DE3831714A1 - TPA-SIMILAR POLYPEPTIDES, THEIR PREPARATION AND USE - Google Patents

Abstract

tPA-like polypeptides and their manufacture are described. The new polypeptides are suitable for use against diseases.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue tPA-ähnliche Polypeptide mit Plasminogenaktivatoraktivität, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.The present invention relates to novel tPA-like polypeptides having Plasminogen activator activity, process for their preparation and their Use in combating diseases.

Der humane, gereifte Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) ist ein Polypeptid aus 527 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 68 kD (Pennica et al. 1983, Nature 301, 214-221 und Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5355-5359) (vgl. Abb. 1a-1c). Das Molekül enthält mehrere distinkte Regionen, sog. Domänen, denen verschiedene Funktionen zugeordnet werden. Der N-Terminus wird durch eine Finger-Region gebildet, die dem Fibronektin homolog ist. Anschließend folgt eine Region, die Ähnlichkeit mit mehreren Wachstumsfaktoren besitzt. Im Anschluß daran folgen zwei Kringel-Domänen. Nach einer Spaltstelle, an der das einkettige Molekül in zwei Ketten gespalten werden kann, schließt sich die Protease-Domäne an; diese enthält das aktive Zentrum und besitzt Homologie zu anderen Serin-Proteasen.The human mature tissue plasminogen activator (tPA) is a polypeptide of 527 amino acids and a molecular weight of about 68 kD (Pennica et al. 1983, Nature 301, 214-221 and Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5355-5359) (see Fig. 1a-1c). The molecule contains several distinct regions, so-called domains, assigned to different functions become. The N-terminus is formed by a finger region corresponding to the Fibronectin is homologous. Then follows a region, the similarity with multiple growth factors. This is followed by two Kringle domains. After a cleavage site, where the single-chain molecule in two chains can be cleaved, the protease domain joins; it contains the active center and has homology to others Serine proteases.

Mehrere Eigenschaften machen den Gewebe-Plasminogenaktivator zu einem interessanten Molekül: tPA besitzt eine starke Affinität zu Fibrin, die Plasminogen-Aktivierung ist Fibrin-abhängig; als Protease spaltet tPA Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibrin zu Spaltprodukten abbaut. tPA ist durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren hemmbar. Ferner hat tPA eine relativ kurze Halbwertzeit; das Molekül wird in der Leber rasch abgebaut.Several properties make the tissue plasminogen activator one interesting molecule: tPA has a strong affinity to fibrin, the Plasminogen activation is fibrin-dependent; as protease tPA splits Plasminogen to plasmin, which in turn degrades fibrin to fission products. tPA is inhibitable by plasminogen activator inhibitors. Furthermore, tPA has one relatively short half-life; the molecule is rapidly degraded in the liver.

Diese Faktoren bewirken, daß tPA in vivo spezifisch an Blutgerinnseln Plasminogen zu Plasmin aktiviert und durch Abbau des Fibrins die Wiederherstellung des Gefäßstromes bewirkt. tPA kann deshalb in der fibrinolytischen Therapie, z. B. nach einem Herzinfarkt, eingesetzt werden.These factors cause tPA to be specific for blood clots in vivo Plasminogen is activated to plasmin and the breakdown by the fibrin the recovery the vessel current causes. tPA can therefore be found in the fibrinolytic therapy, e.g. B. after a heart attack, used become.

Es wurde nun gefunden, daß tPA-ähnliche Polypeptide, die die Aminosequenz des tPA aufweisen, worin jedoch 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, sowie deren Allelvarianten verbesserte Eigenschaften besitzen.It has now been found that tPA-like polypeptides containing the amino acid sequence of tPA, but wherein 1-6 are tripeptides by the tripeptide RGD are replaced, as well as their allelic variants improved properties have.

Die neuen Polypeptide enthalten also ein oder mehrere RGD (= Arg-Gly-Asp) Tripeptide anstelle von jeweils einem Tripeptid im tPA bei unveränderter Gesamtlänge des Moleküls. The new polypeptides thus contain one or more RGD (= Arg-Gly-Asp) Tripeptides instead of one tripeptide each in tPA at unchanged Total length of the molecule.  

Die Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die für die mutierten Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten.The invention further relates to DNA sequences which are mutagenic Polypeptides encode, as well as vectors containing these DNA sequences.

Die neuen Polypeptide lassen sich gentechnisch nach bekannten Verfahren herstellen. Ausgangspunkt für die hier beschriebenen Konstruktionen ist ein cDNA-Klon, im folgenden pUCtPA genannt, der die codierende Sequenz von tPA und noch 5′- und 3′-nicht translatierte Bereiche enthält. Nach einer "leader"- und Prosequenz beginnt das reife Protein mit Ser(1) und endet nach Pro(527).The novel polypeptides can be genetically engineered by known methods produce. Starting point for the constructions described here is a cDNA clone, hereinafter called pUCtPA, containing the coding sequence of contains tPA and still 5 'and 3' untranslated regions. After a "leader" - and prosequence begins the mature protein with Ser (1) and ends to Pro (527).

pUCtPA wird wie folgt isoliert: Aus menschlichem Uterus-Gewebe wird mRNA isoliert und in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Nach Einsetzen dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor pUC9 wird eine cDNA-Bibliothek angelegt. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press, nachzulesen. Auch das "screening" solcher Genbanken mit radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden ist inzwischen eine vielfach verwendete und beschriebene Methode. Nach diesem Verfahren kann ein cDNA-Klon, der die kodierende Region und angrenzende Bereiche enthält, isoliert werden.pUCtPA is isolated as follows: human uterine tissue becomes mRNA isolated and transcribed into double-stranded cDNA. After insertion this cDNA into the commercially available cloning vector pUC9 created a cDNA library. The methods used are for example in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press. Also, the "screening" of such gene banks with radiolabelled Oligonucleotide probes are now widely used and described method. According to this method, a cDNA clone containing the coding region and adjacent areas.

