DE3802221A1

DE3802221A1 - Vorrichtung zur messung der aktivierung von zellen einer zellsuspension, von vollblut-zellen oder von komponenten des blutplasmas

Info

Publication number: DE3802221A1
Application number: DE19883802221
Authority: DE
Inventors: Stephan Prof Dr Rer Nat Nees
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-01-26
Filing date: 1988-01-26
Publication date: 1989-07-27
Anticipated expiration: 2008-01-27
Also published as: DE3802221C2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Aktivierung von Zellen einer Zellsuspension, von Voll blut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Das Blut übernimmt im Körper zahlreiche komplexe physio logische Funktionen. Diese betreffen:

a) die Versorgung aller Organe mit Sauerstoff und Stoffwechselsubstraten;
b) die "Endsorgung" aller Organe von Kohlendioxid und Metaboliten;
c) die Regulation der Körpertemperatur durch Abführung von Stoffwechselwärme in die Peripherie;
d) die Ausführung von Schutzfunktionen durch humorale und zelluläre Abwehrsysteme;
e) die Regulation des Wasserhaushaltes.

Eine wesentliche Voraussetzung zur Erfüllung dieser Funktionen ist die Durchlässigkeit der kleinsten Blutge fäße, in die sich der Blutkreislauf in allen Organen aufspaltet. Diese Blutgefäße werden in ihrer Gesamtheit jeweils als "Mikrozirkulationssystem" eines Organes bezeichnet. Die Durchlässigkeit der Mikrogefäße hängt zum einen von bestimmten Plasmakomponenten des Vollblu tes (z.B. Fibrin oder Albumin) ab, die aufgrund ihrer Konzentration eine bestimmte Plasmaviskosität hervorru fen. Zum anderen aber hängt die Durchlässigkeit der Mikrogefäße von der Konzentration, vor allem aber von der biologischen Reaktivität, bestimmter Zellen des Vollblutes ab. Bei solchen Zellen handelt es sich haupt sächlich um die Thrombozyten und die Granulozyten, die durch bestimmte Mediatorsubstanzen in kürzester Zeit aktiviert und zu ganz bestimmten Reaktionsweisen (Ände rung der Gestalt, Adhäsivität an der Gefäßwand, Aggrega tion, Freisetzung bestimmter Stoffwechselprodukte und eigener Mediatoren) stimuliert werden können. Durch dieses Verhalten kann es lokal zu einer drastischen Einschränkung des Blutflusses durch ein betroffenes Mikrozirkulationssystem kommen. Bei einer derartigen lokalen Erscheinung kann es sich beispielsweise um eine akute Entzündung handeln. Die Prozesse können sich in Notfällen aber auch aufschaukeln und generalisieren, wodurch lebensbedrohliche Schockzustände hervorgerufen werden können, wie dies beispielsweise bei einer bakte riellen Sepsis der Fall ist.

Aufgrund des geschilderten Sachverhaltes ergibt sich ein großes, klinisches Interesse, die Reaktionsbereitschaft der verschiedenen Blutzellen im Vollblut zu erfassen bzw. zu diagnostizieren, und den Aktivierungszustand dieser Blutzellen durch möglichst spezifisch wirkende Medikamente zu hemmen. Ein als "Screening-System" ausge legtes entsprechendes Meßsystem würde die Selektion und Entwicklung spezifischer pharmazeutischer Produkte bzw. Arzneien wesentlich erleichtern.

Bisher ist man bei der Beurteilung entsprechender Krite rien vor allem auf intakte Mikrozirkulationssysteme lebender Organe im Tierversuch angewiesen. Häufige Anwendungen findet hierbei die Hamster-Backentasche und die Skrotalhaut von Nagetieren, bei denen es sich um zwei extrem dünne Organsysteme handelt, die einer direk ten mikroskopischen Beobachtung im Durchlicht zugänglich sind. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die Veröffentlichungen "Nouvelles methodes d′etude de la fonction microcirculatoire , Institut national de la Sant´ et de la recherche medicale, R.Georges, (1986)", und "Harell, G.S. et al.: Microvasc. Res. 18, 384-402 (1979)" verwiesen.

Neben ethischen Gesichtspunkten erschweren aber vor allem die Komplexität, die Schwierigkeit der Prepara tion, die geringe Flexibilität der Versuchsanordnung, die schlechte Reproduzierbarkeit und die sehr teure Durchführung eine breitere Anwendung dieser Systeme. Zudem können physiologisch-chemische Prozesse, denen nach heutiger Erkenntnis immer mehr Bedeutung im Rahmen von Zellaktivierungsprozessen im Kreislaufsystem zuge messen werden müssen (siehe "Lewis, D.H. et al., Prog. appl. Microcirc. 12, 231-235 (1987)"), kaum erfaßt werden, da die Entnahme von Blut aus den erwähnten Mikrozirkulationssystemen technisch sehr schwierig ist und sich auf die für entsprechende chemische Analysen nicht ausreichenden Mengen von wenigen Mikrolitern beschränken muß. Als Ausweichmöglichkeit zum Studium zellulärer und humoraler Interaktionen wurden daher in den letzten Jahren in vitro-Methoden eingesetzt, bei denen man in Petrischalen gezüchtete Endothelzellen - die in vivo die Innenwand aller Blutgefäße auskleiden - mit verschiedenen Blutzellen inkubiert (siehe beispiels weise "Cronstein, BN.N. et al., in "Topics and Perspec tives in Adenosine Research- Gerlach E. u. Becker B. F.- Hrsg. Springer Verlag Heidelberg, 299-308 (1987)"). Dieser Ansatz hat aber den Nachteil, daß der Einfluß der in vivo oft entscheidenden Blutrheologie nicht miterfaßt wird und daß daher die so gewonnenen Aussagen nur eine zweifelhafte Übertragbarkeit auf die Situation im Kreis laufsystem ergeben. Zudem eignen sich solche Testsysteme nicht für Vollblut-Untersuchungen und nicht für die breite Anwendung im Rahmen von Screening-Tests der pharmazeutischen Industrie.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein verbessertes und praktikables Verfahren zur Messung der Aktivierung von Blutzellen anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch ein wie eingangs bereits ge nanntes Verfahren gelöst, das durch die in dem kenn zeichnenden Teil des Patentanspruches 1 angegebenen Merkmale gekennzeichnet ist.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfah rens besteht darin, daß es erstmals Messungen der biolo gischen Reaktivität von Zellen des Vollblutes reprodu zierbar ermöglicht.

