DE3802221C2 - Method for measuring the volume flow rate of cells of a cell suspension, of whole blood cells or of components of the blood plasma - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Volumenflußrate von Zellen einer Zellsuspension, von Voll­ blut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas.The invention relates to a method for measuring the Volume flow rate of cells of a cell suspension, of Voll blood cells or components of blood plasma.

Das Blut übernimmt im Körper zahlreiche komplexe physio­ logische Funktionen. Diese betreffen:The blood takes over numerous complex physio in the body logical functions. These concern:

• a) die Versorgung aller Organe mit Sauerstoff und Stoffwechselsubstraten;a) the supply of all organs with oxygen and Metabolic substrates;
• b) die "Endsorgung" aller Organe von Kohlendioxid und Metaboliten(b) the "final disposal" of all organs of carbon dioxide and Metabolites
• c) die Regulation der Körpertemperatur durch Abführung von Stoffwechselwärme in die Peripherie;c) regulation of body temperature by dissipation from metabolic heat to the periphery;
• d) die Ausführung von Schutzfunktionen durch humorale und zelluläre Abwehrsysteme;d) the execution of protective functions by humoral and cellular defense systems;
• e) die Regulation des Wasserhaushaltes.e) the regulation of the water balance.

Eine wesentliche Voraussetzung zur Erfüllung dieser Funktionen ist die Durchlässigkeit der kleinsten Blutge­ fäße, in die sich der Blutkreislauf in allen Organen aufspaltet. Diese Blutgefäße werden in ihrer Gesamtheit jeweils als "Mikrozirkulationssystem" eines Organs bezeichnet. Die Durchlässigkeit der Mikrogefäße hängt zum einen von bestimmten Plasmakomponenten des Vollblu­ tes (z. B. Fibrin oder Albumin) ab, die aufgrund ihrer Konzentration eine bestimmte Plasmaviskosität hervorru­ fen. Zum anderen aber hängt die Durchlässigkeit der Mikrogefäße von der Konzentration, vor allem aber von der biologischen Reaktivität bestimmter Zellen des Vollblutes ab. Bei solchen Zellen handelt es sich haupt­ sächlich um die Thrombozyten und die Granulozyten, die durch bestimmte Mediatorsubstanzen in kürzester Zeit aktiviert und zu ganz bestimmten Reaktionsweisen (Ände­ rung der Gestalt, Adhäsivität an der Gefäßwand, Aggrega­ tion, Freisetzung bestimmter Stoffwechselprodukte und eigener Mediatoren) stimuliert werden können. Durch dieses Verhalten kann es lokal zu einer drastischen Einschränkung des Blutflusses durch ein betroffenes Mikrozirkulationssystem kommen. Bei einer derartigen lokalen Erscheinung kann es sich beispielsweise um eine akute Entzündung handeln. Die Prozesse können sich in Notfällen aber auch aufschaukeln und generalisieren, wodurch lebensbedrohliche Schockzustände hervorgerufen werden können, wie dies beispielsweise bei einer bakte­ riellen Sepsis der Fall ist. An essential prerequisite for fulfilling this Functions is the permeability of the smallest blood  in which the blood circulation is in all organs splits up. These blood vessels are in their entirety each as a "microcirculation system" of an organ designated. The permeability of the microvessels depends on the one hand from certain plasma components of whole blood tes (e.g. fibrin or albumin), which due to their Concentration a certain plasma viscosity fen. On the other hand, the permeability depends on the Microvessels of concentration, but especially of the biological reactivity of certain cells of the Whole blood. Such cells are at all the platelets and the granulocytes through certain mediator substances in the shortest possible time activated and for very specific reactions (change shape, adhesiveness to the vessel wall, aggrega tion, release of certain metabolic products and own mediators) can be stimulated. By this behavior can be drastic locally Restriction of blood flow from an affected person Microcirculation system come. With such a local appearance may be, for example act acute inflammation. The processes can But also build up and generalize emergencies, causing life-threatening shock can be, as is the case with a bakt rial sepsis is the case.  

Aufgrund des geschilderten Sachverhaltes ergibt sich ein großes klinisches Interesse, die Reaktionsbereitschaft der verschiedenen Blutzellen im Vollblut zu erfassen bzw. zu diagnostizieren, und den Aktivierungszustand dieser Blutzellen durch möglichst spezifisch wirkende Medikamente zu hemmen. Ein als "Screening-System" ausge­ legtes entsprechendes Meßsystem würde die Selektion und Entwicklung spezifischer pharmazeutischer Produkte bzw. Arzneien wesentlich erleichtern.Based on the facts described, there is a great clinical interest, willingness to react of the various blood cells in whole blood or diagnose, and the activation state of these blood cells by acting as specifically as possible Inhibit medication. One out as a "screening system" appropriate measurement system would be the selection and Development of specific pharmaceutical products or Make medicines much easier.

Bisher ist man bei der Beurteilung entsprechender Krite­ rien vor allem auf intakte Mikrozirkulationssysteme lebender Organe im Tierversuch angewiesen. Häufige Anwendungen findet hierbei die Hamster-Backentasche und die Skrotalhaut von Nagetieren, bei denen es sich um zwei extrem dünne Organsysteme handelt, die einer direk­ ter mikroskopischen Beobachtung im Durchlicht zugänglich sind. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die Veröffentlichungen "Nouvelles methodes d′etude de la fonction microcirculatoire , Institut national de la Sant´ et de la recherche medicale, R. Georges, (1986)", und "Harell, G.S. et al.: Microvasc. Res. 18, 384-402 (1979)" verwiesen.So far, one has been evaluating appropriate criteria especially on intact microcirculation systems living organs in animal experiments. Frequent Applications include the hamster cheek pouch and the scrotal skin of rodents, which are two extremely thin organ systems, one of which is direct open to microscopic observation in transmitted light are. In this context, for example, the Publications "Nouvelles methodes d′etude de la fonction microcirculatoire, Institut national de la Sant´ et de la recherche medicale, R. Georges, (1986) ", and "Harell, G.S. et al .: Microvasc. Res. 18, 384-402 (1979) ".

Neben ethischen Gesichtspunkten erschweren aber vor allem die Komplexität, die Schwierigkeit der Prepara­ tion, die geringe Flexibilität der Versuchsanordnung, die schlechte Reproduzierbarkeit und die sehr teure Durchführung eine breitere Anwendung dieser Systeme. Zudem können physiologisch-chemische Prozesse, denen nach heutiger Erkenntnis immer mehr Bedeutung im Rahmen von Zellaktivierungsprozessen im Kreislaufsystem zuge­ messen werden müssen (siehe "Lewis, D.H. et al., Prog. appl. Microcirc. 12, 231-235 (1987)"), kaum erfaßt werden, da die Entnahme von Blut aus den erwähnten Mikrozirkulationssystemen technisch sehr schwierig ist und sich auf die für entsprechende chemische Analysen nicht ausreichenden Mengen von wenigen Mikrolitern beschränken muß. Als Ausweichmöglichkeit zum Studium zellulärer und humoraler Interaktionen wurden daher in den letzten Jahren in vitro-Methoden eingesetzt, bei denen man in Petrischalen gezüchtete Endothelzellen - die in vivo die Innenwand aller Blutgefäße auskleiden - mit verschiedenen Blutzellen inkubiert (siehe beispiels­ weise "Cronstein, BN.N. et al., in "Topics and Perspec­ tives in Adenosine Research - Gerlach E. u. Becker B. F. - Hrsg. Springer Verlag Heidelberg, 299-308 (1987)"). Dieser Ansatz hat aber den Nachteil, daß der Einfluß der in vivo oft entscheidenden Blutrheologie nicht miterfaßt wird und daß daher die so gewonnenen Aussagen nur eine zweifelhafte Übertragbarkeit auf die Situation im Kreis­ laufsystem ergeben. Zudem eignen sich solche Testsysteme nicht für Vollblut-Untersuchungen und nicht für die breite Anwendung im Rahmen von Screening-Tests der pharmazeutischen Industrie.In addition to ethical considerations, however, complicate the complexity, the difficulty of the preparations tion, the low flexibility of the experimental setup,  the poor reproducibility and the very expensive Implementing a broader application of these systems. In addition, physiological-chemical processes, which according to current knowledge, more and more meaning in the frame of cell activation processes in the circulatory system must be measured (see "Lewis, D.H. et al., Prog. appl. Microcirc. 12, 231-235 (1987) "), hardly recorded be because the withdrawal of blood from the mentioned Microcirculation systems is technically very difficult and rely on that for appropriate chemical analysis insufficient quantities of a few microliters must restrict. As an alternative to studying cellular and humoral interactions were therefore in used in vitro methods in recent years endothelial cells grown in petri dishes - that line the inner wall of all blood vessels in vivo - incubated with different blood cells (see example see "Cronstein, BN.N. et al., in" Topics and Perspec tives in Adenosine Research - Gerlach E. u. Becker B. F. - Ed. Springer Verlag Heidelberg, 299-308 (1987) "). However, this approach has the disadvantage that the influence of crucial blood rheology often not recorded in vivo and that the statements thus obtained are therefore only one doubtful transferability to the situation in the circle run system result. Such test systems are also suitable not for whole blood tests and not for them widespread use in screening tests of  pharmaceutical industry.

