DE3807975A1 - Method for the optical characterisation of nucleic acids and oligonucleotides - Google Patents
Method for the optical characterisation of nucleic acids and oligonucleotidesInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Charakterisierung von Nukleinsäuren und Oligonukleotiden.The present invention relates to a method for optical Characterization of nucleic acids and oligonucleotides.
Die genaue Analyse von Nukleinsäuren (einzel- und doppelsträngige DNA oder RNA) ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Lebensvorgänge in den Zellen und insbesondere für die Ermittlung des Informationsgehalts der DNA.The precise analysis of nucleic acids (single- and double-stranded DNA or RNA) is central to the understanding of life processes in the cells and in particular for the determination of the information content of DNA.
Zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen sind bereits Methoden entwickelt worden. Das klassische Verfahren zur Sequenzierung (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463) von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, ist langsam, fehleranfällig und sehr schwer automatisierbar. Deswegen wurden in jüngster Zeit einige Verfahren entwickelt, die Fluoreszenzfärbung von DNA einsetzen (J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986) 315, Nature 321 (1986) 674, Science 238 (1987) 336). Keines dieser Verfahren benutzt jedoch spezifische Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und Nukleinsäure, um die DNA zu charakterisieren. Daher benötigen alle bekannten Verfahren entweder mehrere Farbstoffe oder mehrere Trennbahnen im Separationsmedium.Methods have already been developed for the analysis of nucleic acid sequences Service. The classic sequencing method (Proc Natl Acad Sci. USA 74 (1977) 5463) of nucleic acids, especially DNA, is slow, error-prone and very difficult to automate. That's why in Recently, some methods developed fluorescence staining of DNA Biochem., Biophys., Meth. 13 (1986) 315, Nature 321 (1986). 674, Science 238 (1987) 336). However, none of these methods uses specific interactions between dye and nucleic acid to the Characterize DNA. Therefore, all known methods require either several dyes or multiple separators in the separation medium.
Die Verwendung von Thionukleotiden zur DNA-Sequenzierung durch gehemmte Exonukleaseverdauung wird in WO 86/07612 beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich jedoch nur schlecht zur Automatisierung.The use of thionucleotides for DNA sequencing by inhibited Exonuclease digestion is described in WO 86/07612. This method However, it is not very suitable for automation.
Zur Sichtbarmachung der DNA bei der in-situ-Hybridisierung sind auch mehrere Methoden entwickelt worden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 6633, Exptl. Cell. Res. 153 (1984) 61, Histochem. 85 (1986) 1). Diese Methoden sind jedoch sehr zeitaufwendig bzw. führen durch unvermeidbare Mängel zu teilweise unsicheren Ergebnissen.To visualize the DNA in in situ hybridization are also Several methods have been developed (Proc Natl Acad Sci USA 78 (1981) 6633, Expt. Cell. Res. 153 (1984) 61, Histochem. 85 (1986) 1). These However, methods are very time consuming or lead by unavoidable Deficiencies to partially uncertain results.
Es ist auch eine Methode zur Fluoreszenzfärbung von Nukleinsäuren mittels enzymatischer Übertragung eines gefärbten Thionukleotids beschrieben worden (Nucleic Acids Res. 12 (1984) 1791). Nach dieser Methode kann jedoch nur maximal ein Farbstoffmolekül pro DNA-Strang an die DNA gekoppelt werden.It is also a method for fluorescence staining of nucleic acids by means of enzymatic transfer of a colored thionucleotide (Nucleic Acids Res. 12 (1984) 1791). By this method can however, only a maximum of one dye molecule per DNA strand to the DNA be coupled.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Oligonukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man Detektormoleküle an die Nukleinsäuren und/oder Oligonukleotide koppelt, die aufgrund von Wechselwirkungen erkennen lassen, an welches Nukleotid die Kopplung erfolgt ist.The invention relates to a method for the characterization of Nucleic acids and / or oligonucleotides, characterized in that Coupling detector molecules to the nucleic acids and / or oligonucleotides, which, due to interactions, indicate to which nucleotide the coupling is done.
Als Oligonukleotide sind solche zu verstehen, die bis zu 20 Nukleotide enthalten. Moleküle, die aus mehr als 20 Nukleotiden bestehen, werden hier als Nukleinsäuren bezeichnet.Oligonucleotides are to be understood as those which are up to 20 nucleotides contain. Molecules consisting of more than 20 nucleotides are here referred to as nucleic acids.
Optische Charakterisierung der Nukleinsäure bzw. des Oligonukleotids bedeutet, daß die Basen der Nukleotide durch Ankopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs aufgrund von optischen Eigenschaften identifiziert werden und die Nukleinsäure bzw. das Nukleotid detektiert wird.Optical characterization of the nucleic acid or of the oligonucleotide means that the bases of the nucleotides by coupling a Fluorescent dye identified due to optical properties and the nucleic acid or nucleotide is detected.