Vorteilhafterweise ermöglicht die Erfindung die Durch führung der genannten Messungen, ohne daß man dabei auf lebende Organe bzw. Tierversuche angewiesen ist. Die Erfindung kann daher wesentlich dazu beitragen, die Zahl notwendiger Tierversuche zu verringern.

Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr viel einfacher durchführbar als die bisher bekann ten Verfahren, da es weniger komplex ist und da keine schwierigen Präparationen erforderlich sind.

Vorteilhafterweise können nach der Erfindung ausreichend große Blutmengen im Milliliterbereich untersucht werden. Dabei kann ohne weiteres die Freisetzung von Mediator substanzen und Metaboliten aus den Blutzellen erfaßt werden.

Ein sehr wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sie Messungen bzw. Untersuchungen in der Form von Screening-Tests im großen Umfang ermöglicht, was für die Entwicklung bzw. Selektion spezifisch wirkender pharmazeutischer Produkte unbedingt erforderlich ist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestal tungen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 in schematischer Darstellung eine erfin dungsgemäße Vorrichtung zur Messung der Ver formbarkeit und/oder der Aggregation und/oder der Adhäsivität bzw. der Aktivierung von Zellen;

Fig. 2 in schematischer Darstellung einen Einspann rahmen zum Einspannen einer mit Durchgängen versehenen Scheibe;

Fig. 3A, 3B in vergrößerter Darstellung die Beschaffen heit einer Scheibe und die Verformung einer Zelle beim Durchtritt durch einen Durchgang der Scheibe;

Fig. 4 ein der Scheibe vorsetzbares Endothelnetz;

Fig. 5 eine bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Vorrichtung, in die Endothelnetze gemäß Fig. 5 einsetzbar sind; und

Fig. 6A, 6B Diagramme zur Erläuterung des erfindungs gemäßen Meßverfahrens.

Zu der Erfindung führten die folgenden Überlegungen. Eine ausreichend gute Nachbildung der rheologischen Verhältnisse in Mikrozirkulationsbereichen des Blutkreis laufes läßt sich in vitro erreichen, wenn man Vollblut oder mit schonenden Verfahren gereinigte Blutzellfrakti onen oder Komponenten des Blutplasmas unter definierten, auf die entsprechenden physiologischen Bedingungen eingestellten hydrostatischen Drücken durch mit Durch gängen versehene Teile bzw. Filter strömen läßt, wobei die Filter bzw. Teile biologisch inert sind und die Durchmesser im Bereich der Mikrogefäße in vivo liegen. Um Schwankungen in den verwendeten Filtern bzw. Teilen z.B. im Hinblick auf die Fläche, die Dicke und die Perforation bzw. Durchgänge zu vermeiden, wird in einem ersten Schritt die Filtrations- bzw. Volumentransportrate einer Bezugsflüssigkeit für ein Filter bzw. Teil gemessen, wird in einem zweiten Schritt die Filtrations- bzw. Volumentransportrate der zu untersuchenden biologischen Probe für dasselbe Filter bzw. Teil gemessen und wird schließlich die von den genannten Schwankungen unabhängige relative Filtrations- bzw. Volumentransportrate bestimmt. Um die Bedingungen in vivo nahezu vollkommen nachahmen zu können, kann dem Teil bzw. Filter ein für die Veran kerung von tierischen bzw. menschlichen Zellen modifi ziertes Netz, das zum Beispiel aus Nylon besteht, vorge schaltet werden, wobei die Maschen des Netzes etwa 5 bis 10 mal größer sind als die Durchmesser der durch das Teil bzw. das Filter hindurchströmenden Blutzellen und wobei das Netz vollkommen mit gezüchteten Endothelzellen überzogen ist. Durch die angegebene Maschengröße wird dabei sichergestellt, daß das Netz keinen nennenswerten mechanischen Einfluß auf die Blutbewegung ausübt. Die Anzucht der Endothelzellen erfolgt nach Standartmethoden im Gewebelabor (siehe z.B. "Nees S., Gerbes A.L., Ger lach E., Europ. J. Cell. Biol. 24, 287-297 (1981)"). Die biologische Inertheit der Werkstoffe des gesamten Innenraumes eines derartigen Filtersystemes vorausge setzt, ergeben die relativen Durchfluß- bzw. Filtra tionsraten, d.h. die auf den Durchfluß einer Bezugslö sung, bei der es sich um eine physiologische Salzlösung handeln kann, bezogenen Durchfluß- bzw. Filtrationsraten ausgezeichnete reproduzierbare Kenngrößen für den basa len Aktivierungszustand der Blutzellen in der jeweiligen Vollblutprobe. Die genannte biologische Inertheit läßt sich vorzugsweise durch Materialien wie Teflon oder Plexiglas erreichen. Ein besonderer Vorteil liegt dabei auch darin, daß der Einfluß des vaskulären Endothels bzw. die Freisetzung physiologisch aktiver Stoffe aus diesem Gewebe durch die Zugabe bzw. Entfernung des bzw. der mit Endothelzellen überzogenen Netze genau miterfaßt und gegen die Reaktionen der Blutzellen abgegrenzt werden kann.

Aufgrund der in den letzten Jahren stark erweiterten Kenntnisse über die physiologische Aktivierbarkeit ganz bestimmter Blutzellarten (z.B. der Thrombozyten oder der Granulozyten) durch ganz bestinmte Mediatorsubstanzen lassen sich in der oben geschilderten Weise ausgeführte Untersuchungen außerdem auf die Aktivierbarkeit ganz bestimmter Blutzellarten in der untersuchten Vollblut probe spezifizieren. Zu diesem Zweck wird der zu unter suchenden Probe eine geeignete Menge einer spezifischen Mediatorsubstanz vor der Durchführung des beschriebenen Meßverfahrens zugeführt. Die durch die Mediatorsubstan zen bewirkte selektive Aktivierung der betreffenden Blutzellen führt zu einer charakteristischen konzentra tions- und zeitabhängigen Beeinflussung der Durchfluß- bzw. Filtrationsraten, aus der man wertvolle klinische- diagnostisch und pharmakologisch wichtige Aufschlüsse über die Blut- und Kreislaufphysiologie des Spenders des untersuchten Blutes ziehen kann. Durch die gleichzeitige Zugabe von Medikamenten läßt sich außerdem - immer auf der Basis einer einfachen, reproduzierbaren, und billi gen quantitativen Methode - testen, inwiefern die beob achtete bzw. induzierte Aktivierung der jeweiligen Blutzellen gehemmt werden kann. Die Erfindung ermöglicht es, daß genügend große Blutmengen im Milliliterbereich untersucht und damit auch die Freisetzung von aus den Zellen selbst freigesetzten Mediatorsubstanzen und Metaboliten erfaßt werden kann.