Aus der DE 32 47 815 A1 geht eine Einrichtung zur Messung der Blutungszeit in vitro hervor, bei der eine oder mehrere Aperturen in einem porösen Teil vorgesehen sind, wobei Blut unter konstantem Druck durch die Aperturen befördert und die Verstopfung der Aperturen gemessen wird. Der Durchmesser der Aperturen liegt in einem Bereich von 50 µm bis 300 µm. Eine solche Einrichtung, bei der die Verstopfung nur weniger Aperturen mit den angegebenen Durchmessern gemessen wird, ist zur Messung der Volumenflußrate bzw. des Fließverhaltens von Zellen einer Zellsuspension, von Vollblut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas nicht geeignet.DE 32 47 815 A1 describes a device for measurement the in vitro bleeding time at which one or more Apertures are provided in a porous part, with blood conveyed through the apertures under constant pressure and the blockage of the apertures is measured. Of the The diameter of the apertures is in the range of 50 µm up to 300 µm. Such a facility where the Blockage only a few apertures with the specified Diameter is measured is to measure the Volume flow rate or the flow behavior of cells one Cell suspension, whole blood cells or components blood plasma is not suitable.

Aus der SU 1 018 015 A ist es bekannt, die Filtrationsrate von Erythrozyten beim Durchtritt durch ein feinporiges Filter mit der Filtrationsrate eines Kontrollserums zu vergleichen.The filtration rate is known from SU 1 018 015 A. of erythrocytes when passing through a fine-pored Filters with the filtration rate of a control serum to compare.

In der DE 35 29 792 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Verformbarkeit von roten Blutkörperchen beschrieben, bei dem ein Filter mit etwa 4 · 10⁵ Poren/cm² (Porendurchmesser 3-5 µm) durch eine Membran so verschlossen wird, daß für den Durchfluß nur eine beschränkte Porenanzahl in der Größenordnung von 15 bis 100 Poren übrig bleibt. Die durch diese wenigen Poren hindurchtretenden Blutzellen werden im Hinblick auf ihre Filter-Durchtrittszeiten mit einem elektrischen Widerstands-Meßverfahren untersucht. Eine sinnvolle Messung der Volumenflußrate bzw. des Fließverhaltens von Zellen einer Zellsuspension, von Vollblut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas ist bei der geringen Anzahl der Poren nicht möglich.DE 35 29 792 A1 describes a method for determining the Deformability of red blood cells described in a filter with about 4 · 10 · pores / cm² (pore diameter 3-5 µm) is closed by a membrane so that for the flow only a limited number of pores in the An order of magnitude of 15 to 100 pores remains. By these few pore-passing blood cells are in the  In terms of their filter passage times with a electrical resistance measuring method examined. A sensible measurement of the volume flow rate or Flow behavior of cells in a cell suspension, from Whole blood cells or components of the blood plasma not possible with the small number of pores.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes und praktikables Verfahren zur Messung der Volumenflußrate von Zellen einer Zellsuspension, von Vollblut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas anzugeben.The object of the present invention is a improved and practical method for measuring the Volume flow rate of cells of a cell suspension, from Whole blood cells or components of the blood plasma specify.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.This task is accomplished by a method with the characteristics of claim 1 solved. Further training is the subject of subclaims.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es Messungen der biologischen Reaktivität von Zellen des Vollblutes reproduzierbar ermöglicht.A major advantage of the method according to the invention is that there are measurements of biological Reactivity of whole blood cells reproducible enables.

Vorteilhafterweise ermöglicht das vorliegende Verfahren die Durchführung der genannten Messungen, ohne daß man dabei auf lebende Organe bzw. Tierversuche angewiesen ist. Das Verfahren kann daher wesentlich dazu beitragen, die Zahl notwendiger Tierversuche zu verringern. The present method advantageously enables Carrying out the measurements mentioned without you relies on living organs or animal experiments. The Procedures can therefore make a significant contribution to the number to reduce necessary animal testing.  

Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren einfacher durchführbar als die bisher bekannten Verfahren, da es weniger komplex ist und da keine schwierigen Präparationen erforderlich sind.The method according to the invention is advantageous easier to implement than the previously known methods, because it's less complex and not difficult Preparations are required.

Vorteilhafterweise können in dem vorliegenden Verfahren Blutmengen im Milliliterbereich untersucht werden. Dabei kann ohne weiteres die Freisetzung von Mediatorsubstanzen und Metaboliten aus den Blutzellen erfaßt werden.Advantageously, in the present method Blood quantities in the milliliter range are examined. Here can easily release mediators and metabolites are detected from the blood cells.

Ein weiterer Vorteil des Verfahren besteht darin, daß es Messungen bzw. Untersuchungen in der Form von Screening- Tests im großen Umfang ermöglicht, was für die Entwicklung bzw. Selektion spezifisch wirkender pharmazeutischer Produkte unbedingt erforderlich ist.Another advantage of the method is that it Measurements or examinations in the form of screening Large-scale testing allows for what to develop or selection of specific pharmaceutical Products is absolutely necessary.

Durch die Erfindung wird vorteilhafterweise ein leicht auszuführendes Verfahren geschaffen, durch welches das Zusam­ menwirken der verschiedenen Zell-, Gewebe- bzw. Plasma­ bestandteile mikrovasulärer Strombahnen des Körperkreis­ laufes außerhalb des Körpers quantitativ gemessen und differenziert werden kann. Schon kleinste Änderungen in der Gestalt, Adhäsivität bzw. Aggregabilität der bei konstantem Druck durch ein poröses Teil, dessen Durch­ gänge in der Größenordnung der Zellen bzw. der Bestand­ teile liegen, fließenden Zellen oder Bestandteile, bzw. Änderungen im Aktivierungsgrad plasmatischer Funktions­ ketten, wie z. B. des intrinsischen Gerinnungssystems, machen sich in einer reduzierten Filtrationsrate bemerk­ bar. Die kontinuierliche Erfassung der Filtratmengen im zeitlichen Verlauf durch elektronische Einwaage, stetige Registrierung auf einem Schreiber und Ausgabe als diffe­ renzierte Zahlenwerte über einen Drucker, liefert abso­ lute Meßwerte, die in ihrer Genauigkeit und Empfindlich­ keit der Erfassung durch andere mögliche Meßmethoden (z. B. photoelektrische Meßmethoden) weit überlegen ist. Auf dieser Grundlage können nach dem vorliegenden Verfahren die Filtrationsversuche auch bei sehr kleinen Druckgradienten durchgeführt werden, was die Erfaßbar­ keit kleinster Abänderungen der oben erwähnten biologi­ schen Zell- bzw. Plasmaparameter extrem steigert. Bei­ spielsweise werden schwach assoziierte Zellen bei der Filtration entlang eines kleinen Druckgradienten nicht auseinandergerissen, so daß die Filtrationsrate durch diese schwach assoziierten Zellen bereits deutlich eingeschränkt wird.The invention advantageously makes it easy procedure to be carried out, by which the effect of the various cells, tissues or plasma components of microvascular current paths of the body circle run quantitatively measured outside the body and can be differentiated. Even the smallest changes in the shape, adhesiveness or aggregability of the constant pressure through a porous part, the through would be in the order of the cells or the stock parts lying, flowing cells or components, or Changes in the degree of activation of plasma function  chains, such as B. the intrinsic coagulation system, make themselves felt in a reduced filtration rate bar. The continuous recording of the filtrate quantities in the time course through electronic weighing, steady Registration on a writer and output as diffe limited numerical values via a printer, delivers abso lute measurements that are accurate and sensitive speed of detection by other possible measurement methods (e.g. photoelectric measurement methods) is far superior. On this basis, according to the present procedure the filtration attempts even with very small ones Pressure gradients are carried out, which is detectable Minor changes in the above-mentioned biology cell or plasma parameters extremely increased. At for example, weakly associated cells in the Filtration along a small pressure gradient does not torn apart so that the filtration rate through these weakly associated cells are already evident is restricted.

