DE3752131T2 - Impfstoffe und diagnosetest für haemophilus influenzae - Google Patents
Impfstoffe und diagnosetest für haemophilus influenzaeInfo
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Description
- Die vorliegende Erfmdung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Proteinen und Peptiden, die mit der äußeren Membran von Hämophilus influenzae assoziiert sind. Insbesondere ist die Erfindung auf zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Proteinen und Peptiden gerichtet, die mit einer Klasse äußerer Membranproteine mit einem Molekulargewicht von etwa 16.000 Dalton des Typs b und nichttypisierbarer H. influenzae. einschließlich PBOMP-1 und PBOMP-2, in Verbindung stehen. Die Proteine und Peptide werden als Immungene in Vakzin-Formulierungen zur aktiven Immunisierung und für die Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung in der passiven Immunisierung und als Reagenzien in diagnostischen Assays eingesetzt.
- Die Proteine und Peptide können durch neue, verbesserte Verfahren zur Reinigung von H. influenzae erhalten oder unter Verwendung entweder rekombinanter DNA oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt werden. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf neue DNA-Sequenzen und Vektoren, die zur Steuerung der Expression von mit PBOMP-1 und PBOMP-2 in Verbindung stehenden Proteinen und Peptiden verwendbar sind. Die Nucleotidsequenzen werden als Reagenzien in Nucleinsäurehybridisierungsassays verwendet.
- Rekombinante DNA-Technologie umfaßt die Insertion spezifischer DNA-Sequenzen in ein DNA-Vehikel (Vektor), um ein rekombinantes DNA-Molekül, das in einer Wirtszelle zur Replikation in der Lage ist, zu bilden. Im allgemeinen ist die insertierte DNA-Sequenz für das Empfltnger-DNA-Vehikel fremd, d.h. die insertierte DNA- Sequenz und der DNA-Vektor sind von Organismen abgeleitet, die in der Natur keine genetische Information austauschen oder die insertierte DNA-Sequenz kann gänzlich oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Mehrere allgemeine Verfahren wurden entwickelt, die die Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle ermöglichen. Zum Beispiel beschreibt das U. S. Pat. Nr. 4237224 von Cohen und Boyer die Herstellung derartig rekombinanter Plasmide unter Verwendung von Spaltungsprozessen mit Restriktionsenzymen und Verbindung mit DNA-Ligase durch bekannte Verfahren der Ligation. Diese rekombinanten Plasmide werden dann mittels Transformation eingefhhrt und in einzelligen, in Gewebekulturen gewachsenen Kulturen, einschließlich procaryotischer Organismen und eucaryotischer Zellen, repliziert. Aufgrund der allgemeinen Anwendbarkeit der hier beschriebenen Techniken wird das U. S. Pat. Nr. 4237224 durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung mit einbezogen.
- Ein anderes Verfahren zur Einführung rekombinanter DNA-Moleküle in einzellige Organismen wird durch Collins und Hohn im U. S. Pat. Nr. 4304863 beschrieben, das durch Bezugnahme ebenfalls mit einbezogen ist. Dieses Verfahren verwendet ein Verpackungs-/Transduktionssystem mit bakteriophagen Vektoren (Cosmiden).
- Rekombinante Gene können ebenfalls in Viren wie dem Vakziniavirus eingeführt werden. Rekombinante Viren können durch Transfektion von Plasmiden in mit Virus infizierten Zellen erzeugt werden.
- Ungeachtet des für die Konstruktion verwendeten Verfahrens muß das rekombinante DNA-Molekül mit der Wirtszelle kompatibel, d.h. zu autonomer Replikation in der Wirtszelle in der Lage sein, oder in eines der Wirtszellenchromosomen stabil integriert sein. Das rekombinante DNA-Molekül oder der Virus (z.B. eine Vakziniavirus- Rekombinante) sollte ebenfalls eine Markierungsfünktion besitzen, die die Selektion des (der) gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls (Moleküle) oder Virus (Viren) ermöglicht. Zusätzlich, wenn die gesamten geeigneten Replikations-, Transkriptions- und Translationssignale auf dem rekombinanten DNA-Molekül korrekt angeordnet sind, wird das fremde Gen in den transformierten Bakterienzellen richtig exprimiert, wie im Falle bakterieller Expressionsplasmide oder permissiven von mit einem rekombinanten Virus infizierten Zellinien oder einem einen eucaryotischen Replikationsstartpunkt tragenden rekombinanten Plasmid.
- Verschiedene genetische Signale und Processingereignisse steuern viele Stufen der Genexpression; zum Beispiel die DNA-Transkription und Messenger-RNA-(mRNA)-Translation. Die Transkription von DNA ist abhängig von der Gegenwart eines Promotors, der eine DNA-Sequenz ist, die die Bindung von RNA-Polymerase steuert und dadurch die mRNA-Synthese fördert. Die DNA-Sequenzen von eucaryotischen Promotoren unterscheiden sich von denen procaryotischer Promotoren. Weiterhin können eucaryotische Promotoren und begleitende genetische Signale in einem procaryotischen System nicht erkannt werden oder fünktionieren nicht und ferner werden procaryotische Promotoren in eucaryotischen Zellen nicht erkannt oder fünktionieren nicht.
- In ähnlicher Weise hängt die Translation von mRNA in Procaryoten von der Gegenwart richtiger procaryotischer Signale ab, die sich von denen von Eucaryoten unterscheiden. Effiziente Translation von mRNA in Procaryoten erfordert eine Ribosomen-Bindungsstelle, bezeichnet als die Shine-Dalgarno-Sequenz (SD) auf der mRNA. Diese Sequenz ist eine kurze Nucleotidsequenz der mRNA, die vor dem Startcodon angeordnet ist, in der Regel AUG, welche das N-terminale Methionin des Proteins kodiert. Die SD-Sequenzen sind komplementär zum 3'-Ende der 165 rRNA (ribosomale RNA) und fördern möglicherweise die Bindung der mRNA an Ribosomen durch Duplexierung mit der rRNA, um korrekte Positionierung des Ribosoms zu ermöglichen. Für eine Zusammenfassung über die Maximierung der Genexpression, siehe Roberts und Lauer, 1979, Methods in Enzymology 68:473.
- Viele andere Faktoren komplizieren die Expression fremder Gene in Procaryoten, selbst nachdem die richtigen Signale insertiert und geeignet positioniert sind. Ein derartiger Faktor ist das Vorhandensein eines aktiven proteolytischen Systems in E. coli und anderen Bakterien. Dieses Protein abbauende System scheint selektiv "abnormale" oder fremde Proteine zu zerstören. Ein enormer Nutzen würde daher durch die Entwicklung von Mitteln zum Schutz von in Bakterien exprimierten eucaryotischen Proteinen vor proteolytischem Abbau geboten. Eine Strategie ist es, Hybridgene aufzubauen, in denen die fremde Sequenz in Phase mit einem procaryotischen Gen ligiert ist (d.h. im korrekten Leseraster). Die Expression dieses Hybridgens resultiert in einem Fusionsproteinprodukt (ein Protein, das ein Hybrid procaryotischer und fremder Aminosäuresequenzen ist).