Gemäß Fig. 1 besteht die vorliegende Vorrichtung zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens im wesentlichen aus einem Aufnahmeteil 1 für ein mit Durchgängen 2 versehenes Teil, einem auf der einen Seite des Teiles angeordneten ersten Raum 4, einem auf der anderen Seite des Teiles angeordneten zweiten Raum 5, 6, einer Zulei tung 7 zum ersten Raum 4, einer weiteren Zuleitung 8 zum Einfüllen bzw. Entnehmen einer Bezugsflüssigkeit bzw. Zellsuspension, bei der es sich, wie bereits beschrie ben, z.B. um Vollblut oder um eine bestimmte Zellfrak tion handeln kann, in bzw. aus dem Raum 4, und einer Leitung 9, die die zusammenhängenden Räume 5 und 6 und auch den über das Teil 3 mit diesen Räumen 5, 6 kommuni zierenden Raum 4 mit einem Waagenbad 10 verbindet, das sich auf einer Waagschale oder dergleichen einer Waage 11 befindet.

Das zuvor genannte Teil kann beispielsweise die Form eines mit den Durchgängen 2 versehenen Filters oder einer mit diesen Durchgängen versehenen Scheibe aufweisen. Die Form dieses Teiles, das im folgenden als "Scheibe 3" bezeichnet wird, kann jedoch beliebig sein, solange sichergestellt wird, daß durch das Teil die genannten Suspensionen reproduzierbar fließen können.

Die Scheibe 3 besteht aus einem biologisch, physika lisch und chemisch inerten Material, bei dem es sich beispielsweise um Polycarbonast oder Tetrafluorethylen (Teflon) handelt, in dem durchgehende Öffnungen in der Form von Durchgängen 2 (Fig. 3A), die einen vorgegebenen Durchmesser und eine vorgegebene Dichte besitzen, enthal ten sind. Der Durchmesser der Durchgänge 2 ist so beschaffen, daß er in der Größenordnung der relevanten Zellen der Zellsuspension oder des Blutes liegt, an der bzw. dem Messungen vorgenommen werden sollen. Der Durch messer der Durchgänge 2 ist vorzugsweise nicht größer als 8 µm und vorzugsweise nicht kleiner als 3 µm. Beispielsweise beträgt dieser Durchmesser 5 µm. Die Dichte der Durchgänge 2 in der Scheibe 3 liegt vorzugs weise bei etwa 1000 bis 5000 Durchgängen pro mm², während die Dicke der Scheibe 3 vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 100 µm liegt. Fig. 3B zeigt, in welcher Weise Zellen beim Passieren von Durchgängen 2 in der Scheibe 3 aufgrund des kleineren Durchmessers der Durchgänge 2 verformt werden.

Die Scheibe 3 wird vorzugsweise in die Vertiefung 12 eines Halteringes 13 eingelegt, wobei der Haltering 13 zusammen mit einem Abdeckring 14 einen Einspannrahmen bzw. eine Einspanneinrichtung für die Scheibe 3 bildet. Nach dem Einlegen der Scheibe 3 in die Vertiefung 12 des Halteringes 13 wird der Abdeckring 4 auf die freiliegen de Fläche der in der Vertiefung 12 des Halteringes 13 befindlichen Scheibe 3 gelegt. Dabei ist der Abdeckring 14 so bemessen, daß sein Außenumfang geringfügig kleiner als der Durchmesser der Vertiefung 12 ist. Sowohl in dem Haltering 13 als auch in dem Abdeckring 14 ist eine Öffnung 15 vorgesehen, die nach dem Einsetzen des Ab deckringes 14 in die Vertiefung 12 des Halteringes 13 etwa deckungsgleich zueinander ausgerichtet sind. Auf diese Weise wird erreicht, daß die Scheibe 3 sicher und fest in der aus dem Haltering 13 und dem Abdeckring 14 bestehenden Einspanneinrichtung, die vorzugsweise aus Teflon gestaltet wird, da dadurch an den Andruckflächen eine Dichtwirkung erzielt wird, gehalten wird und daß eine Zellsuspension bzw. Vollblut bzw. Komponenten des Blutplasmas oder eine Bezugsflüssigkeit in der Form einer physiologischen Salzlösung durch die Durchgänge 2 des in den Öffnungen 15 freiliegenden Bereiches der Scheibe 3 hindurchtreten kann.

Die mit der Scheibe 3 versehene Einspanneinrichtung 13, 14 wird vorzugsweise in eine Vertiefung 16 eingesetzt, die sich in dem Aufnahmeteil 1 befindet. Die Vertiefung 16 ist dabei so beschaffen, daß sie etwa komplementär zum Haltering 13 ausgebildet ist.

Vorzugsweise wird der in der Fig. 1 auf der rechten Seite vor der Scheibe 3 befindliche erste Raum 4 dadurch gebildet, daß sich die Vertiefung 16 in einen wenig stens teilweise mit einem Innengewinde 17 versehenen Aufnahmeraum 18 öffnet, wobei ein Klemmteil 19 mit einem Außengewinde 20 derart in den Aufnahmeraum 18 ein schraubbar ist, daß sich die der Scheibe 3 zugewandte Stirnseite des Klemmteiles 19 an der dem Klemmteil 19 zugewandten Seite des Halteringes 13 und des Abdeckrin ges 14 der Einspanneinrichtung abstützt und diese in die Vertiefung 16 hineindrückt. Dabei befindet sich in dem der Einspanneinrichtung vorgelagerten Bereich des Klemm teiles 19 der erste Raum 4, der an seinem der Scheibe 3 abgewandten Ende mit der vorzugsweise aus Teflon beste henden Zuleitung 7 in der später noch näher erläuterten Weise verbunden ist. Die Zuleitung 8, deren Anordnung ebenfalls später erläutert werden wird, endet im ersten Raum 4 vorzugsweise kurz vor der ihr zugewandten Ober fläche der Scheibe 3 bzw. eines vorgeschalteten Endothel netzes, vorzugsweise an der in der Gebrauchslage der Vorrichtung tiefsten Stelle des Raumes 4.

