DE3841755A1 - NEW TNF PEPTIDES - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.The invention relates to new tumor necrosis factor (TNF) derived Peptides, their production and their use as medicines.
Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) wurde be richtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).By Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) has been establishes that the serum from endotoxin-treated animals previously treated with the Mycobacteria strain Calmette-Guerin (BCG) had been infected, one caused hemorrhagic necrosis in various tumors in the mouse. This activity was attributed to the tumor necrosis factor. TNF shows also a cytostatic or cytotoxic effect on a variety of transformed cell lines in vitro, while normal human and animal cell lines are not affected (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Recently the biochemical characterization and the gene described for human TNF (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten;The following protein structure for the mature human can be derived from these data Derive TNF;
ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro
GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly
ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer
GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrIle
SerArgIleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlaIleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp
TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyIleIleAlaLeuValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro
GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly
ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer
GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrIle
SerArgIleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlaIleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp
TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyIleIleAlaLeu
Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).Furthermore, the TNF gene from cattle, rabbits and mice has been described (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.In addition to its cytotoxic properties, TNF is one of the main participants inflammatory reactions (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). In the animal model TNF's involvement in septic shock (Science 229, 869, 1985) and graft versus host disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987).
Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem Molekulargewicht günstige Eigenschaften besitzen.It has now been found that peptides with much lower Molecular weight have favorable properties.
Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I,The invention relates to peptides of the formula I
X-Ala-His-A-Y (I)X-Ala-His-A-Y (I)
worinwherein
A Val, Leu, Ile oder ein Rest -NH-(CH₂) m -CO (mit m in der Bedeutung
einer ganzen Zahl von 1 bis 12) ist,
X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W, G-R-NH-CHM-CO- oder
G-R-NH-CHM-CO-W- und
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder
-V-NH-CHQ-CO-U-Z steht,
wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht
oder
R -Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Ala-Ser-Ser-Asn-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-
oder eine 5-11 Aminosäurereste lange Teilsequenz einer dieser
Peptidketten oder eine Peptidkette aus 1-4 natürlich vorkommenden
α-Aminosäuren bedeuten,
U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden
α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-C₂H₅, -C₆H₅, -CH(OH)-CH₃,A is Val, Leu, Ile or a radical -NH- (CH₂) m -CO (with m meaning an integer from 1 to 12),
X for a group G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W, GR-NH-CHM-CO- or GR-NH-CHM-CO-W- and
Y represents a group -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-UZ or -V-NH-CHQ-CO-UZ,
where in X and Y
G represents a hydrogen atom or an amino protecting group,
Z represents an OH or NH₂ group or a carboxyl protecting group or
R -Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro,
-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Ala-Ser-Ser-Asn-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro
or a partial sequence of one of these peptide chains or a peptide chain of 1-4 naturally occurring α- amino acids which is 5-11 amino acid residues long,
U, V and W represent peptide chains from 1-4 naturally occurring α- amino acids and
M and Q are hydrogen atoms or one of the groups
-CH (CH₃) ₂, -CH (CH₃) -C₂H₅, -C₆H₅, -CH (OH) -CH₃,
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der
Bedeutung einer OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-,
HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-, H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q zusammen eine -(CH₂) c -S-S-(CH₂) d -, -(CH₂) e -CO-NH-(CH₂) f - oder
-(CH₂) e -NH-CO-(CH₂) g -NH-CO-(CH₂) f -Brücke (mit c und d in der
Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6
und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten,
sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.(with b in the meaning of a number from 1 to 6 and T in the meaning of an OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃) ₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO -CO-, H₂N-CO-, H₂N-C (= NH) -NH group) or
M and Q together form a - (CH₂) c -SS- (CH₂) d -, - (CH₂) e -CO-NH- (CH₂) f - or - (CH₂) e -NH-CO- (CH₂) g - NH-CO- (CH₂) f bridge (with c and d meaning a number from 1 to 4, e and f a number from 1 to 6 and g a number from 1 to 12),
and their salts with physiologically acceptable acids.
Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.The peptides of formula I are made up of L-amino acids, but they can Contain 1 to 2 D-amino acids. The side chains of the trifunctional Amino acids can carry protective groups or be unprotected.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.The following are particularly worth mentioning as physiologically acceptable acids: Hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, Methanesulfonic acid, acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, Malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-glutamic acid, L-aspartic acid, pyruvic acid, mucic acid, benzoic acid, Glucuronic acid, oxalic acid, ascorbic acid, acetylglycine.