- Erfolgreiche Expression eines klonierten Gens erfordert effiziente Transkription von DNA, Translation der mRNA und in einigen Fällen posttranslationale Modifikation des Proteins. Expressionsvektoren wurden eingesetzt, um Gene in einem geeigneten Wirt zu exprimieren und die Proteinproduktion zu vergrößern. Das klonierte Gen sollte neben einem starken Promotor, der kontrollierbar ist, plaziert werden, so daß, wenn nötig, mit der Transkription begonnen werden kann. Man kann Zellen bis zu einer hohen Dichte wachsen lassen, und dann kann der Promotor veranlaßt werden, die Zahl der Transkripte zu erhöhen. Dies flihrt bei effizienter Translation zu hohen Ausbeuten an Protein. Dies ist ein besonders wertvolles System, wenn das fremde Protein für die Wirtszelle schädlich ist.
- Die meisten herkömmlichen in E. coli verwendeten Plasmidklonierungsvektoren sind Abkömmlinge von Replicons vom Co1E1-Typ (für zusätzliche Informationen siehe Oka et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 172:151-159). Die Co1E1-Plasmide werden in E. coli-Stämmen als monomere Moleküle mit einer Kopienzahl von ungefähr 50-20 Kopien pro Chromosom stabil gehalten. Verschiedene Expressionsgrade von menschlichen und tierischen Proteinprodukten in diese Plasmide insertierter fremder Gene wurden erhalten. Es sollten jedoch sehr hohe Expressionsstärken erhalten werden, damit das System ökonomisch durchführbar wird, um fremde Proteinprodukte herzustellen.
- Ein Weg, große Mengen eines gegebenen Genproduktes zu erhalten, ist ein Gen in ein Plasmid, das eine sehr hohe Kopienzahl in der Bakterienzelle besitzt, zu klonieren. Durch Erhöhung der Zahl der Kopien eines bestimmten Gens sollten theoretisch die mRNA-Niveaus auch steigen, was zu vergrößerter Produktion des rekombinanten Proteins führen sollte.
- Der Vakziniavirus kann als Klonierungs- und Expressionsvektor eingesetzt werden. Das Virus enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von ungefähr 187 kb-Paaren, das sich im Cytoplasma infizierter Zellen repliziert. Diese Viren enthalten ein komplettes Transkriptionsenzymsystem (einschließlich Capping-, Methylierungs- und Polyadenylierungsenzymen) im Viruskem, das zur Virusinfektiosität nötig ist. Vakziniavirus-Transkriptionsregulationssequenzen (Promotoren) erlauben die Initiierung der Transkription durch Vakzinia-RNA-Polymerase, aber nicht durch eucaryotische RNA-Polymerase.
- Die Expression fremder DNA in rekombinanten Viren erfordert die Fusion von Vakzinia-Promotoren mit proteinkodierenden Sequenzen des fremden Gens. Plasmidvektoren, ebenfalls Insertionsvektoren genannt, wurden aufgebaut, um das chimärische Gen in den Vakzinia-Virus einzufügen. Ein Typ des Insertionsvektors ist zusammengesetzt aus: (1) einem Vakzinia-Virus-Promotor, einschließlich der Transkriptionsstartstelle; (2) mehreren einzelnen Restriktionsendonucleasen-Klonierungsstellen, stromabwärts von der Transkriptionsstartstelle für die Insertion fremder DNA-Fragmente; (3) nichtessentielle Vakziniavirus-DNA (wie das TK-Gen), die den Promotor flankiert, und Klonierungsstellen, die die Insertion des chimärischen Gens in die homologe nichtessentielle Region des Virusgenoms steuern, und (4) ein bakterieller Replikationsstartpunkt und ein Antibiotikaresistenz-Marker flir die Replikation und Selektion in E. coli. Beispiele für derartige Vektoren sind von Mackett beschrieben (1984, J. Virol. 49:857- 864).
- Rekombinante Viren werden durch Transfektion rekombinanter bakterieller Insertionsplasmide, die das fremde Gen enthalten, in mit Vakziniavirus infizierte Zellen, hergestellt. Homologe Rekombination findet in den infizierten Zellen statt und resultiert in der Insertion des fremden Gens in das virale Genom. Rekombinante Viren können einem Screening unterzogen und nachfolgend unter Verwendung immunologischer Techniken, DNA-Plaque- Hybridisierung oder genetischer Selektion, isoliert werden. Diese Vakzinia-Rekombinanten behalten ihre essentiellen Funktionen und Infektiosität und können aufgebaut werden, um ungefähr 35 kb fremder DNA unterzubringen.
- Die Expression eines fremden Gens kann durch enzymatische oder immunologische Assays [z.B. Immunpräzipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELI SA), Radioimmunoassay oder Immunoblotting] nachgewiesen werden. Zusätzlich werden von rekombinanten Vakzinia infizierten Zellen produzierte, natürlich vorkommende Membran-Glycoproteine glykosyliert und können an die Zelloberfläche transportiert werden. Hohe Expressionsstärken können unter Verwendung starker Promotoren oder Klonierung zahlreicher Kopien eines einzelnen Gens in geeigneten Vektoren und passenden Wirten erhalten werden.
- Ein Baculovirus wie Autographica californica-Nuclearpolybedrosis-Virus (AcNPV) kann ebenfalls als Klonierungs- oder Expressionsvektor eingesetzt werden. Die infektiöse Form des AcNPV wird normalerweise in einer Virusokklusion gefunden. Diese Struktur ist weitgehend aus Polyhedrinpeptid zusammengesetzt, in das Viruspartikel eingebettet sind. Polyhedrin-Genexpression tritt sehr spät im Infektionszyklus auf, nachdem die reifen Viruspartikel gebildet sind. Deshalb ist Polyhedrin-Genexpression eine entbehrliche Funktion, d.h. ohne Polyhedrin-Genexpression hergestellte nichtokkludierte Viruspartikel sind voll aktiv und in der Lage, Zellen in Kultur zu infizieren. Nach der Europäischen Patentanmeldung Nr. 84105841.5 von Smith et al. wird ein rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektor durch Spaltung von Baculovirus-DNA hergestellt, um ein ein Polyhedrin-Gen oder einen Abschnitt hiervon umfassendes Fragment zu produzieren, Einfügen dieses Fragments in ein Klonierungsvehikel und danach Einfügen des zu exprimierenden Gens, so daß es sich unter Kontrolle des Polyhedrin-Genpromotors befindet. Der auf diesem Weg gebildete rekombinante Transfervektor wird mit Baculovirus-Helfer-DNA gemischt und eingesetzt, um die Transfektion von Insektenzellen in Kultur zu bewirken, und um Rekombination und Inkorporation des ausgewählten Gens am Polyhedrin-Genort des Baculovirusgenoms zu bewirken. Der resultierende rekombinante Baculovirus wird verwendet, um empfindliche Insekten oder Insektzellkulturen zu infizieren.
