DE3821676A1 - Use of avaron or avaron derivatives in combination with 3'-azido-3'-deoxythymidine for antiviral therapy - Google Patents

Abstract

The invention relates to the use of avaron or derivatives thereof in combination with 3'-azido-3'-deoxythymidine for controlling both AIDS and AIDS-related complex (ARC) as well as adult T-cell leukaemia.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit 3′-Azido-3′-desoxythymidin als antivirale Agenzien speziell bei der Bekämpfung von AIDS bzw. ARC und/oder ATL.The invention relates to the use of Avaron or its Derivatives in combination with 3'-azido-3'-deoxythymidine as antiviral agents especially in the fight against AIDS or ARC and / or ATL.

Avaron und dessen Derivat Avarol sind Naturprodukte. In der DE- OS 34 27 383 ist beschrieben, daß Avaron und Avarol und deren Derivate antitumorale, antibakterielle und antimycotische Eigenschaften besitzen, die sie vor allem zur Behandlung von Krebs- und Infektionskrankheiten geeignet erscheinen lassen. Außerdem ist dort beschrieben, daß diese Verbindungen gegenüber Herpes-simplex-Viruskulturen, also gegen DNA-Viren, in vitro eine gewisse virostatische Wirkung haben. In der DE- OS 36 19 202 wurde beschrieben, daß die genannten Substanzen die Vermehrung der Human Immunodeficiency Virus (HIV) in vitro hemmen. In einer weiteren Schrift DE-OS 36 19 201 wurde niedergelegt, daß auch die Vermehrung der Human-T-Cell- Lymphotropic Viren vom Typ (HTLV-I durch die genannten Substanzen in vitro gehemmt werden. Sowohl HIV-1 als auch HTLV-I sind RNA-Viren.Avaron and its derivative Avarol are natural products. In the DE OS 34 27 383 describes that Avaron and Avarol and their Derivatives antitumoral, antibacterial and antimycotic Possess properties that they are mainly used to treat Cancer and infectious diseases appear appropriate. In addition, there is described that these compounds against herpes simplex virus cultures, ie against DNA viruses, have a certain virostatic effect in vitro. In the DE OS 36 19 202 has been described that the substances mentioned the proliferation of human immunodeficiency virus (HIV) in vitro inhibit. In another document DE-OS 36 19 201 was that the proliferation of human T-cell Lymphotropic viruses of the type (HTLV-I by the named Substances are inhibited in vitro. Both HIV-1 and HTLV-I are RNA viruses.

Das Nukleosid-Analogen 3′-Azido-3′-desoxythymidin (ab jetzt abgekürzt AZT) ist bereits seit 1978 bekannt (T. S. Lin und W. H. Prusoff, J. Med. Chem. 21: 109, 1978). Seine antivirale Aktivität gegen tumor-bewirkende menschliche RNA-Viren - wie HIV-1 - ist seit der Publikation von H. Mitsuya et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7096, 1985) erwiesen und in der EPO Schrift 019 6185 hinterlegt. The nucleoside analog 3'-azido-3'-deoxythymidine (from now abbreviated AZT) has been known since 1978 (T.S. Lin and W.H. Prusoff, J. Med. Chem. 21: 109, 1978). His antiviral Activity against tumor-causing human RNA viruses - such as HIV-1 - has been known since the publication of H. Mitsuya et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7096, 1985) and in the EPO Font 019 6185 deposited.  

Es wird nun durch in virtro Untersuchungen belegt, daß eine Kombination von Avaron oder dessen Derivaten mit AZT einen potenzierenden antiviralen Effekt sowohl gegen HIV-1 als auch gegen HTLV-I zeigen. Diese Eigenschaften waren bisher unbekannt. Die nun beschriebene Erfindung läßt den Einsatz von Avaron oder dessen Derivate in Kombination mit AZT bei der Behandlung der Immunschwäche AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) oder ARC (AIDS-related Complex) als auch bei ATL (adulter T-Zell-Leukämie) als sinnvoll erscheinen.It is now proved by virtro investigations that a Combination of Avarone or its Derivatives with AZT One potentiating antiviral effect against both HIV-1 and against HTLV-I show. These properties have been so far unknown. The invention now described allows the use of Avaron or its derivatives in combination with AZT in the Treatment of Immunodeficiency AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) or ARC (AIDS-related complex) as well as ATL (adult T-cell leukemia) seem to make sense.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS bzw. ARC als auch von ATL mit Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit AZT aufzuzeigen.The invention is based on the object, a promising way to fight AIDS or ARC as also from ATL with Avaron or its derivatives in combination to show with AZT.

AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), oder auch genannt Human-T-Cell Leukemia/Lymphtropic Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) verursacht. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS in Form des Kaposi-Sacroms (KS) oder des ARC sich klinisch am schwersten manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nicht möglich.AIDS is caused by the Human Immunodeficiency Virus (HIV), or also called human T-cell leukemia / lymphtropic virus type III (HTLV-III) or Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) caused. HIV belongs to the type of RNA virus. The virus attack is the main cause of a spectrum of immunological Disorders of which AIDS in the form of Kaposi-Sacroms (KS) or of the ARC is clinically most difficult to manifest. A effective therapeutic treatment of AIDS or ARC was up not possible yet.

Die adulte T-Zell-Leukämie (ATL)/Lymphom-Erkrankung wird durch den Befall von T-Zellen durch das Human-T-Cell-Lymphotroppic Virus von Typ I (HTLV-I) verursacht. ATL ist endemisch im Südwesten Japans, in der Karibik und in Zentralafrika. Adult T-cell leukemia (ATL) / lymphoma disease is caused by infestation of T cells by human T-cell lymphotropic Virus of type I (HTLV-I) causes. ATL is endemic in the Southwestern Japan, the Caribbean and Central Africa.  