Die neuen Peptide können insbesondere offenkettig (G=H, Aminoschutzgruppe; Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe, M und Q nicht miteinander verbunden), Disulfid-verbrückt (G=H, Aminoschutzgruppe; Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe; M+Q=-(CH₂) c -S-S-(CH₂) d - oder Seitenketten-ver brückt (G=H, Aminoschutzgruppe, Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe, M+Q=-(CH₂) e -NH-CO-(CH₂) f - oder -(CH₂) e -NH-CO-(CH₂) g -NH-CO-(CH₂) f -) sein.The new peptides can in particular be open-chain (G = H, amino protecting group; Z = OH, NH₂, carboxyl protecting group, M and Q not linked), disulfide-bridged (G = H, amino protecting group; Z = OH, NH₂, carboxyl protecting group; M + Q = - (CH₂) c -SS- (CH₂) d - or side chain ver bridges (G = H, amino protecting group, Z = OH, NH₂, carboxyl protecting group, M + Q = - (CH₂) e -NH-CO- (CH₂ ) f - or - (CH₂) e -NH-CO- (CH₂) g -NH-CO- (CH₂) f -).
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.The new compounds can be made according to those known in peptide chemistry Create methods.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragment verknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten. So the peptides can be sequenced from amino acids or by fragment build linkage of suitable small peptides. With sequential construction the peptide chain is gradually increased by one at the C-terminus Amino acid extended. When coupling fragments, fragments again by sequential construction from amino acids or by itself Fragment coupling can be obtained. The cyclic peptides are after synthesis of the open-chain peptides by a high dilution obtained cyclization reaction obtained.
Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.Both in the sequential structure and in the fragment coupling the building blocks are linked by forming an amide bond. For this enzymatic and chemical methods are suitable.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbopdiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-di methylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphon säureanhydrid (PPA), N,N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäure chlorid (BOP-Cl), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro′s Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2,5-Di phenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz; HOTDO) und 1,1′-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N′-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.Chemical methods for amide bond formation are discussed in detail at Müller, Methods of Organic Chemistry Vol XV / 2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley, New York, 1976 and other standard works of peptide chemistry. Especially the azide method, the symmetrical and the mixed method are preferred Anhydride method, in situ generated or preformed active esters and Formation of amide bonds with the aid of coupling reagents (activators), in particular dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbopdiimide (DIC), 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 1-ethyl-3- (3-di methylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI), n-propanephosphon acid anhydride (PPA), N, N-bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) amidophosphoric acid chloride (BOP-Cl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), Castro's reagent (BOP), O-benzotriazolyl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium salts (HBTU), 2,5-di phenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophene dioxide (Steglich reagent; HOTDO) and 1,1′-carbonyl-diimidazole (CDI). The coupling reagents can alone or in combination with additives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or 2-hydroxypyridine can be used.
Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutz gruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxy carbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppen technik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteins. Die Seitenkettenschutzgruppen der tri funktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminosäureschutzgruppe abgespalten werden. Eine aus führliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.While protective groups can normally be dispensed with in enzymatic peptide synthesis, reversible protection of the reactive functional groups of the two reactants which are not involved in the formation of the amide bond is required for chemical synthesis. In chemical peptide synthesis, three protecting group techniques known from the literature are preferred: the benzyloxycarbonyl (Z), the t-butyloxy carbonyl (Boc) and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protective group technology. The protective group of the α- amino function of the chain-extending building block is designated in each case. The side chain protective groups of the trifunctional amino acids are chosen so that they are not necessarily split off together with the α- amino acid protective group. Müller, Methods of Organic Chemistry Vol XV / 1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974 provides a comprehensive overview of amino acid protecting groups.
Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit über flüssig.The building blocks that serve to build the peptide chain can be in solution in Suspension or by a similar method as described by Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 will. Methods in which peptides are sequential are particularly preferred or by fragment coupling using the Z, Boc or Fmoc protection group technology can be established, with the reactants in Solution to be reacted, as well as procedures in which, similar the Merrifield technique mentioned, a reactant to an insoluble polymeric carrier (hereinafter also called resin) bound for Reaction is brought. The peptide is typically used here the Boc or Fmoc protective group technique sequentially on the polymer Carrier built, the growing peptide chain at the C-terminus covalent with the insoluble resin particles (see Fig. 1 and 2). These Working method allows reagents and by-products to be filtered remove, the recrystallization of intermediates is thus over liquid.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzyl alkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyl oxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz (Fa. BACHEM).The protected amino acids can be attached to any suitable polymer are bound, which are only insoluble in the solvents used be and a stable physical form, the light filtration enables, must have. The polymer must have a functional group contain the first protected amino acid by a covalent Binding can be firmly tied. The are suitable for this purpose various polymers, e.g. B. cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, sulfonated polystyrene, chloromethylated copolymer of Styrene and divinylbenzene (Merrifield resin), 4-methylbenzhydrylamine resin (MBHA resin), phenylacetamidomethyl resin (Pam resin), p-benzyloxybenzyl alcohol resin, benzhydrylamine resin (BHA resin), 4- (hydroxymethyl) benzoyl oxymethyl resin, resin according to Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; BACHEM), HYCRAM resin (ORPEGEN) or SASRIN resin (BACHEM).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N′-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Di chlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.All solvents that are suitable for peptide synthesis in solution are suitable prove inert under the reaction conditions, especially water, N, N'-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, di chloromethane (DCM), 1,4-dioxane, tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and mixtures of the solvents mentioned. Peptide synthesis on the polymeric carrier in all inert organic solvents, in to which the amino acid derivatives used are soluble will; however, solvents which additionally swell with resin are preferred Have properties such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, as well Mixtures of these solvents.
Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z. B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungs reaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.After successful synthesis, the peptide is removed from the polymeric carrier cleaved. The conditions under which the different types of resin split off are known from the literature. Most often find acidic and Palladium-catalyzed cleavage reactions application, especially the Cleavage in liquid anhydrous hydrogen fluoride, in anhydrous Trifluoromethanesulfonic acid, in diluted or concentrated Trifluoroacetic acid or the palladium-catalyzed cleavage in THF or THF-DCM mixtures in the presence of a weak base such as e.g. B. Morpholine. Depending on the choice of the protective groups, these can take place under the gap conditions be preserved or also split off. Partly too Deprotection of the peptide can be useful when certain derivatization reactions or a cyclization are to be carried out.
Die neuen Peptide zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine zytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Ab stoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Peptide besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die Zytotoxizität des Peptids durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Peptids bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die Zellinie mit dem entsprechenden Pepitid in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Bindungsexperiment die Affinität des Peptids zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.Some of the new peptides show good cytotoxic properties. A other part of the peptides has a high affinity for the cellular TNF receptor, but without having cytotoxic activity. they thus represent TNF antagonists. They bind to the natural in competition TNF to the cellular TNF receptor and thus suppress the TNF effect. The new peptides prove to be valuable medicinal products that are used for Treatment of neoplastic and autoimmune diseases as well for the control and prophylaxis of infections, inflammation and Ab rejection reactions can be used in transplants. By simple experiments can be clarified which mode of action the own individual peptides. With a TNF-sensitive cell Cytotoxicity of the peptide by incubation of the cell line in the presence of the Peptide determined. In a second experiment you incubate the Cell line with the corresponding pepitid in the presence of a lethal agent TNF amount. This can demonstrate the TNF-antagonizing effect will. In addition, the affinity is determined by an in vitro binding experiment of the peptide to the cellular TNF receptor.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:The biological characterization of the new peptides on their agonistic or antagonistic effect took place in the following test systems:
I. Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,
II. Kompetition-Zytotoxitätstest auf TNF-sensitiven
Indikatorzellen,
III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden
Indikatorzellen.I. cytotoxicity test on TNF-sensitive indicator cells,
II. Competition cytotoxicity test on TNF-sensitive indicator cells,
III. Competition receptor binding test on TNF receptor expressing indicator cells.
Die agonistische Bewertung der neuen Pepitide basiert auf deren zytotoxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt:The agonistic assessment of the new peptides is based on their cytotoxic effect on TNF-sensitive cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937). The L929 and MCF-7 test was performed as follows:
- 1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol% CO₂.1. 100 ul culture medium with 3 to 5 × 10³ freshly trypsinized itself L929 cells (mouse) in exponential growth or MCF-7 cells (human) were placed in the wells of one Pipetted 96-well flat-bottom culture plate. The plate was over Incubated overnight at 37 ° C in the incubator. The one with steam saturated air in the incubator contained 5 vol% CO₂.
- Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 65°C) foetales Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Gentamycin (50 mg/ml).The L929 culture medium contained 500 ml MEM Earle 1 × (Boehringer, Mannheim), 50 ml heat-inactivated (30 min, 65 ° C) fetal Calf serum (FCS), 50 ml L-glutamine (200 mM), 5 ml 100 × non-essential amino acids, 3 ml 1M Hepes buffer pH 7.2 and 50 ml gentamycin (50 mg / ml).
- Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.The MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco 1x (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS, 5 ml L-glutamine and 5 ml 100 × non-essential amino acids.
- 2. Am folgenden Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Peptid-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d. h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% CO₂ inkubiert.2. The following day, 100 ul of the peptide solution to be tested were added given to the cell cultures and titrated serially twice. In addition some cell controls (i.e. not with peptide dilution treated cell cultures) and some rhu-TNF controls (i.e. with recombinant human TNF-treated cell cultures). The culture plate was exposed for 48 hours at 37 ° C in one atmosphere Steam-saturated air incubated with 5 vol.% CO₂.
