesbezüglich ist die glei che Situation wie bei einem herkömmlichen Doppelstrahl-Spektro photometer gegeben.

Bei Verwendung eines Lasers als Lichtquelle bei der photo akustischen Spektroskopie ergibt die Spektroskopie ein hoch empfindliches Nachweisverfahren. Infolgedessen wird ein Nach weis von hoher Empfindlichkeit entsprechend einer Absorption von 10^-5 bis 10^-6 möglich.

Nachstehend folgt ein konkretes Ausführungsbeispiel, das sich auf die Bestimmung von Ferritin in Serum bezieht.

In einem Behälter, der daran immobilisierten anti-Ferrritin- Antikörper enthält, werden 0,05 ml einer Humanserumprobe und 0,1 ml 0,01 m Natriumphosphatpuffer pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% NaN₃, 1 millimolar MgCl₂ und 0,1 m NaCl (nachstehend als Pufferlösung A) be zeichnet, gegeben und 10 Minuten bei 37°C geschüttelt. Sodann wird 1 ml Pufferlösung A zu der Reaktionslösung gegeben und durch Saugen entfernt. Dieser Waschvorgang wird dreimal wie derholt. Nach dem wiederholten Waschen werden 150 µl mit alka lischer Phosphatase markierter anti-Ferritin-Antikörper, der mit Pufferlösung A auf 1970 Einheiten/15 µl verdünnt ist, zu gesetzt. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C ge schüttelt. Sodann werden der Waschvorgang mit der Pufferlösung A und der Absaugvorgang auf die vorstehend beschriebene Weise wiederholt. Nach Durchführung der wiederholten Waschung werden 50 µl 2 millimolare p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat zur Einleitung der enzymatischen Reaktion zugesetzt. Anschließend wird 10 Minuten bei 30°C geschüttelt.

Sodann wird die Reaktion unter Verwendung von 2,5 ml einer 0,1 m EDTA-Lösung beendet. Die das enzymatische Reaktionspro dukt enthaltende Reaktionslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und einer Messung mittels eines photoakustischen Spektrometers unterworfen. In Fig. 2 ist eine Eichkurve für Ferritin dargestellt, die unter Verwendung von Eichproben auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden ist. Die Nachweisgrenze beim herkömmlichen Absorptionsverfahren beträgt etwa 0,25 ng/ml, wogegen das vorstehend beschriebene Verfahren eine Bestimmung bei niedrigeren Konzentrationen von beispiels weise 0,001 ng/ml oder darunter ermöglicht.

Der bei dieser Bestimmung verwendete anti-Ferritin-Antikörper weist eine ausreichend hohe Spezifität auf, so daß mit anderen Serumproteinen überhaupt keine Kreuzreaktionen beobachtet wer den.

Die zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmen den Substanz einzugehen;
- Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bin dung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teil chen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase frei zusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen-Anti körper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermit tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um ein hete rogenes Festphasen-Immunoassay-Verfahren, bei dem feine Teil chen als Markierungsmittel verwendet werden, eine nicht-kompe titive Reaktion gemäß einem heterogenen Verfahren an einer festen Phase durchgeführt wird und die Menge der zu bestimmen den Substanz in einer Probe durch photoakustische Spektrosko pie bestimmt wird.