Beispielsweise in Japan sind 10 bis 15% der Erwachsenen mit HTLV-I infiziert, wobei jedes Jahr 100 bis 200 Personen an adulter T-Zell-Leukämie erkranken, von denen mehr als die Hälfte innerhalb eines Jahres sterben. Eine wirksame Behandlung der adulten T-Tell-Leukämie war bisher noch nicht möglich.For example, in Japan, 10 to 15% of adults are using HTLV-I infects, with every year 100 to 200 people adult T-cell leukemia, of which more than the Half die within a year. An effective Treatment of adult T-Tell leukemia has not been done yet possible.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine Kombination von Avaron oder dessen Derivaten mit AZT besser als eine Monotherapie mit einer der genannten Substanzen zur Bekämpfung von AIDS oder des ARC bzw. ATL geeignet ist. Basis dieser Erfindung ist der Nachweis, daß Avaron oder dessen Derivate in Kombination mit AZT (1) eine synergistischen anti-HIV-Effekt und (2) einen synergistischen HTLV-I-Effekt bewirken.Surprisingly, it has now been found that a combination of Avarone or its derivatives with AZT is better than a monotherapy with one of the said substances for controlling AIDS or ARC or ATL is suitable. The basis of this invention is the demonstration that Avaron or its derivatives in combination with AZT (1) cause a synergistic anti-HIV effect and (2) a synergistic HTLV-I effect.

Die erfindungsmäßig zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und systemisch also oral, rektal oder parenteral (intramuskulär, intravenös und subkutan), verabreicht werden können.The erfindungsmäßig coming into use compounds are generally processed into pharmaceutical agents, which are present as dosage units and thus systemically oral, rectally or parenterally (intramuscular, intravenous and subcutaneously).

Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung oder Verbesserung von AIDS oder ARC bzw. ATL wirksame Menge an Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit AZT, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% von Avaron oder dessen Derivaten und 0,5 bis 98 Gew.-% von AZT zusammen mit einem pharmazeutischen Träger. The funds include a treatment, elimination, Alleviation or improvement of AIDS or ARC or ATL effective amount of Avarone or its derivatives in combination with AZT, optionally together with a pharmaceutical compatible carriers and excipients. For example contain such pharmaceutical agents 0.5 to 98 wt .-% of Avarone or its derivatives and 0.5 to 98% by weight of AZT together with a pharmaceutical carrier.  

Wenn die Mittel in einer Form einer Dosiseinheit vorliegen, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Answendung kommenden Verbindung Avaron oder dessen Derivaten und AZT.If the means are in the form of a unit dose, this preferably contains 50 to 500 mg of the invention to the application coming compound Avaron or its Derivatives and AZT.

Die pharmazeutischen Mittel können zur oralen Verabreichung in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, oder in flüssiger Form, beispielsweise als wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Lösung oder mit Flüssigkeit gefüllte Kapseln vorliegen.The pharmaceutical agents may be for oral administration in solid form, for example as tablets, lozenges, capsules, Powder, or in liquid form, for example as an aqueous or oily suspension, syrup, elixir, solution or with Liquid filled capsules are present.

Avaron oder dessen Derivate sollten mit AZT entweder gleichzeitig oder sequentiell angewandt werden, abhängig von der Schwere der Krankheit.Avaron or its derivatives should be used with AZT either simultaneously or sequentially on the severity of the disease.

Bevorzugte orale Mittel liegen in der Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Träger, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidion), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kartoffelstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol oder Siliciumoxid), Disintegrationsmittel (z. B. Stärke) und Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), enthalten.Preferred oral agents are in the form of tablets or Capsules before and can conventional carriers, such as binders (eg. Syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or Polyvinylpyrrolidione), fillers (eg lactose, sugar, Corn starch, potato starch, calcium phosphate, sorbitol or Glycine), lubricants (e.g., magnesium stearate, talc, Polyethylene glycol or silica), disintegrating agents (eg starch) and wetting agents (eg sodium lauryl sulphate), contain.

Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.Means for parenteral administration are generally in Form of a solution or suspension of the invention for Application coming connection together with usual pharmaceutical carriers, for example in the form of a aqueous solution for intravenous injection or oily Suspension for intramuscular injection. For parenteral Administration suitable agents are obtained by adding 0.1 to 10 wt .-% of the compound of the invention in water or  a support made of an aliphatic polyalcohol, such as Glycerol, propylene glycol or polyethylene glycols or a Mixture consists of dissolves. The polyethylene glycols exist from a mixture of non-volatile, usually liquid Polyethylene glycols, both in water and in organic liquids are soluble and their Molecular weights ranging from 200 to 1500.

Pharmazeutische Mittel zur rektalen Verabreichung liegen in Form von Suppositorien vor, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen einer geeigneten Suppositoriengrundlage, wie Kakaobutter, gehärtete Fette, Polywachse oder Polyethylenglykole, in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% einverleibt sind.Pharmaceutical agents for rectal administration are in Form of suppositories, wherein the inventive Compounds of a suitable suppository base, such as Cocoa butter, hydrogenated fats, poly waxes or Polyethylene glycols, in an amount of 1 to 10% by weight are incorporated.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt an Hand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Tablettieren, Einverleiben der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in eine Suppositoreingrundlage, Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Benzylalkohol oder Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH.The preparation of the pharmaceutical agent is done by hand conventional method, for example by tableting, Incorporation of the present invention used Compounds in a suppository base, sterile filtration and filling in ampoules or dropper bottles of a solution of in accordance with the invention for use in compounds Injection water together with usual additives, such as Sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, disodium EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt), benzyl alcohol or sodium hydroxide to adjust the pH.

Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC bzw. ATL umfaßt die Verabreichung einer therapeutischen (antiviral oder prophylaktisch) wirksamen Menge an Averon oder dessen Derivaten in Kombination mit AZT an eine Patienten, der dieser Behandlung bedarf.The method for the treatment of AIDS or ARC or ATL includes the administration of a therapeutic (antiviral or prophylactically) effective amount of averone or its  Derivatives in combination with AZT to a patient who this treatment is needed.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten an Hand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeine beträgt die Tagesdosis für Avaron oder dessen Derivate 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht, bzw. 2-59, 3-30 und 15-20 mg/kg Körpergewicht für AZT.The dosage depends primarily on the specific Form of administration and the purpose of the therapy. The size single doses and the regimen can be administered on best on the basis of an individual assessment of the respective Disease case be determined by the doctor, the Age the weight and condition of the recipient who Route of administration and the type and scissors of the disease must be taken into account. In general, the Daily dose for Avaron or its derivatives 2-20, preferably 3-10, especially 6-7 mg / kg body weight, or 2-59, 3-30 and 15-20 mg / kg body weight for AZT.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.The duration of treatment depends on the type and severity of the treatment Illness. It generally extends over several Weeks, for example 4 to 8 weeks.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV) und gegen das Human-T-Cell-Leukämie-Virus vom Typ I (HTLV-I). Diese Verbindungen sind deshalb zur therapeutischen und prophylaktische Behandlung der durch das AIDS-Virus und das ATL-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.The compounds used according to the invention are effective in many ways against the Human Immunodeficiency Virus (HIV) and the human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I). These compounds are therefore therapeutic and prophylactic treatment by the AIDS virus and the ATL virus caused diseases useful.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wird nachfolgend am Beispiel von Avarol und AZT an Hand pharmakologischer in vitro-Testsysteme untersucht. The activity of the present invention used Compounds will be described below using the example of Avarol and AZT investigated on the basis of pharmacological in vitro test systems.  

Beispiele: Pharmakologische Wirkungen von Avarol und AZTExamples: Pharmacological effects of Avarol and AZT Beispiele: 1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von Avarol und AZT in Kombination; 2) Nachweis der anti-HTLV-I-Aktivität von Avarol und AZT in Kombination;Examples: 1) Evidence of anti-HIV activity of Avarol and AZT in Combination; 2) Detection of anti-HTLV-I activity of Avarol and AZT in Combination; 1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von Avarol und AZT in Kombination.1) Evidence of anti-HIV activity of Avarol and AZT in Combination.

Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte OKT4+ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS- Virus der Isolatbezeichnung HTLV-IIIB (zugehörig zu HIV-1) vermehrt (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed und R. C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).The cell line H9 was used, which was is a cloned OKT4 + T cell line in which the AIDS Virus of the isolate designation HTLV-IIIB (belonging to HIV-1) (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed and R.C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).

VersuchsdurchführungExperimental Procedure Reinigung von HIV-1 Reverser Transkriptase und AssaybedingungenPurification of HIV-1 reverse transcriptase and assay conditions

Die für die vorliegenden Versuche verwendete HIV-1 Reverse Transkriptase (Herstellung nach dem Verfahren von: P. S. Sarin, Y. Taguchi, D. Sun, A. Thornton, R. C. Gallo, B. Oeberg; Bichem. Pharmacol. 34, 4075 4079; 1985) wurde mittels sequentieller Chromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Hydroxylapatit gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl-aminomethan) (pH 7.5), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% Triton X-100 und 20% Glycerin aufbewahrt. Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MGCl2, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C8H17-C6H4- (OCH2CH2)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d.i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)15.(A)n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und 3H-Desoxythymidintriphosphat (3H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA- Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationszähler bestimmt.The HIV-1 reverse transcriptase used in the present experiments (prepared by the method of: PS Sarin, Y. Taguchi, D. Sun, A. Thornton, RC Gallo, B. Oeberg, Bichem Pharmacol 34, 4075 4079, 1985 ) was purified by sequential chromatography on DEAE-cellulose, phosphocellulose and hydroxyapatite. The purified enzyme was stored in 50 mM Tris-HCl (tris (hydroxymethyl-aminomethane) (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% Triton X-100 and 20% glycerol.) The reverse transcriptase assay was performed in reaction mixture (50 μl) containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM MGCl2, 100 mM potassium chloride, 0.01% Triton X-100 (C8H17-C6H4- (OCH2CH2) 9- 10-OH) or NP40 (non-ionic detergent Nonidet P40, product name of Sigma, di Octylphenolethylenoxid condensate), 10 ug / ml (dT) 15. (A) n (hybrid polymers of the oligo- or polynucleotides Oligodesoxythymidylsäure and Polyadenylic acid) as template primer and 3H-deoxythymidine triphosphate (3H-dTTP) The reaction mixture was incubated for 1 h at 37 ° C and the reaction was monitored by addition of 50 μg of yeast tRNA and 2 ml of a 10% trichloroacetic acid solution (TCA) 1mM sodium pyrophosphate. The samples were filtered through Millipore filters (0.45 μm), first at 5% TCA solution (5 ×) and then washed with 2 ml of 70% ethanol. The filters were dried under a heat lamp, then scintillation fluid was added and radioactivity determined in a β scintillation counter.

HIV-Infizierung von H9-ZellenHIV infection of H9 cells

H9-Zellen (M: Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed, R. C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HTLV- III-Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic, vgl. oben) pro 4×100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit Arzneimittel behandelter Teil dieser Proben wurde als posivite Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentration an zu testender Verbindung (Avarol oder dessen Derivate) gegeben wurden. Die HTLV-III Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben beschrieben analysiert.H9 cells (M: Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed, R.C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) with polybrene (commercially available available hexadimethrine bromide; 2 μg / ml) for 30 min. At 37 ° C treated, polybrenfrei washed and with 200 000 000 HTLV III virus particles (isolated from H9 cell cultures after M. Popovic, cf. above) per 4 x 100,000 H9 cells. On non-drug-treated part of these samples used as a posivite control, whereas to the Test samples different concentration of to be tested Compound (Avarol or its derivatives) were given. The HTLV-III reverse transcriptase activity of these cultures was  analyzed as described above.