- H. influenzae wird in zwei Gruppen eingeteilt. Die Stämme, die eine bekannte Hülle besitzen, werden durch die serologische Reaktion der Hülle mit Referenzantiseren typisiert. Die Typen a-f wurden identifiziert. Stämme, die mit keinem der Referenzantiseren reagieren, sind als nicht typisierbar bekannt.
- H. influenzae Typ b (Hib) ist die häufigste Ursache für neonatale Meningitis und andere invasive Infektionen in den Vereinigten Staaten (Fraser et al., 1974, Am. J. Epidemiol. 100:29-34). Meningitis in der Kindheit tritt hauptsächlich im Alter zwischen ein und fünf Jahren auf. 60% dieser Meningitisfälle aufgrund von Hib treten bei Kindern unter zwei Jahren auf (Fraser et al., siehe oben).
- Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, daß nicht typisierbare H. influenzae (Hi) ebenfalls Krankheiten einschließlich Pneumonie, Bakteriämie, Meningitis, postpartumer Sepsis und akuter fiebriger Tracheobronchitis bei Erwachsenen hervorruft (Murphy et al., 1985, J. Infect. Diseases 152:1300-1307). Nicht typisierbare Hi ist ein häufiges ethiologisches Agens für Otitis media bei Kindern und jungen Erwachsenen, das ungefähr 20 bis 40% aller Otitis media-Fälle verursacht. Kinder können zahlreiche Infektionen infolge desselben Organismusses durchmachen, da die Infektion keine langanhaltende Immunität verleiht. Die geläufige Therapie für chronisches oder wiederholtes Auftreten von Otitis media umfaßt Verabreichung von Antibiotika und Röhrcheneinführung zur Drainage des Innenohrs. Hi- Stämme wurden auch schon als Primärursache für Sinusitis genannt (Cherry J. D. und J. P. Dudley, 1981, in Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Feigin and Cherry eds., S. 103-105). Zusätzlich verursacht nicht typisierbare Hi neonatale Sepsis.
- Es wurde gezeigt, daß gegen das Hüllenpolysaccharid des Typs b H. influenzae (Hib), das Polyribosylribitolphosphat (PRP) umfaßt, produziertes Antiserum bakterizid wirkt und Schutz bietet gegen Hib (Smith et al., 1973, Pediatrics 52:637-644; Anderson et al. 1972, J. Clin. Inv. 51:31-38). Anti-PRP-Antikörper sind unwirksam gegen nicht typisierbare H. influenzae-Infektionen.
- Der ideale Kandidat für ein Haemophilus-Vakzin würde drei Eigenschaften besitzen: (a) er würde in Säuglingen von 2-6 Monaten immunogen wirken (b) er würde einen Antikörper hervorrufen, der gegen durch typisierbare und nicht typisierbare H. influenzae hervorgerufene Infektionen schützen würde und (c) er würde Antikörper gegen ein auf der Oberfläche aller Stämme von H. influenzae gefündenes Determinant hervorrufen.
- Die derzeit verfügbaren Vakzine, die gegen Hib-Infektionen schützen, bestehen im wesentlichen aus PRP, dem Typ b-Hüllenpolysaccharid. Gereinigtes PRP-Polysaccharid ist immunogen in Kindern mit einem Alter über 18 Monaten, bewirkt aber keine schützende Antikörperantwort in Kindern, jünger als 18 Monate. Allgemein wurde von Polysacchariden gezeigt, daß sie in Kindern mit einem Alter von weniger als etwa 18 Monaten schwache Immungene sind.
- Um sich diesem Problem zuzuwenden, haben verschiedene Laboratorien Studien begonnen, in denen PRP entweder chemisch an ein Proteinträgermolekül gekoppelt ist (Anderson et al., 1985, Ped. Res. 18:252A) oder mit Proteinmolekülen gemischt (Monji et al., 1986, Infect. Immun. 51:865-871) und an Tiere oder Menschen verabreicht wurde. Es wurde gezeigt, daß an Protein konjugiertes PRP eine Anti-PRP-Antikörperantwort in menschlichen Säuglingen im Alter von 6 Monaten hervorruft, während eine Mischung von PRP mit einigen Proteinen Anti-PRP- Antikörper in Tiersäuglingen produzierte (Monji et al., siehe oben).
- Obwohl die konjugierten und gemischten Vakzinformulierungen eine Schwierigkeit von PRP-Vakzinen aufzeigen d.h. ihr Unvermögen Säuglinge jünger als 18 Monate zu schützen, zeigt sie ein anderes Hauptproblem des PRP-Vakzins nicht auf. Anti-PRP-Antikörper sind unwirksam gegen nicht typisierbare H. influenzae, denen definitionsgemäß die PRP-Hülle fehlt. Daher gibt es einen lang bekannten Bedarf nach einem Vakzin, das eine schützende Immunantwort in Kindern mit ungefähr 18 Monaten und jünger gegen typisierbare, einschließlich Typ b und nicht typisierbare H. influenzae. hervorruft.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vakzinformulierung bereitszustellen, die eine schützende Immunantwort gegen typisierbare H. influenzae. einschließlich Tyb b und nicht typisierbare H. influenzae, in Kindern unter 6 Monaten genauso wie in älteren Kindern und Erwachsenen hervorruft. Der Ansatz der vorliegenden Erfindung ist es, mit einem Protein oder einem Fragment hiervon, das auf der Oberfläche von Haemophilus exponiert ist, zu impfen. Der beste Kandidat ist ein äußeres Membranprotein (OMP) von H. influenzae. Außere Membranproteine sind in der Regel oberflächenexponierte Moleküle. Sie sind aus Protein zusammengesetzt, das normalerweise in Säuglingen immunogen wirkt, und es wurde gezeigt, daß sie in der Lage sind, schützende Antikörper in anderen bakteriellen Systemen hervorzurufen (Sugasawara et al., 1983, Infect. Immun. 42:980-985).