Da alle gemessenen Filtrationsraten im Endeffekt mit Filtrationsraten einer Bezugslösung in der Form einer physiologischen Salzlösung verglichen werden, die die Lösungsgrundlage auch aller Blut-, Zell- bzw. Plasmafrak­ tionen bildet, ergeben sich relative Filtrationsraten, deren Größe unabhängig ist von technisch unvermeidbaren Schwankungen in der Fläche, Dicke bzw. Perforation der verwendeten porösen Teile bzw. Filter. Unter der genann­ ten relativen Filtrationsrate wird das Verhältnis der Filtrationsrate der Bezugslösung zur Filtrationsrate der biologischen Probe verstanden.Since all measured filtration rates ultimately with Filtration rates of a reference solution in the form of a physiological saline, which are compared The basis for the solution of all blood, cell and plasma fractures formations, there are relative filtration rates, the size of which is independent of technically unavoidable Fluctuations in the area, thickness or perforation of the  used porous parts or filters. Under the genann th relative filtration rate is the ratio of Filtration rate of the reference solution to the filtration rate of the understood biological sample.

Als ein klinisch immer interessanter werdender Aspekt erweist sich die durch das vorliegende Verfahren geschaffene einfa­ che Möglichkeit, die physiologisch-chemische Aktivität des vaskulären Endothels über ein mit diesem Gewebe bewachsenes Netz in das Meßsystem einzubeziehen, das dann seine zahlreichen neu erkannten hämostasiologischen bzw. inflammatorisch wichtigen Funktionen auch im Test­ system erfüllt (siehe z. B. "Nees S. Internist (1987) 28 : 699-710).As a clinically increasingly interesting aspect proves the simple created by the present procedure che possibility of the physiological-chemical activity of the vascular endothelium over one with this tissue overgrown network in the measuring system, the then his numerous newly recognized hemostasiological or inflammatory important functions also in the test system fulfilled (see for example "Nees S. Internist (1987) 28: 699-710).

Klinisch immer interessanter wird auch die durch das vorliegende Verfahren geschaffene Möglichkeit, bestimmte zelluläre Aktivierungsprozesse durch Zugabe spezifischer Mediator­ substanzen von außen her selektiv zu induzieren und ihre Kinetik zu registrieren, bzw. ihre Hemmbarkeit durch bestimmte Wirkstoffe, beispielsweise durch Medikamente, zu messen.Clinically, this is also becoming more and more interesting The present method creates the possibility of certain cellular Activation processes by adding a specific mediator selectively induce substances from the outside and their Kinetics to register, or their inhibibility by certain active ingredients, for example through medication, to eat.

Ein Vorteil besteht auch darin, daß die Vorrichtung zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens leicht zerlegbar und einfach zusam­ mensetzbar ist, wodurch eine intensive Reinigung ermög­ licht wird, und die häufige Wiederholung von reproduzier­ baren Messungen sehr erleichtert wird. Darüber hinaus bietet die Konstruktion dieser Vorrich­ tung aber auch den Vorteil, daß die wesentlichen Teile der Vorrichtung (Filter bzw. Scheibe 3) als einmal verwendbare Wegwerfartikel hergestellt werden können, was den Einsatz in der Klinik und der forschenden pharmazeutischen Industrie stark begünstigt.An advantage is also that the device for performing the present method is easy to disassemble and easy to put together, making intensive cleaning is possible, and the frequent repetition of reproducible measurements is made very easy. In addition, the construction of this Vorrich device also has the advantage that the essential parts of the device (filter or disc 3 ) can be manufactured as a single-use disposable article, which greatly favors use in the clinic and the researching pharmaceutical industry.

Im folgenden wird das Verfahren im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert, welche Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens zeigen. Es zeigen im einzelnen:The following is the procedure in connection with the Figures explained which devices for Show implementation of the procedure. The individual shows:

Fig. 1 in schematischer Darstellung eine Vorrichtung zur Messung der Volumenflußrate; Fig. 1 shows a schematic representation of an apparatus for measuring the volume flow rate;

Fig. 2 in schematischer Darstellung einen Einspannrahmen zum Einspannen einer mit Durchgängen versehenen Scheibe; Fig. 2 is a schematic representation of a clamping frame for clamping a disk is provided with passages;

Fig. 3A, 3B in vergrößerter Darstellung die Beschaffen­ heit einer Scheibe und die Verformung einer Zelle beim Durchtritt durch einen Durchgang der Scheibe; Fig. 3A, 3B in an enlarged view the procurement unit of a disc and the deformation of a cell when passing through a passage of the disc;

Fig. 4 ein der Scheibe vorsetzbares Endothelnetz; Fig. 4 a of the disc vorsetzbares Endothelnetz;

Fig. 5 ein Detail der Vorrichtung und Fig. 5 shows a detail of the device and

Fig. 6A, 6B Diagramme zur Erläuterung des Meßverfahrens. Fig. 6A, 6B are diagrams for explaining the measuring method.

Zu der Erfindung führten die folgenden Überlegungen. Eine ausreichend gute Nachbildung der rheologischen Verhältnisse in Mikrozirkulationsbereichen des Blutkreis­ laufes läßt sich in vitro erreichen, wenn man Vollblut oder mit schonenden Verfahren gereinigte Blutzellfrakti­ onen oder Komponenten des Blutplasmas unter definierten, auf die entsprechenden physiologischen Bedingungen eingestellten hydrostatischen Drücken durch mit Durch­ gängen versehene Teile bzw. Filter strömen läßt, wobei die Filter bzw. Teile biologisch inert sind und die Durchmesser im Bereich der Mikrogefäße in vivo liegen. Um Schwankungen in den verwendeten Filtern bzw. Teilen, z. B. im Hinblick auf die Fläche, die Dicke und die Perforation bzw. Durchgänge zu vermeiden, wird in einem ersten Schritt die Filtrations- bzw. Volumentransportrate einer Bezugsflüssigkeit für ein Filter bzw. Teil gemessen, wird in einem zweiten Schritt die Filtrations- bzw. Volumentransportrate der zu untersuchenden biologischen Probe für dasselbe Filter bzw. Teil gemessen und wird schließlich die von den genannten Schwankungen unabhängige relative Filtrations- bzw. Volumentransportrate bestimmt. Um die Bedingungen in vivo nahezu vollkommen nachahmen zu können, kann dem Teil bzw. Filter ein für die Veran­ kerung von tierischen bzw. menschlichen Zellen modifi­ ziertes Netz, das zum Beispiel aus Nylon besteht, vorge­ schaltet werden, wobei die Maschen des Netzes etwa 5 bis 10 mal größer sind als die Durchmesser der durch das Teil bzw. das Filter hindurchströmenden Blutzellen und wobei das Netz vollkommen mit gezüchteten Endothelzellen überzogen ist. Durch die angegebene Maschengröße wird dabei sichergestellt, daß das Netz keinen nennenswerten mechanischen Einfluß auf die Blutbewegung ausübt. Die Anzucht der Endothelzellen erfolgt nach Standardmethoden im Gewebelabor (siehe z. B. "Nees S., Gerbes A.L., Ger­ lach E., Europ. J. Cell. Biol. 24, 287-297 (1981)). Die biologische Inertheit der Werkstoffe des gesamten Innenraumes eines derartigen Filtersystemes vorausge­ setzt, ergeben die relativen Durchfluß- bzw. Filtra­ tionsraten, d. h. die auf den Durchfluß einer Bezugslö­ sung, bei der es sich um eine physiologische Salzlösung handeln kann, bezogenen Durchfluß- bzw. Filtrationsraten ausgezeichnete reproduzierbare Kenngrößen für den basa­ len Aktivierungszustand der Blutzellen in der jeweiligen Vollblutprobe. Die genannte biologische Inertheit läßt sich vorzugsweise durch Materialien wie Teflon oder Plexiglas erreichen. Ein besonderer Vorteil liegt dabei auch darin, daß der Einfluß des vaskulären Endothels bzw. die Freisetzung physiologisch aktiver Stoffe aus diesem Gewebe durch die Zugabe bzw. Entfernung des bzw. der mit Endothelzellen überzogenen Netze genau miterfaßt und gegen die Reaktionen der Blutzellen abgegrenzt werden kann.The following considerations led to the invention. A sufficiently good replica of the rheological Conditions in microcirculation areas of the bloodstream Running can be achieved in vitro if you have whole blood or blood cell fractions cleaned with gentle procedures blood plasma components or components under defined, on the corresponding physiological conditions set hydrostatic pressures with with through gears provided parts or filters flow, whereby the filters or parts are biologically inert and the Diameters in the range of microvessels are in vivo. To avoid fluctuations in the filters or parts used, e.g. B. in terms of area, thickness and Avoiding perforation or passage is all in one first step is the filtration or volume transport rate a reference liquid for a filter or part, in a second step, the filtration or  Volume transport rate of the biological to be examined Sample for the same filter or part is measured and is finally the one that is independent of the fluctuations mentioned relative filtration or volume transport rate determined. To mimic the conditions in vivo almost completely to be able to use the part or filter for the event modification of animal or human cells adorned net, which consists of nylon, for example be switched, the mesh of the network about 5 to Are 10 times larger than the diameter of the through the Part or the filter flowing through blood cells and the network being entirely with cultured endothelial cells is covered. Due to the specified mesh size thereby ensuring that the network has no significant exerts mechanical influence on blood movement. The Endothelial cells are grown using standard methods in the tissue laboratory (see e.g. "Nees S., Gerbes A.L., Ger laugh E., Europ. J. Cell. Biol. 24: 287-297 (1981)). The biological inertness of the materials of the whole Interior of such a filter system beforehand sets, give the relative flow or Filtra tion rates, d. H. on the flow of a reference sol solution, which is a physiological saline solution can act, related flow or filtration rates excellent reproducible parameters for the basa len activation state of the blood cells in the respective Whole blood sample. The aforementioned biological inertness leaves  preferably by materials such as Teflon or Reach plexiglass. There is a particular advantage here also in that the influence of the vascular endothelium or the release of physiologically active substances this tissue by adding or removing the of the networks covered with endothelial cells and delimited against the reactions of the blood cells can be.