Immunofluoreszenz-AssayImmunofluorescence assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol : Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HTLV-III p17 (Gag-Protein mit MG=17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG=24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln in den Zellen anzeigt. Die HTLV-III infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol-Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0.25% Triton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege- Antimaus IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wude 50%iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop bestimmt.The immunofluorescence assays were performed on methanol: acetone (1: 1) - fixed cells using monoclonal antibodies (out the mouse) against HTLV-III p17 (Gag protein with MW = 17,000) and p24 (Gag protein with MW = 24,000). These two Proteins are marker proteins that determine the presence of Indicating virus particles in the cells. The HTLV-III infected cells were treated with or without drug treatment fixed to toxoplasmosis slides. After fixation with Methanol-acetone (1: 1) for 30 min. At room temperature, the slides were sealed in sealed plastic containers at -20 ° C kept until used. The monoclonal antibodies were added to the cells at room temperature in one Humidity chamber incubated for 1 h with PBS (phosphate buffer), containing 0.25% Triton X-100, washed for 2 h. The cells were then incubated with fluorescein (FICT) for 1 h. Antimaus IgG (Capell Labs.) Treated, and with PBS buffer, the 0.25% Triton X-100, washed overnight. On the Slides were given 50% glycerol and cell fluorescence was determined with a Zeiss fluorescence microscope.

UntersuchungsparameterTest parameters 1. Zellwachstum1. Cell Growth

H9-Zellen sowie mit HTLV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2×1 000 000 Zellen/ml Kultur­ medium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4- tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3× 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten H9-Zellen lediglich 0,5×1 000 000 Zellen/ml war, diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.H9 cells as well as HTLV-IIIB infected H9 cells were in a concentration of 0.2 x 1,000,000 cells / ml of culture medium used to inoculate a culture medium. After 4-  daily incubation, the density of H9 cells was 1.3x 1 000 000 cells / ml, while the density of HTLV-IIIB infected H9 cells only 0.5 × 1 000 000 cells / ml were, these two values formed the control values.

Dann wurden Proben von H9-HTLV-IIIB-Zellen 0,2×1 000 000 Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von Avarol und AZT alleine oder in Kombination behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Then, samples of H9-HTLV-IIIB cells became 0.2 × 1,000,000 Cells / ml 4 days with different concentrations of Avarol and AZT treated alone or in combination. It the following results were obtained:  

Es ist ersichtlich, daß Avarol in den gewählten Konzentrationen 0,07 und 0,14 µM und AZT in den Konzentrationen 0.05 und 0.1 µM die Wachstumsrate von H9-HTLV- IIIB-Zellen auf Werte steigert, die weniger als 50% der normalen Wachstumsrate von nichtinfizierten Zellen beträgt. Werden die Substanzen jedoch in Kombination gegeben, werden Wachstumsraten erzielt, die im Bereich der Kontrolle, nämlich der H9-Zellen ohne HTLV-IIIB liegen. It can be seen that Avarol in the chosen Concentrations 0.07 and 0.14 μM and AZT in the Concentrations 0.05 and 0.1 μM the growth rate of H9-HTLV IIIB cells to levels that are less than 50% of the normal growth rate of uninfected cells. However, the substances are given in combination Achieved growth rates in the area of control, namely of H9 cells without HTLV-IIIB.  

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch H9-HTLV-IIIB-Zellen, die mit Avarol und AZT behandelt wurden2. Inhibition of the production of reverse transcriptase by H9-HTLV-IIIB cells treated with Avarol and AZT

Es wurde untersucht, ob die 4tägige Zugabe von Avarol oder AZT oder eine Kombination beider Substanzen zu H9-HTLV-IIIB- Zellen die Produktion von HTLV-III-Viren einstellen. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:It was investigated whether the 4-day addition of Avarol or AZT or a combination of both to H9-HTLV-IIIB- Cells stop production of HTLV-III viruses. As a measure for the amount of virus in the culture medium was the reverse Transcriptase selected. So the inhibition of the reverses Transcriptase indicates inhibition of virus production. The Results are summarized in the following table:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HTLV-IIIB-Zellen, die nicht mit Avarol oder AZT behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von Avarol oder AZT führte zu einer dosisabhängigen Verringerung der reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Z. B. bei der Dosis von 0,14 µM von Avarol wurde eine 31%ige, bzw. von 0,1 µM von AZT wurde eine 42%ige Hemmung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Kombinationen an Substanzen bewirkten jedoch eine nahezu 100%-Hemmung. Bei Kombination der Verbindungen wird die Virusreplikation vollständig bei Dosen inhibiert, bei denen verschiedene in vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, nicht nachteilig beeinflußt werden.It can be seen that in the supernatant of H9-HTLV-IIIB cells, not treated with Avarol or AZT, one had considerable activity on reverse transcriptase. The Addition of Avarol or AZT resulted in a dose-dependent Reduction of reverse transcriptase activity in the Got over. For example, at the dose of 0.14 μM Avarol became a 31%, respectively, of 0.1 μM of AZT was a 42% Inhibition observed. The invention for use However, coming combinations of substances caused one almost 100% inhibition. When combining the compounds will virus replication is completely inhibited at doses various in vitro parameters, such as the Cell growth, not be adversely affected.