Bei dieser Ausführungsform wird eine Probe mit einem Gehalt an der zu bestimmenden Substanz mit einem Antigen oder einem Anti körper, die in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen und die an einer festen Phase immobilisiert worden sind, umgesetzt, wobei man einen an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Kompex erhält. Anschließend wird ein vorher mit feinen Teilchen mar kiertes Antigen oder Antikörper zugesetzt, wodurch eine weitere Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft. Sodann wird das mit den feinen Teilchen markierte, nicht-umgesetzte Antigen oder Anti körper aus dem Reaktionssystem entfernt (B/F-Trennung). Hier auf wird der erhaltene, mit feinen Teilchen markierte und an der festen Phase immobilisierte Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase unter Verwendung einer Freisetzungslösung frei gesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Freisetzungslösung mit einem Gehalt an dem Komplex wird in eine photoakustische Zelle gebracht und mit einfallendem Licht bestrahlt. Eine in der Pro be hervorgerufene Druckänderung (ein photoakustisches Signal) wird mittels eines piezoelektrischen keramischen Materials in ein elektrisches Signal (Erzeugung von Spannung) umgewandelt. Aufgrund einer vorher aufgestellten Eichkurve, bei der bekann te Konzentrationen der zu bestimmenden Substanz eingesetzt und die Beziehung zwischen der Konzentration der Substanz und dem photoakustischen Signal zugrunde gelegt wird, wird der Anti gen-Antikörper-Komplex quantitativ durch photoakustische Spektroskopie gemessen, was eine quantitative Bestimmung der Substanz ermöglicht. Da die Menge des von der festen Phase freigesetzten, mit den feinen Teilchen markierten Antigen- Antikörper-Komplexes je nach Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe variiert, entspricht die Intensität des photoakustischen Signals der Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe.

Gemäß dieser Ausführungsform lassen sich geringe Mengen von Be standteilen, die bisher in der Praxis nur durch RIA meßbar wa ren, quantitativ messen und zwar rascher und mit höherer Empfindlichkeit als mit RIA.

Als feine Teilchen eignen sich erfindungsgemäß Teilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 100 µm, wobei inerte feine Teilchen mit einem durchschnittli chen Teilchendurchmesser von 0,1 bis 10 µm besonders bevorzugt sind. Wird das Antigen oder der Antikörper mit derartigen feinen Teilchen markiert, so steigert dies den Wirkungsgrad der Reaktion erheblich, was zu einem raschen Verlauf der Be stimmung führt. Um eine zu bestimmende Probe durch das erfin dungsgemäße Verfahren unter hoher Empfindlichkeit rasch quan titativ zu ermitteln, wird vorzugsweise ein mit inerten feinen Teilchen, wie Latex-Teilchen, markiertes Antigen oder Antikörper in Kontakt mit der die zu bestimmende Substanz in hohen Konzen trationen enthaltenden Probe gebracht. Eine Antigen-Antikörper- Reaktion wurde unter Verwendung von feinen Teilchen mit jeweils unterschiedlichen Teilchendurchmessern zur quantitativen Be stimmung von humanem IgG verwendet. Dabei wurde festgestellt, daß bei Einsatz von feinen Teilchen mit einem durchschnittli chen Teilchendurchmesser von 100 µm oder weniger humanes IgG quan titativ innerhalb einer Reaktionszeit von 1 Stunde bestimmt werden konnte. Ferner wurde festgestellt, daß insbesondere bei Verwendung von inerten feinen Teilchen mit einem durchschnitt lichen Teilchendurchmesser von 10 µm oder weniger humanes IgG quantitativ innerhalb einer Reaktionszeit von 15 Minuten be stimmt werden konnte. Da bei der Analyse einer biologischen Probe eine annehmbare Reaktionszeit im allgemeinen höchstens 1 Stunde und vorzugsweise höchstens 15 Minuten betragen soll, ist die Verwendung von inerten feinen Teilchen mit einem durch schnittlichen Teilchendurchmesser von 10 µm oder weniger be vorzugt. Es wurde ein Vergleich unter Berücksichtigung der Nachweisempfindlichkeit und des Rauschabstands durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß feine Teilchen mit einem durch schnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 µm oder mehr und vorzugsweise von 0,1 µm oder mehr geeignet sind. Aus den vorste henden Ergebnissen ergibt sich, daß inerte feine Teilchen mit einem Teilchendurchmesser von 100 µm oder weniger und insbe sondere von 0,1 bis 10 µm geeignet sind.