- Zusätzlich wurde gezeigt, daß Hi- und Hib-Stämme ähnliche OMP-Profile besitzen (Loeb und Smith, 1980, Infect. Immun. 30:709-717). Antikörper für ein OMP von Haemophilus könnten sowohl bakterizid als auch opsonisch wirken, so wie gezeigt wurde, daß Anti-PRP bakterizid und opsonisch für Hib ist (Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38; Cates et al., 1985, Infect. Immun. 48:183-189). Ein äußeres Membranprotein hat den zusätzlichen Vorteil, daß es Hi und Hib gemeinsam ist und gegen beide Bakterientypen schützen könnte.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Peptide und Proteine, die mit einem äußeren Membranprotein mit ungefährem Molekulargewicht von 16.000 Dalton von Haemophilus influenzae, identifiziert durch die Anmelder und als "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-1" (PBOMP-1) bezeichnet, und auf ein antigenverwandtes äußeres Membranprotein mit ungetährem Molekulargewicht von 16.000 Dalton von Haemophilus influenzae, ebenfalls durch die Anmelder identifiziert und als "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-2" (PBOMP-2) bezeichnet, in Beziehung stehen, genauso wie die molekular geklonten Gene oder Genfragmente, die diese Peptide oder Proteine kodieren. Die Erfindung ist ebenfalls auf ein im wesentlichen reines, unter Verwendung neuer und verbesserter Verfahren aus H. influenzae erhaltenes PBOMP-1 gerichtet. Die Peptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung können als Immungene in Vakzinformulierungen für H. influenzae oder als Reagenzien in diagnostischen Immunoassays für H. influenzae verwendet werden.
- Die vorliegende Erfmdung richtet sich ebenfalls auf Verfahren zur molekularen Klonierung von Genen oder Genfragmenten, die mit PBOMP-1 und PBOMP-2 in Beziehung stehende Peptide kodieren. Diese molekular klonierten Sequenzen können dann beim weiteren Aufbau anderer Vektoren für die kodierten Peptidprodukte verwendet werden oder um die PBOMP-1- oder PBOMP-2-Gene für die Verwendung in diagnostischen Assays für H. influenzae, basierend auf Nucleinsäurehybridisierung, zu erhalten.
- Die Peptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung können aus H. influenzae aufgereinigt oder unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken in jedem Vektor-Wirt-System hergestellt oder durch chemische Verfahren synthetisiert werden. Demgemäß richtet sich die Erfindung ebenfalls auf die Konstruktion neuer DNA-Sequenzen und Vektoren, einschließlich Plasmid-DNA und viraler DNA, wie menschlichen Viren, tierischen Viren, Insektenviren oder Bakteriophagen, die zur Steuerung der Expression von PBOMP-1 und PBOMP-2 verwandten Peptiden oder Proteinen in geeigneten Wirtszellen, aus denen die Peptide und Proteine aufgereinigt werden können, verwendet werden können. Chemische Verfahren für die Synthese von PBOMP-1 und PBOMP-2 verwandten Peptiden und Proteinen werden beschrieben.
- Die mit PBOMP-1 und PBOMP-2 in Verbindung stehenden Peptide und Proteine können als Immungene in Untereinheit-Vakzinformulierungen zur Verwendung gegen alle pathogenen H. influenzae,einschließlich sowohl des Typs k als auch nicht typisierbarer H. influenzae, eingesetzt werden. PBOMP-1 und PBOMP-2 verwandte Proteine oder Peptide für Unterheit-Vakzinpräparationen können durch chernische Synthese, Aufreinigung von H. influenzae oder Aufreinigung aus rekombinanten Viren, die PBOMP-1 oder PBOMP-2 verwandten Peptide oder Proteine selbst produzieren, erhalten werden, oder es können Extrakte von mit derartigen rekombinanten Viren infizierten Zellen als Immungene in viralen Vakzinformulierungen verwendet werden. Da das PBOMP-1- oder PBOMP-2-Protein im Wirtstier als "fremd" erkannt wird, wird eine gegen PBOMP-1 oder PBOMP-2 gerichtete humorale und möglicherweise zellvermittelte Immunantwort induziert. In einer geeignet hergestellten Vakzinformulierung sollte dies den Wirt gegen spätere H. influenzae-Infektionen schützen. Darüberhinaus sind die vorliegenden Untereinheit-Vakzinformulierungen mit momentan verfügbaren PRP-Vakzinen kompatibel.
- Die mit PBOMP-1 und/oder PBOMP-2- in Beziehung stehenden Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in humanmedizinischen Assays verwendet werden. Das umfaßt die Verwendung der Peptide und Proteine der vorliegenden Erfindung als Reagenzien in Immunoassays wie ELISA-Tests und Radioimmunoassays, die als diagnostische Hilfsmittel zum Nachweis von H. influenzae-Infektion in Blutproben, Körperflüssigkeit, Geweben etc. gebräuchlich sind. Die PBOMP-1 und/oder PBOMP-2 kodierenden Gensequenzen können in DNA-DNA- oder DNA- RNA-Hybridisierungsassays für den ähnlichen diagnostischen Nachweis von H. influenzae verwendet werden. Zusätzlich liefern diese Reagenzien ein wertvolles Hilfsmiffel zur Aufklärung des Pathogenesemechanismus von H. influenzae.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf monoklonale anti-PBOMP-2-Antikörper, die bei passiven Immunisierungssystemen und in diagnostischen Immunoassays Verwendung finden.
- Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend detaillierten Beschreibung und den Beispielen der spezifischen Ausführungsformen leichter verständlich, ebenso durch die beigefügten Figuren, in denen:
- Fig. 1 eine Restriktionskarte von pGD103, einem Abkömmling von pLG339 zeigt (siehe Stoker et al., 1982, Gene 18:335-41).
- Fig. 2 (A und B) zeigt Karten von pAA130, das ein 5,7 Kb-Fragment von H. influenzae-DNA in pGD103 kloniert, umfaßt. Fig. 2A zeigt eine kreisförmige Restriktionskarte von pAA130. Fig. 2B zeigt Deletionsanalysen des insertierten H. influenzae-Fragments von pAA130. Die durchgezogenen schwarzen Linien bezeichnen verbleibende H. influenzae-DNA in den Deletionsabkömmlingen. Der PBOMP-Phenotvp ist rechts bezeichnet. Ein PBOMP-2kodierendes Gen ist bei einem 781 bp BstEII-XmnI-Fragment lokalisiert.
- Fig. 3 zeigt die Reaktivität ganzer Zellysate von E. coli JM83 und pAA130 enthaltenden E. coli JM83 mit polyklonalem Anti-PBOMP-1-Antiserum. Die Spuren zeigen: (A) pAA130 enthaltendes JM83; (B) pAA130 enthaltendes JM83; (C) JM83; (D) JM83; (E) Molekulargewichtsstandards wie in Kilodaltons auf der rechten Seite der Figur dargestellt; und (F) Hi S-2.