3. Inhibierung der HTLV-IIIB p15 und p24 Expression in H9-HTLV- IIIB durch Avarol oder AZT3. Inhibition of HTLV-IIIB p15 and p24 expression in H9-HTLV IIIB by Avarol or AZT

Es hat sich gezeigt, daß Avarol eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p24 und p15 in infizierten H9-Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem HTLV-IIIB- Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung(en) kultiviert wurden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p24 und p15-Proteins. Nach Inkubierung der H9-HTLV-IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Avarol has been shown to be highly inhibitory Effect on the expression of HIV p24 and p15 in infected Owns H9 cells. When the target H9 cells are infected with the HTLV IIIB Isolate treated and without the compound (s) to be tested were cultured, the H9 cells were infected and it came as determined by indirect immunofluorescence assays, for expression of the p24 and p15 protein. After incubation of H9-HTLV-IIIB cells with the compounds to be tested an almost complete protective effect observed. There were received the following results:  

Es ist ersichtlich, daß Avarol und AZT alleine bereits eine signifikante Reduktion der Expression der HTLV-III-Proteine p15 und p24 verursacht. Werden die Substanzen jedoch in Kombination gegeben wird eine nahezu komplette Reduktion der Expression der viralen Proteine erreicht. It can be seen that Avarol and AZT alone already have a Significant reduction in the expression of HTLV-III proteins caused p15 and p24. However, if the substances are in Combination is given a nearly complete reduction of Expression of viral proteins achieved.  

Nachweis, daß Avaron oder dessen Derivate in Kombination mit AZT die Proliferation von nichtinfizierten H9-Zellen antagonistisch hemmen, während die Kombination der Substanzen synergistisch die Virusvermehrung inhibieren.Evidence that Avarone or its derivatives in combination with AZT proliferation of uninfected H9 cells inhibit antagonistically while combining the substances synergistically inhibit virus proliferation.

Als Beispiel für Avaron und dessen Derivate wurde wiederum Avarol gewählt.As an example of Avaron and its derivatives was again Avarol elected.

Die 50%-Hemmkonzentrationen für Avarol und AZT alleine wurden nach W.E.G. Müller et al. (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 19: 665, 1983) ermittelt. Die 50%-Hemmkonzentrationen für ausgewählte Kombinationen von AZT mit Avarol wurden nach der Isobologram-Methode dargestellt (G. B. Elion et al., J. Biol. Chem. 208:, 477, 1954 und W. E. G. Müller und R. K. Zahn, Cancer Res. 39:, 1102, 1979). Eine quantitative Aussage über die Art der Wechselwirkung wurde über die Bestimmung des "Fractional Inhibitory Concentration Index" (FIC) erreicht. Diese FIC- Werte wurden nach W. E. G. Müller und R. K. Zahn (Cancer Res. 39: 1102, 1979) und T. C. Chou und P. Talalay (Adv. Enzyme Regul. 22: 27, 1984) errechnet. Für synergistische Effekte ergibt sich ein FIC von <1, für additive Effekte eine FIC=1 und für antagonistische Effekte ein FIC von <1 (I. Phillips und C. Warren, Antimicrob. Agents Chemother. 9: 736, 1976).The 50% inhibitory concentrations for Avarol and AZT alone were according to W.E.G. Müller et al. (Eur. J. Cancer Clin. Oncol 19: 665, 1983). The 50% inhibitory concentrations for Selected combinations of AZT with Avarol were reported after the Isobologram method (G. B. Elion et al., J. Biol. Chem. 208 :, 477, 1954 and W.E.G. Muller and R.K. Zahn, Cancer Res. 39 :, 1102, 1979). A quantitative statement about the species the interaction was determined by the determination of the "fractional Inhibitory Concentration Index "(FIC). Values were determined according to W. E. G. Müller and R. K. Zahn (Cancer Res. 1102, 1979) and T.C. Chou and P. Talalay (Adv. Enzyme Regul. 22: 27, 1984). For synergistic effects results a FIC of <1, for additive effects a FIC = 1 and for antagonistic effects a FIC of <1 (I. Phillips and C. Warren, Antimicrob. Agents Chemother. 9: 736, 1976).

a) Nachweis des antagonistischen Effektes auf nichtinfizierte H9-Zellen.a) Detection of the antagonistic effect on non-infected H9 cells.

50%-Hemmkonzentrationen für die Substanzen alleine:50% inhibitory concentrations for the substances alone:

für Avarol:|1,9 µMfor Avarol: | 1.9 μM für AZT:for AZT: 1,6 µM1.6 μM

50%-Hemmkonzentrationen für die Substanzen in den Kombinationsexperimenten:50% inhibitory concentrations for the substances in the Combination experiments:

Avarol(µM)Avarol (uM) AZT (µM)AZT (μM) 0,680.68 1,331.33 0,980.98 1,151.15 1,221.22 0,980.98 1,511.51 0,770.77 1,601.60 0,500.50

Diese Daten zeigen, daß ein eindeutig antagonistischer Effekt durch beide Substanzen auf die Zellproliferation ausgeübt wird. Quantitativ wird diese Aussage an einem Beispiel erläutert:These data show that a clearly antagonistic effect exerted by both substances on cell proliferation becomes. Quantitatively, this statement is based on an example explains:

Kombination von:
AZT bei einer Konzentration von 0,75 µM plus Avarol einer Konzentration von 1,48 µM ergab ein FIC-Wert von 1,25 (signifikant antagonistischer Effekt). Combination of:
AZT at a concentration of 0.75 μM plus Avarol at a concentration of 1.48 μM gave a FIC value of 1.25 (significant antagonistic effect).

b) Nachweis des synergistischen, antiviralen Effektes.b) Evidence of the synergistic, antiviral effect.