Zur Charakterisierung sind nur solche Farbstoffe geeignet, die ein unterschiedliches Löschungsvermögen "quenching" zeigen, d. h. die unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen dem Farbstoff und den vier möglichen terminalen Basen besitzen. Eine geeignete Meßgröße dieser Wechselwirkung ist die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffs.For characterization, only those dyes are suitable, the one show different extinguishing ability "quenching", d. H. the different ones Interactions between the dye and the four possible ones possess terminal bases. A suitable measure of this interaction is the fluorescence lifetime of the dye.
Als Farbstoffe eignen sich Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoresceine, Rhodamine, Oxazine und insbesondere Cumarine - vorzugsweise 7-Amino-4- methylcumarin-, Carbostyryle - vorzugsweise 7-Amino-4-methylcarbostyryl - und Oxadiazole - vorzugsweise 2-(4-Biphenyl)-5-phenyl-1,3,4-oxadiazol.Suitable dyes are fluorescent dyes such as fluoresceins, Rhodamines, oxazines and in particular coumarins - preferably 7-amino-4 methylcoumarin, carbostyrene - preferably 7-amino-4-methylcarbostyryl - and oxadiazoles - preferably 2- (4-biphenyl) -5-phenyl-1,3,4-oxadiazole.
Zur Anwendung bei der Sequenzierung ist diese Erfindung besonders geeignet, da erstmals die Information, die in den spezifischen Kettenabbrüchen liegt, durch die Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an die terminalen Nukleotide zur Identifikation genutzt wird.For use in sequencing, this invention is particular suitable, since for the first time the information, which in the specific Chain termination is due to the coupling of fluorescent dyes the terminal nucleotides are used for identification.
Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Kennzeichnung von Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man Thionukleotide in die Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide inkorporiert und anschließend spezifisch kovalent an den Schwefel des Thionukleotids Detektormoleküle koppelt.The invention further relates to a method for the identification of Nucleic acids or oligonucleotides, characterized in that Thionucleotides incorporated into the nucleic acids or oligonucleotides and then specifically covalently attached to the sulfur of the thionucleotide Coupling detector molecules.
Kennzeichnung der Nukleinsäure bzw. des Oligonukleotids bedeutet, daß die Nukleinsäure bzw. das Oligonukleotid sichtbar oder detektierbar gemacht wird.Labeling of the nucleic acid or the oligonucleotide means that the Nucleic acid or the oligonucleotide made visible or detectable becomes.
Als Detektormoleküle können u. a. Farbstoffe, radioaktive Label, Spinlabel oder Antigene dienen. Letztere können in einer Antigen-Antikörperreaktion mit gefärbten Antikörpern sichtbar gemacht werden. Die Detektion kann in üblicher Weise, z. B. fluoreszenzmikroskopisch, spektroskopisch oder mit Hilfe der Blot-Technik erfolgen.As detector molecules u. a. Dyes, radioactive labels, spin labels or antigens. The latter can be in an antigen-antibody reaction be visualized with stained antibodies. The detection can be in usual way, z. B. fluorescence microscopy, spectroscopy or with Help the blotting technique done.
Als Thionukleotide eignen sich zum Einbau in die Nukleinsäure bzw. das Oligonukleotid solche, die in der 2′- bzw. 3′-Stellung der Pentose eine SH-Gruppe tragen, wie z. B. 2′,3′-Didesoxy-3′-thioribose, 2′,3′-Didesoxy- 3-thioxylose, 2′,3′-Didesoxy-2′-thioarabinose, 2′-Desoxy-2′-thioarabinose, 3′-Desoxy-3′-thioxylose, 3′-Desoxy-3′-thioribose. Besonders geeignet sind solche Thionukleotide, die das S-Atom am Phosphor tragen, d. h. die Desoxynukleotid-5′-thiophosphate bzw. Nukleotid-5′-thiophosphate.Thionucleotides are suitable for incorporation into the nucleic acid or the Oligonucleotide those which in the 2'- or 3'-position of the pentose a Wear SH group, such as 2 ', 3'-dideoxy-3'-thioribose, 2', 3'-dideoxy 3-thioxylose, 2 ', 3'-dideoxy-2'-thioarabinose, 2'-deoxy-2'-thioarabinose, 3'-deoxy-3'-thioxylose, 3'-deoxy-3'-thioribose. Particularly suitable those thionucleotides which carry the S atom on the phosphorus, d. H. the Deoxynucleotide 5'-thiophosphates or nucleotide 5'-thiophosphates.
Die Inkorporierung des Thionukleotids erfolgt terminal und/oder an beliebigen Stellen der Nukleinsäure bzw. des Oligonukleotids auf chemische oder vorzugsweise enzymatische Weise. Der terminale Einbau erfolgt zur Sequenzanalyse, der Einbau an beliebigen Stellen dient der Kennzeichnung der Nukleinsäuren und Oligonukleotide.The incorporation of the thionucleotide takes place terminally and / or on Any position of the nucleic acid or the oligonucleotide on chemical or preferably enzymatic way. The terminal installation takes place for Sequence analysis, the installation at arbitrary points is used for labeling the nucleic acids and oligonucleotides.