- 3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Peptid-Verdünnung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.3. The percentage of surviving cells in those with peptide dilution treated cultures was by means of crystal violet staining certainly. To do this, the liquids from the wells removed by knocking off the test plate. In every well 50 ul crystal violet solutions were pipetted.
-
Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung:
3,75 g Kristallviolett
1,75 g NaCl
161,5 ml Ethanol
43,2 ml 37% Formaldehyd
ad 500 ml WasserThe crystal violet solution had the following composition: 3.75 g crystal violet
1.75 g NaCl
161.5 ml of ethanol
43.2 ml 37% formaldehyde
ad 500 ml water - Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.The crystal violet solution remained in the wells and for 20 min was then also knocked off. Then the Plates washed 5 times each by immersing them in water to remove the non-cell-bound dye. The cell-bound Dye was removed by adding 100 ul reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) in each well extracted from the cells.
- 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.4. By shaking the plates for 5 min each was obtained Deepen an evenly colored solution. To determine the The extinction of the staining solution in the surviving cells individual wells measured at 540 nm.
- 5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50% Zytotoxi zitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50% Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. Then, based on the cell control, the 50% cytotoxi and the reciprocal of the sample dilution that leads to 50% cytotoxicity as the cytotoxic activity of the investigated sample determined.
Die antagonistische Bewertung der Peptide basiert auf deren Eigenschaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der Kompetition-Zytotoxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:The antagonistic evaluation of the peptides is based on their Property, the cytotoxic effect of rhu-TNF on TNF-sensitive Compete cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937). The Competition cytotoxicity test with L929 and MCF-7 cells was as follows carried out:
- 1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich im exponentiellem Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthiel 5 Vol% CO₂.1. 100 ul culture medium with 3 to 5 × 10³ freshly trypsinized itself L929 cells (mouse) in exponential growth or MCF-7 cells (human) were placed in the wells of one Pipetted 96-well flat-bottom culture plate. The plate was over Incubated overnight at 37 ° C in the incubator. The one with steam saturated air in the incubator contained 5 vol% CO₂.
- Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentiele Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 µl Gentamycin (50 mg/ml).The L929 culture medium contained 500 ml MEM Earle 1 × (Boehringer, Mannheim), 50 ml for 30 min at 56 ° C heat-inactivated FCS, 5 ml L-glutamine (200 mM), 5 ml 100 × nonessential amino acids, 3 ml 1M Hepes buffer pH 7.2 and 500 µl gentamycin (50 mg / ml).
- Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.The MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco 1x (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS, 5 ml L-glutamine (200 mM) and 5 ml 100 × non-essential Amino acids.
- 2. Am nächsten Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 µl einer rhu-TNF-Verdünnung im Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100% zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Peptid-Lösung und nicht mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde dann 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% CO₂ inkubiert.2. The next day, 100 ul of the peptide solution to be tested were added added to the cell cultures and titrated serially twice. To this Cell cultures were then 100 ul of a rhu-TNF dilution in Culture medium in the final concentration in the cell culture Has 80-100% cytotoxic effect. In addition, some Cell controls (i.e. not with peptide solution and not with rhu-TNF solution treated cell cultures) and some rhu-TNF controls (= only treated with rhu-TNF solution Cell cultures). The culture plate was then at 48 hours 37 ° C in an atmosphere of water vapor-saturated air 5 vol.% CO₂ incubated.
- 3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.3. The percentage of surviving cells in the solution solution treated cultures was by means of crystal violet staining certainly. To do this, the liquids from the wells removed by knocking off the test plate. In every well 50 ul crystal violet solutions were pipetted.
- Die Kristallviolettlösung hatte die in II.3 angegebene Zusammensetzung.The crystal violet solution had the one given in II.3 Composition.
- Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.The crystal violet solution remained in the wells and for 20 min was then also knocked off. Then the Plates washed 5 times each by immersing them in water to remove the non-cell-bound dye. The cell-bound dye was added by adding 100 ul Reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) in extracted each well from the cells.
- 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.4. By shaking the plates for 5 min each was obtained Deepen an evenly colored solution. To determine the The extinction of the staining solution in the surviving cells individual wells measured at 540 nm.
- 5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die rhu-TNF-Kontrolle der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. Then, based on the cell control and the rhu-TNF control defined the 50% competition value and the Sample concentration at the submitted rhu-TNF concentration leads to 50% competition of rhu-TNF cytotoxicity, as antagonistic activity of the examined sample was determined.
Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven Indikatorzellen (z. B. U937) konkurrieren. Der Kompetition-Rezeptor bindungstest wurde wie folgt durchgeführt:Both the agonistic and the antagonistic effects of Peptides require that the latter bind to the TNF receptor. The means that peptides with agonistic or antagonistic effect and rhu-TNF to bind to the TNF receptor on TNF-sensitive Indicator cells (e.g. U937) compete. The competition receptor Binding test was carried out as follows:
- 1. 100 µl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Peptids sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktionsgefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriumazid.1. 100 µl medium with different concentrations of the test sample The peptide and the rhu-TNF (= control) were placed in the reaction vessels pipetted. The medium contained 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS and 100 mg Sodium azide.
- 2. Anschließend wurden 100 µl Medium mit 1 ng ¹²⁵Jod-markiertem rhu-TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das ¹²⁵Jod-markierte rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 µl Medium) mit dem 200fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 µl Medium) gemischt.2. 100 µl medium was then labeled with 1 ng ¹²⁵iodine rhu-TNF (lactoperoxidase method according to Bolton) into the reaction vessels given and mixed. To determine the non-specific Binding (NSB) became the ¹²⁵iodine-labeled in the reaction vessels rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 µl medium) with 200 times Excess of non-radioactively labeled rhu-TNF (200 ng rhu-TNF mixed in 100 ul medium).
- 3. Dann wurden 100 µl Medium mit 2×10⁶ U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 µl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt.3. Then 100 ul medium with 2 × 10⁶ U937 cells (human) were in the Pipette and mix reaction tubes. The reaction vessels (Test volume 300 µl) were incubated at 0 ° C for 90 min. After 45 min the reaction batches were mixed again.
- 4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt.4. After the incubation period, the cells were 5 min at 1800 rpm and Centrifuged at 4 ° C, washed 3 times with medium, quantitatively in Transferred tubes and the cell-bound radioactivity in a Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac).
- 5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten ¹²⁵J-rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der ¹²⁵J-rhu-TNF-Bindung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. After correcting the measured values for the non-specific binding, based on the total binding, the 50% competition value defined and the sample concentration that is presented at the ¹²⁵J-rhu-TNF concentration to 50% competition of ¹²⁵J-rhu-TNF binding results as a competitive activity of investigated sample determined.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten: Abs = 4-Aminobuttersäure, Ac = Essigsäure, Ade = 10-Aminodekansäure, Ahx = 6-Aminohexansäure, Ano = 9-Aminononansäure, Aoc = 8-Aminooktansäure, Ape = 5-Aminopentansäure, Hcy = Homocystein, Hly = Homolysin, Orn = Ornithin, Dap = 2,3-Diaminopropionsäure.The following examples are intended to explain the invention in more detail. The proteogenic amino acids are known in the examples with the Abbreviated three letter code. In addition, Abs = 4-aminobutyric acid, Ac = acetic acid, Ade = 10-aminodecanoic acid, Ahx = 6-aminohexanoic acid, Ano = 9-aminononanoic acid, Aoc = 8-aminooctanoic acid, Ape = 5-aminopentanoic acid, Hcy = homocysteine, Hly = homolysin, Orn = ornithine, Dap = 2,3-diaminopropionic acid.
Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unter schiedliche Synthesezyklen.The device is used for the Boc and Fmoc protection group technology different synthesis cycles.
Das nach Ia erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur (Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 ml/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol (0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N₂ Fluorwasserstoff einkondensiert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluorwasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester gewaschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30%iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.The peptide resin obtained according to Ia was dried in vacuo and in a Reaction vessel of a Teflon HF apparatus (from PENINSULA) transferred. After adding a scavenger, preferably anisole (1 ml / g resin), as well in the case of tryptophan-containing peptides of a thiol for removal the indolene formyl group, preferably ethanedithiol (0.5 ml / g Resin) was condensed with cooling with liquid N₂ hydrogen fluoride (10 ml / g resin). The mixture was allowed to warm to 0 ° C and stirred at this temperature for 45 min. Then the hydrogen fluoride stripped off in vacuo and the residue washed with ethyl acetate, to remove remaining scavenger. The peptide was made with 30% acetic acid extracted, filtered and the filtrate lyophilized.
Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et₂O oder MeOH/Et₂O kristallisiert.To produce peptide hydrazides, the peptide resin (Pam or Merrifield resin) suspended in DMF (15 ml / g resin) and after transfer stirred with hydrazine hydrate (20 equivalents) for 2 days at room temperature. For working up, the resin was filtered off and the filtrate Evaporated dry. The residue was made from DMF / Et₂O or MeOH / Et₂O crystallized.
Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und anschließend in Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985). The peptide resin obtained according to Ib was dried in vacuo and then depending on the amino acid composition of a subjected to the following splitting procedures (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).
Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30% Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.The suspension of the peptide resin in the appropriate TFA mixture was stirred at room temperature for the specified time, after which the The resin is filtered off and washed with TFA and DCM. The filtrate and the Wash solutions were largely concentrated and the peptide by addition precipitated from diethyl ether. After cooling in the ice bath, the Filtered precipitate, taken up in 30% acetic acid and lyophilized.
Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc; SEPHADEX LH20/MeOH) und anschließender Mittel druckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 µ, 100 Å; mobile Phase; Gradient mit A = 0,1% TFA/MeOH, B = 0,1% TFA/H₂O). The purification was carried out by means of gel chromatography (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc; SEPHADEX LH20 / MeOH) and subsequent agents pressure chromatography (stationary phase: HD-SIL C-18, 20-45 µ, 100 Å; mobile phase; Gradient with A = 0.1% TFA / MeOH, B = 0.1% TFA / H₂O).
Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde mit analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100×2,1 mm VYDAC C-18, 5 µ, 300 Å; mobile Phase = CH₃CN/H₂O-Gradient, gepuffert mit 0,1% TFA, 40°C) bestimmt. Zur Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombardment- Massenspektroskopie herangezogen.The purity of the end products obtained was determined using analytical HPLC (Stationary phase: 100 × 2.1 mm VYDAC C-18, 5 µ, 300 Å; mobile phase = CH₃CN / H₂O gradient, buffered with 0.1% TFA, 40 ° C) determined. To Amino acid analysis and fast atom bombardment were characterized. Mass Spectroscopy.
1,11 g Boc-Leu-Pam-Harz (Substitution ∼ 0,45 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß AIa mit je 2 mmol1.11 g Boc-Leu-Pam resin (substitution ∼ 0.45 mmol / g), corresponding to one Batch size of 0.5 mmol, were according to AIa with 2 mmol
Boc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Gly-OH
Boc-Ape-OH
Boc-His(Z)-OH
Boc-Ala-OH
Boc-Val-OH
Boc-Pro-OH
Boc-Lys(Cl-Z)-OH
Boc-Asp(OCHx)-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH
Boc-Pro-OHBoc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Gly-OH
Boc-Ape-OH
Boc-His (Z) -OH
Boc-Ala-OH
Boc-Val-OH
Boc-Pro-OH
Boc-Lys (Cl-Z) -OH
Boc-Asp (OCHx) -OH
Boc-Ser (Bzl) -OH
Boc-Pro-OH
umgesetzt (bei allen auf His folgenden Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 verzichtet).implemented (steps 14-16 were not carried out for all couplings following His).
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 1-6 und 14-16 gemäß AIa) und das Peptidharz im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,91 g.After the synthesis had ended, the N-terminus was acetylated (steps 1-6 and 14-16 according to AIa were carried out) and the peptide-resin was dried in vacuo; the yield was 1.91 g.
0,95 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß AII unterworfen. Das Rohprodukt (245 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 60-80% A; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 172 mg Endprodukt erhalten.0.95 g of the resin thus obtained was subjected to HF cleavage in accordance with AII. The crude product (245 mg) was purified by gel filtration (SEPHADEX G-10) and medium pressure chromatography (cf. AIV; 60-80% A; 0.25% min -1 ). 172 mg of the final product were obtained.
0,48 g Fmoc-Leu-p-Alkoxybenzylalkoholharz (Substitution ∼ 0,52 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol, wurden gemäß AIb mit je 1 mmol0.48 g Fmoc-Leu-p-alkoxybenzyl alcohol resin (substitution ∼ 0.52 mmol / g), corresponding to a batch size of 0.25 mmol, were according to AIb with 1 mmol
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Aoc-OH
Fmoc-His(Trt)-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Lys(Boc)-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Thr(tBu)-OH
Fmoc-Arg(Mtr)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Arg(Mtr)-OH
Fmoc-Val-OHFmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Aoc-OH
Fmoc-His (Trt) -OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Lys (Boc) -OH
Fmoc-Asp (OtBu) -OH
Fmoc-Ser (tBu) -OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Thr (tBu) -OH
Fmoc-Arg (Mtr) -OH
Fmoc-Ser (tBu) -OH
Fmoc-Ser (tBu) -OH
Fmoc-Ser (tBu) -OH
Fmoc-Arg (Mtr) -OH
Fmoc-Val-OH
umgesetzt.implemented.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus entschützt (Ausführung der Schritte 2-4 gemäß AIb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,24 g.After the synthesis, the N-terminus was deprotected (steps 2-4 according to AIb). The peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 1.24 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (475 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 50-70%; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 294 mg Reinprodukt erhalten.The crude peptide (475 mg) obtained after the TFA cleavage according to AIII was purified by gel filtration (SEPHADEX G-10) and medium pressure chromatography (cf. AIV; 50-70%; 0.25% min -1 ). 294 mg of pure product were obtained.
Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen:Analogously to Examples 1 and 2, the following can be produced:
3. H-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-
Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
4. Ac-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-
Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂
5. Ac-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂
6. Ac-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Aoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
7. H-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
8. Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
9. Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂3. H-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
4. Ac-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂
5. Ac-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂
6. Ac-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Aoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
7. H-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
8. Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-OH
9. Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Ape-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-NH₂
1,11 g Boc-Leu-Pam-Harz (Substitution ∼ 0,45 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurden gemäß AIa mit je 2 mmol1.11 g Boc-Leu-Pam resin (substitution ∼ 0.45 mmol / g), corresponding to one Batch size of 0.5 mmol were 2 mmol each according to AIa
Boc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Cys(pMB)-OH
Boc-Gly-OH
Boc-Ape-OH
Boc-His(Z)-OH
Boc-Ala-OH
Boc-Cys(pMB)-OH
Boc-Pro-OH
Boc-Lys(Cl-z)-OH
Boc-Asp(OCHx)-OHBoc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Cys (pMB) -OH
Boc-Gly-OH
Boc-Ape-OH
Boc-His (Z) -OH
Boc-Ala-OH
Boc-Cys (pMB) -OH
Boc-Pro-OH
Boc-Lys (Cl-z) -OH
Boc-Asp (OCHx) -OH
umgesetzt (bei allen auf His folgenden Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 verzichtet). implemented (steps 14-16 were not carried out for all couplings following His).
Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,76 g.The peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 1.76 g.
0,88 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß AII unterworfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 l 0,1%iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K₃[Fe(CN)₆]-Lösung zugetropft, bis die gelblich-grüne Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD 3×4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotations verdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.0.88 g of the resin thus obtained was subjected to HF cleavage in accordance with AII subject. The lyophilized crude product became 0.1% in 2 l Acetic acid added and the pH then with aqueous ammonia 8.4 set. 0.01 N was slowly added under an argon atmosphere K₃ [Fe (CN) ₆] solution added dropwise until the yellowish green color is longer than 15 minutes remained. The mixture was stirred for a further 1 h, then with glacial acetic acid acidified to pH 4.5 and with 15 ml of an aqueous suspension Anion exchanger (BIORAD 3 × 4A, chloride form) added. After 30 min the ion exchange resin was filtered off, the filtrate on the rotation evaporator evaporated to 100 ml and then lyophilized.
Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.All solvents used were previously saturated with nitrogen to prevent possible oxidation of the free cysteine residues.
Das Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX G-15) und Mittel druckchromatographie (vgl. AIV; 60-80% A; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 72 mg Reinprodukt erhalten.The crude product was purified by gel chromatography (SEPHADEX G-15) and medium pressure chromatography (cf. AIV; 60-80% A; 0.25% min -1 ). 72 mg of pure product were obtained.
Analog Beispiel 10 lassen sich herstellen:The following can be produced analogously to Example 10:
1,02 g Boc-Leu-MBHA-Harz (Substitution ∼ 0,49 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von ∼0,5 mmol, wurden gemäß AIa mit je 2 mmol1.02 g Boc-Leu-MBHA resin (substitution ∼ 0.49 mmol / g), corresponding to one Batch size of ∼0.5 mmol, were according to AIa with 2 mmol
Boc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Asp-(OCHx)-OH
Boc-Gly-OH
Boc-Aoc-OH
Boc-His(Z)-OH
Boc-Ala-OH
Boc-Dap(Z)-OH
Boc-Pro-OHBoc-Ala-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Asp- (OCHx) -OH
Boc-Gly-OH
Boc-Aoc-OH
Boc-His (Z) -OH
Boc-Ala-OH
Boc-Dap (Z) -OH
Boc-Pro-OH
umgesetzt (bei allen auf His folgenden Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 verzichtet). Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 1-6 und 14-16 gemäß AIa). Das erhaltene Peptidharz wurde in Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,58 g.implemented (steps 14-16 were not carried out for all couplings following His). After the synthesis was complete, the N-terminus was acetylated (steps 1-6 and 14-16 according to AIa). The peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 1.58 g.
Das nach der HF-Spaltung gemäß AII erhaltene Rohprodukt (385 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst, mit 210 mg NaHCO₃ und 0,12 ml Diphenylphos phorylazid versetzt. Die Mischung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockne eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX LH 20) gereinigt. Es wurden 122 mg Rein produkt erhalten.The crude product (385 mg) obtained after the HF cleavage according to AII was in 500 ml degassed DMF dissolved, with 210 mg NaHCO₃ and 0.12 ml diphenylphos phorylazide added. The mixture was stirred at room temperature for 3 days and then evaporated to dryness. The crude peptide was made by Gel chromatography (SEPHADEX LH 20) cleaned. There were 122 mg pure received product.