Aufgrund der in den letzten Jahren stark erweiterten Kenntnisse über die physiologische Aktivierbarkeit ganz bestimmter Blutzellarten (z. B. der Thrombozyten oder der Granulozyten) durch ganz bestimmte Mediatorsubstanzen lassen sich in der oben geschilderten Weise ausgeführte Untersuchungen außerdem auf die Aktivierbarkeit ganz bestimmter Blutzellarten in der untersuchten Vollblut­ probe spezifizieren. Zu diesem Zweck wird der zu unter­ suchenden Probe eine geeignete Menge einer spezifischen Mediatorsubstanz vor der Durchführung des beschriebenen Meßverfahrens zugeführt. Die durch die Mediatorsubstan­ zen bewirkte selektive Aktivierung der betreffenden Blutzellen führt zu einer charakteristischen konzentra­ tions- und zeitabhängigen Beeinflussung der Durchfluß- bzw. Filtrationsraten, aus der man wertvolle klinisch-dia­ gnostisch und pharmakologisch wichtige Aufschlüsse über die Blut- und Kreislaufphysiologie des Spenders des untersuchten Blutes ziehen kann. Durch die gleichzeitige Zugabe von Medikamenten läßt sich außerdem - immer auf der Basis einer einfachen, reproduzierbaren, und billi­ gen quantitativen Methode - testen, inwiefern die beob­ achtete bzw. induzierte Aktivierung der jeweiligen Blutzellen gehemmt werden kann. Die Erfindung ermöglicht es, daß genügend große Blutmengen im Milliliterbereich untersucht und damit auch die Freisetzung von aus den Zellen selbst freigesetzten Mediatorsubstanzen und Metaboliten erfaßt werden kann.Because of the greatly expanded in recent years Knowledge of the physiological activability entirely certain types of blood cells (e.g. platelets or Granulocytes) by certain mediator substances can be carried out in the manner described above Investigations also on the activatability entirely certain types of blood cells in the whole blood examined specify sample. For this purpose, the under a suitable amount of a specific sample Mediator substance before performing the described Measuring method supplied. The through the mediator substance zen caused selective activation of the concerned Blood cells lead to a characteristic concentration tion and time-dependent influencing of the flow or Filtration rates from which valuable clinical-dia gnostically and pharmacologically important information on the blood and circulatory physiology of the donor of the examined blood can draw. By the simultaneous  Addition of medication can also - always on the basis of a simple, reproducible, and cheap quantitative method - test to what extent the observ respected or induced activation of the respective Blood cells can be inhibited. The invention enables there is enough blood in the milliliter range examined and thus also the release of from the Cells themselves released mediator substances and Metabolites can be detected.

Gemäß Fig. 1 besteht die Vorrichtung zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens im wesentlichen aus einem Aufnahmeteil 1 für ein mit Durchgängen 2 versehenes Teil, einem auf der einen Seite des Teiles angeordneten ersten Raum 4, einem auf der anderen Seite des Teiles angeordneten zweiten Raum 5 und einem weiteren Raum 6 einer Zulei­ tung 7 zum ersten Raum 4, einer weiteren Zuleitung 8 zum Einfüllen bzw. Entnehmen einer Bezugsflüssigkeit bzw. Zellsuspension, bei der es sich, wie bereits beschrie­ ben, z. B. um Vollblut oder um eine bestimmte Zellfrak­ tion handeln kann, in bzw. aus dem ersten Raum 4, und einer Leitung 9, die die zusammenhängenden Räume 5 und 6 und auch den über das Teil 3 mit diesen Räumen 5, 6 kommuni­ zierenden Raum 4 mit einem Waagenbad 10 verbindet, das sich auf einer Waagschale oder dergleichen einer Waage 11 befindet. Referring to FIG. 1, the apparatus for carrying out the present process consists essentially of a receiving part 1 for a provided with passages 2 part, an on one side of the part disposed first space 4, a arranged on the other side of the part of the second space 5 and a further space 6 of a supply device 7 to the first space 4 , a further feed line 8 for filling or removing a reference liquid or cell suspension, in which, as already described, for. B. can be whole blood or a certain cell fraction, in or out of the first room 4 , and a line 9 , the connected rooms 5 and 6 and also the part 3 with these rooms 5 , 6 communicating room 4 connects to a scale bath 10 , which is located on a weighing pan or the like of a scale 11 .

Das zuvor genannte Teil kann beispielsweise die Form eines mit den Durchgängen 2 versehenen Filters oder einer mit diesen Durchgängen versehenen Scheibe aufweisen. Die Form dieses Teiles, das im folgenden als "Scheibe 3" bezeichnet wird, kann jedoch beliebig sein, solange sichergestellt wird, daß durch das Teil die genannten Suspensionen reproduzierbar fließen können.The aforesaid part may, for example, take the form of a filter provided with the passages 2 or a disk provided with these passages. However, the shape of this part, which is referred to below as "disc 3 ", can be as long as it is ensured that the suspensions can flow reproducibly through the part.

Die Scheibe 3 besteht aus einem biologisch, physika­ lisch und chemisch inerten Material, bei dem es sich beispielsweise um Polycarbonat oder Tetrafluorethylen (Teflon) handelt, in dem durchgehende Öffnungen in der Form von Durchgängen 2 (Fig. 3A), die einen vorgegebenen Durchmesser und eine vorgegebene Dichte besitzen, enthal­ ten sind. Der Durchmesser der Durchgänge 2 ist so beschaffen, daß er in der Größenordnung der relevanten Zellen der Zellsuspension oder des Blutes liegt, an der bzw. dem Messungen vorgenommen werden sollen. Der Durch­ messer der Durchgänge 2 ist vorzugsweise nicht größer als 8 um und vorzugsweise nicht kleiner als 3 µm. Beispielsweise beträgt dieser Durchmesser 5 µm. Die Dichte der Durchgänge 2 in der Scheibe 3 liegt vorzugs­ weise bei etwa 1000 bis 5000 Durchgängen pro mm², während die Dicke der Scheibe 3 vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 100 µm liegt. Fig. 3B zeigt, in welcher Weise Zellen beim Passieren von Durchgängen 2 in der Scheibe 3 aufgrund des kleineren Durchmessers der Durchgänge 2 verformt werden.The disc 3 is made of a biologically, physically and chemically inert material, which is, for example, polycarbonate or tetrafluoroethylene (Teflon), in the through openings in the form of passages 2 ( Fig. 3A), which have a predetermined diameter and have a specified density, are included. The diameter of the passages 2 is such that it is in the order of the relevant cells of the cell suspension or of the blood on which measurements are to be made. The diameter of the passages 2 is preferably not larger than 8 µm and preferably not smaller than 3 µm. For example, this diameter is 5 µm. The density of the passages 2 in the disk 3 is preferably approximately 1000 to 5000 passes per mm 2, while the thickness of the disk 3 is preferably in a range from 2 to 100 microns. Fig. 3B shows the way in which cells when passing from passages 2 in the disk 3 due to the smaller diameter of the passages 2 are deformed.