Teile der DNA-Sequenz von PUC9tPA sind mit Hilfe von Restriktionsenzymen leicht zugänglich. Diese Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten können benutzt werden, um die DNA-Sequenzen, die für die neuen Polypeptide codieren, zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide pBR322, pUC8 oder 9, pUC18 oder 19, M13mp18 oder M13mp19 erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine ermöglichen. Die Transformation bzw. Transfektion der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben. Auch können die Hybridplasmide mit entsprechenden Signalsequenzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide ins Medium erlauben. Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die mutierte tPA-cDNA, unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promoters setzt. Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons und der Leader-/Prosequenz des tPA-Gens. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft sind z. B. die Integration und Expression des Fremdgens auf der Basis des Rinderpapillom-Virus. In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz codieren, ist der Aufbau sog. "shuttle"-Vektoren möglich. Konstruktion und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z. B. in die Maus-Fibroblastenzellinie C127. Es ist selbstverständlich, daß auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe, Insektenzellen und andere Säugerzellen, wie z. B. CHO-, L- und 293-Zellen, für die Expression verwendet werden können.Parts of the DNA sequence of PUC9tPA are using restriction enzymes easy to access. These fragments, possibly in combination with chemical synthesized oligonucleotides, adapters or gene fragments can used to identify the DNA sequences responsible for the new polypeptides encode, clone. The incorporation of gene fragments or synthetic DNA sequences in cloning vectors, e.g. As the commercial plasmids pBR322, pUC8 or 9, pUC18 or 19, M13mp18 or M13mp19 is carried out in known way. Also, the genes or gene fragments with appropriate chemically synthesized or from bacteria, phages, eukaryotic cells or whose viruses are provided with isolated control regions containing the Allow expression of the proteins. The transformation or transfection the hybrid plasmid thus obtained is in suitable host organisms also known and described in detail. Also, the hybrid plasmids be provided with appropriate signal sequences that the Allow secretion of polypeptides into the medium. When expressed in mammalian cells, one can use vectors that are too expressing gene, in this case the mutated tPA cDNA, among the Control of the mouse metallothionein or SV40 viral promoter. Necessary for expression is the presence of the methionine start codon and the leader / prosequence of the tPA gene. One then isolates clones that Copies of these vectors have been integrated as episomes or integrated into the genome. Particularly advantageous z. B. the integration and expression of Foreign gene based on the bovine papilloma virus. Combined with  prokaryotic sequences responsible for replication in bacterial cells and code antibiotic resistance, the construction is so-called "shuttle" vectors possible. Construction and propagation of the plasmid take place initially in bacterial cells; then the conversion takes place in the Eukaryotic cells, e.g. In the mouse fibroblast cell line C127. It is of course, that other cell systems, eg. Yeast, insect cells and other mammalian cells, such as. CHO, L and 293 cells for which Expression can be used.

Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu sezernieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren. So erhält der Gewebe-Plasminogenaktivator bei der Expression in Eukaryontenzellen noch Glykosidseitenketten an den Aminosäuren 117, 184 und 448 (Asn). Bakterien sind nicht in der Lage, Glycosidseitenketten zu synthetisieren. Die meisten in Bakterien exprimierten eukaryontischen Proteine, wie auch tPA und die von ihr erfindungsgemäß abgeleiteten Polypeptide, fallen in der Zelle als denaturierte Einschlußkörper an und müssen proteinchemisch renaturiert werden. Ferner sind Bakterien oft nicht in der Lage, die Initiatoraminsäure Methionin vom fertigen Protein abzuspalten. Durch die Verwendung von Sekretionssystemen können diese Schwierigkeiten umgangen werden.These eukaryotic expression systems have the advantage of being useful in are able to use their products effectively and mostly in native form secrete. They also have the ability to produce their products post-translationally modify. Thus, the tissue plasminogen activator upon expression in Eukaryotic cells or glycoside side chains at amino acids 117, 184 and 448 (Asn). Bacteria are unable to access glycoside side chains synthesize. Most eukaryotic bacteria expressed in bacteria Proteins, as well as tPA and derived from it according to the invention Polypeptides are produced in the cell as denatured inclusion bodies and must be renatured protein-chemically. Furthermore, bacteria are often not capable of initiating the methionine from the finished protein secede. By using secretion systems, these can Difficulties are avoided.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression der neuen Polypeptide zu benutzen.Due to the degeneration of the genetic code, it is also possible other DNA sequences, e.g. B. chemically synthesized genes with different Use DNA sequence for the expression of the new polypeptides.

Die Reinigung der neuen Polypeptide erfolgt durch deren Abtrennung aus dem Kulturmedium durch Affinitäts- und Ionenaustausch-Chromatographie nach bekannten Verfahren.The purification of the new polypeptides is carried out by separating them from the Culture medium by affinity and ion exchange chromatography according to known methods.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Polypeptide besitzen eine erhöhte Gerinnselspezifität, längere Halbwertzeit, verringerte Inhibitorbindung und/oder größere proteolytische Aktivität und können daher zur Thrombolyse eingesetzt werden. Sie zeigen dabei verbesserte Eigenschaften gegenüber humanem Gewebe-Plasminogenaktivator.The polypeptides obtained according to the invention have an increased Clot specificity, longer half-life, decreased inhibitor binding and / or greater proteolytic activity and therefore may cause thrombolysis be used. They contrast with improved properties human tissue plasminogen activator.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, die mindestens eines der neuen Polypeptide enthalten, ggf. in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel. Die Arzneimittel können auch Kombinationen der neuen Proteine mit anderen Fibrinolytika, wie Prourokinase, Urokinase oder Streptokinase oder deren Derivate, sowie mit anderen Pharmaproteinen, z. B. Superoxiddismutase enthalten. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen näher beschrieben.The invention therefore also pharmaceuticals, at least contain one of the novel polypeptides, optionally in a pharmaceutical compatible carrier or binder. The medicines can also Combinations of the new proteins with other fibrinolytics, such as Prourokinase, urokinase or streptokinase or their derivatives, as well as with  other pharmaceutical proteins, e.g. B. contain superoxide dismutase. Further Embodiments of the invention are closer in the following examples described.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, verwiesen.For genetic engineering methods to z. For example, refer to the manual of Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Beispiel 1example 1 Isolierung eines cDNA-Klones für humanen Gewebe-PlasminogenaktivatorIsolation of a cDNA clone for human tissue plasminogen activator