Als inerte feine Teilchen werden vorzugsweise feine Teilchen aus polymeren organischen Substanzen verwendet, die in einem flüssigen Medium, das im allgemeinen für den Test einer Kör perflüssigkeit verwendet wird, im wesentlichen unlöslich sind und die die vorstehend erwähnten durchschnittlichen Teilchen durchmesser aufweisen. Zu derartigen Teilchen gehören bei spielsweise feine Latex-Teilchen aus organischen Polymeren, wie Polystyrol und dgl.; Zellen; feine Teilchen von anorgani schen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid, Aluminiumoxid und dgl.; mineralische Pulver; und feine Metall teilchen.

Zur Freisetzung des mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes von der festen Phase wird eine wäßrige Natriumhydroxidlösung als Freisetzungslösung verwendet. Es können auch verschiedene andere Freisetzungslösungen eingesetzt werden, beispielsweise wäßrige Lösungen mit einem Gehalt an caotropic Ionen, wie eine wäßrige Natriumthiocyanatlösung und dgl.

Das Verfahren zur Analyse der den Antigen-Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung durch photoakustische Spektros kopie ist das gleiche wie bei der ersten Ausführungsform. Die vorstehend beschriebene zweite Ausführungsform kann im wesent lichen mit der gleichen Vorrichtung wie bei der ersten Ausfüh rungsform durchgeführt werden, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Einspritzen des mit den feinen Teilchen markier ten Antigens oder Antikörpers und eine Einrichtung zum Ein spritzen der Freisetzungslösung vorgesehen sind.

Nachstehend wird ein spezielles Beispiel für diese Ausführungs form angegeben.

10 ml 0,1 m Glycinpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an anti-Human-α-fötoprotein (AFP)-Antikörper wird mit 1 ml Poly styrol-Latex-Teilchen mit einem durchschnittlichen Teilchen durchmesser von 0,22 µm (Feststoffkonzentration: 10 Gew.-%) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtempera tur gerührt und anschließend unter Kühlung auf 2 bis 4°C 40 Mi nuten bei 12 000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Nieder schlag wird in 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin, 0,1 m NaCl und 2 millimolar MgCl₂ suspendiert, wodurch man mit Latexteilchen markierten anti-AFP-Antikörper mit einer Konzentration der Latexteilchen von 1 Gew.-% erhält.

Auf den Boden eines Polystyrolröhrchens werden 20 ml anti-AFP- Antikörper gegeben und zur Immobilisierung 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Sodann werden 0,5 ml 0,5% Rinderserumalbumin zuge setzt. Nach einer Standzeit bei 37°C von 30 Minuten wird das Medium im Röhrchen durch Dekantieren entfernt. Die Innenwand des Röhrchens wird mit 1 ml 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin ge waschen.

In das auf diese Weise hergestellte Röhrchen werden 100 µl einer Probenlösung gegeben. Die Umsetzung wird 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann werden 100 µl des mit den Latexteil chen markierten anti-Human-AFP-Antikörpers zugesetzt. Die Um setzung wird 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. Hierauf wird die Innenwand des Röhrchens 2mal mit 1 ml des vorerwähnten Phosphatpuffers gewaschen, um den mit den Latexteilchen mar kierten, nicht-umgesetzten anti-Human-AFP-Antikörper zu ent fernen. Nach dem Waschen werden in das Röhrchen 300 µl 4 n NaOH gegeben. Die Umsetzung wird 5 Minuten bei 37°C durchge führt, um den mit Latexteilchen markierten Antigen-Antikörper- Komplex von der festen Phase des Röhrchens freizusetzen.

Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Durchfluß zelle eingeführt, und ein photoakustisches Signal wird gemes sen. Als Lichtquelle wird ein Argonionenlaser verwendet. Eine zur Bestimmung von Human-AFP aufgestellte Eichkurve ist in Fig. 3 dargestellt. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß Human-AFP quantitativ in einem niedrigen Konzentrationsbereich von 10 ng/ml oder darunter gemessen werden kann, während dies nach einem herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist.

Im vorliegenden Beispiel ist aufgrund der Verwendung einer photoakustischen Durchflußzelle eine kontinuierliche photo metrische Messung möglich, so daß der Durchsatz erhöht werden kann.