Die Scheibe 3 wird vorzugsweise in die Vertiefung 12 eines Halteringes 13 eingelegt, wobei der Haltering 13 zusammen mit einem Abdeckring 14 einen Einspannrahmen bzw. eine Einspanneinrichtung für die Scheibe 3 bildet. Nach dem Einlegen der Scheibe 3 in die Vertiefung 12 des Halteringes 13 wird der Abdeckring 4 auf die freiliegen­ de Fläche der in der Vertiefung 12 des Halteringes 13 befindlichen Scheibe 3 gelegt. Dabei ist der Abdeckring 14 so bemessen, daß sein Außenumfang geringfügig kleiner als der Durchmesser der Vertiefung 12 ist. Sowohl in dem Haltering 13 als auch in dem Abdeckring 14 ist eine Öffnung 15 vorgesehen, die nach dem Einsetzen des Ab­ deckringes 14 in die Vertiefung 12 des Halteringes 13 etwa deckungsgleich zueinander ausgerichtet sind. Auf diese Weise wird erreicht, daß die Scheibe 3 sicher und fest in der aus dem Haltering 13 und dem Abdeckring 14 bestehenden Einspanneinrichtung, die vorzugsweise aus Teflon gestaltet wird, da dadurch an den Andruckflachen eine Dichtwirkung erzielt wird, gehalten wird und daß eine Zellsuspension bzw. Vollblut bzw. Komponenten des Blutplasmas oder eine Bezugsflüssigkeit in der Form einer physiologischen Salzlösung durch die Durchgänge 2 des in den Öffnungen 15 freiliegenden Bereiches der Scheibe 3 hindurchtreten kann. The disk 3 is preferably placed a retaining ring 13 in the recess 12, the retaining ring 13 together with a cover ring 14 forms a clamping frame and a clamping device for the disc. 3 After inserting the disk 3 into the recess 12 of the retaining ring 13 of the cover ring 4 onto the exposed de surface of the disk 3 contained in the cavity 12 of the retaining ring 13 is placed. The cover ring 14 is dimensioned so that its outer circumference is slightly smaller than the diameter of the recess 12 . Both in the retaining ring 13 and in the cover ring 14 , an opening 15 is provided, which are aligned approximately congruently with one another after the insertion of the cover ring 14 into the recess 12 of the retaining ring 13 . In this way it is achieved that the disc 3 is held securely and firmly in the clamping device consisting of the retaining ring 13 and the cover ring 14 , which is preferably made of Teflon, since a sealing effect is achieved on the pressure surfaces, and that a cell suspension or Whole blood or components of the blood plasma or a reference liquid in the form of a physiological saline solution can pass through the passages 2 of the area of the disk 3 exposed in the openings 15 .

Die mit der Scheibe 3 versehene Einspanneinrichtung 13, 14 wird vorzugsweise in eine Vertiefung 16 eingesetzt, die sich in dem Aufnahmeteil 1 befindet. Die Vertiefung 16 ist dabei so beschaffen, daß sie etwa komplementär zum Haltering 13 ausgebildet ist.The clamping device 13 , 14 provided with the disc 3 is preferably inserted into a recess 16 which is located in the receiving part 1 . The recess 16 is such that it is approximately complementary to the retaining ring 13 .

Vorzugsweise wird der in der Fig. 1 auf der rechten Seite vor der Scheibe 3 befindliche erste Raum 4 dadurch gebildet, daß sich die Vertiefung 16 in einen wenig­ stens teilweise mit einem Innengewinde 17 versehenen Aufnahmeraum 18 öffnet, wobei ein Klemmteil 19 mit einem Außengewinde 20 derart in den Aufnahmeraum 18 ein­ schraubbar ist, daß sich die der Scheibe 3 zugewandte Stirnseite des Klemmteiles 19 an der dem Klemmteil 19 zugewandten Seite des Halteringes 13 und des Abdeckrin­ ges 14 der Einspanneinrichtung abstützt und diese in die Vertiefung 16 hineindrückt. Dabei befindet sich in dem der Einspanneinrichtung vorgelagerten Bereich des Klemm­ teiles 19 der erste Raum 4, der an seinem der Scheibe 3 abgewandten Ende mit der vorzugsweise aus Teflon beste­ henden Zuleitung 7 in der später noch näher erläuterten Weise verbunden ist. Die Zuleitung 8, deren Anordnung ebenfalls später erläutert werden wird, endet im ersten Raum 4 vorzugsweise kurz vor der ihr zugewandten Ober­ fläche der Scheibe 3 bzw. eines vorgeschalteten Endothel­ netzes, vorzugsweise an der in der Gebrauchslage der Vorrichtung tiefsten Stelle des ersten Raumes 4. Preferably located in Fig. 1 on the right side in front of the disc 3 first chamber 4 is formed in that the recess opens in a little least partially provided with an internal thread 17 receiving space 18 16, wherein a clamping member 19 with an external thread 20 a is threadably such in the receiving space 18 that the disc 3 facing end face of the clamp member 19 at the clamp member 19 facing side of the retaining ring 13 and the Abdeckrin ges 14 of the clamping device is supported, and this pushes into the depression sixteenth It is located in the area of the clamping part 19 of the clamping part 19 of the first space 4 , which is connected at its end facing away from the disc 3 with the preferably best Teflon existing supply line 7 in the manner explained in more detail later. The feed line 8 , the arrangement of which will also be explained later, ends in the first space 4, preferably shortly before the upper surface of the disc 3 or an upstream endothelium network facing it, preferably at the lowest point of the first space 4 in the position of use of the device.

Die Vertiefung 16 geht an der dem ersten Raum 4 abgewandten Seite in einen zweiten Raum 5 über, der vorzugsweise einen kleineren Durchmesser aufweist als die Vertiefung 16, so daß sich am Übergang zwischen dem zweiten Raum 5 und der Vertiefung 16 eine Auflageschulter bzw. -fläche 21 für die Einspanneinrichtung bildet.The depression 16 merges on the side facing away from the first space 4 into a second space 5 , which preferably has a smaller diameter than the depression 16 , so that there is a support shoulder or surface at the transition between the second space 5 and the depression 16 21 forms for the clamping device.

Vorzugsweise öffnet sich der zweite Raum 5 an der der Vertiefung 16 abgewandten Seite in einen weiteren Raum 6, der ebenso wie der zweite Raum 5 im Aufnahmeteil 1 angeordnet ist und der zusammen mit dem zweiten Raum 5 den dem ersten Raum 4 gegenüberliegenden und über das Teil 3 mit diesem kommunizierenden Raum bildet. Der weitere Raum 6 steht über die Leitung 9 mit dem bereits erwähnten Waagenbad 10 in Verbindung und weist außerdem noch eine Zuleitung 22 auf, deren Funktion später noch näher erläutert werden wird. Es sind der Übergangsbereich 31 zwischen dem weiteren Raum 6 und der Leitung 9 und der Übergang 31′ zwischen dem weiteren Raum 6 und der Zuleitung 22 derart konisch gestaltet, daß sich der weitere Raum 6 zur Leitung 9 bzw. zur Zuleitung 22 hin ohne Ecken und Kanten in der Flußrichtung verjüngt, und daß die Leitung 9 in der Gebrauchslage der Vorrichtung am höchsten Punkt des weiteren Raumes 6 einmündet. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß sich in diesen Übergangsbereichen 31, 31′ keine Luftblasen verfangen können, wenn der weitere Raum 6 mit der Bezugsflüssigkeit gefüllt wird.Preferably, the second space 5 opens on the side facing away from the recess 16 into a further space 6 which, like the second space 5 , is arranged in the receiving part 1 and which together with the second space 5 is located opposite the first space 4 and over the part 3 forms with this communicating space. The other room 6 is connected via line 9 to the scale bath 10 already mentioned and also has a feed line 22 , the function of which will be explained in more detail later. There are the transition region 31 between the further space 6 and the line 9 and the transition 31 'between the further space 6 and the feed line 22 so conical that the other space 6 to the line 9 or to the feed line 22 without corners and Edges tapered in the direction of flow, and that the line 9 opens out in the use position of the device at the highest point of the further space 6 . This ensures that no air bubbles can get caught in these transition areas 31 , 31 'when the further space 6 is filled with the reference liquid.

Entsprechend weist der der Zuleitung 7 zugewandte Endbe­ reich 32 des ersten Raumes 4 eine konische Form auf, durch die ein Verfangen von Luftblasen beim Füllen des Raumes 4 verhindert wird, wenn die Vorrichtung um 90° verschwenkt wird, wie dies später erläutert werden wird.Correspondingly, the end 7 facing the supply line 32 of the first space 4 has a conical shape, by which entrapping of air bubbles is prevented when filling the space 4 when the device is pivoted by 90 °, as will be explained later.