Die terminale enzymatische Inkorporierung des Thionukleotids erfolgt durch matrizengesteuerte Polymerisation von Nukleinsäure mit einer Polymerase in Gegenwart eines variierten Terminators. Unter variierten Terminatoren sind Didesoxynukleotid-α-thiophosphate bzw. Triphosphate der oben genannten Didesoxypentosen mit einer SH-Gruppe zu verstehen.The terminal enzymatic incorporation of the thionucleotide is effected by template-controlled polymerization of nucleic acid with a polymerase in the presence of a varied terminator. Diversified terminators are dideoxynucleotide α- thiophosphates or triphosphates of the abovementioned dideoxypentoses with an SH group.
Die enzymatische Inkorporierung von Thionukleotiden an beliebigen Stellen einer DNA erfolgt vorzugsweise durch die enzymatische Nick-Translation in Gegenwart einer DNAase und einer DNA-Polymerase. Als DNAase eignet sich beispielsweise Desoxyribonuclease I aus Rinderpankreas. Als DNA- Polymerasen kommen beispielsweise Polymerase I aus E. coli, das Klenow- Fragment und T 7-DNA-Polymerase in Betracht.The enzymatic incorporation of thionucleotides at arbitrary sites a DNA is preferably carried out by the enzymatic nick translation in Presence of a DNAase and a DNA polymerase. As a DNAase is suitable for example deoxyribonuclease I from bovine pancreas. As a DNA Polymerases are, for example, polymerase I from E. coli, which Klenow- Fragment and T 7 DNA polymerase into consideration.
Die chemische Inkorporierung der Thionukleotide erfolgt in bekannter Weise (vgl. Winnacker: Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, D-6940 Weinheim, 1985, Seiten 44 ff.). Anstelle von Nukleotiden werden lediglich Thionukleotide eingesetzt.The chemical incorporation of the thionucleotides takes place in a known manner (see Winnacker: Gene and Clones, VCH Verlagsgesellschaft, D-6940 Weinheim, Germany) 1985, pages 44 ff.). Instead of nucleotides are only thionucleotides used.
Der Farbstoff kann an das Thionukleotid direkt gebunden werden. Voraussetzung hierfür ist jedoch, daß der Farbstoff eine aktivierte Kopplungsgruppe für Schwefel enthält. Solche Gruppen sind beispielsweise α-Halogenacetyl-, Maleinimid- und Allylbromidgruppen. Farbstoffe dieser Art sind beispielsweise in dem Katalog "Bioprobes" von der Firma Molecular Probes, Eugene, USA, beschrieben. The dye can be directly attached to the thionucleotide. The prerequisite for this, however, is that the dye contains an activated coupling group for sulfur. Such groups include, for example, α- haloacetyl, maleimide and allyl bromide groups. Dyes of this type are described, for example, in the catalog "Bioprobes" by Molecular Probes, Eugene, USA.
Die Färbung kann auch direkt erfolgen. Hierzu wird ein wie oben beschriebenes aktiviertes Hapten gebunden. Das kann mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit gefärbten Antikörpern oder durch die Kopplung eines Enzyms, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion auslöst, geschehen (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1981) 2238, Exptl. Cell Res. 153 (1984) 61, Histochem. 85 (1986) 1).The coloring can also be done directly. This will be as above linked activated hapten. That can be done with the help of a Antigen-antibody reaction with stained antibodies or by the Coupling of an enzyme, such as peroxidase, which triggers a color reaction, See, for example, Proc Natl Acad Sci USA 70 (1981) 2238 Expt. Cell Res. 153 (1984) 61, Histochem. 85 (1986) 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren bringt folgende Vorteile:The method according to the invention has the following advantages:
- 1. Die Färbung der DNA erfolgt unmittelbar vor der Auftrennung bzw. der Sichtbarmachung. Dadurch bleiben praktisch alle Eigenschaften der DNA bis zur Sichtbarmachung erhalten. Die Nukleotide in der DNA werden durch den Austausch eines Sauerstoffatoms gegen ein Schwefelatom bzw. eines Wasserstoffatoms gegen eine SH-Gruppe nicht wesentlich geändert. Hierdurch unterscheidet sich das neue Verfahren deutlich von den bekannten Verfahren.1. The staining of the DNA takes place immediately before the separation or the Visualization. This leaves virtually all the properties of the DNA until the visualization. The nucleotides in the DNA become by replacing an oxygen atom with a sulfur atom or of a hydrogen atom to an SH group has not changed significantly. As a result, the new process differs significantly from the known methods.
- 2. Die Färbereaktion verläuft unter milden Reaktionsbedingungen schnell und quantitativ.2. The staining reaction proceeds rapidly under mild reaction conditions and quantitatively.