Die Vertiefung 16 geht an der dem ersten Raum 4 abge wandten Seite in einen Teilraum 5 über, der vorzugsweise einen kleineren Durchmesser aufweist als die Vertiefung 16, so daß sich am Übergang zwischen dem Teilraum 5 und der Vertiefung 16 eine Auflageschulter bzw. -fläche 21 für die Einspanneinrichtung bildet.

Vorzugsweise öffnet sich der Teilraum 5 an der der Vertiefung 16 abgewandten Seite in einem weiteren Teil raum 6, der ebenso wie der Teilraum 5 im Aufnahmeteil 1 angeordnet ist und der zusammen mit dem Teilraum 5 den dem ersten Raum 4 gegenüberliegenden und über das Teil 3 mit diesem kommunizierenden zweiten Raum bildet. Der Teilraum 6 steht über die Leitung 9 mit dem bereits erwähnten Waagenbad 10 in Verbindung und weist vorzugs weise außerdem noch eine Zuleitung 22 auf, deren Funk tion später noch näher erläutert werden wird. Vor zugsweise sind der Übergangsbereich 31 zwischen dem Teilraum 6 und der Leitung 9 und der Übergang 31′ zwischen dem Teilraum 6 und der Zuleitung 22 derart konisch gestaltet, daß sich der Teilraum 6 zur Leitung 9 bzw. zur Zuleitung 22 hin ohne Ecken und Kanten in der Flußrichtung verjüngt, und daß die Leitung 9 in der Gebrauchslage der Vorrichtung am höchsten Punkt des Raumes 6 einmündet. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß sich in diesen Übergangsbereichen 31, 31′ keine Luftblasen verfangen können, wenn der Teilraum 6 mit der Bezugsflüssigkeit gefüllt wird.

Entsprechend weist der der Zuleitung 7 zugewandte Endbe reich 32 des Raumes 4 eine konische Form auf, durch die ein Verfangen von Luftblasen beim Füllen des Raumes 4 verhindert wird, wenn die Vorrichtung um 90° verschwenkt wird, wie dies später erläutert werden wird.

Die Befestigung der Zuleitung 7 im Klemmteil 19 muß derart erfolgen, daß das freie Ende der Zuleitung 7 in den Raum 4 dicht hineingeführt wird. Im Detail sind dafür die folgenden Konstruktionsmerkmale vorgesehen: In dem der Scheibe 3 abgewandten Endbereich des Klemmteiles 19 ist eine wenigstens teilweise mit einem Innengewinde 23 versehene Ausnehmung 24 angeordnet, die über einen Durchgang 25 mit dem Raum 4 in Verbindung steht. Der Durchgang 25 weist vorzugsweise einen Durchmesser auf, der geringfügig größer ist als der Außendurchmesser der Zuleitung 7 und der kleiner ist als der Durchmesser der Ausnehmung 24. Am Übergang zwischen dem Durchgang 25 und dem Boden der Ausnehmung 24 entsteht dadurch ein ringförmiger Auflagebereich für einen Dichtungsring 26, der mit seinem Außenumfang an der Innenwandung der Ausnehmung 24 und mit seinem Innenumfang am Außenumfang der Zuleitung 7 anliegt. In die Ausnehmung 24 ist ein mit einem Außengewinde 27 versehenes Verschlußteil 28 derart einschraubbar, daß sein der Scheibe 3 zugewandtes Ende gegen den Dichtungsring 26 gepreßt wird. Der Dich tungsring 26 wird dabei so verformt, daß zwischen dem Außenumfang der Zuleitung 7 und dem Boden der Ausnehmung 24 eine dichte Verbindung entsteht.

Die vorzugsweise aus einem Teflon-Schlauch gebildete Zuleitung 8 kann beispielsweise dicht durch einen im Klemmteil 19 ausgebildeten Durchgang so verlaufen, daß sie an der genannten tiefsten Stelle des Raumes 4 in der genannten Weise vor der Scheibe 3 bzw. einem Endothel netz 64 (Fig. 5) endet. Es ist jedoch auch denkbar, die Zuleitung 8 aus zwei Teilleitungen zu bilden, von denen eine dicht an die Öffnung des genannten Durchganges angesetzt ist, die in den Raum 4 mündet und von denen die andere dicht an die Öffnung dieses Durchganges angesetzt ist, die sich zur Außenseite des Klemmteiles 19 hin öffnet.

Vorzugsweise ist das Aufnahmeteil 1 an einem ver schwenkbaren Rahmenteil 29 befestigt, das aus der in der Fig. 1 ersichtlichen Lage (zweite Position), in der die Längsachsen des Durchganges 5 und des Raumes 4 und des Endbereiches der Zuleitung 7 horizontal angeordnet sind, um 90° derart verdrehbar ist, daß die genannten Längs achsen etwa vertikal ausgerichtet sind (erste Position). Durch den Schwenkvorgang kann die Vorrichtung zum Füllen der Räume 4 bzw. 5, 6 beiderseits der Scheibe 3 in Lagen gekippt werden in denen bei den jeweiligen Füllvorgän gen in den entsprechenden Räumen 4 bzw. 5, 6 vorhandene Luftblasen nach oben entweichen können. Beispielsweise wird beim Füllen des Raumes 4 und der Zuleitung 7 aus einem Reservoir 30 das Rahmenteil 29 derart gekippt, daß die Längsachse des Raumes 4 etwa vertikal ausgerich tet ist. Entsprechend wird beim Füllen der Teilräume 5 und 6 über die Zuleitung 22 das Rahmenteil 29 so gedreht, daß in den genannten Teilräumen enthaltene Luftblasen durch die Zuleitung 9 entweichen können.