50%-Hemmkonzentrationen für die Substanzen alleine:50% inhibitory concentrations for the substances alone:

für Avarol:|0,21 µMfor Avarol: | 0.21 μM für AZT:for AZT: 0,13 µM0.13 μM

50%-Hemmkonzentrationen für die Substanzen in den Kombinationsexperimenten:50% inhibitory concentrations for the substances in the Combination experiments:

Avarol(µM)Avarol (uM) AZT (µM)AZT (μM) 0,0080,008 0,0490,049 0,0160.016 0,0320.032 0,0210,021 0,0250,025 0,050.05 0,0180,018 0,0480.048 0,0090.009

Diese Daten zeigen, daß ein eindeutig synergistisch, antiviraler Effekt durch beide Substanzen erreicht wird. Quantitativ wird diese Aussage an einem Beispiel erläutert:These data show that a clearly synergistic, antiviral effect is achieved by both substances. Quantitatively, this statement is explained using an example:

Kombination von:
AZT bei einer Konzentration von 0,025 µM plus Avarol einer Konzentration von 0,033 µM ergab einen FIC-Wert von 0,35 (signifikant synergistischer Effekt).Combination of:
AZT at a concentration of 0.025 μM plus avarol at a concentration of 0.033 μM gave a FIC value of 0.35 (significant synergistic effect).

Als Ergebnis aus dieser Versuchsreihe wird geschlossen, daß beide Substanzen einen antagonistischen Effekt auf die Zellproliferation und einen synergistischen Effekt auf die HIV- 1-Vermehrung in vitro ausüben. Demnach kann auf eine erhöhte therapeutische Breite beider Substanzen für die in vivo- Anwendung geschlossen werden. As a result of this series of experiments it is concluded that Both substances have an antagonistic effect on the Cell proliferation and a synergistic effect on the HIV 1-Multiplication in vitro. Accordingly, an increased therapeutic range of both substances for the in vivo Application to be closed.  

2) Nachweis der anti-HTLV-I-Aktivität von Avarol und AZT in Kombination.2) Detection of anti-HTLV-I activity of Avarol and AZT in Combination.

Als Teststubstanzen kamen Avarol (als Beispiel für Avaron oder deren Derivate) und AZT zur Anwendung.The test substances Avarol (as an example for Avaron or their derivatives) and AZT are used.

Dabei kann man die Zellinien MT-2, ATL-3I und ATL-1K zur Anwendung bringen. Diese Zellinien sind in Hashino H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 6061-6065 (1983) und Miyoshi J. et al., Nature 294: 770-771, (1981) beschrieben. Dabei handelt es sich um Zell-Linien, die alle das HTLV-Provirus enthalten; unter ihnen exprimieren die Linien MT-2 und ATL-3I die retroviralen Antigene und produzieren auch das HTLV-I-Virus.One can use the cell lines MT-2, ATL-3I and ATL-1K for Bring application. These cell lines are described in Hashino H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 6061-6065 (1983) and Miyoshi J. et al., Nature 294: 770-771, (1981). It acts these are cell lines that all contain the HTLV provirus; among them, lines MT-2 and ATL-3I express the retroviral antigens and also produce the HTLV-I virus.

VersuchsdurchführungExperimental Procedure Reinigung von HTLV-I Reverser Transcriptase und Assys- BedingungenPurification of HTLV-I Reverse Transcriptase and Assay conditions

Die für die vorliegenden Versuche verwendete HTLV-I Reverse Transkriptase (Herstellung nach dem Verfahren von: P. S. Sarin, Y. Taguchi, D. Sun, A. Thornton, R. C. Gallo, B. Oeberg, Biochem Pharmacol. 34: 4075-4079, 1985) wurde mittels sequentieller Chromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Hydroxylapatit gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM HCl (Tris-hydroxymethyl-aminomethan) (pH 7,5), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% Triton X-100 und 20% Glycerin aufbewahrt. Die Assays auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgCl2, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01% Triton X-100 (C8H17-C6H4-(OCH2CH2)9-10- OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i. Octylphenolethylenoxid- Kondensat), 10 µg/ml (dT)15.(A)n (Hybridpolymer aus den Oligo- bzw. Polynukleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H - Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA- Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Szintillationsflüsigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Szintillationszähler bestimmt.The HTLV-I reverse transcriptase used in the present experiments (prepared by the method of: PS Sarin, Y. Taguchi, D. Sun, A. Thornton, RC Gallo, B. Oeberg, Biochem Pharmacol 34: 4075-4079, 1985 ) was purified by sequential chromatography on DEAE-cellulose, phosphocellulose and hydroxyapatite. The purified enzyme was stored in 50 mM HCl (tris-hydroxymethyl-aminomethane) (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% Triton X-100 and 20% glycerol. The reverse transcriptase assays were performed in a reaction mixture (50 μl) containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM MgCl 2, 100 mM potassium chloride, 0.01% Triton X-100 (C8H17 -C6H4- (OCH2CH2) 9-10-OH) or NP40 (non-ionic detergent Nonidet P40, product name from Sigma, di Octylphenolethylenoxid- condensate), 10 ug / ml (dT) 15. (A) n (hybrid polymer of the oligo- or polynucleotides oligodeoxythymidonic acid and polyadenylic acid) as template primer and 3 H-deoxythymidine triphosphate (3 H-dTTP). The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 1 h, and the reaction was stopped by adding 50 μg of yeast tRNA and 2 ml of a 10% trichloroacetic acid solution (TCA) containing 1 mM sodium pyrophosphate. The samples were filtered through Millipore filters (0.45μm), washed first with 5% TCA solution (5x) and then with 2 ml of 70% ethanol. The filters were dried under a heat lamp, then scintillation fluid was added and the radioactivity determined in a β scintillation counter.

Zellkultur-BedingungenCell culture conditions

Es wurden die Bedingungen angewandt, wie sie von H. Hoshino et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 80: 7337-7341, 1983 beschrieben wurden.The conditions were applied as described by H. Hoshino et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 80: 7337-7341, 1983 were.