- Fig. 4 zeigt die Sequenzierungsstrategie des 789 bp BstEII-XmnI-Fragments von pAA130, das den Ursprung, Richtung und Ausdehnung der bestimmten Sequenz jedes Klons zeigt. Der Pfeil am unteren Teil bezeichnet den Ort des hauptsächlichen offenen Leserasters (ORF).
- Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz des 789 bp BstEII-XmnI-Fragments von pAA130, das das PBOMP-2- Gen enthält. Das vorausgesagte ORF ist durch die unterstrichene Sequenz gezeigt. Die Richtung der Transkription ist durch die Pfeilspitze bezeichnet. Die zwei mit "N" bezeichneten Basen stellen unbekannte Nucleotide dar.
- Fig. 6 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von PBOMP-2. Die Nucleotidsequenz ist oben und die entsprechende Aminosäuresequenz unten dargestellt. Die in dem Kasten eingerahmte Gruppe bezeichnet die vorausgesagte N-terminale Aminosäure der reifen Form des Proteins.
- Fig. 7 zeigt die autoradiographische SDS-PAGE-Analyse von E. coli JM83 -Zellen, die die rekombinanten Plasmide pAA130 und pAA152 enthalten, genauso wie die Kontrolle E. coli JM83-Zellen, die pGD103 enthalten. Die Spuren zeigen (1) pAA130; (2) pAA152 und (3) pGD103. Die Stelle einer Bande mit ungefährem Molekulargewicht von 15.000 Dalton ist an der linken Seite der Figur angegeben.
- Fig. 8 (A und B) zeigt die Western Blot Gelanalyse des ganzen Zellysates von pAA130 oder pAA152 enthaltenden E. coli JM83 mit oder ohne Globomycin. Die Molekulargewichtsstandards sind links bei Fig. 8 (A und B) angegeben. Fig. 8A zeigt Lysate von Zellen, die das PBOMP-1-Gen enthaltende pAA152 enthalten. Die Spuren zeigen: (1) kein Globomycin; und (2) Globomycin vorhanden.
- Fig. 8B zeigt Zellysate, die pAA130 enthalten, das das PBOMP-2-Gen enthält. Die Spuren zeigen: (1) kein Globomycin und (2) Globomycin vorhanden.
- Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pPX163, das die gesamte kodierende Sequenz des stromabwärts vom lac-Promotor insertierten PBOMP-2-Proteins enthält.
- Fig. 10 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse des ganzen Zellysats von pPX163 enthaltendem E. coli JM103, das mit oder ohne IPTG gezüchtet worden ist. Die Spuren zeigen: (1) Molekulargewichtsstandards: Kilodalton; (2) Lysat von pPX163 enthaltendem JM103, gezüchtet ohne IPTG; und (3) wie in Feld 2, für 4 Stunden mit IPTG (5mM) gezüchtet. Die Pfeile zeigen Positionen der drei durch IPTG induzierten PBOMP-2 reaktiven Banden.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Proteine und Peptide, die zu Epitopen eines äußeren Membranproteins von H. influenzae mit ungefährem Molekulargewicht von 16.000 Dalton in Beziehung stehen, d.h. PBOMP-1, und einem verwandten äußeren Membranprotein mit einem ungefähren Molekulargewicht von 16.000 Dalton von H. influenzae, d.h. PBOMP-2. Die unter Verwendung von SDS-PAGE bestimmten scheinbaren Molekulargewichte spiegeln die gesamten Molekulargewichte der reifen Formen (d.h. proteolytisch verarbeitet), einschließlich jeder posttranslationalen Modifikation(en) (z.B. Fettacylierung, Acetylierung etc.), wieder. Die Proteine und Peptide der Erfindung können unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Zusätzlich können die Proteine und Peptide der Erfindung in im wesentlichen reiner Form aus Kulturen von H. influenzae unter Verwendung neuer und verbesserter Verfahren der Isolierung und Aufreinigung erhalten werden. Die die Epitope von H. influenzae spezifizierenden PBOMP-2-Proteine und -Peptide können als Immungene in verschiedenen Vakzinformulierungen eingesetzt werden, um gegen Infektion mit H. influenzae als einem ethiologischen Agens von bakterieller Meningitis, Otitis media, Epiglottitis, Pneumonie etc., zu schützen. Die Vakzinformulierungen sind sowohl gegen H. influenzae typisierbare Stämme einschließlich Typus a, b, c, d, e und f, als auch gegen nicht typisierbare H. influenzae-Stämme wirksam.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die Nucleotidsequenz(en) der die PBOMP-2-Proteine kodierenden Gene, genauso wie Aminosäuresequenzen der PBOMP-2-Proteine und Polypeptidfragmente hiervon.
- Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden rekombinante DNA-Techniken verwendet, um PBOMP-2-Epitope kodierende Nucleotidsequenzen in Expressionsvektoren, die die Expression dieser Sequenzen in geeigneten Wirtszellen steuern, zu insertieren. Diese Expressionsvektor-Wirtszellensysteme können zur Herstellung von PBOMP-2 und verwandter Proteine und Peptide verwendet werden. Die Genprodukte können aus Zellkulturen aufgereinigt und als Immungene in Untereinheit-Vakzinformulierungen verwendet werden. Alternativ kann die Aminosäuresequenz von PBOMP-2-Proteinen und -Peptiden aus den in Rekombinanten, die immunogene PBOMP- 2 verwandte Proteine und Peptide exprirnieren, enthaltenen H. influenzae-Nucleotidsequenzen abgeleitet werden. Diese Proteine und Peptide können dann chemisch synthetisiert und in synthetischen Untereinheit-Vakzinformulierungen verwendet werden.
- Wenn der Expressionsvektor, der die PBOMP-2-Sequenz exprimiert, ein rekombinanter Virus ist, kann der Virus selbst als Vakzin verwendet werden. Die infektiösen rekombinanten Viren, die die PBOMP-2-Proteine und Peptide exprimieren und keine Krankheit im Wirt hervorrufen, können in lebenden Virusvakzinpräparationen verwendet werden, um substantielle Immunität zu liefern. Alternativ können inaktive Virusvakzine unter Verwendung von "getöteten" rekombinanten Viren hergestellt werden, die die PBOMP-2-Proteine und -Peptide exprimieren.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein polyvalentes Antiserum und monoklonale Antikörper gegen PBOMP-2 und genauso auf Verfahren zur Verwendung eines derartigen Immunglobulins zur passiven Immunisierung und auf diagnostische Assays für H. influenaze.