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei der DNA-Sequenzierung macht es erstmals möglich, eine Trennbahn für alle Basen und nur einen Farbstoff zur Identifikation der Basen zu verwenden. Durch dieses 1-Bahn-1-Farbstoff-Konzept wird eine Steigerung der Analysengenauigkeit erreicht und die Durchführung der DNA-Sequenzierung wesentlich erleichtert, da alle Trennsysteme und insbesondere auch HPLC angewendet werden können.The application of the present invention in DNA sequencing makes It is possible for the first time to use a separator for all bases and only one dye to use for the identification of the bases. Through this 1-lane 1-dye concept an increase in analytical accuracy is achieved and Making DNA sequencing much easier, since all Separation systems and in particular also HPLC can be used.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden keine wrong stops beobachtet, da diese nicht markiert werden. Wrong stops sind Kettenabbrüche, die unspezifisch in der DNA erfolgen und für die es z. Z. keine Erklärung gibt.In the method according to the invention no wrong stops are observed, because they are not marked. Wrong stops are chain terminations that unspecifically done in the DNA and for it z. Z. no explanation gives.
Die Verwendung von zusätzlich in der Base variierten Didesoxynukleotiden verstärkt die Auflösungsgenauigkeit der optischen Charakterisierung der terminalen Nukleotide. Die Variation in der Base besteht beispielsweise im Austausch von C- gegen N-Atome oder umgekehrt, z. B. durch Verwendung von 3,7-Diazapurin, 5-Aza-7-desapurin oder 6-Azacytosin.The use of additionally varied in the base dideoxynucleotides Strengthens the resolution accuracy of the optical characterization of terminal nucleotides. The variation in the base is, for example, in Exchange of C for N atoms or vice versa, z. B. by using 3,7-diazapurine, 5-aza-7-desapurine or 6-azacytosine.
Dieselbe Wirkung wie das 1-Bahn-1-Farbstoff-Konzept hat 1-Bahn-2-Farbstoffkonzept, das zusätzlich noch die spektrale Unterscheidung der Farbstoffe in Kombination mit den Fluoreszenzlebenszeiten nutzt. The same effect as the 1-lane 1 dye concept has 1-lane 2 dye concept, additionally the spectral distinction of the Dyes in combination with fluorescence lifetimes.
Das neue Verfahren benutzt zum ersten Mal die Messung der Fluoreszenzlebenszeit von an DNA-Moleküle gekoppelten Farbstoffen. Die Messung ist sehr empfindlich, da das sonst bei steady-state-Messungen störende Streulicht der Anregung die Messung nicht beeinflussen kann. Die Meßgenauigkeit wird dadurch erhöht. Außerdem erlaubt die Messung der Fluoreszenzlebenszeit die Identifikation der Basen, auch wenn sich deren Banden überlappen, da die Dauer der Lebenszeiten durch die Überlappung nicht beeinflußt wird. Die Lebenszeit kann beispielsweise durch single shot, single photon counting oder mit einer Streak-Kamera gemessen werden, bei einer Anregung mit einer schnellen Blitzlichtlampe oder einem kurzen Laserpuls geeigneter Wellenlänge.The new method uses fluorescence lifetime measurement for the first time of dyes coupled to DNA molecules. The measurement is very sensitive, otherwise it interferes with steady-state measurements Stray light of the excitation can not influence the measurement. The Measuring accuracy is thereby increased. In addition, the measurement allows the Fluorescence lifetime the identification of the bases, even if their Gangs overlap, as the lifetimes are limited by the overlap is not affected. The lifetime can be, for example, single shot, single photon counting or be measured with a streak camera, when excited with a fast flashlamp or a short flash Laser pulse of suitable wavelength.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzierung basiert im wesentlichen auf folgenden Voraussetzungen:The method according to the invention for sequencing is based essentially on the following conditions:
- 1. Matrizengesteuerte Polymerisation mit einem variierten Terminator, so daß jeder DNA-Strang eine spezifische Kopplungsstelle am Ende hat.1. Template-controlled polymerization with a varied terminator, see above that each DNA strand has a specific coupling site at the end.
- 2. Kopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs mit der Eigenschaft, daß durch die unterschiedliche Fluoreszenzlebenszeit die terminalen Nukleotide identifiziert werden.2. Coupling of a fluorescent dye with the property that the different fluorescence lifetime the terminal nucleotides be identified.
- 3. Trennung der DNA-Bruchstücke auf einer Bahn mittels HPLC oder Elektrophorese.3. Separation of DNA fragments on a web by HPLC or Electrophoresis.