Immunofluorezenz-AssayImmunofluorezenz assay

Die Imunofluoreszenz-Assays wurden mit Methanol : Aceton (1 : 1)- fixierten ATL-3I-Zellen unter Verwendung eines standardisierten ATL-Patientenserums gegen das retrovirale Antigen (Code 3 KI, H. Hoshino et al. siehe vorstehendes Literaturzitat) durchgeführt. Die ATL-3I-Zellen wurden nach Inkubation mit oder ohne Arzneimittel an Toxoplasmose Slides fixiert.The immunofluorescence assays were performed with methanol: acetone (1: 1) - fixed ATL-3I cells using a standardized ATL patient serum against the retroviral Antigen (Code 3 KI, H. Hoshino et al., See above Literature quote). The ATL-3I cells were after Incubation with or without drugs to Toxoplasmosis slides fixed.

Nach der Fixierung mit Methanol-Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert und mit PBS (Phosphatbuffer), der 0,25% Triton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FITC) markiertem Kaninchen Antimensch IgG (Capell Labs.) behandelt und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop bestimmt.After fixing with methanol-acetone (1: 1) for 30 min.  at room temperature, the slides were sealed in Store plastic containers at -20 ° C until use. The Monoclonal antibodies were added to the cells at Room temperature in a humidity chamber for 1 h and incubated with PBS (phosphate buffer) containing 0.25% Triton X-100, 2 h washed. The cells were then incubated with fluorescein (FITC) for 1 h. labeled rabbit anti-human IgG (Capell Labs.) and with PBS buffer containing 0.25% Triton X-100 overnight washed. The slides were given 50% glycerine and The cell fluorescence was measured with a Zeiss fluorescence microscope certainly.

UntersuchungsparameterTest parameters 1. Zellwachstum1. Cell Growth

ATL-3I, MT-2 und ATL-1K Zellen wurden in Petrischalen in einer Konzentration von 3×10³-Zellen/cm³ in Kulturmedium mit 20% Kälberserum angesetzt. Nach 2tägiger Inkubation betrug die Dichte der Zellen:ATL-3I, MT-2 and ATL-1K cells were grown in petri dishes in one Concentration of 3 x 10³ cells / cm³ in culture medium with 20% Calf serum. After 2 days of incubation, the Density of cells:

ATL-3I: 13,2×10³ Zellen/cm²
MT-2: 14,4×10³ Zellen/cm²
ATL-1K: 15,7×10³ Zellen/cm².ATL-3I: 13.2 x 10³ cells / cm²
MT-2: 14.4 x 10³ cells / cm²
ATL-1K: 15.7 x 10³ cells / cm².

Diese Werte bilden die Kontrollwerte.These values form the control values.

Dann wurden die Ansätze mit diesen Zellen 2 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen an Avarol und AZT behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Then the batches with these cells were used for 2 days treated with different concentrations of avarol and AZT. The following results were obtained:  

Es ist ersichtlich, daß Avarol und AZT bei den gewählten Konzentrationen das Wachstum der HTLV-Zellen hemmt; in noch stärkerem Maße jedoch wird eine Hemmwirkung durch die Substanzen in Kombination erzielt.It can be seen that Avarol and AZT in the selected Concentrations inhibit the growth of HTLV cells; in still To a greater extent, however, an inhibitory effect by the Substances achieved in combination.

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch ATL-3I Zellen, die mit Avaron und/oder AZT behandelt wurden2. Inhibition of the production of reverse transcriptase by ATL-3I cells treated with Avaron and / or AZT

Es wurde untersucht, ob die 2tägige Zugabe von Avarol und/oder AZT zu ATL-3I-Zellen die Produktion von HTLV-I-Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:It was investigated if the 2-day addition of Avarol and / or AZT to ATL-3I cells the production of HTLV-I viruses established. As a measure of the amount of virus in the culture medium was  the reverse transcriptase chosen. So inhibition of the reverse Transcriptase indicates inhibition of virus production. The Results are summarized in the following table:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der ATL-3I Zellen, die nicht mit Avarol und/oder AZT behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von Avarol oder AZT führte bereits zu einer dosisabhängigen Verringerung der Reversen Transkriptase- Aktivität im Überstand. Wurden die beiden Substanzen jedoch in Kombination zugegeben wurden bei den geringen Konzentrationen ein synergistischer Effekt erzielt. Bereits bei einer geringen Dosis von 0,14 µM an Avarol und 0,1 µM an AZT wurde eine 100%ige Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen sind deshalb in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig zu inhibieren.It can be seen that in the supernatant of the ATL-3I cells, the not treated with Avarol and / or AZT, one had considerable activity on reverse transcriptase. The Addition of Avarol or AZT has already led to one dose-dependent reduction of reverse transcriptase Activity in the supernatant. However, the two substances were in Combination were added at the low concentrations  achieved a synergistic effect. Already at a low Dose of 0.14 μM of avarol and 0.1 μM of AZT became 100% Inhibition observed. The invention for use Therefore, future connections are able to Almost completely inhibit virus replication.

3. Inhibierung der Expression der retroviralen (HTLV-I)- Antigene in ATL-3I Zellen durch Avaron und/oder AZT3. Inhibition of the Expression of Retroviral (HTLV-I) - Antigens in ATL-3I cells by Avaron and / or AZT

Es hat sich gezeigt, daß Avarol und AZT stark inhierende Wirkung auf die Expression von retroviralen Antigenen in ATL- 3I Zellen besitzt. Wenn die ATL-3I Zellen ohne die zu testenden Verbindungen kultiviert wurden, wurden die retroviralen Antigene exprimiert. Nach Inkubation der ATL-3I- Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein starkter Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: It has been shown that Avarol and AZT are strongly inhibiting Effect on the expression of retroviral antigens in ATL Has 3I cells. If the ATL-3I cells without the too were cultivated in the test compounds were the retroviral antigens expressed. After incubation of the ATL-3I Cells with the compounds to be tested became stronger Protective effect observed. There were the following results receive:  

Es ist ersichtlich, daß Avarol und AZT eine Reduktion der Expression viralter Antigene bewirken. Eine besonders starke und synergistische Reduktion wird durch beide Substanzen in Kombination erreicht. It can be seen that Avarol and AZT reduce the Effect expression of viral antigens. A particularly strong one and synergistic reduction is due to both substances in Combination achieved.  