1 g Harz nach Breipohl et al. (Fa. BACHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurde gemäß AIb mit je 2 mmol1 g of resin according to Breipohl et al. (BACHEM), according to a batch size of 0.5 mmol was according to AIb with 2 mmol
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ahx-OH
Fmoc-His(Trt)-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Dap(Z)-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Lys(Z)-OHFmoc-Leu-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Asp (OtBu) -OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ahx-OH
Fmoc-His (Trt) -OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Dap (Z) -OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Lys (Z) -OH
umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2-4 und 8-9 gemäß AIb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; Ausbeute 1,75 g.implemented. After the synthesis had ended, the N-terminus was acetylated (steps 2-4 and 8-9 were carried out according to AIb). The peptide resin was dried in vacuo; Yield 1.75 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt (518 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO₃ und 0,12 ml Diphenylphosphorylazid wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft, und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (182 mg) wurde in 20 ml MeOH gelöst und nach Zugabe von 20 mg Pd/C (10%) 8 h bei Normaldruck hydriert. Das nach Abfiltrieren des Katalysators und Eindampfen erhaltene Produkt wurde durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 55-75% A; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 144 mg Reinprodukt erhalten.The crude product (518 mg) obtained after the TFA cleavage according to AIII was dissolved in 500 ml of degassed DMF. After adding 210 mg of NaHCO₃ and 0.12 ml of diphenylphosphoryl azide, the mixture was stirred at room temperature for 3 days. The mixture was then evaporated to dryness and the crude peptide was purified by gel chromatography (SEPHADEX LH 20). The isolated monomer (182 mg) was dissolved in 20 ml of MeOH and, after addition of 20 mg of Pd / C (10%), hydrogenated for 8 hours at normal pressure. The product obtained after filtering off the catalyst and evaporating was purified by medium pressure chromatography (cf. AIV; 55-75% A; 0.25% min -1 ). 144 mg of pure product were obtained.
Analog Beispiel 67 und 68 lassen sich herstellen:Analogously to Examples 67 and 68, the following can be produced:
Claims (7)
A Val, Leu, Ile oder ein Rest -NH-(CH₂) m -CO (mit m in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 1 bis 12) ist,
X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W, G-R-NH-CHM-CO- oder G-R-NH-CHM-CO-W- und
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht,
wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
R -Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Ala-Ser-Ser-Asn-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-
oder eine 5-11 Aminosäurereste lange Teilsequenz einer dieser Peptidketten oder eine Peptidkette aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren bedeutet,
U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-C₂H₅, -C₆H₅, -CH(OH)-CH₃, (mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung einer OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-, H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q zusammen eine -(CH₂) c -S-S-(CH₂) d -, -(CH₂) e -CO-NH-(CH₂) f - oder -(CH₂) e -NH-CO-(CH₂) g -NH-CO-(CH₂) f -Brücke (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten,
sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.1. The invention relates to peptides of the formula I, X-Ala-His-AY (I) in which
A is Val, Leu, Ile or a radical -NH- (CH₂) m -CO (with m meaning an integer from 1 to 12),
X for a group G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W, GR-NH-CHM-CO- or GR-NH-CHM-CO-W- and
Y represents a group -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-UZ or -V-NH-CHQ-CO-UZ,
where in X and Y
G represents a hydrogen atom or an amino protecting group,
Z represents an OH or NH₂ group or a carboxyl protecting group or
R -Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro,
-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Gln-Ala-Ser-Ser-Asn-Lys-Pro-,
-Leu-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro
or a partial sequence of one of these peptide chains or a peptide chain of 1-4 naturally occurring α- amino acids which is 5-11 amino acid residues long,
U, V and W represent peptide chains from 1-4 naturally occurring α- amino acids and
M and Q are hydrogen atoms or one of the groups
-CH (CH₃) ₂, -CH (CH₃) -C₂H₅, -C₆H₅, -CH (OH) -CH₃, (with b in the meaning of a number from 1 to 6 and T in the meaning of an OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃) ₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO -CO-, H₂N-CO-, H₂N-C (= NH) -NH group) or
M and Q together form a - (CH₂) c -SS- (CH₂) d -, - (CH₂) e -CO-NH- (CH₂) f - or - (CH₂) e -NH-CO- (CH₂) g - NH-CO- (CH₂) f bridge (with c and d meaning a number from 1 to 4, e and f a number from 1 to 6 and g a number from 1 to 12),
and their salts with physiologically acceptable acids.
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