30 g tPA-produzierendes menschliches Uterus-Gewebe wurde in 6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% Sarcosyl im Ultra-Turax® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen über Nacht bei 45 000 rpm abgetrennt. Anschließend wurde die polyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Cellulose abgetrennt. Mit Hilfe des Enzyms AMV-Reverse Transcriptase und oligo(dT)12-18 als Starter wurde die polyA⁺-RNA in einsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli-DNA-Polymerase I. An die doppelsträngige cDNA wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase SalI-Linker angesetzt. Das kommerziell erhältliche Plasmid pUC9 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI linearisiert. Beide DNAs wurden miteinander ligiert und mit dem so erhaltenen Hybrid CaCl₂-behandelte, kompetente Zellen des E. coli-Stammes HB101 transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit 100 µg/ml Ampicillin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.30 g of tPA-producing human uterine tissue was in 6 M guanidinium thiocyanate, 5 mM sodium citrate (pH 7.0), 0.1 M 2-mercaptoethanol, 0.5% Sarcosyl in Ultra-Turax®. Rough cell debris were centrifuged at 3000 rpm. The RNA was purified by centrifugation separated by a 5.7 M CsCl pad overnight at 45 000 rpm. Subsequently, the polyA⁺-containing RNA fraction was purified by affinity chromatography separated on oligo (dT) -cellulose. Using the enzyme AMV reverse transcriptase and oligo (dT) 12-18 as Starter, the polyA⁺ RNA was transcribed into single-stranded cDNA. The synthesis of the second strand was carried out with E. coli DNA polymerase I. To the double-stranded cDNA were using the enzyme T4 DNA ligase SalI linker attached. The commercially available plasmid pUC9 was with linearized to the restriction enzyme SalI. Both DNAs were together ligated and with the resulting hybrid CaCl₂-treated, competent Cells of E. coli strain HB101 transformed. The cells were plated on LB plates with 100 μg / ml ampicillin and incubated overnight at 37 ° C.

Die Kolonien wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, Replika-plattiert, mit 0,5 N NaOH/1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2stündiges Backen bei 80°C fest an den Filter gebunden. Die Filter wurden in 6 × SET-Puffer (1 × SET = 0,15 M NaCl, 15 mM Tris/HCl pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1% SDS und 5 × Denhardts Lösung (100 × Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h, bei 68°C vorhybridisiert. Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden drei Oligonukleotid-Sonden, die jeweils 17 Basen der tPA-DNA umfassen, hergestellt. Sie bestehen aus folgenden Sequenzen:The colonies were transferred to nitrocellulose filters, replica-plated, lysed with 0.5 N NaOH / 1.5 M NaCl and the denatured DNA by baking for 2 hours at 80 ° C firmly attached to the filter. The filters were placed in 6x SET buffer (1 x SET = 0.15 M NaCl, 15 mM Tris / HCl pH 7.4, 1mM EDTA), 0.1% SDS and 5x Denhardt's solution (100 x Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g polyvinylpyrrolidone, 1 g BSA per 50 ml) for 4 h, prehybridized at 68 ° C. With the help of a DNA synthesizer were three oligonucleotide probes each comprising 17 bases of the tPA DNA, manufactured. They consist of the following sequences:

Diese Sonden wurden am 5′-Ende mit γ-³²P-ATP markiert. Sie wurden dann mit den vorhybridisierten Filtern in einer Lösung, die 6 × SET, 0,1% SDS, 5 × Denhardts und 10% Dextransulfat enthält, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Filter werden danach mehrfach in 6 × SET/0,1% SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einem Röntgenfilm exponiert. Klone, die beim "Screening" eine radioaktive Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet. Ein Klon, im folgenden pUCtPA genannt, enthält ein etwa 2,1 kb großes Insert, das die codierende Region, sowie 5′- und 3′-nicht-codierende Bereiche enthält (Abb. 2). Plasmid-DNA von pUCtPA wurde durch Lysozym-Aufschluß und SDS-Alkali-Behandlung der Bakterienkultur sowie anschließende CsCl-Gradientenzentrifugation präpariert.These probes were labeled at the 5 'end with γ- 32 P-ATP. They were then incubated with the prehybridized filters in a solution containing 6x SET, 0.1% SDS, 5x Denhardts and 10% dextran sulfate overnight at 42 ° C with gentle shaking. The filters are then washed several times in 6 × SET / 0.1% SDS at 42 ° C, dried and exposed to X-ray film. Clones that gave a radioactive response during screening were isolated and rescued. One clone, termed pUCtPA, contains an approximately 2.1 kb insert containing the coding region as well as 5 'and 3' non-coding regions ( Figure 2). Plasmid DNA from pUCtPA was prepared by lysozyme digestion and SDS-alkali treatment of the bacterial culture followed by CsCl gradient centrifugation.