Dieses Verfahren ist auch zur Automatisation geeignet. Da zur Zeit große Anstrengungen unternommen werden, um die DNA-Sequenzierung zu beschleunigen, stellen der Ersatz der radioaktiven Markierung durch einen Fluoreszenzfarbstoff, das 1-Bahnkonzept und die somit erleichterte Automatisation einen wesentlichen Schritt in diese Richtung dar.This method is also suitable for automation. Because at the moment big Efforts are being made to increase DNA sequencing accelerate the replacement of the radioactive label by one Fluorescent dye, the 1-Bahn concept and thus facilitated Automation is a significant step in this direction.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für spezielle Farbstoffkopplung an DNA stellt die in-situ-Hybridierung dar. Neben dem Zeitgewinn durch den Ersatz von radioaktiven Markierungen durch Fluoreszenzfarbstoffe ist man auch an der simultanen Detektion mehrerer Hybride interessiert, welche durch Farbreaktionen realisierbar ist.Another field of application for special dye coupling to DNA represents the in-situ hybridization. In addition to the time saved by the replacement of radioactive labels by fluorescent dyes is also on interested in the simultaneous detection of several hybrids, which by Color reactions is feasible.
Bei den Färbemethoden der bekannten Sequenzierverfahren wurde der Farbstoff direkt an die Base des Nukleotids oder an den ersten Zuckerrest des Primers gebunden. Solche Modifikationen durch zusätzliche meist aromatische Systeme stören zu sehr bei der in-situ-Hybridisierung, so daß man sich hier bei den derzeitigen Verfahren darauf beschränkt, vor der Hybridisierung die Basen chemisch durch Bindung von Haptenen und durch Kopplungsstellen zu modifizieren, um nach der Hybridisierung die Farbstoffkopplung durchzuführen. Die chemischen Eigenschaften werden durch die drastischen Modifikationen stark beeinflußt.In the staining methods of the known sequencing methods, the Dye directly to the base of the nucleotide or to the first sugar residue bound to the primer. Such modifications by additional mostly aromatic systems interfere too much with in situ hybridization, so that Here, in the current procedures, you are limited to this, before the Hybridize the bases chemically by binding haptens and by To modify coupling sites after the hybridization of the Dye coupling to perform. The chemical properties are going through strongly affected the drastic modifications.
Die Basenmodifikation beeinflußt ebenfalls die Hybridisierungseigenschaften sehr, die in veränderten Schmelztemperaturen und veränderten Enzymaffinitäten ihren Ausdruck finden.The base modification also affects the hybridization properties very, which changed in melting temperatures and changed Enzyme affinities find their expression.
Hinsichtlich der Farbstoffkopplung bietet die Erfindung folgende Vorteile;With regard to the dye coupling, the invention offers the following advantages;
- 1. Erstmals wird nicht die Base modifiziert, sondern der Phosphat- oder Zuckerrest variiert.1. For the first time not the base is modified, but the phosphate or Sugar residue varies.
- 2. Erstmals können alle Basen oder nur eine gewünschte Region gefärbt werden.2. For the first time, all bases or only one desired region can be colored become.
- 3. Eine Steigerung der Farbstoffdichte ist möglich und somit eine Steigerung der Empfindlichkeit3. An increase of the dye density is possible and thus a Increase in sensitivity
- 4. Alle Moleküle, die zur indirekten Färbereaktion erwünscht sind, können gekoppelt werden.4. All molecules that are desired for indirect staining reaction can be coupled.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur in-situ-Hybridisierung basiert im wesentlichen auf folgenden Voraussetzungen:The method according to the invention for in situ hybridization is based on essentially on the following conditions:
- 1. Die Nukleinsäureproben können durch Nick-Translation mit Thio-desoxynukleotiden, durch matrizengesteuerte Polymerisation oder durch chemische Synthese hergestellt werden.1. The nucleic acid samples can be analyzed by nick translation Thio-deoxynucleotides, by matrix-controlled polymerization or be prepared by chemical synthesis.
- 2. Die Nukleinsäureprobe mit einem beliebigen Anteil an inkorporierten Thionukleotiden wird zur in-situ-Hybridisierung eingesetzt.2. The nucleic acid sample with any proportion of incorporated Thionucleotides are used for in situ hybridization.
- 3. Erst nach der Hybridisierung wird die Kopplungs- und Färbereaktion durchgeführt.3. Only after hybridization is the coupling and staining reaction carried out.
Im Vergleich zu den obigen Methoden ist diese Methode mindestens 4× empfindlicher, da hier alle Basen und nicht nur eine Base gefärbt werden können. Um das gegenseitige Quenchen der benachbarten Farbstoffe zu vermeiden, kann man lipophile Solventien wie Hexafluorisopropanol zusetzen. Um die Farbstoffdichte weiter zu erhöhen, kann man Kopplungs reagentien verwenden, die mehrere Farbstoffe tragen. Das gleiche Ziel läßt sich auch erreichen, wenn man ein Antigen koppelt und dies über Antigen-/ Antikörperreaktionen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachweist.Compared to the above methods, this method is at least 4 × more sensitive, since all bases and not just a base are dyed here can. To the mutual quenching of the adjacent dyes too You can avoid lipophilic solvents such as hexafluoroisopropanol enforce. In order to increase the dye density further, one can coupling use reagents that carry multiple dyes. The same goal lets can also be achieved by coupling an antigen and doing so via antigen / Detects antibody reactions with fluorescently labeled antibodies.