- Das Verfahren der Erfindung kann in die folgenden Stufen eingeteilt werden:
- (1) Isolierung und Aufreinigung von PBOMP-Protein; (2) partielle Aminosäuresequenzierung von PBOMP; (3) molekulare Klonierung von PBOMP-2-kodierenden Genen oder Genfragmenten, einschließlich Insertion der Gene und Genfragmente in Expressionsvektoren und Identifizierung und Aufreinigung der rekombinanten Genprodukte; (4) Nucleotidsequenzierung des PBOMP-2-kodierenden Gens und (5) Bestimmung der Immunopotenz der PBOMP-2- Proteine und verwandter Produkte durch Herstellung von Antikörpern gegen gereinigte und rekombinante Protein- und Peptidprodukte. Das Verfahren umfaßt ferner (6) die Formulierung von Vakzinen und (7) diagnostische Assays für den Nachweis von PBOMP-2-Gen oder -Genprodukt (und daher H. influenzae) in Körperflüssigkeitsproben.
- Ein OMP mit 16.000 Dalton Molekulargewicht (MW) wurde sowohl durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) als auch Western Blot Analyse in allen H. influenzae-Stämmen (zur Zeit einige Hundert) nachgewiesen. Die monoklonalen Antikörperdaten geben an, daß dieses Protein in hohem Grad haltbar ist (Murphy et al., 1986, Infect. Immun. 54:774-49). Somit könnte jeder H. influenzae-Stamm als Quelle für die PBOMP-Gene dienen. Da viele H. influenzae-Stämme keine nachweisbaren Plasmide oder induzierbare Prophagen enthalten, sind die PBOMP-Gene wahrscheinlich chromosomal. Demgemäß ist der erste Schriu in der molekularen Klonierung von PBOMP kodierenden DNA-Sequenzen die Isolierung derartiger Sequenzen aus chromosomaler DNA von H. influenzae. Nachfolgend wird H. influenzae-Gene kodierende DNA als "Hi-DNA" und PBOMP-Sequenzen kodierende DNA als "PBOMP-DNA" bezeichnet.
- Um Hi-DNA-Fragmente zu erzeugen, kann die Hi-DNA an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man geringe Konzentrationen an DNAase I verwenden, um die DNA zu fragmentieren oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie z.B. durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können dann durch Standardtechniken nach Größe getrennt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese, Säulenchromatographie (z.B. Molekularsieb- oder Ionenaustauschchromatographie) oder Sedimentationsgeschwindigkeit in Saccharosegradienten.
- Jedes Restriktionsenzym oder jede Kombination von Restriktionsenzymen kann verwendet werden, um das (die) die PBOMP-Sequenzen enthaltenden Hi-DNA-Fragment (e) zu erzeugen, vorausgesetzt, daß das (die) Enzym (e) die Immunopotenz der PBOMP-Genprodukte nicht zerstört. Zum Beispiel kann die Antigenstelle eines Proteins aus ungefähr 7 bis ungefähr 14 Aminosäuren bestehen. Somit kann ein Protein der Größe der PBOMP-Peptide viele einzelne Antigenstellen besitzen und daher könnten viele partielle PBOMP-Polypeptidgensequenzen eine Antigenstelle kodieren. Folglich können viele Restriktionsenzymkombinationen verwendet werden, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die, wenn sie in einen geeigneten Vektor insertiert werden, in der Lage sind, die Herstellung von PBOMP- spezifischen Aminosäuresequenzen, die verschiedene antigene Determinanten umfassen, zu steuern.
- Wenn einmal die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann die Identifizierung des spezifischen DNA-Fragments, das das PBOMP-Gen enthält, durch mehrere Methoden erreicht werden.
- Die die PBOMP-Gene enthaltenden DNA-Sequenzen können durch Hybridisierung der Hi-DNA-Fragmente mit einer synthetischen Oligonucleotidsonde identifiziert werden. Redundante synthetische Oligonucleotidsonden werden basierend auf der Aminosäuresequenz der Peptidfragmente des PBOMP-Proteins aufgebaut. Diese synthetischen Sonden können mit ³²P-Adenosintriphosphat radioaktiv markiert werden und werden verwendet, um Hi-DNA- Bibliotheken flir PBOMP-spezifische Gensequenzen enthaltende Klone einem Screening zu unterziehen (siehe Anderson et al., 1983, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:6838-42).
- Alternativ kann die PBOMP-Gen-DNA nach Insertion in einen Klonierungsvektor in einem "shotgun"- Ansatz identifiziert und isoliert werden. Eine große Anzahl von im Stand der Technik bekannten Vektor-Wirtssystemen kann verwendet werden. Vektorsysteme können entweder Plasmide oder modifizierte Viren sein. Geeignete Klonierungsvektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die viralen Vektoren wie das lambda-Vektorsystem gtll, gt WES.tB, Charon 4 und Plasmidvektoren wie pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101 und andere ähnliche Systeme. Das Vektorsystem muß mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Rekombinante Moleküle können über Tranformation, Transfektion, oder Infektion in die Zellen eingeführt werden.
- Wenn die ein PBOMP-Gen oder -Genfragment enthaltende Hi-DNA in einen Klonierungsvektor insertiert und verwendet wird, um geeignete Wirtszellen zu transformieren, können viele Kopien des PBOMP-Gens oder -Genfragments erzeugt werden. Das kann durch Ligation des Hi-DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre, kohäsive Enden besitzt, erreicht werden. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen nicht vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle modifiziert werden. Eine derartige Modifikation umfaßt die Herstellung stumpfer Enden, indem die Einzelstrang-DNA-Enden zurückverdaut werden oder indem die Einzelstrang- Enden aufgefüllt werden, so daß die Enden stumpfendig ligiert werden können. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligation von Nucleotidsequenzen (Linkern) an den DNA-Enden hergestellt werden. Diese ligierten Linker können spezifisch chemisch synthetisierte Oligonudeotide, die Restriktionsstellen-Erkennungssequenzen kodieren, umfassen. Zum Beispiel wird nach dem DNA-Modifizierungsverfahren von Maniatis (siehe Maniatis et al., 1982, Molecular doning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 107-114) gescherte DNA mit einer Restriktionsmethylase behandelt (zum Beispiel M.EcoRI) und mit synthetischen DNA-Linkern, die eine Restriktionsstelle für dieses Enzym kodieren, ligiert. Die DNA wird dann mit Restriktionsendonuclease behandelt, um die endständigen Linker (aber nicht die modifizierten internen Restriktionsstellen) abzuspalten, und mit den geeigneten Vektorarmen ligiert. In einem alternativen Verfahren kann der gespaltene Vektor und das PBOMP-DNA-Fragment durch homopolymeres Anhängen modifiziert werden.