Bei der dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifi sche Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phasen immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge stellten enzymmarkierten und an der festen Phase immobili sierten Antigen-Antikörper-Komplexes; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren dem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation der ersten Ausführungsform, wobei aber die Reihenfolge der Reak tionen verändert ist.

Gemäß diesem Verfahren wird eine zu bestimmende Substanz in einer Probe vorher mit einem Antigen oder einem Antikörper, der dazu in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen und mit einem Enzym markiert ist, umgesetzt, um einen mit dem Enzym markierten Antigen- Antikörper-Komplex zu erhalten. Anschließend wird der Komplex zu einem Antigen oder einem Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub stanz einzugehen und an einer festen Phase, z.B. an der Innen wand eines Reaktors, an unlöslichen Kügelchen oder dgl., immobilisiert worden sind, zugesetzt, um eine weitere Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz im Komplex mit dem an der festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper durchzuführen, wodurch man einen mit dem Enzym markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex erhält. Das nicht-umgesetzte Reagens wird entfernt (B/F-Trennung) wonach ein Substrat zugesetzt und die Reaktionslösung durch photoakustische Spektroskopie auf die gleiche Weise wie bei der ersten Ausführungsform analysiert wird.

Beim Enzym, der festen Phase und dgl., die bei diesem Immuno assay-Verfahren verwendet werden, handelt es sich um die glei chen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Es wird die gleiche Vorrichtung, wie für die erste Ausführungsform ver wendet, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung vorgesehen ist, um vorher die in einer Probe zu bestimmende Substanz mit dem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, umzusetzen.

Nachstehend folgt ein Beispiel für diese Ausführungsform.

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einer defi nierten AFP-Menge werden mit 0,1 ml anti-AFP-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist, gegeben. Das erhalte ne Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird 1 ml 0,9%NaCl zugesetzt und sodann durch Absaugen ent fernt. Dieser Waschvorgang wird dreimal wiederholt. Nach Durchführung der wiederholten Waschung wird 0,1 g p-Nitrophe nylphosphat als Substrat in 100 ml 0,05 m Carbonatpuffer (pH-Wert 9,8) mit einem Gehalt an 1 millimolar MgCl₂ gelöst. 1 ml der Substratlösung werden in den Behälter gegeben und 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 n NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktions produkt enthaltende Reaktionslösung wird in eine photoakusti sche Zelle gesaugt und mittels eines photoakustischen Spektro meters gemessen.

In Fig. 4 ist eine Eichkurve für Standardseren mit einem Ge halt an definierten AFP-Mengen angegeben.

Bei der vierten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe in einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des mit den feinen Teilchen markierten Antigen- Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phase immobi lisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Behandeln des auf diese Weise erhaltenen, mit feinen Teil chen markierten und an der festen Phase immobilisierten Anti gen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizu setzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen Freisetzungslösung, die den Antigen-Antikörper-Komplex enthält, mit intermittie rendem Licht, Messen der dadurch erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Dieses Immunoassay-Verfahren stellt eine Modifikation der drit ten Ausführungsform dar, wobei als Markierungsmittel feine Teilchen anstelle des beim letztgenannten Verfahren verwende ten Enzyms eingesetzt werden. Ferner stellt diese Ausführungs form eine Modifikation der zweiten Ausführungsform dar, wobei die Reihenfolge der Reaktionen verändert ist.

Somit handelt es sich bei den feinen Teilchen, der Freisetzungs lösung und dgl., die bei der vorliegenden Ausführungsform ver wendet werden, um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausführungsform. Es kann die gleiche Vorrichtung wie bei der ersten Ausführungsform verwendet werden, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Einspritzen des mit den feinen Teil chen markierten Antigens oder Antikörpers anstelle der Einrich tung zum Einspritzen des mit einem Enzym markierten Antigens oder Antikörpers vorgesehen ist und daß eine Einrichtung zum Einspritzen der Freisetzungslösung anstelle der Einrichtung zum Einspritzen des Substrats vorhanden ist.