Mit der zuvor beschriebenen Vorrichtung wird das erfin dungsgemäße Verfahren durch Vornahme der folgenden Schritte ausgeübt:

1) Es wird eine Scheibe 3 in der oben beschriebenen Weise in die Spanneinrichtung 13, 14 eingelegt.
2) Die Spanneinrichtung 13, 14 wird in die Vertiefung 16 des Aufnahmeteiles 1 eingesetzt.
3) Das Klemmteil 19 wird in die Ausnehmung 18 einge schraubt, bis die Spanneinrichtung 13, 14 zwischen der Schulterfläche 21 und der ihr zugewandten Stirnseite des Klemmteiles 19 festgeklemmt ist.
4) Der Dichtungsring 26 wird über den Endbereich der vorzugsweise schlauchförmigen Zuleitung 7 geschoben.
5) Der Endbereich der Zuleitung 7 wird durch die Ausnehmung 24 und den Durchgang 25 derart in den Raum 4 eingeführt, daß der Dichtungsring 26 etwa am Boden der Ausnehmung 24 aufliegt und daß sich das Ende der Zuleitung 7 am Übergang zwischen dem konischen Bereich 32 und dem Durchgang 25 befindet.
6) Das Verschlußteil 28 wird in die Ausnehmung 24 eingeschraubt, bis der Dichtungsring 26 zwischen dem Boden der Ausnehmung 24 und der dem Boden zugewandten Stirnseiten des Verschlußteiles 28 dichtend verformt wird.
7) Auffüllen der Teilräume 5 und 6 und der Zuleitung 9 über die Zuleitung 22 bei geöffnetem Absperrventil 66 mit der Bezugsflüssigkeit bzw. mit der physiolo gischen Salzlösung, wobei das Rahmenteil 29 zweck mäßigerweise so verschwenkt wird, daß gegebenenfalls vorhandene Luftblasen durch die Zuleitung nach oben 9 entweichen können. Dabei muß, um ein Abfließen der Bezugsflüssigkeit in den Raum 4 zu verhindern, das Absperrventil 62 geschlossen werden. Das Ventil 67 ist geöffnet. Verriegeln der Zuleitung 22.
8) Der Raum 4 und die Zuleitung 7 werden aus einem ersten Reservoir 30 mit einer Bezugsflüssigkeit, bei der es sich vorzugsweise um eine physiologische Salzlösung handelt, aufgefüllt. Hierbei wird vor zugsweise das Rahmenteil 29 in die genannte erste Position geschwenkt, damit ein Entweichen von Luftblasen durch die Zuleitung 7 nach oben möglich ist. Dabei erfolgt das Auffüllen bis zu einem vorgegebenen hydrostatischen Druckniveau h ₂ im Reservoir 30. Dieses Druckniveau h ₂ wird mit der Hilfe von an sich bekannten Einrichtungen gehalten. Die genannten Einrichtungen bestehen vorzugsweise aus einem Niveaufühler z.B. in der Form eines Schwimmers oder eines elektrooptischen Fühlers 70, der an seinem Ausgang ein Signal für einen nicht dargestellten Regelkreis erzeugt, der den Zufluß von Bezugsflüssigkeit über eine Zufuhrleitung 71 und das Abpumpen von Bezugsflüssigkeit über eine Entnahmeleitung 72 regelt. Die Zugabe und Entnahme der Bezugsflüssigkeit kann auch kontinuierlich derart erfolgen, daß durch die Zugabeleitung 71 fortlaufend mehr Bezugsflüssigkeit zugeführt als über die Zuleitung 7 in die Vorrichtung abgegeben wird und daß der Überschuß an Bezugsflüssigkeit im Reservoir 30 zum Erhalt des Niveaus h ₂ über die Entnahmeleitung 72 fortlaufend abgefühlt wird.
9) Quantitatives Messen des Volumentransportes der physiologischen Salzlösung, im Verlauf der Zeit durch kontinuierliches Abwägen mit der Waage 11. Dabei ist es von Bedeutung, daß das entsprechend fixierte Ende der Leitung 9 in das Waagenbad 10 eintaucht. Hierbei werden vorzugsweise die Wägeda ten mit einem Schreiber kontinuierlich registriert und zu bestimmten Zeiten mit der Hilfe eines Druckers ausgedruckt.
10) Nach dem Unterbrechen der Verbindung zwischen der Zuleitung 7 und dem Reservoir 30 und dem Schließen des Absperrventiles 67 Absaugen der physiologischen Salzlösung im Raum 4 und in der Zuleitung 7 über die an der tiefsten Stelle des Raumes 4 angeordnete Zuleitung 8, wobei sich das Rahmenteil 29 in der zweiten Position befindet.
11) Injektion von in derselben physiologischen Salzlö sung suspendierten Zellen (Zellsuspension) oder von Vollblut durch die Zuleitung 8 in den Raum 4 derselben Filtrationsvorrichtung mit derselben Scheibe 3 bis zum Kontakt mit der Flüssigkeit im Reservoir 30 über das geöffnete Absperrventil 62 und bis zum Druckniveau h ₂ der Bezugsflüssigkeit, das dann aufrechterhalten wird, wie dies unter Punkt 8 erläutert wurde.
12) Öffnen des Absperrventiles 67 und sofortiges Messen des sich ergebenden Volumentransportes der Zellsus pension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas analog zum oben unter Punkt 9 beschrie benen Vorgang durch kontinuierlich registriertes Abwägen des Filtrates durch die Waage 11. Hierzu werden vorzugsweise die Wägedaten mit einem Schrei ber kontinuierlich registriert und zu bestimmten Zeiten mit der Hilfe eines Druckers ausgedruckt.
13) Errechnen der relativen Filterbarkeit bzw. Volumen transportrate, die gleich dem Filtrat der Zellsu spension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas pro Zeiteinheit dividiert durch das Filtrat der Bezugslösung pro Zeiteinheit ist.

Gemäß der Fig. 5 kann ein in der bereits erwähnten Weise hergestelltes Endothelnetz 64 der Scheibe 3 in Strömungsrichtung vorgeschaltet werden. Vorzugsweise sind hierzu das Klemmteil 19 und der Raum 4 darin so bemessen, daß ein Randbereich 68 des Raumes 4 über die Einspanneinrichtung nach innen hinausragt, so daß wenig stens ein eingesetztes Endothelnetz 64, das in Fig. 4 auszugsweise dargestellt ist, hinter dem Randbereich, vorzugsweise in angenähert paralleler Flächenausrichtung zur Scheibe 3 festgehalten wird. Gemäß Fig. 4 sollen die einzelnen Netzfäden 68 des Netzes 64 vollständig (kon fluent) mit Endothelzellen 69 bewachsen sein.