Beispiel 2Example 2 Herstellung von einzelsträngiger tPA-kodierender DNAPreparation of single-stranded tPA-encoding DNA

Ausgangspunkt war das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pUCtPA. Es wurde präparativ mit dem Restriktionsenzym SalI geschnitten. Die erhaltenen Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das SalI-Fragment, das die tPA-kodierende DNA-Sequenz enthielt, wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. 30 ng dieses Fragmentes wurden bei 4°C mit 100 ng des SalI geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors mp19 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 µl. Die Ligation wurde durch 5minütiges Erhitzen auf 80°C beendet.The starting point was the plasmid pUCtPA described in Example 1. It was preparatively cut with the restriction enzyme SalI. The obtained Fragments were separated by gel electrophoresis. The SalI fragment, the containing the tPA-encoding DNA sequence was electrophoretically from the Gel elutes. 30 ng of this fragment were incubated at 4 ° C with 100 ng of SalI cloned, commercially available cloning vector mp19 ligated. The volume of the ligation mixture was 10 μl. The ligation was done by Heating for 5 minutes at 80 ° C ended.

1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 µl kompetenten SR 101-Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 µl 0,2 M PTG-Lösung und 120 µl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agarplatten ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich. Klone, die die tPA-cDNA enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67) wurde die Orientierung der tPA-cDNA innerhalb des Plasmids festgestellt.1/10 volume of this ligation mixture was used to transform 100 μl used competent SR 101 cells. After completion of the transformation 60 μl of 0.2 M PTG solution and 120 μl of XGal were added to the transformation mixture (20 mg / ml). This approach was used in NZYDT top agar on NZYDT agar plates plated. The medium NZYDT is commercially available. Clones which contained the tPA cDNA, could due to lack of blue coloration of Plaques are identified. Using DNA sequence analysis (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67) became the orientation of the tPA cDNA detected within the plasmid.

Das mP19 Plasmid, welches die cDNA von tPA in der Orientierung enthielt, daß bei der Bildung einzelsträngiger M13 Phagen der t-Strang der tPA cDNA-Bestandteil des Phagengenoms ist, wurde als mptPA bezeichnet.The mP19 plasmid containing the cDNA of tPA in orientation, that in the formation of single-stranded M13 phages, the t-strand of the tPA cDNA component of the phage genome was called mptPA.

Werden nun Bakterien des Stammes SR 101 oder davon abgeleitete Zellen mit dem Plasmid mptPA transformiert, so werden bei der Vermehrung dieser Zellen einzelsträngige Bakteriophagen in das Medium entlassen, die den t-Strang der tPA-cDNA enthalten. Die einzelsträngige DNA kann dann mit herkömmlichen und vielfach beschriebenen Methoden isoliert werden.Become now bacteria of the strain SR 101 or derived cells with the plasmid mptPA transformed, so in the propagation of this Let cells release single-stranded bacteriophages into the medium containing the  t-strand of tPA cDNA included. The single-stranded DNA can then with conventional and widely described methods are isolated.

Im übrigen wurden, falls nicht besonders beschrieben, die Empfehlungen der Hersteller der Enzyme und Plasmide für die Enzymspaltung und Isolierung der Plasmide befolgt.Moreover, unless specifically described, the recommendations of Producer of enzymes and plasmids for enzyme cleavage and isolation followed the plasmids.

Beispiel 3Example 3 Einführung von Substitutionen in die cDNA von tPAIntroduction of substitutions into the cDNA of tPA

Im folgenden werden Substitutionen beschrieben, die alle bewirken, daß nach Expression der substituierten cDNA das Aminosäuremotiv RGD einmal oder mehrmals an unterschiedlichen Stellen des Polypeptids tPA enthalten ist. All diese Polypeptide haben eine Länge von 527 Aminosäuren. Ausgangspunkt für die Substitutionen war das in Beispiel 2 beschriebene mptPA.In the following, substitutions are described which all cause after expression of the substituted cDNA, the amino acid motif RGD once or several times at different locations of the polypeptide tPA is. All of these polypeptides are 527 amino acids in length. starting point for the substitutions, the mptPA described in Example 2 was.

0,04 µmol der einzelsträngigen mptPA wurden mit 0,5 µmol eines Oligonukleotids (21-27mer), dessen Sequenz bis auf 1-3 Basenaustausche dem zu verändernden Bereich der mptPA DNA komplementär war, umgesetzt. Das Oligonukleotid wurde vorher mit Hilfe der T₄ Polynukleotidkinase phosphoryliert. Ein typischer Mutagenisierungsansatz sah wie folgt aus:0.04 μmol of the single-stranded mptPA were mixed with 0.5 μmol of an oligonucleotide (21-27mer), whose sequence except for 1-3 base exchanges to transformed region of the mptPA DNA was complementary. The oligonucleotide was previously phosphorylated with the help of T₄ polynucleotide kinase. A typical mutagenization approach was as follows:

einzelsträngige mptPA DNAsingle-stranded mptPA DNA 1 µl (0,04 µmol)1 μl (0.04 μmol) kinasiertes Oligonukleotid (inklusive ATP aus Kinasierungsreaktion)kinased oligonucleotide (including ATP from kinase reaction) 1 µl (0,5 µmol)1 μl (0.5 μmol) 10 × Ligase-Puffer10 × ligase buffer 5 µl5 μl 1 mM dNTPs1mM dNTPs 2,5 µl (50 µM Endkonzentration)2.5 μl (50 μM final concentration) 1 mM ATP1 mM ATP 4 µl (100 µM Endkonzentration)4 μl (100 μM final concentration) H₂OH₂O 36,5 µl36.5 μl