Für die Färbereaktion wurde in allen Beispielen der Farbstoff 7-Amino-N-(2-ethylaminocarbonyliodmethyl)-4-methyl-cumarin (=4,7-IEME-Cum) verwendet.For the staining reaction, the dye was used in all examples 7-amino-N- (2-ethylaminocarbonyliodomethyl) -4-methyl-coumarin (= 4,7-IEME-cum) used.
13 mg (0,034 m Mol) 4,7-IEME-Cum wurden in 625 µl Dimethylformamid gelöst. Danach wurden schnell 300 µl 1 M Puffer (Tris/HCl, pH 7,4) und 325 µl 83 mM (0,027 m Mol) Thio-AMP in wäßriger Lösung zugegeben. Nach 1 min bei 5°C war die Reaktion vollständig abgelaufen und kein Thio-AMP mehr nachweisbar.13 mg (0.034 mol) of 4,7-IEME-cum were dissolved in 625 μl of dimethylformamide solved. Thereafter, 300 μl of 1 M buffer (Tris / HCl, pH 7.4) and 325 μl of 83 mM (0.027 mol) of thio-AMP in aqueous solution. To 1 min at 5 ° C, the reaction was complete and no Thio-AMP more detectable.
Die Reaktionslösung wurde durch Säulenchromatographie über ®QAE-Sephadex A25 mit Triethylammoniumbicarbonat pH 7,5 (Gradientenelution: 20-150 mM; 2×2 l) bei 4°C aufgetrennt. Die fluoreszierende Funktion enthielt das Produkt in annähernd 100%-Ausbeute.The reaction solution was purified by column chromatography ®QAE-Sephadex A25 with triethylammonium bicarbonate pH 7.5 (Gradient elution: 20-150 mM, 2 x 2 L) separated at 4 ° C. The fluorescent function contained the product in approximate 100% yield.
Der Reinheitsgrad betrug gemäß HPLC-Analyse 80% (reversed phase C₁₈-Kieselgel mit Gradientenelution: Puffer (50 mM KHPO₄, pH 6,5)-Acetonitril/Puffer (1.1) mit der Steigerung: 100% in 50 min). Das Produkt wurde von der Säule bei ca. 40% eluiert. Es waren keinerlei fluoreszierende Verunreinigungen in dem Produkt enthalten.The purity was according to HPLC analysis 80% (reversed phase C₁₈ silica gel with gradient elution: buffer (50 mM KHPO₄, pH 6.5) -Acetonitrile / buffer (1.1) with the increase: 100% in 50 min). The product was eluted from the column at ca. 40%. There were do not contain any fluorescent impurities in the product.
In entsprechender Weise läßt sich der Farbstoff an Thio-TMP, Thio-GMP und Thio-CMP koppeln und die entsprechenden Thiodesoxynukleotide koppeln.In a similar manner, the dye can be thio-TMP, thio-GMP and thio-CMP and the corresponding thiodesoxynucleotides couple.
Die mit dem Farbstoff (F) gekoppelten Nukleotide werden als AF, GF, CF, TF bezeichnet. Die Einzelschußfluoreszenzlebensdauermessung wurde als Meßart gewählt.The nucleotides coupled to the dye (F) are termed AF, GF, CF, TF denotes. Single shot fluorescence lifetime measurement was reported as Measuring mode selected.
Gemessene Lebenszeiten in H₂O:Measured lifetimes in H₂O:
Die zu sequenzierende einzelsträngige DNA wird mit einem zum Anfangsteil der zu lesenden Sequenz komplementären Oligonukleotid (Primer) hybridisiert. Das Hybrid bildet den Ausgangspunkt des DNA-Polymeraseschrittes (b).The single-stranded DNA to be sequenced with a for Initial part of the sequence to be read complementary oligonucleotide (Primer) hybridizes. The hybrid forms the starting point of the DNA polymerase step (b).
Bei der matrizengesteuerten Polymerisation wird ausgehend von dem anhybridisierten Oligomer (Primer) ein komplementärer Gegenstrang zur zu sequenzierenden DNA-Matrize synthetisiert. In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen wurde jeweils ein Thiodesoxy-Analog als Terminator im Gemisch mit den natürlichen Nukleotiden angeboten und so statistisch verteilte Abbrüche der Polymerasereaktion an der wachsenden Gegenkette erzielt.In the template-controlled polymerization starting from the an oligomer (primer) hybridized to a complementary strand synthesized to be sequenced DNA template. In 4 different Reactions were each a thiodesoxy analog terminator offered in a mixture with the natural nucleotides and so on statistically distributed terminations of the polymerase reaction at the scored growing counter-chain.