- Die Identifizierung eines klonierten PBOMP-Gens kann durch Einrichten einer chromosomalen Genbank von Hi in einem Vektorsystem und Screenen einzelner Klone für die Produktion von PBOMP-2 oder PBOMP-2 verwandten Proteins durch jedes der hier beschriebenen Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf der spezifischen Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen PBOMP, erreicht werden.
- Die die PBOMPs oder Teile hiervon kodierenden Nucleotidsequenzen werden in einen geeigneten Expressionsvektor, d.h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten Protein kodierenden Sequenzen enthält, insertiert. Eine Vielzahl von Wirts-Vektorsystemen kann eingesetzt werden, um die Protein kodierende(n) Sequenz(en) zu exprimieren. Zunächst muß das Vektorsystem mit der eingesetzten Wirtszelle kompatibel sein. Wirts-Vektorsysteme umfassen, sind aber nicht auf die folgenden beschränkt: Mit Bakteriophagen-DNA transformierte Bakterien, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA; Mikroorganismen wie Hefevektoren enthaltende Hefe, mit Virus infizierte Säugetierzellsysteme (z.B. Vakziniavirus, Adenovirus etc.); mit Virus infizierte Insektenzellsysteme (z.B. Baculovirus). Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirts-Vektorsystem kann jedes einer Zahl geeigneter Transkriptions- und Transiationselemente verwendet werden.
- Um effiziente Expression des Gens (oder eines Teils des Gens) zu erhalten, muß im Expressionsvektor ein Promotor vorhanden sein. RNA-Polymerase bindet normalerweise an den Promotor und initiiert die Transkription eines Gens oder einer Gruppe ligierter Gene und regulatorischer Elemente (bezeichnet als Operon). Promotoren variieren in ihrer "Stärke", d.h. ihrer Fähigkeit, die Transkription zu fördern. Um ein kloniertes Gen zu exprimieren, ist es erwünscht, starke Promotoren zu verwenden, um einen hohes Transkriptionsniveau und daher die Expression des Gens zu erhalten. Abhängig von dem verwendeten Wirtszellsystem kann jeder einer Zahl geeigneter Promotoren verwendet werden. Wenn zum Beispiel in E. coli kloniert wird, können seine Bakteriophagen oder Plasmide, Promotoren wie der lac-Promotor, trp-Promotor recA-Promotor, ribosomaler RNA-Promotor, der PR- und PL-Promotor von Coliphage Lambda und anderen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, lacUV5, ompF, bla, lpp und dergleichen, eingesetzt werden, um hohe Transkriptionsniveaus benachbarter DNA-Segmente zu bewirken. Zusätzlich können ein Hybrid-trp-lacUV5-(tac)-Promotor oder andere durch rekombinante DNA oder andere synthetische DNA- Techniken hergestellte E. coli-Promotoren eingesetzt werden, um Transkription des insertierten Gens zu bewirken.
- Bakterielle Wirtszellstämme und Expressionsvektoren können ausgewählt werden, die die Wirkung des Promotors verhindern, bis er spezifisch induziert wird. In bestimmten Operonen ist für effiziente Transkription der insertierten DNA die Zugabe von spezifischen Induktoren notwendig; zum Beispiel wird das lac-Operon durch Zugabe von Lactose oder IPTG (lospropylthio-beta-D-galactosid) induziert. Eine Vielzahl anderer Operone wie trp, pro etc. werden verschieden kontrolliert. Das trp-Operon wird induziert, wenn Tryptophan im Wachstumsmedium nicht vorhanden ist, und der PL-Promotor von lambda kann durch eine Zunahme der Temperatur in den Wirtszellen, die einen temperaturempfindlichen lambda-Repressor z.B. c1857 enthalten, induziert werden. Auf diese Art und Weise kann mehr als 95% der promotorgesteuerten Transkription in nichtinduzierten Zellen verhindert werden. Somit kann die Expression des gentechnisch veränderten PBOMP-Proteins oder -Peptids kontrolliert werden. Das ist wichtig, wenn das Proteinprodukt des klonierten Gens für die Wirtszellen tödlich oder schädlich ist. In derartigen Fällen können die Transformanten unter derartigen Bedingungen kultiviert werden, daß der Promotor nicht induziert wird, und wenn die Zellen im Wachstumsmedium eine geeignete Dichte erreichen, kann der Promotor zur Produktion des Proteins induziert werden.
- Ein derartiges Promotor/Operator-System ist das sog. "tac" oder trp-lac-Promotor/Operator-System (Russel und Bennett, 1982, Gene 20:231-243; DeBoer, Europäische Patentanmeldung 67540, angemeldet 18. Mai 1982). Dieser Hybrid-Promotor ist durch Kombination des -35 b.p. (-35 Region) des trp-Promotors und des -10 b.p. (-10 Region oder Pribnow Box) des lac-Promotors (die DNA-Sequenzen, die der RNA-Polymerase-Bindungsort sind) aufgebaut. Zusätzlich zur Erhaltung der starken Promotoreigenschaften des Tryptophan-Promotors ist tac ebenfalls durch den lac-Repressor kontrolliert.
- Bei Klonierung in einer eucaryotischen Wirtszelle können Verstärkersequenzen (z.B. die 72 bp Tandemwiederholung von SV40-DNA oder die retroviralen langen terminalen Wiederholungen oder LTRs, etc.) insertiert werden, um die transkriptionale Effizienz zu erhöhen. Verstärkersequenzen sind ein Satz eucaryotischer DNA-Elemente, die scheinbar die transkriptionale Effizienz in einer Art und Weise relativ unabhängig von ihrer Position und Orientierung bezüglich eines nahen Gens erhöhen. Anders als die klassischen Promotorelemente (JLZ.. der Polymerase- Bindungsort und die Goldberg-liogness "TATA"-Box), die direkt 5' zum Gen lokalisiert sein müssen, besitzen Verstärkersequenzen eine bemerkenswerte Fähigkeit, stromaulwärts, innerhalb oder stromabwärts von eucaryotischen Genen zu funktionieren. Daher ist die Position der Verstärkersequenz bezüglich des insertierten Gens weniger kritisch.
- Spezifische Initiationssignale werden ebenfalls für effiziente Gentranskription und -translation in procaryotischen Zellen benötigt. Diese Transkriptions- und Translationsinitiationssignale können in ihrer "Stärke" variieren, wie jeweils durch die Menge an genspezifischer Messenger-RNA und synthetisiertem Protein gemessen. Der DNA- Expressionsvektor, der einen Promotor enthält, kann ebenfalls jede Kombination verschiedener "starker" Transkriptions- und/oder Translationsinitiationssignale enthalten. Zum Beispiel benötigt effiziente Translation in E. coli eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz mit ungefähr 7-9 Basen, 5' zum Initiationscodon (ATG), um eine Ribosomenbindungsstelle zu schaffen. Somit kann jede SD-ATG-Kombination, die von Wirtszellenribosomen genutzt werden kann, angewandt werden. Derartige Kombinationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die SD-ATG-Kombination vom cro-Gen oder dem N-Gen des Coliphagen lambda oder von den E. coli Tryptophan E-, D-, C-, B- oder A- Genen. Zusätzlich kann jede durch rekombinante DNA oder andere Techniken, die den Einbau synthetischer Nucleotide umfassen, produzierte SD-ATG-Kombination verwendet werden.