Nachstehend wird diese Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einem Ge halt an einer definierten AFP-Menge werden mit 0,1 ml mit La texteilchen markiertem anti-AFP-Antikörper, der gemäß dem Ver fahren der zweiten Ausführungsform hergestellt worden ist, ver setzt. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Reaktionslösung in ein Röhrchen mit einem Gehalt an anti-AFP-Antikörper, der auf die gleiche Weise wie bei der zweiten Ausführungsform an der Innenwand immobili siert ist (ein Behälter mit einem Gehalt an daran immobilisier tem anti-AFP-Antikörper), gebracht. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Innenwand des Röhrchens dreimal mit 1 ml 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,1 m NaCl und 2 millimolar MgCl₂ gewaschen, um nicht-umgesetz ten, mit Latex-Teilchen markierten anti-AFP-Antikörper zu ent fernen. In das gewaschene Röhrchen werden 0,3 ml 4 n NaOH ge geben, und 5 Minuten bei 37°C inkubiert, um einen mit Latex- Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle ge saugt und der Messung mittels eines photoakustischen Spektro meters unterzogen.

Eine mit dem Standardserum gebildete Eichkurve mit einem Ge halt an einer definierten AFP-Menge ist in Fig. 5 dargestellt.

Bei der fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Probe, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spe zifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um einem Enzym-Immunoassay, bei dem ein Enzym als Markierungsmittel verwendet wird, eine kompetitive Reaktion gemäß einem hetero genen Verfahren unter Verwendung einer festen Phase durchge führt wird und die Menge der zu bestimmenden Substanz durch photoakustische Spektroskopie ermittelt wird.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren werden eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, kompetitiv mit einem Antigen oder Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und die an einer festen Phase, z.B. an der Innenwand eines Reaktors, immobilisiert sind, umgesetzt. Bei dieser Reaktion nimmt mit steigender Menge der zu bestim menden Substanz in der Probe die Menge der enzymmarkierten Substanz, die mit dem an der festen Phase immobilisierten Anti gen oder Antikörper reagiert, ab. Nach der kompetitiven Reak tion wird das nicht-umgesetzte Reagens entfernt (B/F-Trennung), und ein Substrat wird zum erhaltenen, mit dem Enzym markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex gegeben. Anschließend wird die Reaktionslösung durch photoakustische Spektroskopie analysiert, wobei die Menge der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird.

Bei der festen Phase, dem Enzym und dgl., die bei dieser Aus führungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die für diese Aus führungsform verwendete Vorrichtung entspricht im wesentlichen der bei der ersten Ausführungsform verwendeten Vorrichtung, mit der Abänderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die in der Probe zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, aufweist.

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einem Gehalt an thyroidstimulierendem Hormon (TSH), 0,1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1 ml mit alkalischer Phosphatase markiertes TSH werden in einen Behäl ter gegeben, an dessen Innenwand anti-TSH-Antikörper immobili siert ist, und 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach beendeter Umsetzung wird das nicht-umgesetzte, mit alkalischer Phosphata se markierte TSH durch dreimaliges Waschen mit 1 ml des vor stehenden Phosphatpuffers entfernt. Nach dem Waschen werden 1,5 ml einer Lösung von Dinatriumphenylphosphat und 4-Amino antipyrin als Substrat-Puffer-Lösung in den Behälter gegeben und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann werden 1,5 ml des farbbildenden Reagens Kaliumhexacyanoferrat(III) zugesetzt. Nach 10 Minuten wird die Reaktionslösung in eine photoakusti sche Zelle gesaugt und einer Messung mittels eines photoakusti schen Spektrometers unterworfen.

Eine mit dem TSH enthaltenden Standardserum erhaltene Eichkurve ist in Fig. 6 dargestellt.

Bei der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Anti körper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub stanz einzugehen;
- Behandeln des erhaltenen, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen- Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation des Verfahrens der fünften Ausführungsform, wobei der Test unter Verwendung von feinen Teilchen als Markierungsmittel anstelle des im letztgenannten Verfahren verwendeten Enzyms durchgeführt wird.

Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausfüh rungsform. Die bei dieser Ausführungsform verwendete Vorrich tung entspricht der Vorrichtung der fünften Ausführungsform, mit der Abänderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, und eine Einrichtung zum Ein spritzen der Freisetzungslösung aufweist.

Die vorliegende Ausführungsform wird durch das folgende Bei spiel näher erläutert.

In einen Behälter, der an der Innenwand immobilisierten anti- TSH-Antikörper enthält, werden 100 µl Probe- oder Standard serum mit einem Gehalt an TSH und 100 µl mit Latex-Teilchen markierter anti-TSH-Antikörper gegeben. Sodann wird 60 Minuten bei 4°C inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Reaktionen in kompetitiver Weise durchzuführen. Sodann werden die nicht-um gesetzten, mit Latexteilchen markierten anti-TSH-Antikörper durch dreimaliges Waschen mit 1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin entfernt. Nach dem Waschen wird der mit den Latex-Teilchen markierte Antigen-Antikörper- Komplex unter Verwendung von 0,3 ml 4 n NaOH freigesetzt. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle ge saugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterworfen.

Eine mit dem Standardserum mit einem Gehalt an TSH erhaltene Eichkurve ist in Fig. 7 dargestellt.

Bei der siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen,
- Umsetzen eines Substrats mit dem enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex und Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren dem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren werden eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, kompetitiv mit einem Antigen oder Antikörper, die in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und die mit einem Enzym markiert ist, umgesetzt.

Bei dem Enzym, der festen Phase und dgl., die bei diesem Ver fahren verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform.

Die bei dieser Ausführungsform eingesetzte Vorrichtung ent spricht im wesentlichen der Vorrichtung der ersten Ausführungs form, mit der Abänderung, daß ein Reaktor vorliegt, an dem die gleiche Substanz, wie die zu bestimmende Substanz immobili siert ist.

Das nachstehende Beispiel dient der näheren Erläuterung die ser Ausführungsform.

150 µl einer Probe oder einer gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung werden mit 150 µl anti-Ferritin-Antikörper, der mit alka lischer Phosphatase markiert ist, und mit 0,1 ml Phosphatpuf fer mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin vermischt. In die Reaktionslösung wird ein Silikonteil, an dem Ferritin immobilisiert ist, getaucht. Das erhaltene Gemisch wird 60 Mi nuten bei 37°C geschüttelt, um die kompetitiven Reaktionen durchzuführen. Anschließend wird das Siliconteil dreimal mit dem vorerwähnten Puffer gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird 1 ml p-Nitrophenylphosphat als Substrat zugesetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,1 m NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktionsprodukt enthaltende Lösung wird in eine photoakusti sche Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterworfen.

Eine mit der gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung erhaltene Eichkurve ist in Fig. 8 dargestellt.

Bei der achten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung han delt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Behandeln des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen- Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation des Verfahrens der siebten Ausführungsform, wobei als Markie rungsmittel anstelle des im letztgenannten Verfahren verwen deten Enzyms feine Teilchen eingesetzt werden.

Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausfüh rungsform.

Die in dieser Ausführungsform verwendete Vorrichtung ent spricht im wesentlichen der Vorrichtung der siebten Ausfüh rungsform, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Ein spritzen des mit den feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers vorgesehen ist.

Nachstehend wird die vorliegende Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.

150 µl einer Probe oder einer gereinigten Ferritin-Antigen- Lösung werden mit 150 µl anti-Ferritin-Antikörper, der mit Latex-Teilchen markiert ist, und mit 0,1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin vermischt. Ein Siliconteil mit daran immobilisiertem Ferritin wird in die Reaktionslösung getaucht. Nach 60minütigem Schütteln bei 37°C wird das Siliconteil zweimal mit 1 ml des vorgenannten Phosphatpuffers gewaschen, um die nicht-umgesetzten, mit Latex- Teilchen markierten anti-Ferritin-Antikörper zu entfernen. Sodann werden 300 µl 4 n NaOH zum Siliconteil gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert, um einen mit Latex-Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase, d.h. dem Siliconteil, freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unter worfen.