Die Befestigung der Zuleitung 7 im Klemmteil 19 muß derart erfolgen, daß das freie Ende der Zuleitung 7 in den Raum 4 dicht hineingeführt wird. Im Detail sind dafür die folgenden Konstruktionsmerkmale vorgesehen: In dem der Scheibe 3 abgewandten Endbereich des Klemmteiles 19 ist eine wenigstens teilweise mit einem Innengewinde 23 versehene Ausnehmung 24 angeordnet, die über einen Durchgang 25 mit dem Raum 4 in Verbindung steht. Der Durchgang 25 weist vorzugsweise einen Durchmesser auf, der geringfügig größer ist als der Außendurchmesser der Zuleitung 7 und der kleiner ist als der Durchmesser der Ausnehmung 24. Am Übergang zwischen dem Durchgang 25 und dem Boden der Ausnehmung 24 entsteht dadurch ein ringförmiger Auflagebereich für einen Dichtungsring 26, der mit seinem Außenumfang an der Innenwandung der Ausnehmung 24 und mit seinem Innenumfang am Außenumfang der Zuleitung 7 anliegt. In die Ausnehmung 24 ist ein mit einem Außengewinde 27 versehenes Verschlußteil 28 derart einschraubbar, daß sein der Scheibe 3 zugewandtes Ende gegen den Dichtungsring 26 gepreßt wird. Der Dich­ tungsring 26 wird dabei so verformt, daß zwischen dem Außenumfang der Zuleitung 7 und dem Boden der Ausnehmung 24 eine dichte Verbindung entsteht.The attachment of the supply line 7 in the clamping part 19 must be such that the free end of the supply line 7 is inserted tightly into the space 4 . The following design features are provided for this in detail: In the end region of the clamping part 19 facing away from the disk 3 , an at least partially provided with an internal thread 23 recess 24 is arranged, which is in communication with the space 4 via a passage 25 . The passage 25 preferably has a diameter that is slightly larger than the outer diameter of the feed line 7 and that is smaller than the diameter of the recess 24 . At the transition between the passage 25 and the bottom of the recess 24 , this creates an annular contact area for a sealing ring 26 , which bears with its outer circumference on the inner wall of the recess 24 and with its inner circumference on the outer circumference of the feed line 7 . A closure part 28 provided with an external thread 27 can be screwed into the recess 24 in such a way that its end facing the disc 3 is pressed against the sealing ring 26 . The device ring 26 is deformed so that a tight connection is formed between the outer circumference of the feed line 7 and the bottom of the recess 24 .

Die aus einem Teflon-Schlauch gebildete Zuleitung 8 kann beispielsweise dicht durch einen im Klemmteil 19 ausgebildeten Durchgang so verlaufen, daß sie an der genannten tiefsten Stelle des Raumes 4 in der genannten Weise vor der Scheibe 3 bzw. einem Endothel­ netz 64 (Fig. 5) endet. Es ist jedoch auch denkbar, die Zuleitung 8 aus zwei Teilleitungen zu bilden, von denen eine dicht an die Öffnung des genannten Durchganges angesetzt ist, die in den Raum 4 mündet und von denen die andere dicht an die Öffnung dieses Durchganges angesetzt ist, die sich zur Außenseite des Klemmteiles 19 hin öffnet.The feed line 8 formed from a Teflon tube can, for example, run tightly through a passage formed in the clamping part 19 in such a way that it meshes at the deepest point of the space 4 in the manner mentioned in front of the disk 3 or an endothelium 64 ( FIG. 5 ) ends. However, it is also conceivable to form the feed line 8 from two sub-lines, one of which is placed close to the opening of the said passage, which opens into the space 4 and of which the other is placed close to the opening of this passage, which is opens to the outside of the clamping part 19 .

Es ist das Aufnahmeteil 1 an einem ver­ schwenkbaren Rahmenteil 29 befestigt, das aus der in der Fig. 1 ersichtlichen Lage (zweite Position), in der die Längsachsen des zweiten Raumes 5 und des ersten Raumes 4 und des Endbereiches der Zuleitung 7 horizontal angeordnet sind, um 90° derart verdrehbar ist, daß die genannten Längs­ achsen etwa vertikal ausgerichtet sind (erste Position). Durch den Schwenkvorgang kann die Vorrichtung zum Füllen der Räume 4 bzw. 5 und 6 beiderseits der Scheibe 3 in Lagen gekippt werden, in denen bei den jeweiligen Füllvorgängen in den entsprechenden Räumen 4 bzw. 5 und 6 vorhandene Luftblasen nach oben entweichen können. Beispielsweise wird beim Füllen des ersten Raumes 4 und der Zuleitung 7 aus einem Reservoir 30 das Rahmenteil 29 derart gekippt, daß die Längsachse des Raumes 4 etwa vertikal ausgerichtet ist. Entsprechend wird beim Füllen der Räume 5 und 6 über die Zuleitung 22 das Rahmenteil 29 so gedreht, daß in den genannten Räumen enthaltene Luftblasen durch die Zuleitung 9 entweichen können.It is the receiving part 1 attached to a ver pivotable frame part 29 , from the position shown in FIG. 1 (second position) in which the longitudinal axes of the second space 5 and the first space 4 and the end region of the feed line 7 are arranged horizontally , can be rotated by 90 ° in such a way that the longitudinal axes mentioned are aligned approximately vertically (first position). Due to the pivoting process, the device for filling the rooms 4 or 5 and 6 can be tilted on both sides of the disc 3 in layers in which 4 or 5 and 6 existing air bubbles can escape upwards during the respective filling processes in the corresponding rooms. For example, when filling the first space 4 and the feed line 7 from a reservoir 30, the frame part 29 is tilted such that the longitudinal axis of the space 4 is oriented approximately vertically. Correspondingly, when filling the rooms 5 and 6 via the supply line 22, the frame part 29 is rotated so that air bubbles contained in the said rooms can escape through the supply line 9 .

Mit der zuvor beschriebenen Vorrichtung wird das erfin­ dungsgemäße Verfahren durch Vornahme der folgenden Schritte ausgeübt:This is invented with the device described above procedures according to the invention by performing the following Steps exercised:

• 1) Es wird eine Scheibe 3 in der oben beschriebenen Weise in die Einspanneinrichtung 13, 14 eingelegt.1) A disc 3 is inserted into the clamping device 13, 14 in the manner described above.
• 2) Die Einspanneinrichtung 13, 14 wird in die Vertiefung 16 des Aufnahmeteiles 1 eingesetzt.2) The clamping device 13, 14 is inserted into the recess 16 of the receiving part 1 .
• 3. Das Klemmteil 19 wird in die Ausnehmung 18 eingeschraubt, bis die Einspanneinrichtung 13, 14 zwischen der Schulterfläche 21 und der ihr zugewandten Stirnseite des Klemmteiles 19 festgeklemmt ist.3. The clamping part 19 is screwed into the recess 18 until the clamping device 13, 14 is clamped between the shoulder surface 21 and the end face of the clamping part 19 facing it.
• 4) Der Dichtungsring 26 wird über den Endbereich der vorzugsweise schlauchförmigen Zuleitung 7 geschoben.4) The sealing ring 26 is pushed over the end region of the preferably tubular feed line 7 .
• 5) Der Endbereich der Zuleitung 7 wird durch die Ausnehmung 24 und den Durchgang 25 derart in den Raum 4 eingeführt, daß der Dichtungsring 26 etwa am Boden der Ausnehmung 24 aufliegt und daß sich das Ende der Zuleitung 7 am Übergang zwischen dem konischen Bereich 32 und dem Durchgang 25 befindet.5) The end region of the feed line 7 is inserted through the recess 24 and the passage 25 into the space 4 such that the sealing ring 26 rests approximately at the bottom of the recess 24 and that the end of the feed line 7 is located at the transition between the conical region 32 and the passage 25 is located.
• 6) Das Verschlußteil 28 wird in die Ausnehmung 24 eingeschraubt, bis der Dichtungsring 26 zwischen dem Boden der Ausnehmung 24 und der dem Boden zugewandte Stirnseite des Verschlußteiles 28 dichtend verformt wird.6) The closure part 28 is screwed into the recess 24 until the sealing ring 26 is deformed in a sealing manner between the bottom of the recess 24 and the end face of the closure part 28 facing the floor.
• 7) Auffüllen der Räume 5 und 6 und der Zuleitung 9 über die Zuleitung 22 bei geöffnetem Absperrventil 66 mit der Bezugsflüssigkeit bzw. mit der physiolo­ gischen Salzlösung, wobei das Rahmenteil 29 zweck­ mäßigerweise so verschwenkt wird, daß gegebenenfalls vorhandene Luftblasen durch die Zuleitung nach oben durch die weitere Leitung 9 entweichen können. Dabei muß, um ein Abfließen der Bezugsflüssigkeit in den ersten Raum 4 zu verhindern, das Absperrventil 62 geschlossen werden. Das Ventil 67 ist geöffnet. Verriegeln der Zuleitung 22.7) Filling the rooms 5 and 6 and the feed line 9 via the feed line 22 with the shut-off valve 66 open with the reference liquid or with the physiological saline solution, the frame part 29 advantageously being pivoted so that any air bubbles present through the feed line upwards can escape through the further line 9 . In order to prevent the reference liquid from flowing into the first space 4 , the shut-off valve 62 must be closed. The valve 67 is open. Lock the supply line 22 .
• 8) Der Raum 4 und die Zuleitung 7 werden aus einem ersten Reservoir 30 mit einer Bezugsflüssigkeit, bei der es sich vorzugsweise um eine physiologische Salzlösung handelt, aufgefüllt. Hierbei wird vor­ zugsweise das Rahmenteil 29 in die genannte erste Position geschwenkt, damit ein Entweichen von Luftblasen durch die Zuleitung 7 nach oben möglich ist. Dabei erfolgt das Auffüllen bis zu einem vorgegebenen hydrostatischen Druckniveau h₂ im Reservoir 30. Dieses Druckniveau h₂ wird mit der Hilfe von an sich bekannten Einrichtungen gehalten. Die genannten Einrichtungen bestehen vorzugsweise aus einem Niveaufühler z. B. in der Form eines Schwimmers oder eines elektrooptischen Fühlers 70, der an seinem Ausgang ein Signal für einen nicht dargestellten Regelkreis erzeugt, der den Zufluß von Bezugsflüssigkeit über eine Zufuhrleitung 71 und das Abpumpen von Bezugsflüssigkeit über eine Entnahmeleitung 72 regelt. Die Zugabe und Entnahme der Bezugsflüssigkeit kann auch kontinuierlich derart erfolgen, daß durch die Zugabeleitung 71 fortlaufend mehr Bezugsflüssigkeit zugeführt als über die Zuleitung 7 in die Vorrichtung abgegeben wird und daß der Überschuß an Bezugsflüssigkeit im Reservoir 30 zum Erhalt des Niveaus h₂ über die Entnahmeleitung 72 fortlaufend abgeführt wird.8) The space 4 and the feed line 7 are filled from a first reservoir 30 with a reference liquid, which is preferably a physiological salt solution. Here, the frame part 29 is preferably pivoted into said first position so that an escape of air bubbles through the feed line 7 is possible upwards. The filling takes place up to a predetermined hydrostatic pressure level h 2 in the reservoir 30 . This pressure level h₂ is maintained with the help of known devices. The facilities mentioned preferably consist of a level sensor z. B. in the form of a float or an electro-optical sensor 70 , which generates at its output a signal for a control circuit, not shown, which controls the inflow of reference liquid via a supply line 71 and the pumping of reference liquid via a sampling line 72 . The addition and removal of the reference liquid can also be carried out continuously in such a way that more reference liquid is continuously supplied through the addition line 71 than is fed into the device via the line 7 and that the excess of reference liquid in the reservoir 30 to maintain the level h 2 continuously via the removal line 72 is dissipated.
• 9) Quantitatives Messen des Volumentransportes der physiologischen Salzlösung, im Verlauf der Zeit durch kontinuierliches Abwägen mit der Waage 11. Dabei ist es von Bedeutung, daß das entsprechend fixierte Ende der Leitung 9 in das Waagenbad 10 eintaucht. Hierbei werden vorzugsweise die Wägeda­ ten mit einem Schreiber kontinuierlich registriert und zu bestimmten Zeiten mit der Hilfe eines Druckers ausgedruckt.9) Quantitative measurement of the volume transport of the physiological saline solution over time by continuous weighing with the scale 11 . It is important that the correspondingly fixed end of the line 9 is immersed in the scale bath 10 . In this case, the weighing data are preferably registered continuously with a recorder and printed out at certain times with the help of a printer.
• 10) Nach dem Unterbrechen der Verbindung zwischen der Zuleitung 7 und dem Reservoir 30 und dem Schließen des Absperrventiles 67 Absaugen der physiologischen Salzlösung im Raum 4 und in der Zuleitung 7 über die an der tiefsten Stelle des Raumes 4 angeordnete weitere Zuleitung 8, wobei sich das Rahmenteil 29 in der zweiten Position befindet.10) After interrupting the connection between the supply line 7 and the reservoir 30 and closing the shut-off valve 67, suction of the physiological saline solution in the room 4 and in the supply line 7 via the further supply line 8 arranged at the deepest point of the room 4 , whereby the Frame part 29 is in the second position.
• 11) Injektion von in derselben physiologischen Salzlö­ sung suspendierten Zellen (Zellsuspension) oder von Vollblut durch die weitere Zuleitung 8 in den Raum 4 derselben Filtrationsvorrichtung mit derselben Scheibe 3 bis zum Kontakt mit der Flüssigkeit im Reservoir 30 über das geöffnete Absperrventil 62 und bis zum Druckniveau h₂ der Bezugsflüssigkeit, das dann aufrechterhalten wird, wie dies unter Punkt 8 erläutert wurde.11) Injection of cells suspended in the same physiological saline solution (cell suspension) or of whole blood through the further feed line 8 into the space 4 of the same filtration device with the same disk 3 until contact with the liquid in the reservoir 30 via the open shut-off valve 62 and up to the pressure level h₂ of the reference liquid, which is then maintained, as explained in point 8 .
• 12) Öffnen des Absperrventiles 67 und sofortiges Messen das sich ergebenden Volumentransportes der Zellsus­ pension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas analog zum oben unter Punkt 9 beschrie­ benen Vorgang durch kontinuierlich registriertes Abwägen des Filtrates durch die Waage 11. Hierzu werden vorzugsweise die Wägedaten mit einem Schrei­ ber kontinuierlich registriert und zu bestimmten Zeiten mit der Hilfe eines Druckers ausgedruckt.12) Open the shut-off valve 67 and immediately measure the resulting volume transport of the Zellsus pension, the whole blood or the components of the blood plasma analogous to the procedure described under point 9 by continuously weighing the filtrate with the scale 11 . For this purpose, the weighing data are preferably continuously recorded with a writer and printed out at certain times with the help of a printer.
• 13) Errechnen der relativen Filterbarkeit bzw. Volumen­ transportrate, die gleich dem Filtrat der Zellsu­ spension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas pro Zeiteinheit dividiert durch das Filtrat der Bezugslösung pro Zeiteinheit ist.13) Calculate the relative filterability or volume  transport rate, which is equal to the filtrate of the Zellsu pension, whole blood or components of the Blood plasma per unit of time divided by The reference solution is filtrate per unit of time.

Gemäß der Fig. 5 kann ein in der bereits erwähnten Weise hergestelltes Endothelnetz 64 der Scheibe 3 in Strömungsrichtung vorgeschaltet werden. Vorzugsweise sind hierzu das Klemmteil 19 und der erste Raum 4 darin so bemessen, daß ein Randbereich des ersten Raumes 4 über die Einspanneinrichtung nach innen hinausragt, so daß wenig­ stens ein eingesetztes Endothelnetz 64, das in Fig. 4 auszugsweise dargestellt ist, hinter dem Randbereich, vorzugsweise in angenähert paralleler Flächenausrichtung zur Scheibe 3 festgehalten wird. Gemäß Fig. 4 sollen die einzelnen Netzfäden 68 des Netzes 64 vollständig (kon­ fluent) mit Endothelzellen 69 bewachsen sein.According to FIG. 5, a prepared in the aforementioned manner Endothelnetz 64 may the disc be connected upstream in the flow direction. 3 For this purpose, the clamping part 19 and the first space 4 are preferably dimensioned such that an edge region of the first space 4 projects inward beyond the clamping device, so that at least an inserted endothelial network 64 , which is shown in part in FIG. 4, behind the edge region , preferably held in approximately parallel surface alignment to the disc 3 . According to Fig. 4 are each net threads to be covered with endothelial cells of the network 69 68 64 completely (kon fluent).

Durch die weitere Zuleitung 8 können vor der Ausführung des oben genannten Schrittes 12 Mediatorsubstanzen in den ersten Raum 4 eingebracht werden. um eine gute Durchmischung derselben im ersten Raum 4 zu erreichen, kann in diesem eine Mischeinrichtung vorgesehen sein, die beispielsweise die Form eines durch einen Magneten von außen bewegbaren Metallringes oder dergl. aufweist.The additional supply line 8 allows 12 mediator substances to be introduced into the first space 4 before the above-mentioned step is carried out. In order to achieve thorough mixing of the same in the first space 4 , a mixing device can be provided in the first space 4 , which has, for example, the shape of a metal ring or the like which can be moved from the outside by a magnet.

Im folgenden wird ein nach dem Verfahren durchgeführter Test in Zusammenhang mit den Fig. 6A und 6B näher erläutert.A test carried out according to the method in connection with FIGS. 6A and 6B is explained in more detail below.

Es wurde die spezifische Aktivierbarkeit von polymorph­ kernigen Leukozyten (= PMN = neutrophile Granulozyten) durch N-Formyl-methionyl-Leucyl-phenylanin (= FMLP) in Vollblut und in einer Suspension der rein dargestellten Zellen untersucht.It was the specific activability of polymorph nuclear leukocytes (= PMN = neutrophil granulocytes) by N-formyl-methionyl-leucyl-phenylanine (= FMLP) in Whole blood and in a suspension of the purely shown Cells examined.