Die Markierung der bei der Sequenzierung gebildeten DNA-Fragmente mit basenspezifischen Enden kann entweder durch konventionelle radioaktive Markierungstechniken, beispielsweise durch Verwendung von am 5′-Ende mit 32p-markierten Primer-Oligonukleotiden oder durch Ankopplung von Fluoreszenzlabeln an die Thiofunktion der Thio-2′,3′-didesoxynukleotide nach erfolgter enzymatischer Sequenzierreaktion.Labeling of DNA fragments with base-specific ends formed during sequencing may be performed either by conventional radioactive labeling techniques , for example by using 5 'end with 32p- labeled primer oligonucleotides or by coupling fluorescent labels to the thio function of the thio-2', 3'-dideoxynucleotides after enzymatic sequencing reaction.
Es wird die Sequenz des DNA-Bruchstücks ermittelt, welches man erhält, wenn man das HIV I pol-Leseraster mit den Restriktionsenzymen Bgl I und Sal I schneidet. Das zu sequenzierende Bruckstück wird in den Vektor M13 mp 19 mit den BamH I- und Sal I-Schnittstellen eingebaut und kloniert.It determines the sequence of the DNA fragment that is obtained if the HIV I pol reading frame with the restriction enzymes Bgl I and Sal I cuts. The Bruckstück to be sequenced is in the Vector M13 mp 19 incorporated with the BamH I and Sal I interfaces and cloned.
Man pipettierte
2 µl DNA-Lösung, 100-300 µg/ml
0,5 µl Oligomer, 5 µg/ml (5′-GTAAAACGACGGCCA-3′)
1 µl Puffer:
200 mM Tris/HCl pH 7,5, 100 mM MgCl₂,
10 mM Dithioerythrol, 500 mM NaCl
6,5 µl Wasser
in ein Eppendorf-Gefäß und inkubierte den Reaktionsansatz 60 min
bei 65°C.One pipetted
2 μl of DNA solution, 100-300 μg / ml
0.5 μl oligomer, 5 μg / ml (5'-GTAAAACGACGGCCA-3 ')
1 μl buffer:
200 mM Tris / HCl pH 7.5, 100 mM MgCl₂,
10 mM dithioerythrol, 500 mM NaCl
6.5 μl of water
in an Eppendorf tube and incubated the reaction mixture at 65 ° C for 60 min.
Das Reaktionsgemisch aus a. wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurden 0,8 µl (=4 Units) DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) zugegeben und der Polymerisationsansatz auf einer Mikrotiterplatte in 4 Ansätze zu je 2,5 µl aufgeteilt.The reaction mixture from a. was cooled to room temperature. Subsequently, 0.8 μl (= 4 units) of DNA polymerase (Klenow fragment) was added and the polymerization mixture on a microtiter plate divided into 4 batches of 2.5 ul.
Zu jeder der Reaktionen wurden danach 3 µl des jeweiligen Sequenziermixes gegeben, der die Polymerisation startet.For each of the reactions were then 3 .mu.l of the respective Sequencing mix is given, which starts the polymerization.
Es wurden folgende 4 Nukleotidlösungen (die Zahlenangaben bedeuten µMol/l) = "Sequenziermixe" verwendet:The following 4 nucleotide solutions (the numbers mean μMol / l) = "sequencing mixes" used:
Zur Polymerisation ließ man die 4 Ansätze 20 min bei Raumtemperatur stehen.For polymerization, the 4 batches were left for 20 minutes at room temperature stand.
Die Auftrennung und Detektion kann durch das oben beschriebene 1-Bahn-1-Farbstoffprinzip oder wahlweise durch das 4-Bahnprinzip mit radioaktiv markierten Nukleotiden erfolgen. The separation and detection can be accomplished by the above-described 1-lane-1 dye principle or optionally by the 4-lane principle with radioactively labeled nucleotides take place.
Die DNA-Stränge wurden durch Elektrophorese bei 75 Watt in 2 h auf 6% Acrylamid-8M-Harnstoffgelen nach der Methode von Sanger und Coulson (FEBS-Letters 87 (1978) 107) aufgetrennt. Bei der Detektion durch Autoradiographie erhielt man dieselbe Sequenz wie Ratner et al. (Nature 313 (1985) 277).The DNA strands were electrophoresed at 75 watts in 2 h to 6% Acrylamide 8M urea gels according to the method of Sanger and Coulson (FEBS Letters 87 (1978) 107). In the detection by Autoradiography was given the same sequence as Ratner et al. (Nature 313 (1985) 277).