Der Mutagenisierungsansatz wurde 15 min bei 37°C inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und schließlich mit 1 Einheit Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 Einheiten T₄-Ligase (Biolabs) zugegeben. Der Ansatz wurde danach 16 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 5 µl dieses Ansatzes zur Transformation von Komponenten SR 101-Zellen verwendet. Die daraus resultierenden Phagen-Plaques wurden auf Nitrozellulose übertragen. Danach wurden die Filter 5 min in 5XSSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 h bei 80°C "gebacken". Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Waschen der Filter erfolgte bei 6 × SET/0,1% SDS bei einer Temperatur von 55-65°C in Abhängigkeit von der Basenzusammensetzung und Länge der verwendeten Oligonukleotid-Hybridisierungsprobe. Hybridisiert wurde jeweils mit dem Oligonukleotid, das in dem entsprechenden Mutagenisierungsansatz eingesetzt wurde. Positive Klone wurden autoradiographisch sichtbar gemacht. Positive Klone wichen in 1-3 Positionen von der mptPA-Sequenz ab. Diese Substitutionen bewirkten, daß die in mp18 enthaltene tPA-cDNA nun für ein Polypeptid kodiert, das an einer oder mehreren Stellen das Aminosäuremotiv RGD enthält, wobei die Gesamtzahl der Aminosäuren dieser Polypeptide jeweils 527 ist.The mutagenization mixture was incubated at 37 ° C for 15 minutes, then at room temperature cooled and finally with 1 unit Klenow fragment (Boehringer Mannheim). After one hour incubation at room temperature 200 units of T₄ ligase (Biolabs) were added. The approach was then incubated at 4 ° C for 16 h. Subsequently, 5 μl of this Approach to the transformation of components SR 101 cells used. The resulting phage plaques were transferred to nitrocellulose. Thereafter, the filters were washed in 5XSSC for 5 minutes, dried in air and "baked" at 80 ° C for 2 h. Prehybridization and hybridization were carried out as described in Example 1. Washing the filters was carried out at 6 × SET / 0.1% SDS at a temperature of 55-65 ° C depending from the base composition and length of the oligonucleotide hybridization probe used.  Hybridization was carried out in each case with the oligonucleotide, used in the corresponding Mutagenisierungsansatz has been. Positive clones were visualized autoradiographically. positive Clones diverged from the mptPA sequence in 1-3 positions. These Substitutions caused that contained in mp18 tPA cDNA now for a Polypeptide encoded at one or more sites the amino acid motif RGD contains, where the total number of amino acids of these polypeptides each is 527.

Beispiel 3.1Example 3.1

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ TCTGCGTTTTATCACCTCTGCAGAT 3′5 'TCTGCGTTTTATCACCTCTGCAGAT 3'

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD1 bezeichnet.The washing temperature was 60 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD1.

Beispiel 3.2Example 3.2

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ CCACCCGGCTCGCCTCTGAGCACA 3′5 'CCACCCGGCTCGCCTCTGAGCACA 3'

Die Waschtemperatur betrug 62°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD2 bezeichnet.The washing temperature was 62 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD2.

Beispiel 3.3Example 3.3

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ ACCAGCAATAATCCCCCCGGTTGCT 3′5 'ACCAGCAATAATCCCCCCGGTTGCT 3'

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD3 bezeichnet. The washing temperature was 60 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD3.  

Beispiel 3.4Example 3.4

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ CTGTGCTCCAATCGCCCCTGTAGC 3′5 'CTGTGCTCCAATCGCCCCTGTAGC 3'

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD4 bezeichnet.The washing temperature was 60 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD4.

Beispiel 3.5Example 3.5

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GGTGCACTCGTCGCCTCTCTCCGCTG 3′5 'GGTGCACTCGTCGCCTCTCTCCGCTG 3'

Die Waschtemperatur betrug 64°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD5 bezeichnet.The washing temperature was 64 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD5.

Beispiel 3.6Example 3.6

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GATGCCGTCTCCCCTCCGCCCGC 3′5 'GATGCCGTCTCCCCTCCGCCCGC 3'

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD6 bezeichnet.The washing temperature was 60 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD6.

Beispiel 3.7Example 3.7

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ CAGGAACCGATCTCCGCGCGACCTCC 3′5 'CAGGAACCGATCTCCGCGCGACCTCC 3'

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD7 bezeichnet. The washing temperature was 65 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD7.  

Beispiel 3.8Example 3.8

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GATGAGTATGTCCCCGCGCAGGAACCG 3′5 'GATGAGTATGTCCCCGCGCAGGAACCG 3'

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD8 bezeichnet.The washing temperature was 65 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD8.

Beispiel 3.9Example 3.9

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ TCGCCAGGGTCCCCCCGGTATGTTCT 3′5 'TCGCCAGGGTCCCCCCGGTATGTTCT 3'

Die Waschtemperatur betrug 63°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD9 bezeichnet.The washing temperature was 63 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD9.

Beispiel 3.10Example 3.10

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GCTCTCCTGGTCACCGCGGGACGAA 3′5 'GCTCTCCTGGTCACCGCGGGACGAA 3'

Die Waschtemperatur betrug 61°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD10 bezeichnet.The washing temperature was 61 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD10.

Beispiel 3.11Example 3.11

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GCTGCAGGTCCCCCCGGGGAAGGCA 3′5 'GCTGCAGGTCCCCCCGGGGAAGGCA 3'

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD11 bezeichnet. The washing temperature was 65 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD11.  

Beispiel 3.12Example 3.12

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ AGTGTCTCCATTACACAGCATG 3′5 'AGTGTCTCCATTACACAGCATG 3'

Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD12 bezeichnet.The washing temperature was 55 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD12.

Beispiel 3.13Example 3.13

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ TGGGGCCCGTCGCCCCGAGTGTC 3′5 'TGGGGCCCGTCGCCCCGAGTGTC 3'

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD13 bezeichnet.The washing temperature was 60 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD13.

Beispiel 3.14Example 3.14

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ CGAATCGCCCCGGCAGGCGTC 3′5 'CGAATCGCCCCGGCAGGCGTC 3'

Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD14 bezeichnet.The washing temperature was 55 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD14.

Beispiel 3.15Example 3.15

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:For mutagenization, as described in Example 3, an oligonucleotide was used used with the following sequence:

5′ GGTCGCATGTCGCCACGAATCCAG 3′5 'GGTCGCATGTCGCCACGAATCCAG 3'

Die Waschtemperatur betrug 58°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD15 bezeichnet. The washing temperature was 58 ° C in 6 x SET / 0.1% SDS. The resulting positive clones were designated as mptPA-RGD15.  