Eine mit der gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung erhaltene Eichkurve ist in Fig. 9 dargestellt.

Bei der neunten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
- Umsetzen des erhaltenen, enzymmarkierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobi lisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge stellten, enzymmarkierten und an der festen Phase immobili sierten Antigen-Antikörper-Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle, Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Bei diesem Verfahren wird eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, kompetitiv mit einem Anti körper, der dazu in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, umgesetzt, um einen mit dem Enzym markierten Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten. Dieser Komplex wird ferner mit einem zweiten Anti körper (einem Antikörper gegen den erstgenannten Antikörper), der an der Innenwand eines Reaktors oder dgl. immobilisiert ist, umgesetzt, wonach das nicht-umgesetzte Reagens entfernt wird. Anschließend wird ein Substrat zugesetzt und der Test durchgeführt.

Beim Enzym und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die bei dieser Ausführungs form verwendete Vorrichtung ist im wesentlichen die gleiche wie bei der ersten Ausführungsform, mit der Abänderung, daß beispielsweise ein Reaktor, an dem der zweite Antikörper immobilisiert ist, und eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, vorgesehen sind.

Ein Gemisch aus 10 µl einer Probe oder einer Standardlösung mit einem Gehalt an humanem Choriongonadotropin (hCG), 0,1 ml 200 000-fach verdünnter Kaninchen-anti-hCG-Antikörper, 10 µl 40-fach verdünnte Lösung von mit β-Galactosidase verdünntem hCG und 80 µl eines 0,02 m Phosphatpuffers (pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin, 1 millimolar Magne siumchlorid, 0,1 m Natriumchlorid und 0,1% Natriumnitrid wer den 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Reaktionslösung wird in einen Behälter, an dessen Innenwand anti-Kaninchen-γ-Globulin- Antikörper (ein zweiter Antikörper) immobilisiert ist, ge bracht und 20 Minuten bei 40°C inkubiert. Anschließend wird die Innenwand dreimal mit 2 ml des vorerwähnten Phosphatpuf fers gewaschen. Sodann werden 100 µl 4-Methylumbelliferyl-β- D-galactopyranosid in den Behälter gegeben und 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 n NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktionsprodukt ent haltende Reaktionslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektro meter unterworfen.

Eine mit dem Standardserum mit einem Gehalt an hCG erhaltene Eichkurve ist in Fig. 10 dargestellt.

Bei der zehnten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmen de Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
- Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
- Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase frei zusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

Dieses Immunoassay-Verfahren stellt eine Modifikation des Verfahrens der neunten Ausführungsform dar, wobei als Markie rungsmittel feine Teilchen anstelle des im letztgenannten Verfahren verwendeten Enzyms eingesetzt werden. Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in dieser Aus führungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die in dieser Ausführungsform eingesetzte Vorrichtung entspricht im wesentli chen der Vorrichtung der neunten Ausführungsform, mit der Ab änderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teil chen markiert ist, enthält.

Ein Gemisch aus 10 µl einer Probe oder eines Standardserums mit einem Gehalt an hCG, 0,1 ml 200 000-fach verdünntem Kanin chen-anti-hCG-Antikörper, 10 µl mit Latex-Teilchen markiertem hCG und 80 µl 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) mit einem Ge halt an 0,1% Rinderserumalbumin, 1 millimolar Magnesiumchlo rid, 0,1 m Natriumchlorid und 0,1% Natriumnitrid wird 60 Mi nuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wird die Reaktionslösung in einen Behälter gegeben, an dessen Innenwand anti-Kaninchen γ-Globulin-Antikörper immobilisiert ist. Sodann wird 20 Minu ten bei 37°C inkubiert. Hierauf wird die Innenwand zweimal mit 1 ml des vorerwähnten Phosphatpuffers gewaschen, um das nicht- umgesetzte, mit Latex-Teilchen markierte hCG zu entfernen. Nach dem Waschen werden 300 µl 4 n NaOH zugesetzt, um einen mit den Latex-Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakusti sche Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterzogen. Eine mit dem hCG enthaltenden Standard serum erhaltene Eichkurve ist in Fig. 11 dargestellt.