Durch die Zuleitung 8 können vor der Ausführung des oben genannten Schrittes 12, Mediatorsubstanzen in den Raum 4 eingebracht werden. Um eine gute Durchmischung derselben im Raum 4 zu erreichen, kann in diesem eine Mischeinrich tung vorgesehen sein, die beispielsweise die Form eines durch einen Magneten von außen bewegbaren Metallringes oder dergl. aufweist.

Im folgenden wird ein nach der vorliegenden Erfindung durchgeführter Test in Zusammenhang mit den Fig. 7A und 7B näher erläutert.

Es wurde die spezifische Aktivierbarkeit von polymorph kernigen Leukozyten (=PMN=neutrophile Granulozyten) durch N-Formyl-methionyl-Leucyl-phenylanin (=FMLP) in Vollblut und in einer Suspension der rein dargestellten Zellen untersucht.

Dabei wurde das Vollblut mit einer physiologischen Salzlösung im Verhältnis 1:10 verdünnt. Die PMN-Zellen wurden durch eine Percoll-Dichtegradientenzentrifugation nach einem Standartverfahren und unter Verwendung einer Zellseparationszentrifuge ZS der Fa. Edmund Bühler, D- 7454 Bodelshausen (siehe auch DE-OS 35 04 205) gewonnen und anschließend mit einer physiologischen Salzlösung 3 mal gewaschen und schließlich auf 1/10 ihrer Konzentra tion im Vollblut eingestellt. Kurz vor Durchführung des vorliegenden Verfahrens wurde den Zellpräparaten und Vollblutfraktionen eine definierte Konzentration von FMLP (der Fa. Sigma Chemie) zugesetzt. Als Teil wurde ein Polycarbonatfilter der Fa. Nucleopore mit einem Porendurchmesser von 5 µm ± 10% verwendet. Die Filtra tion erfolgte unter einem konstanten hydrostatischen Druck von 10 cm H₂O bei 37°C.

Aus den Fig. 7A und 7B ist ersichtlich, daß das FMLP ein in hohem Maße wirksamer Aktivator der PMN-Leukozyten ist, die in Abhängigkeit von der FMLP-Konzentration durch eine Formänderung und eine auch gesteigerte Affi nität zum Filter die relative Volumenstromrate immer mehr einschränkten. Die Tatsache, daß die EC₅₀ dieser Prozesse im Vollblut etwa 3×10^-9M (Fig. 7B), in der PMN-Suspension aber etwa 2×10^-8M (Fig. 7A) beträgt, weist darauf hin, daß es unter den gegebenen Bedingungen im Vollblut zu einer starken Wechselwirkung mit anderen Blutzellen kommt, die die Durchlässigkeit des Filters bzw. des Teiles 3 zusätzlich erniedrigt. Eine rasterelek tronenmikroskopische Überprüfung der Filter ergab, daß es sich dabei um Plättchen handelte.

Zusammenfassend wird darauf hingewiesen, daß durch die vorliegende Erfindung erstmals eine leicht bedienbare Untersuchungsvorrichtung und ein leicht auszuführendes Verfahren geschaffen wird, durch die das Zusammenwir ken der verschiedenen Zell-, Gewebe- bzw. Plasmabestand teile mikrovaskulärer Strombahnen des Körperkreislaufes außerhalb des Körpers quantitativ gemessen und differen ziert werden kann. Schon kleinste Änderungen in der Ge stalt, Adhäsivität bzw. Aggregabilität machen sich in einer reduzierten Filtrationsrate bemerkbar, weil die Zellen unter konstantem Druck durch ein poröses Teil ge drückt werden, dessen Durchgänge in der Größenordnung der Zelldurchmesser liegen. Auch die Aktivität plasmatischer Funktionsketten, wie z.B. des intrinsischen Gerinnungs systems, läßt sich nach der Erfindung messen.

Die kontinuierliche Erfassung der Filtratmengen im zeitlichen Verlauf durch elektronische Einwaage, stetige Registrierung auf einem Schreiber und Ausgabe als diffe renzierte Zahlenwerte über einen Drucker, liefert abso lute Meßwerte, die in ihrer Genauigkeit und Empfindlich keit der Erfassung durch andere mögliche Meßmethoden (z.B. photoelektrische Meßmethoden) weit überlegen ist. Auf dieser Grundlage können bei der vorliegenden Erfin dung die Filtrationsversuche auch bei sehr kleinen Druckgradienten durchgeführt werden, was die Erfaßbar keit kleinster Abänderungen der oben erwähnten biologi schen Zell- bzw. Plasmaparameter extrem steigert. Bei spielsweise werden schwach assoziierte Zellen bei der Filtration entlang eines kleinen Druckgradienten nicht auseinandergerissen, so daß die Filtrationsrate durch diese schwach assoziierten Zellen bereits deutlich eingeschränkt wird.

Da alle gemessenen Filtrationsraten im Endeffekt mit Filtrationsraten einer Bezugslösung in der Form einer physiologischen Salzlösung verglichen werden, die die Lösungsgrundlage auch aller Blut-, Zell- bzw. Plasmafrak tionen bildet, ergeben sich relative Filtrationsraten, deren Größe unabhängig ist von technisch unvermeidbaren Schwankungen in der Fläche, Dicke bzw. Perforation der verwendeten porösen Teile bzw. Filter. Unter der genann ten relativen Filtrationsrate wird das Verhältnis der Filtrationsrate der Bezugslösung zur Filtrationsrate der biologischen Probe verstanden.

Als ein klinisch immer interessanter werdender Aspekt erweist sich die durch die Erfindung geschaffene einfa che Möglichkeit, die physiologisch-chemische Aktivität des vaskulären Endothels über ein mit diesem Gewebe bewachsenes Netz in das Meßsystem einzubeziehen, das dann seine zahlreichen neu erkannten hämostasiologischen bzw. inflammatorisch wichtigen Funktionen auch im Test system erfüllt (siehe z.B. "Nees S. Internist (1987) 28: 699-710").