Beispiel 4Example 4 Konstruktion von Vektoren für die Expression der modifizierten tPA-DNAConstruction of vectors for the expression of the modified tPA DNA

DNA des Affenvirus SV40 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und BclI geschnitten und das 0,24 kb-Fragment gelelektrophoretisch präpariert (Abb. 5). Die Enden wurden in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP mit dem Klenow-Fragment der DNA-PolymeraseI aufgefüllt. Anschließend wurden XhoI-Linker anligiert.Monkey virus SV40 DNA was cut with the restriction enzymes BamHI and BclI, and the 0.24 kb fragment was gel electrophoretically prepared ( FIG. 5). The ends were filled in with the Klenow fragment of DNA polymerase I in the presence of the four deoxynucleotide triphosphates dATP, dCTP, dGTP and dTTP. Subsequently, XhoI linkers were ligated.

Parallel wurde der kommerziell erhältliche Vektor pUC18 mit dem Enzym SmaI linearisiert. Dann wurden ebenfalls XhoI-Linker angesetzt. DNA dieses Vektors ("pUC18Xho") wurde mit XhoI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem 0,24 kb XhoI-SV40-Fragment (s. o.) ligiert. Es entstand pSVpA. pSVpA-DNA wurde präparativ mit XhoI gespalten und wie oben mit Klenow-Polymerase in Gegenwart der vier dNTPs inkubiert. Das 0,24 kb-Fragment wurde Gel-isoliert. Gleichzeitig wurde der Eukaryonten-Expressionsvektor CL28XhoBPV, entstanden durch Ligation von CL28X und pB2-2 (nach Reddy et al., 1987, DNA 6, 461-72), partiell mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten, d. h. es wurde zeitlich derart limitiert inkubiert, daß Moleküle entstanden, die nur an einer der beiden XbaI-Erkennungssequenzen gespalten, also linearisiert sind (Abb. 6). Der Ansatz wurde dann wie beschrieben mit Klenow-Polymerase und dNTPs umgesetzt. Die linearen Moleküle wurden anschließend durch Gelelektrophorese isoliert.In parallel, the commercially available vector pUC18 was linearized with the enzyme SmaI. Then XhoI linkers were also set up. DNA of this vector ("pUC18Xho") was linearized with XhoI, treated with alkaline phosphatase and ligated with the 0.24 kb XhoI-SV40 fragment (see above). It was pSVpA. pSVpA DNA was preparatively digested with XhoI and incubated as above with Klenow polymerase in the presence of the four dNTPs. The 0.24 kb fragment was gel isolated. At the same time, the eukaryotic expression vector CL28XhoBPV, produced by ligation of CL28X and pB2-2 (according to Reddy et al., 1987, DNA 6, 461-72), was partially cut with the restriction enzyme XbaI, ie it was incubated in a time limited manner such that Molecules were formed that are only cleaved at one of the two XbaI recognition sequences, ie linearized ( Figure 6). The batch was then reacted as described with Klenow polymerase and dNTPs. The linear molecules were subsequently isolated by gel electrophoresis.

Es erfolgte dann die Ligation der linearen pCL28XhoBPV-Fragmente mit dem vorbehandelten 0,24 kb-Fragment aus SV40. Nach Transformation und Screening von Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der das SV40-Fragment in der etwa 0,15 kb 3′-wärts der XhoI-Stelle gelegenen vormaligen XbaI-Stelle trug; diese DNA ("pCL28XhoBPV-SVpolyA") trug die SV40-Transkriptionsstopsignale der "frühen" Gene.Ligation of the linear pCL28XhoBPV fragments with the pretreated 0.24 kb fragment from SV40. After transformation and Screening of minilysates, a clone was isolated that contains the SV40 fragment in the approximately 0.15 kb 3'-wards of the former XhoI site XbaI site wore; this DNA ("pCL28XhoBPV-SVpolyA") carried the SV40 transcriptional stop signals of the "early" genes.

Plasmid-DNA von pCL28XhoBPV-SVpolyA wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Gleichzeitig wurde mptPARGD1-15 mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und das 2,1 kb große Fragment isoliert. Beide Fragmente wurden mittels T4-Ligase miteinander verbunden. Nach Transformation und Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der die mutierte tPA-DNA einfach und in der korrekten Orientierung enthielt: pCL28BPV-tPA-RGD1-15. Plasmid DNA from pCL28XhoBPV-SVpolyA was digested with the restriction enzyme XhoI linearized and treated with alkaline phosphatase. At the same time was mptPARGD1-15 was cleaved with the restriction enzyme SalI and 2.1 kb in size Fragment isolated. Both fragments were ligated together by T4 ligase connected. After transformation and minilysates a clone was isolated, render the mutant tPA DNA simple and in the correct orientation contained: pCL28BPV-tPA-RGD1-15.  

Beispiel 5Example 5 Transfektion und Etablierung von ZellinienTransfection and establishment of cell lines