Dabei wurde das Vollblut mit einer physiologischen Salzlösung im Verhältnis 1 : 10 verdünnt. Die PMN-Zellen wurden durch eine Percoll-Dichtegradientenzentrifugation nach einem Standardverfahren und unter Verwendung einer Zellseparationszentrifuge ZS der Fa. Edmund Bühler, D-D 7241 Bodelshausen (siehe auch DE 35 04 205 A1) gewonnen und anschließend mit einer physiologischen Salzlösung 3mal gewaschen und schließlich auf 1/10 ihrer Konzentra­ tion im Vollblut eingestellt. Kurz vor Durchführung des vorliegenden Verfahrens wurde den Zellpräparaten und Vollblutfraktionen eine definierte Konzentration von FMLP (der Fa. Sigma Chemie) zugesetzt. Als Teil wurde ein Polycarbonatfilter der Fa. Nucleopore mit einem Porendurchmesser von 5 µm ± 10% verwendet. Die Filtra­ tion erfolgte unter einem konstanten hydrostatischen Druck von 10 cm H₂O bei 37°C.The whole blood was treated with a physiological Saline diluted 1:10. The PMN cells were by Percoll density gradient centrifugation using a standard procedure and using a Cell separation centrifuge ZS from Edmund Bühler, D-D 7241 Bodelshausen (see also DE 35 04 205 A1) and then with a physiological saline solution Washed 3 times and finally on 1/10 of their concentration tion set in whole blood. Shortly before the The present method was the cell preparations and Whole blood fractions a defined concentration of FMLP (from Sigma Chemie) added. As part of a polycarbonate filter from Nucleopore with a Pore diameter of 5 µm ± 10% used. The Filtra tion took place under a constant hydrostatic Pressure of 10 cm H₂O at 37 ° C.

Aus den Fig. 6A und 6B ist ersichtlich, daß das FMLP ein in hohem Maße wirksamer Aktivator der PMN-Leukozyten ist, die in Abhängigkeit von der FMLP-Konzentration durch eine Formänderung und eine auch gesteigerte Affinität zum Filter die relative Volumenstromrate immer mehr einschränkten. Die Tatsache, daß die EC₅₀ dieser Prozesse im Vollblut etwa 3 × 10^-9M (Fig. 6B), in der PMN-Suspension aber etwa 2 × 10^-8M (Fig. 6A) beträgt, weist darauf hin, daß es unter den gegebenen Bedingungen im Vollblut zu einer starken Wechselwirkung mit anderen Blutzellen kommt, die die Durchlässigkeit des Filters bzw. des Teiles 3 zusätzlich erniedrigt. Eine rasterelektronenmikroskopische Überprüfung der Filter ergab, daß es sich dabei um Plättchen handelte.From FIGS. 6A and 6B it can be seen that the FMLP is a potent highly activator of PMN leukocytes which restricted depending on the FMLP concentration by a change in shape and also increased affinity for the filters, the relative volume flow rate, more and more. The fact that the EC₅₀ of these processes in whole blood is about 3 × 10 ^-9 M ( Fig. 6B), but in the PMN suspension about 2 × 10 ^-8 M ( Fig. 6A) indicates that it is below Given the conditions in whole blood, there is a strong interaction with other blood cells, which additionally lowers the permeability of the filter or of part 3 . A scanning electron microscope examination of the filters showed that they were platelets.

Claims (10)

1. Verfahren zur Messung der Volumenflußrate von Zellen einer Zellsuspension, von Vollblut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas, die durch ein poröses Teil befördert werden, wobei als poröses Teil ein mit Durchgängen (2), deren Durchmesser in der Größenordnung der Zellen oder der Komponenten liegt, versehenes Teil (3) verwendet wird, wobei das Teil (3) die Form einer Scheibe aufweist, in der die Durchgänge (2) von der einen Seite der Scheibe zur anderen Seite der Scheibe (3) verlaufen und der Durchmesser der Durchgänge (2) in einem Bereich von 3 bis 8 µm liegt und die Dichte der Durchgänge (2) in der Scheibe etwa 1000 bis 5000 Durchgänge pro mm² beträgt und die Dicke der Scheibe im Bereich von 2 bis 100 µm liegt, wobei in einem ersten Schritt unter Verwendung des Teiles (3) die Volumenflußrate einer durch das Teil (3) hindurchtretenden Bezugsflüssigkeit ermittelt wird, wobei in einem zweiten Schritt unter Verwendung desselben Teils (3) die Volumenflußrate der durch das Teil (3) hindurchtretenden Zellsuspension, Vollblut-Zellen oder Komponenten des Blutplasmas ermittelt wird, wobei die Bezugsflüssigkeit und die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas durch denselben reproduzierbaren und definierten Druck durch das Teil (3) befördert werden, wobei die Volumenflußraten durch Abwägen dadurch bestimmt werden, daß die durch das Teil (3) hindurchtretende Bezugsflüssigkeit oder die durch das Teil (3) hindurchtretende Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas in ein auf einer Waage (11) befindliches Waagenbad (11) eingeleitet werden, und wobei in einem weiteren Schritt aus den gemessenen Volumenflußraten eine sich ergebende relative Volumenflußrate bestimmt wird.1. A method for measuring the volume flow rate of cells of a cell suspension, whole blood cells or components of the blood plasma which are transported through a porous part, the porous part having a passage ( 2 ), the diameter of which is in the order of the cells or Components, provided part ( 3 ) is used, the part ( 3 ) having the shape of a disc in which the passages ( 2 ) run from one side of the disc to the other side of the disc ( 3 ) and the diameter of the passages ( 2 ) is in a range from 3 to 8 µm and the density of the passages ( 2 ) in the disk is approximately 1000 to 5000 passes per mm² and the thickness of the disk is in the range from 2 to 100 µm, in a first step using the part ( 3 ) the volume flow rate of a reference liquid passing through the part ( 3 ) is determined, wherein in a second step using the same part ( 3 ) the Vo lumen flow rate of the cell suspension, whole blood cells or components of the blood plasma passing through the part ( 3 ) is determined, the reference liquid and the cell suspension, the whole blood or the components of the blood plasma being conveyed through the part ( 3 ) by the same reproducible and defined pressure, wherein the volume flow rates are determined by weighing the fact that the by the part (3) passing reference liquid or the light passing through the part (3) cell suspension, the whole blood or the components of the blood plasma in a befindliches on a balance (11) Waagenbad (11) are introduced, and in a further step a resulting relative volume flow rate is determined from the measured volume flow rates. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor der Messung der Volumenflußrate der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas wenigstens eine Mediatorsubstanz in die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas eingebracht wird, die die Aktivierung oder Verformbarkeit und/oder die Aggregationsneigung und/oder die Adhäsivität der Zellen bzw. Komponenten beeinflußt.2. The method according to claim 1, wherein before the measurement of Volume flow rate of the cell suspension, whole blood or at least one of the components of the blood plasma Mediator substance in the cell suspension, whole blood or the components of the blood plasma is introduced, which the Activation or deformability and / or the Tendency to aggregate and / or the adhesiveness of the cells or components affected. 3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Mediatorsubstanz während der Messung der Volumenflußrate der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas in die Zellsuspension eingebracht wird. 3. The method of claim 1, wherein a Mediator substance during the measurement of the volume flow rate the cell suspension, whole blood or components of the blood plasma is introduced into the cell suspension.   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als Bezugsflüssigkeit eine physiologische Salzlösung verwendet wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein as Reference liquid uses a physiological saline solution becomes. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zellsuspension die zu untersuchenden Zellen in einer physiologischen Kochsalzlösung enthält.5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the Cell suspension the cells to be examined in a contains physiological saline. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas und gegebenenfalls die Bezugsflüssigkeit durch ein mit tierischen oder menschlichen Zellen bewachsenes Netz (64) befördert wird, das vor dem Teil (3) angeordnet wird, wobei dessen Maschen oder Öffnungen so bemessen sind, daß die Zellen im wesentlichen ungehindert hindurchströmen können.6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell suspension, the whole blood or the components of the blood plasma and optionally the reference liquid is conveyed through a network ( 64 ) overgrown with animal or human cells, which is arranged in front of the part ( 3 ) , the meshes or openings of which are dimensioned such that the cells can flow through them essentially unimpeded. 7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei auf dem Netz (64) eine Endothelzellenschicht etabliert wird.7. The method according to claim 6, wherein an endothelial cell layer is established on the network ( 64 ). 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Umgebung einer Meßvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens auf einer konstanten Temperatur gehalten wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the Environment of a measuring device for performing the Process is kept at a constant temperature. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die eine Scheibe (3) aus Polycarbonat verwendet wird. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the one disc ( 3 ) made of polycarbonate is used. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei ein Netz (64) aus Nylon verwendet wird, an dessen Oberfläche tierische oder menschliche Zellen verankerbar sind.10. The method according to any one of claims 6 to 9, wherein a network ( 64 ) made of nylon is used, on the surface of which animal or human cells can be anchored.