Klinisch immer interessanter wird auch die durch die Erfindung geschaffene Möglichkeit, bestimmte zelluläre Aktivierungsprozesse durch Zugabe spezifischer Mediator substanzen von außen her selektiv zu induzieren und ihre Kinetik zu registrieren, bzw. ihre Hemmbarkeit durch bestimmte Wirkstoffe, beispielsweise durch Medikamente, zu messen.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht auch darin, daß sie leicht zerlegbar und einfach zusam mensetzbar ist, wodurch eine intensive Reinigung ermög licht wird, und die häufige Wiederholung von reproduzier baren Messungen sehr erleichtert wird. Darüber hinaus bietet die Konstruktion der erfindungsgemäßen Vorrich tung aber auch den Vorteil, daß die wesentlichen Teile der Vorrichtung (Filter bzw. Scheibe 3) als einmal verwendbare Wegwerfartikel hergestellt werden können, was den Einsatz in der Klinik und der forschenden pharmazeutischen Industrie stark begünstigt.

Claims

1. Verfahren zur Messung der Aktivierung von Zellen einer Zellsuspension, von Vollblut-Zellen oder von Komponenten des Blutplasmas, die durch ein poröses Teil befördert werden, dadurch gekennzeichent, daß

- als poröses Teil ein mit Durchgängen (2), deren Durchmesser in der Größenordnung der Zellen bzw. der Komponenten liegt, versehenes Teil (3) verwendet wird, daß
- in einem Schritt unter Verwendung des Teiles (3) die Filtrations- bzw. Volumenflußrate einer durch das Teil (3) hindurchtretenden Bezugsflüssigkeit ermittelt wird, daß
- in einem weiteren Schritt unter Verwendung dessel ben Teiles (3) die Filtrations- bzw. Volumenfluß rate der durch das Teil (3) hindurchtretenden Zellsuspension, Vollblut-Zellen oder Komponenten des Blutplasmas ermittelt wird, und daß
- in einem nachfolgenden Schritt als Maß für die Aktivierung aus den gemessenen Filtrations- bzw. Volumenflußraten die sich ergebende relative Filtrations- bzw. Volumenflußrate bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß als Teil (3) eine Scheibe verwendet wird, die von einer Seite der Scheibe zur anderen Seite der Scheibe verlaufende Durchgänge (2) aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß als Teil (3) ein Filter verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Messung der Volumen flußrate der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas wenigstens eine Mediator substanz in die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas eingebracht wird, die die Aktivierung bzw. Verformbarkeit und/oder die Aggregations neigung und/oder die Adhäsivität der Zellen bzw. Kompo nenten beeinflußt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Mediatorsubstanz während der Messung der Volumenflußrate der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas in die Zellsuspen sion eingebracht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Bezugsflüssigkeit eine physiologische Salzlösung verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension die zu untersuchenden Zellen in einer physiologischen Kochsalz lösung enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension oder das Vollblut mit einem reproduzierbaren Druck durch das Teil (3) befördert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezugsflüssigkeit und die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas durch denselben reproduzierbaren und definierten Druck durch das Teil (3) befördert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas und gege benenfalls die Bezugsflüssigkeit durch ein mit tieri schen oder menschlichen Zellen bewachsenes Netz (64) befördert wird, das vor dem Teil (3) angeordnet ist und dessen Maschen bzw. Öffnungen so bemessen sind, daß die Zellen im wesentlichen ungehindert hindurchströmen können.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenn zeichnet, daß auf dem Netz eine Endothelzellenschicht etabliert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtrations- bzw. Volu menflußraten durch Abwägen dadurch bestimmt werden, daß die durch das Teil (3) hindurchtretende Bezugsflüssig keit bzw. die durch das Teil (3) hindurchtretende Zell suspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blut plasmas in ein auf einer Waage (11) befindliches Waagen bad (11) eingeleitet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezugsflüssigkeit einem Reservoir (30) entnommen wird, das über eine Zuleitung (7) mit einem Raum (4) vor dem Teil (3) in Verbindung steht, und daß in dem Reservoir ein vorgegebener Pegel (h ₂) der Bezugsflüssigkeit aufrecht erhalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekenn zeichnet, daß nach der Bestimmung der Filtrations- bzw. Volumenflußrate der Bezugsflüssigkeit und dem Unterbre chen der Verbindung zwischen dem Raum (4) und dem Reservoir (30) die Bezugsflüssigkeit aus dem Raum (4) abgesaugt und die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas in den Raum (4) eingebracht wird, derart, daß nach der Herstellung der Verbindung zum Reservoir (30) die Zellsuspension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplasmas mit der Bezugsflüssigkeit, deren Pegel (h ₂) bei der nachfolgenden Bestimmung der Filtrations- bzw. Volumenflußrate der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas aufrecht erhalten wird, im Reservoir (30) in Verbindung stehen.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Umgebung der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens auf einer konstanten Temperatur gehalten wird.

16. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeich net, daß das Teil (3) in ein Aufnahmeteil (1) einsetzbar ist, das auf der einen Seite des Teiles (3) einen ersten Raum (4), in den die Bezugsflüssigkeit bzw. die Zellsus pension, das Vollblut oder die Komponenten des Blutplas mas einführbar sind, und auf der anderen Seite des Teiles (3) einen zweiten Raum (5, 6) aufweist, dem über eine Leitung das durch das Teil (3) hindurchgetretene Filtrat entnehmbar ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet, daß die Bezugsflüssigkeit über eine erste Zuleitung (7), deren Ende in den Raum (4) führt, aus einem Reservoir (30) einführbar ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Teil (3) die Form einer Scheibe aufweist, in der die Durchgänge (2) von der einen Seite der Scheibe zur anderen Seite der Scheibe (3) verlaufen.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekenn zeichnet, daß der Durchmesser der Durchgänge in einem Bereich von 3 bis 8 µm liegt, insbesondere etwa 5 µm beträgt.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Durchgänge (2) in der Scheibe (3) etwa 1000 bis 5000 Durchgänge pro mm² beträgt.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Scheibe im Bereich von 2 bis 100 µm liegt.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Teil (3) ein Filter ist, dessen Poren einen Durchmesser von 3 bis 8 µm insbesondere von etwa 5 µm besitzen.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe (3) aus Polycarbonat besteht.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchgänge (2) bzw. Poren durch Laserbeschuß hergestellt sind.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Teil (3) in eine Einspanneinrichtung (13, 14) einsetzbar ist, die in dem Aufnahmeteil (1) befestigbar ist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekenn zeichnet, daß die Einspanneinrichtung aus einem Halte ring (13) mit einer ringförmigen Vertiefung (12) zur Aufnahme des Teiles (3) und einem Abdeckring (14) be steht, der nach dem Einsetzen des Teiles (3) in die Vertiefung (12) ebenfalls in die Vertiefung (12) ein setzbar ist, um das Teil (3) zu fixieren.