C127I-Zellen (J. Virol. 26 (1978), 292; ATCC catalogue of cell lines and hybridomas 5th edition, 1985, p 142) wurden mit BPV-Expressionsplasmiden transfiziert mit der Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode (Virology 52 (1973)/456, DNA cloning; volume II; ed. D. M. Glover IRL Press, Seiten 143 ff. und 213 (1985)). 5×10⁵ C127I-Zellen wurden in DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) + 10% FCS (Foetales Kalbsserum) in 60 mm Petrischalen eingesät. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt auf MEM (Modified Eagles Medium) mit 25 mM Hepes + 10% FCS. Mit 10 µg CsCl-gereinigter Plasmid DNA wurde ein Ca-Phosphat-Copräzipitat gebildet, welches vorsichtig auf die C127I-Zellen aufgebracht wurde. Die Zellen wurden 4 h bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Durch eine anschließende Glycerin-Schock-Behandlung wurde die Effizienz der Transfektion erheblich gesteigert. Hierzu wurde 4 h nach Aufbringen des Präzipitates das Medium von den Zellen abgezogen. Die Zellen wurden 3 min mit je 2 ml 15% Glycerin/HBS (DNA cloning Vol. II, Seite 152) pro 60 mm Petrischale bei Raumtemperatur inkubiert. Die Glycerin/HBS-Lösung wurde abgezogen, der Zellrasen mit 3 ml DMEM + 10% FCS gewaschen. Die Zellen wurden mit DMEM + 10% FCS bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Dreimal in der Woche wurde das DMEM + 10% FCS abgezogen und durch frisches ersetzt. Nach 2-3 Wochen waren transfizierte Zellen, die das BPV-Genom enthalten, als Ansammlungen transformierte Zellen, sogenannte Foci, zu erkennen. Foci, die die oben beschriebenen tPA-Muteine exprimieren, wurden durch einen Casein-Agar-Overlay (siehe unten) identifiziert. Nach 2-3 h Inkubation bei 37°C; 7% CO₂ waren im trüben Casein-Agar Lysehöfe an den Stellen zu erkennen, an denen sich tPA-exprimierende Zellen befinden. Nach Entfernen des Casein-Agar wurden die sich an diesen Stellen befindenden Zellen nach der "cloning-cylinder"-Methode isoliert (DNA cloning Vol. II, S. 220). Die erhaltenen Zellinien wurden anschließend mit Standardmethoden in DMEM + 10% FCS hochgezüchtet.C127I cells (J. Virol., 26 (1978), 292; ATCC catalog of cell lines and hybridomas 5th edition, 1985, p 142) were probed with BPV expression plasmids transfected with the calcium phosphate coprecipitation method (Virology 52 (1973) / 456, DNA cloning; volume II; ed. D.M. Glover IRL Press, Pages 143 ff. And 213 (1985)). 5 x 10⁵ C127I cells were grown in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) + 10% FCS (Fetal Calf Serum) sown in 60 mm Petri dishes. The next Day, the medium was changed to MEM (Modified Eagles Medium) at 25 mM Hepes + 10% FCS. With 10 ug CsCl-purified plasmid DNA was a Ca-phosphate coprecipitate formed, which was careful on the C127I cells was applied. The cells were kept at 37 ° C for 4 h; 7% CO₂ incubated. By subsequent glycerol shock treatment was the efficiency the transfection increased significantly. This was done 4 h after application of the precipitate, the medium is withdrawn from the cells. The cells were 3 min each with 2 ml of 15% glycerol / HBS (DNA cloning Vol. II, page 152) per 60 mm Petri dish incubated at room temperature. The glycerol / HBS solution was stripped, the cell lawn washed with 3 ml of DMEM + 10% FCS. The Cells were incubated with DMEM + 10% FCS at 37 ° C; 7% CO₂ incubated. Three times a week, the DMEM + 10% FCS was subtracted and through fresh replaced. After 2-3 weeks, transfected cells were the BPV genome contain, as accumulations transformed cells, so-called Foci, to recognize. Foci expressing the tPA muteins described above were performed identified a casein agar overlay (see below). After 2-3 h Incubation at 37 ° C; 7% CO₂ were in the murky casein agar Lysehöfe to the To recognize sites where tPA-expressing cells are located. To The casein agar was removed at those locations Cells isolated by the cloning-cylinder method (DNA cloning Vol. II, P. 220). The obtained cell lines were subsequently treated with standard methods raised in DMEM + 10% FCS.

Zur Produktion wurden die Zellinien nach Erreichen der Konfluenz in serumfreiem DMEM gehalten. Das tPA-Mutein aus dem so erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand kann nun charakterisiert und aufgereinigt werden. For production, the cell lines were after reaching confluence in kept serum-free DMEM. The tPA mutein from the thus obtained serum-free Cell culture supernatant can now be characterized and purified become.  

Für den oben erwähnten Agar-Overlay-Test werden folgende Lösungen benötigt:For the above-mentioned agar overlay test, the following solutions needed:

Overlay-AgaroseOverlay agarose

• 1) 8% Magermilchlösung in H₂O werden 30 min bei 100°C gekocht und anschließend im 37°C Wasserbad abgekühlt.1) 8% skimmed milk in H₂O be cooked for 30 min at 100 ° C and then cooled in a 37 ° C water bath.
• 2) eine 2%ige Lösung von Low-melting Agarose in PBS wird nach Autoklavieren im 37°C Wasserbad abgekühlt. Anschließend wird im Verhältnis 1 : 1 doppelt konzentriertes DMEM zugegeben.2) A 2% solution of low-melting agarose in PBS will after Autoclave cooled in 37 ° C water bath. Subsequently, in the Ratio 1: 1 double concentrated DMEM added.
• 3) 0,64 mg Plasminogen wird in 1 ml H₂O gelöst. Durch Zusammenpipettieren von 16 ml Lösung 2, 4 ml Lösung 1 und 0,4 ml Plasminogen wird die Overlay-Agarose hergestellt. Diese wird nach Mischen im 37°C Wasserbad gehalten.3) 0.64 mg plasminogen is dissolved in 1 ml H₂O. By pipetting together of 16 ml of solution 2, 4 ml of solution 1 and 0.4 ml of plasminogen is the Overlay agarose made. This is after mixing in a 37 ° C water bath held.

Zur Durchführung des Tests werden die Zellen in 60 mm Petrischalen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen. Anschließend werden je 2 ml "Overlay-Agarose" vorsichtig in die Petrischalen pipettiert. Die Petrischalen werden zum Abkühlen und Erstarren der Agarose bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird 2-3 h im Brutschrank bei 37°C unter Zugabe von 7% CO₂ inkubiert und die Größe und Anzahl der Lysehöfe bestimmt.To perform the assay, the cells are plated in 60 mm Petri dishes twice washed with serum-free medium. Then 2 ml each of "overlay agarose" Carefully pipetted into the Petri dishes. The Petri dishes are allowed to cool and solidify the agarose at room temperature. Then 2-3 h in the incubator at 37 ° C with the addition of Incubated 7% CO₂ and determines the size and number of lysis.