Zur Inkorporation der Thionukleotide in die Proben-DNA wird eine Nick-Translation durchgeführt. Es wurde die DNA-Probe (PUC 177) verwendet, die spezifisch an die Zentromerregion des humanen Chromosoms 1 bindet. Die in-situ-Hybridisierung wird mit einer Zellkern-Metaphasenplatte durchgeführt, indem die Metaphasenkerne und die Proben-DNA gemeinsam denaturiert und anschließend renaturiert werden, wobei nur die kleine Proben-DNA an das Chromosom 1 hybridisieren kann. Die erfolgte Hybridisierung wird unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.For incorporation of the thionucleotides in the sample DNA is a Nick translation performed. It was the DNA sample (PUC 177) used specifically to the centromeric region of the human Chromosome 1 binds. The in situ hybridization is done with a Nuclear metaphase plate performed by the metaphase nuclei and the sample DNA is denatured together and then renatured with only the small sample DNA to chromosome 1 can hybridize. The hybridization is carried out under the Observed fluorescence microscope.
- Ansatz:
1 µg Proben DNA (pUC 177) V = 2,5 µl c = 435 µg/ml
Thio-d-UTP: 10 µl, c = 0,5 mM
dATP/dGTP/dCTP: je 5 µl, c = 0,2 nM
Nick-Translations-Puffer: 5 µl
H₂O: 12,5 µl- Approach:
1 μg of sample DNA (pUC 177) V = 2.5 μl c = 435 μg / ml
Thio-d-UTP: 10 μl, c = 0.5 mM
dATP / dGTP / dCTP: 5 μl each, c = 0.2 nM
Nick translation buffer: 5 μl
H₂O: 12.5 μl
Nach der Mischung der Reaktionslösung wurden 5 µl Enzymlösung zupipettiert, und der Ansatz bei 15°C für 90 min inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde rasch auf Eis abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopp-Mix beendet. After mixing the reaction solution, 5 μl of enzyme solution pipetted and the batch incubated at 15 ° C for 90 min. To Expiration of the incubation period was rapidly cooled on ice and the Reaction ended by adding 50 μl Stop Mix.
Verwendete Lösungen:
- Nick-Translations-Puffer:
Tris/HCl (pH: 7,2): 0,5 M
MgSO₄: 0,1 M
Dithiothreitol: 1×10-3 Mol/l
Rinderserumalbumin (Fraktion V): 500 µg/ml
- Enzymlösung:
DNA-Polymerase (E. coli): 0,4 E/ml
DNAase I (Rinderpankreas): 40 pg/µl
- Stopp-Mix:
Bromphenolblau: 0,1%
Dextranblau: 0,5%
NaCl: 0,1 M
EDTA: 0,2 mM
Tris/HCl (pH 7,8): 0,2 mMUsed solutions:
- Nick translation buffer:
Tris / HCl (pH 7.2): 0.5M
MgSO₄: 0.1M
Dithiothreitol: 1 × 10 -3 mol / l
Bovine serum albumin (fraction V): 500 μg / ml
- Enzyme solution:
DNA polymerase (E. coli): 0.4 U / ml
DNAase I (bovine pancreas): 40 pg / μl
- Stop Mix:
Bromophenol blue: 0.1%
Dextran blue: 0.5%
NaCl: 0.1M
EDTA: 0.2 mM
Tris / HCl (pH 7.8): 0.2 mM
- Ansatz der Proben-DNA aus Schritt a)
Proben-DNA (PUC 177): 10 µl
Formamid: 30 µl
20×SSC pH 7: 5 µl
H₂O: 5 µl
Verwendete Lösung:
- 20×SSC (pH 7,0): NaCl 1,5 M
Na₃-Citrat 0,15 M
- Denaturierung
Gleichzeitige Denaturierung der Proben-DNA und der auf dem
Objektträger fixierten Kerne und Metaphasen bei 70°C für 10 min.
- Hybridisierung
Über Nacht bei 40-42°C.
- Nachweisreaktion und Beobachtung
Nach Waschen der Objektträger wurden diese mit Färbelösung
behandelt:
- Tris/HCl (1M) pH=7,8: 5 µl
- H₂O/DMF (1 : 1): 45 µl
- 4,7-IEMeCum: 0,5 µg- Approach of the sample DNA from step a)
Sample DNA (PUC 177): 10 μl
Formamide: 30 μl
20 × SSC pH 7: 5 μl
H₂O: 5 ul
Used solution:
20X SSC (pH 7.0): NaCl 1.5M
Na₃-citrate 0.15 M.
- denaturation
Simultaneous denaturation of the sample DNA and the nuclei and metaphases fixed on the slide at 70 ° C for 10 min.
- Hybridization
Overnight at 40-42 ° C.
- Detection reaction and observation
After washing the slides, they were treated with staining solution:
Tris / HCl (1M) pH = 7.8: 5 μl
- H₂O / DMF (1: 1): 45 ul
- 4,7-IEMeCum: 0,5 μg
Hinterher wurde die Färbelösung abgewaschen und die Metaphasen der Zellkerne auf dem Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.Afterwards, the staining solution was washed off and the metaphases the cell nuclei on the slide under the fluorescence microscope observed.
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