27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Einspanneinrichtung (13, 14) in eine Vertiefung (16) des Aufnahmeteiles (1) einsetzbar ist, in die ein Durchgang (5) mündet, der Teil des zweiten Raumes (5, 6) ist und dessen Durchmesser kleiner ist als der Durchmesser der Vertiefung (16), so daß zwischen der Vertiefung (16) und dem Durchgang (5) eine Auflagefläche für die Einspanneinrichtung (13, 14) gebildet ist, daß die Vertiefung (16) in einem Aufnahmeraum (18) des Aufnahmeteiles (1) mündet, dessen Durchmesser größer ist als der Durchmesser der Vertiefung (16), daß in dem Aufnahmeraum (18) ein Klemmteil (19) derart befestigbar ist, daß es die Einspanneinrichtung (13, 14) in der Vertiefung (16) fixiert und daß das Klemmteil (19) in dem der Einspanneinrichtung (13, 14) und dem darin befindlichen Teil (3) vorgelagerten Bereich den ersten Raum (4) aufweist.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekenn zeichnet, daß der Aufnahmeraum (18) in wenigstens einem Teilbereich ein Innengewinde (17) aufweist, in dem ein Außengewinde (20) des Klemmteiles (19) verschraubbar ist.

29. Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß in dem im Raum (4) abge wandten Endbereich des Klemmteiles (19) eine Ausnehmung (24) vorgesehen ist, die über einen Durchgang (25), dessen Durchmesser kleiner bemessen ist als der Durch messer der Ausnehmung (24), mit dem Raum (4) in Verbin dung steht, daß zwischen dem Durchgang (25) des Klemm teiles (19) und der Ausnehmung (24) des Klemmteiles (19) eine Auflagefläche für einen Dichtungsring (26) gebildet ist, dessen Außenumfang an der Innenwandung der Ausneh mung (24) und dessen Innendurchmesser an dem Außenumfang der Zuleitung (7) anliegt, die durch den Durchgang (25) bis zum Raum (4) hindurchgeführt ist, und daß in der Ausnehmung (24) ein Verschlußteil (28) derart befestig bar ist, daß sein dem Dichtungsring (26) zugewandtes Ende derart gegen den Dichtungsring (26) drückt, daß eine dichte Verbindung zwischen dem Außenumfang der Zuleitung (7) und dem Boden bzw. der Innenwandung der Ausnehmung (24) besteht.

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekenn zeichnet, daß die Ausnehmung (24) wenigstens in einem Teilbereich ihrer Innenwandung ein Innengewinde (23) aufweist, in dem ein Außengewinde (27) des Verschluß teiles (28) verschraubbar ist.

31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß durch das Klemmteil (19) eine weitere Zuleitung (9) zur Entnahme der Bezugsflüs sigkeit aus dem ersten Raum (4) und zum Einführen der Zellsuspension, des Vollblutes oder der Komponenten des Blutplasmas in den ersten Raum (4) und gegebenenfalls zum Einführen einer Mediatorsubstanz in den ersten Raum (4) derart verläuft, daß ihr eines freies Ende in der Gebrauchslage an der tiefsten Stelle des ersten Raumes (4) kurz vor dem Teil (3) oder einem diesem vorgeschal teten Netz (64) endet.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Klemmteil (19) an seiner dem Teil (3) zugewandten Seite so ausgebildet ist, daß der Rand seiner den Raum (4) bildenden Ausneh mung die Halteeinrichtung (13, 14) derart übergreift, daß zwischen dem Rand und dem Teil (3) in der Halteein richtung (13, 14) der Randbereich wenigstens eines mit tierischen oder menschlichen Zellen bewachsenen Netzes (64) derart haltbar ist, daß es etwa parallel zum Teil (3) ausgerichtet ist.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekenn zeichnet, daß das Netz (64) eine Maschen- bzw. Poren weite derart aufweist, daß durchströmende Zellen bzw. Komponenten im wesentlichen nicht behindert werden.

34. Vorrichtung nach Anspruch 32 oder 33, da durch gekennzeichnet, daß das Netz aus Nylon besteht, an dessen Oberfläche tierische oder menschliche Zellen verankerbar sind.

35. Vorrichtung nach Ansprüchen 32 bis 34, da durch gekennzeichnet, daß auf dem Netz (64) eine Endo thelzellenschicht etabliert ist.

36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuleitung (9) mit einem auf einer Waage (11) befindlichen Waagenbad (10) in Verbindung steht.

37. Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekenn zeichnet, daß die Waage (11) einen die Wägedaten konti nuierlich registrierenden Schreiber aufweist.

38. Vorrichtung nach Anspruch 37, dadurch gekenn zeichnet, daß dem Schreiber ein Drucker zugeordnet ist, der die Daten zu bestimmten Zeiten ausdruckt.

39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir (30) einen Niveaufühler (70) aufweist, dessen Ausgangssignal einem Regelkreis zuführbar ist, der im Reservoir (30) einen vorgegebenen Pegel (h ₂) der Bezugsflüssigkeit aufrechter hält.

40. Vorrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zufuhr von Bezugsflüssigkeit über ei ne Zufuhrleitung (71) und die Entnahme von Bezugs flüssigkeit über eine Entnahmeleitung (72) durch den Regelkreis gesteuert wird.

41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß im Reservoir (30) ein vor bestimmter Pegel (h ₂) der Bezugsflüssigkeit dadurch auf rechterhalten wird, daß über eine Zufuhrleitung (71) mehr Bezugsflüssigkeit zugeführt wird, als über die Lei tung (7) zum Raum (4) abgeführt wird, und daß über eine Entnahmeleitung (72) die den Pegel übersteigende Bezugs flüssigkeit abgeführt wird.