Beispiel 6Example 6 Isolierung eines neuen PolypeptidsIsolation of a new polypeptide

Aus dem gemäß Beispiel 5 erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand wurde das tPA-Mutein nach Sterilfiltration und Zugabe von 0,01% ®Tween 80 durch eine Affinitätschromatographie an Erythrina-Trypsin-Inhibitor-Sepharose (ETI-Sepharose, 1 cm×3 cm) isoliert. Zur Herstellung der Affinitätsmatrix wurden 5 mg ETI an 1 ml CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt. Das Gelmaterial wurde vor dem Auftragen des Zellüberstands mit 20 mM Na-Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,01% ®Tween 80, pH 7,0 äquilibriert. Nach dem Auftragen wurde das Gelmaterial mit demselben Puffer behandelt, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Desorption des spezifisch gebundenen Muteins erfolgte anschließend durch Elution mit 0,1 M Glycin, 0,1 M Arginin/HCl, 0,01% ®Tween 80, pH 3,0. Das Eluat wurde vereinigt und mit 0,1 M Natronlauge auf pH 5,0 eingestellt. From the serum-free cell culture supernatant obtained according to Example 5 was the tPA mutein after sterile filtration and 0.01% ®Tween 80 added an affinity chromatography on Erythrina trypsin inhibitor Sepharose (ETI Sepharose, 1 cm × 3 cm) isolated. For the preparation of the affinity matrix 5 mg ETI were coupled to 1 ml CNBr-activated Sepharose 4B. The Gel material was 20 mM prior to application of the cell supernatant Na phosphate, 0.15M NaCl, 0.01% ® Tween 80, pH 7.0 equilibrated. After this Applying the gel material was treated with the same buffer to Unspecifically bound material to remove. The desorption of the specifically bound mutein was subsequently eluted with 0.1 M glycine, 0.1 M arginine / HCl, 0.01% ® Tween 80, pH 3.0. The eluate was combined and adjusted to pH 5.0 with 0.1 M sodium hydroxide solution.  

Beispiel 7Example 7 Charakterisierung des Oligosaccharid-AnteilsCharacterization of the oligosaccharide content

5-10 µg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Muteins wurden durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Nach dem Absättigen mit PBS-Puffer (2 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4), der 0,1% ®Tween 20, pH 7,4 enthielt, wurde die Membran 2 h mit an Peroxidase gekoppeltem Lektin von Griffonia Simplicifolia inkubiert. Nach dem Entfernen ungebundenen Materials mit Hilfe von TBS-Puffer (10 mM Tris, 150 mM CaCl, pH 7,4) wurde die Nitrozellulose 5-10 min in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02% H₂O₂ und 0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol inkubiert. Positive Reaktionen wurden durch Blaufärbung der Proteinbande innerhalb von 5 min sichtbar. Die Reaktion wurde dann durch Transferieren der Nitrozellulose-Membran in Wasser gestoppt.5-10 μg of the mutein obtained in Example 6 were analyzed by SDS gel electrophoresis separated and then on nitrocellulose membranes transferred. After saturation with PBS buffer (2 mM phosphate, 150mM NaCl, pH 7.4) containing 0.1% ® Tween 20, pH 7.4 became Membrane 2 h with peroxidase-coupled lectin from Griffonia Simplicifolia incubated. After removing unbound material with Help from TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM CaCl, pH 7.4) was added Nitrocellulose 5-10 min in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.02% H₂O₂ and 0.5 mg / ml 4-chloro-1-naphthol incubated. Positive reactions were due Blue staining of the protein band visible within 5 min. The reaction was then transferred by transferring the nitrocellulose membrane into water stopped.

Die Oligosaccharid-Reste enthalten α-gebundene Galaktose-Reste, die gemäß Abb. 8 mit β-gebundenen subterminalen Galaktose-Resten verknüpft sind. Dabei sind die α-Galaktose-Reste bevorzugt an der Galaktose 6′ (Numerierung der Zuckerreste siehe Abb. 8) lokalisiert. Die anderen subterminalen Galaktose-Reste sind entweder durch Sialinsäure oder weitere α-gebundene Galaktose substituiert.The oligosaccharide residues contain α- bound galactose residues, which are linked to β -linked sub-terminal galactose residues as shown in FIG . The α -galactose residues are preferably located on the galactose 6 ' (numbering of the sugar residues, see FIG. 8). The other subterminal galactose residues are substituted by either sialic acid or other α- linked galactose.

Claims (6)

1. tPA-ähnliche Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Aminosäuresequenz des tPA aufweisen, worin 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, sowie deren Allelvarianten.1. tPA-like polypeptides, characterized in that they have the amino acid sequence of the tPA, wherein 1-6 tripeptides are replaced by the tripeptide RGD, as well as their allelic variants. 2. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.2. DNA sequences coding for the polypeptides according to claim 1. 3. Vektoren, die Gensequenzen enthalten, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.3. Vectors containing gene sequences coding for the polypeptides according to Claim 1 encode. 4. Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Peptidsequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wirtsorganismus ein Gen zur Expression bringt, das für die Peptidsequenzen nach Anspruch 1 kodiert.4. Genetic engineering process for the preparation of peptide sequences according to Claim 1, characterized in that in a host organism brings a gene for expression, according to the peptide sequences after Claim 1 encoded. 5. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel.5. A pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide according to claim 1, optionally in a pharmaceutically acceptable carrier or Binder. 6. Arzneimittel nach Anspruch 5, enthaltend die Kombination aus mindestens einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 und einem anderen Fibrinolytikum.6. Medicament according to claim 5, containing the combination of at least one polypeptide according to claim 1 and another Fibrinolytic.