Claims

1. Immunoassay-Verfahren, gekennzeichnet durch

- Durchführen einer kompetitiven oder nicht-kompetitiven Reaktion auf der Grundlage eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase und unter Einsatz einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen, und eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Anti gen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezfi sche Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen; oder
einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Sub stanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, und eines Antigens oder Antikörpers, die eine spe zifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einge hen; oder
einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markier ten Antigens oder Antikörpers wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz;
- Messen der Aktivität des erhaltenen, mit dem Enzym oder den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Kom plexes durch photoakustische Spektroskopie; und
- Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aufgrund des gemessenen Aktivitätswerts.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex, der mit dem Enzym markiert und an der festen Phase immobilisiert ist, mit einer Substanz umgesetzt wird, und die erhaltene Reaktions lösung mit intermittierendem Licht bestrahlt wird, wonach die dadurch erzeugte akustische Welle gemessen und die Men ge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle ermittelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex, der mit feinen Teilchen markiert und an der festen Phase immobilisiert ist, mit einer Freisetzungslösung behandelt wird, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizuset zen, und die den Antigen-Antikörper-Komplex enthaltende Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht bestrahlt wird, wonach die dabei erzeugte akustische Welle gemessen und die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den feinen Teilchen um Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 100 µm handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobili sierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem enzym markierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen einer Substanz mit dem erhaltenen, enzymmarkier ten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit inter mittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobili sierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei die ses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz ein zugehen;
- Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisier ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungs lösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wo bei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phasen immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Anti körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge stellten enzymmarkierten und an der festen Phase immobi lisierten Antigen-Antikörper-Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper mit feinen Teilchen mar kiert ist, und wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wo bei dieses Antigen oder Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz ein zugehen;
- Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisier ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungs lösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Probe, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Anti körper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der La ge ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmar kierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Behandeln des erhaltenen, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikör per-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Anti gen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizuset zen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu be stimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Wel le.

11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermit tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Sub stanz in der Probe aus der akustischen Welle.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen;
- Behandeln des erhaltenen, mit den feinen Teilchen mar kierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase frei zusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu be stimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in der Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
- Umsetzen des erhaltenen, enzymmarkierten Antigen-Anti körper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Pha se immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Anti körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
- Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge stellten, enzymmarkierten und an der festen Phase immo bilisierten Antigen-Antikörper-Komplex; und
- Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermit tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim mende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
- Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bin dung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
- Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immo bilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Frei setzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizusetzen; und
- Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.

15. Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassay, gekenn zeichnet durch

- einen Reaktor, an dem ein Antigen oder Antikörper, die eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Sub stanz eingehen, oder die gleiche Substanz wie die zu be stimmende Substanz immobilisiert sind oder einen Reaktor mit einem Gehalt an unlöslichen Kügelchen, an denen das Antigen oder der Antikörper oder die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz immobilisiert sind;
- eine Einrichtung zum Einspritzen einer Probe, die eine zu bestimmende Substanz enthält, in den Reaktor;
- eine Einrichtung zum Einspritzen eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers in den Reaktor, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu be stimmenden Substanz einzugehen, oder zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, in den Reaktor;
- eine Einrichtung zum Einspritzen eines Substrats für das Enzym oder einer Freisetzungslösung zum Freisetzen des am Reaktor immobilisierten und mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplexes in den Reaktor;
- eine photoakustische Zelle, in die Enzym-Substrat-Kom plex-Lösung oder die Freisetzungslösung, die den mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex enthält, eingeführt wird;
- eine Einrichtung zum Bestrahlen der Reaktionslösung oder der Freisetzungslösung in der Zelle mit intermittieren dem Licht;
- eine Einrichtung zum Nachweisen einer durch die Bestrah lung mit intermittierendem Licht erzeugten akustischen Welle; und
- eine Einrichtung zur Berechnung der Menge der zu bestim menden Substanz aus der akustischen Welle.