Nachweis, daß Avaron und dessen Derivate in Kombination mit AZT die Vermehrung von HIV-I-infizierten Zellen synergistisch hemmt.Evidence that Avaron and its derivatives in combination with AZT synergistically prolongs the proliferation of HIV-1 infected cells inhibits.

Als Beispiel für Avaron und dessen Derivate wurde wiederum Avarol gewählt.As an example of Avaron and its derivatives was again Avarol elected.

Die Bestimmung der FIC-Werte wurde - wie oben angeführt - durchgeführt.The determination of the FIC values was - as stated above - carried out.

Als Untersuchungsmodell wurden die ATL-3I-Zellen verwandt.As a model of investigation, the ATL-3I cells were used.

Ergebnis:
(a) 50%-Hemmkonzentration für die Substanzen alleine:Result:
(a) 50% inhibitory concentration for the substances alone:

für Avarol:|0,42 µMfor Avarol: | 0.42 μM für AZT:for AZT: 0,36 µM0.36 μM

(b) Kombinationsexperimente:(B) combination experiments:

Diese Daten zeigen, daß stets in Kombination der beiden Substanzen ein FIC-Wert kleiner als 1 erzielt wurde. Dieses Ergebnis belegt, daß durch AZT und Avarol - wenn angewandt in Kombination - einen synergistisch, hemmenden Einfluß auf die Vermehrung von HTLV-I-infizierten Zellen bewirkt wird. These data show that always in combination of the two Substances a FIC value less than 1 has been achieved. This Result proves that by AZT and Avarol - when applied in Combination - a synergistic, inhibiting influence on the Propagation of HTLV-I-infected cells is effected.  

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung: Beispiele für pharmazeutische MittelThe following examples serve to explain the Invention: Examples of pharmaceutical agents

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.In the following formulation examples, as Active ingredient in each case one of the invention for use coming compounds individually or in admixture with a other compounds of the invention are used.

Beispiel aExample a Tablettenformulierungtablet formulation Wirkstoff|10 mgActive substance | 10 mg Lactoselactose 18 mg18 mg Kartoffelstärkepotato starch 38 mg38 mg Gelatinegelatin 2 mg2 mg Talkumtalc 2 mg2 mg Magnesiumstearatmagnesium stearate 0,1 mg0.1 mg

Beispiel bExample b Tablettenformulierungtablet formulation Wirkstoff|10 mgActive substance | 10 mg Kartoffelstärkepotato starch 40 mg40 mg Polyvinylpyrrolidonpolyvinylpyrrolidone 5 mg5 mg

Die Tabletten werden mit einer gefärbten Zuckerschicht überzogen.The tablets are coated with a colored sugar layer.

Beispiel cExample c Kapselformulierungcapsule formulation Wirkstoff|10 mgActive substance | 10 mg Maisstärkecorn starch 90 mg90 mg Lactoselactose 50 mg50 mg Talkumtalc 2 mg2 mg

Diese Mischung wird in Gelatinekapseln gefüllt.This mixture is filled in gelatine capsules.

Beispiel dExample d Flüssige orale FormulierungLiquid oral formulation Wirkstoff|2 gActive ingredient | 2 g Saccharosesucrose 250 g250 g Glucoseglucose 300 g300 g d-Sorbitd-Sorbitol 150 g150 g Agar-agarAgar Agar 0,15 g0.15 g Methylparabenmethylparaben 0,5g0.5g PropylparabenPropylparaben 0,05 g0.05 g Geschmackstoff (Orangengeschmack) Tartazin gelb|10 gFlavor (orange flavor) Tartazin yellow | 10 g Gereinigtes Wasser aufPurified water on 1000 ml1000 ml

Beispiel fExample f Flüssige orale FormulierungLiquid oral formulation Wirkstoff|2 gActive ingredient | 2 g Tragacanthtragacanth 7 g7 g Glyceringlycerin 50 g50 g Saccharosesucrose 400 g400 g Methylparabenmethylparaben 0,5g0.5g PropylparabenPropylparaben 0,05 g0.05 g Geschmackstoff (Geschmack von schwarzer Johannisbeere) Roter Farbstoff Nr. 2C.E.184|0,02 gFlavor (blackcurrant flavor) Red Dye No. 2C.E.184 | 0.02 g Gereinigtes Wasser aufPurified water on 1000 ml1000 ml

Beispiel gExample g Flüssige orale FormulierungLiquid oral formulation Wirkstoff|2,4 gActive ingredient | 2.4 g Saccharosesucrose 400 g400 g Tinktur von BitterorangenschaltenTincture of bitter orange shades 20 g20 g Tinktur von SüßorangenschalenTincture of sweet orange peel 15 g15 g Gereinigtes Wasser aufPurified water on 1000 ml1000 ml

Claims (3)

1. Verwendung von von Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit 3′-Azido-3′-desoxythymidin als Arzneimittel.1. Use of Avarone or its Derivatives in Combination with 3'-azido-3'-deoxythymidine as a drug. 2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit 3′-Azido-3′- desoxythymidin.2. Medicines characterized by a content of Avaron or its derivatives in combination with 3'-azido-3 ' deoxythymidine. 3. Verwendung von Avaron oder dessen Derivaten in Kombination mit 3′-Azido-3′-desoxythymidin zur antiviralen Behandlung von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bzw. ARC (AIDS- related Complex) und/oder von ATL (adulter T-Zell-Leukämie).3. Use of Avarone or its derivatives in combination with 3'-azido-3'-deoxythymidine for antiviral treatment of AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) or ARC (AIDS related complex) and / or of ATL (adult T-cell leukemia).