- Jede der oben beschriebenen Methoden zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um einen Promotor und andere Kontrollelemente an spezifischen Orten innerhalb des Vektors zu verknüpfen.
- Demgemäß können genetische Sequenzen von H. influenzae, die diese PBOMP-Proteine oder -Peptide kodierenden Regionen enthalten, mit einem Expressionsvektor an einem spezifischen Ort bezüglich des Vektorpromotors und der Kontrollelemente ligiert werden, so daß, wenn das rekombinante DNA-Molekül in eine Wirtszelle eingeführt wird, die fremde genetische Sequenz durch die Wirtszelle exprimiert werden kann (d.h. transkribiert und translatiert wird). Das rekombinante DNA-Molekül kann in geeignete Wirtszellen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Bakterien, Viren, Hefe, Säugetierezellen oder dergleichen) durch Transformation, Transduktion oder Transfektion (in Abhängigkeit vom Vektor-/Wirtszellsystem) eingeführt werden. Transformanten werden ausgewählt, basierend auf der Expression eines oder mehrerer geeigneter Genmarker, die normalerweise im Vektor vorhanden sind, wie Ampicillinresistenz oder Tetracyclinresistenz in pBR322 oder Thymidinkinaseaktivität in eucaryotischen Wirtssystemen. Die Expression derartiger Markergene sollte anzeigen, daß das rekombinante DNA-Molekül intakt ist und repliziert wird. Die Expressionsvektoren können aus Klonierungsvektoren abgeleitet werden, die in der Regel eine Markierfunktion enthalten. Derartige Klonierungsvektoren können SV40 und Adenovirus, Vakzinia Virusvektoren, Insektenviren wie Baculoviren, Hefevektoren, Bakteriophagenvektoren wie lambda gt-WES-lambda B, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-1-lambda BC, lambda gt-1-lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9 oder Plasmid- DNA-Vektoren wie pBR322, pAC105, pVA51, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, pBR325, Col E1, pSC101, pBR313, pM121, RSF2124, pCR1, RP4, pBR328 und dergleichen umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
- Die Übertragung von Arzneimittelresistenz-Faktoren zwischen H. influenzae und E.coli über Konjugation (Stuy, 1979, J. Bact. 139:520-529); und Transformation (Mann, 1979, Plasmid 2:503-505) und Klonienung von Haemophilus chromosomalen Genen in E. coli (Mann et al., 1980, Gene 3:97-112) gibt an, daß mindestens einige Gene in beiden Organismen effizient exprimiert werden können, und daß die grundlegenden Mechanismen transkriptionaler und transiationaler Kontrolle ähnlich sein können.
- In der besonderen Ausführungsform in den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde ein E. coli-Plasmidsystem als Expressionsvektor ausgewählt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung eines derartigen E. coli-Expressionsvektors beschränkt.
- Gentechnische Techniken könnten ebenfalls verwendet werden, um das klonierte Gen weiter zu charakterisieren und/oder anzupassen. Zum Beispiel könnte ortsgerichtete Mutagenese des ein PBOMP-Protein kodierenden Gens verwendet werden, um die Regionen des Proteins zu identifizieren, die für die Erzeugung schützender Antikörperantworten verantwortlich sind. Es könnte ebenfalls verwendet werden, um das Protein in Regionen außerhalb der schützenden Bereiche zu modifizieren, zum Beispiel um die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen oder um eine leichtere Aufreinigung zu erlauben.
- Fremde Geninserte enthaltende Expressionsvektoren können durch drei Hauptansätze identifiziert werden: (1) DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu dem insertierten fremden Gen homolog sind; (2) An- oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen (z.B. Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphenotyp, Thymidinkinaseaktivität etc.) und (3) Expression von insertierten Sequenzen, basierend auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Genprodukts.
- Wenn einmal eine Rekombinante identifiziert ist, die ein PBOMP-Gen exprimiert, sollte das Genprodukt analysiert werden. Immunologische Analyse ist besonders wichtig, weil das endgültige Ziel ist, die Genprodukte oder rekombinanten Viren, die derartige Produkte in Vakzinformulierungen und/oder als Antigene in diagnostischen Immunoassays exprimieren, zu verwenden.
- Eine Vielzahl von Antiseren ist zur Analyse der Immunoreaktivität des Produkts verfügbar, einschließlich, aber nicht beschränkt auf polyvalente Antiseren und monoklonale Antikörper.
- Die Identifizierung der Proteine und Peptide der Erfindung erfordert, daß das PBOMP verwandte Protein oder Peptid immunoreaktiv auf eine Vielzahl von gegen PBOMP oder seine Analogen oder Abkömmlinge gerichtete Antikörper ist.
- Das Protein oder Peptid sollte immunoreaktiv sein, ob es aus der Expression einer ganzen PBOMP-Gensequenz, eines Teils der Gensequenz oder aus zwei oder mehr Gensequenzen, die ligiert werden, um die Produktion von Fusionsproteinen zu bewirken, resultiert. Diese Reaktivität kann durch standard immunologische Techniken wie Radioimmunopräzipitation, Radioimmunokompetition, ELISA oder Immunoblots, demonstriert werden.
- Wenn einmal das H. influenzae-PBOMP verwandte Protein identifiziert ist, kann es isoliert und durch Standardverfahren, einschließlich Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Säulenchromatographie nach der Größe), Zentrifugieren, differentielle Löslichkeit oder durch jede andere Standardtechnik flir die Aufreinigung von Proteinen gereinigt werden.
- Wenn alternativ einmal ein immunoreaktives, mit H. influenzae PBOMP verwandtes Protein, produziert durch eine Rekombinante, identifiziert ist, kann die Aminosäuresequenz des immunoreaktiven Proteins von der Nucleotidsequenz des in der Rekombinanten enthaltenen chimären Gens abgeleitet werden. Als Folge kann das Protein durch im Stand der Technik bekannte chemische Standardverfahren synthetisiert werden (z.B. siehe Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111).
- In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen derartige Peptide, ob sie durch rekombinante DNA-Techniken oder durch chemische Syntheseverfahren hergestellt sind, alle oder einen Teil der im wesentlichen wie in Fig. 6 dargestellten Aminosäuresequenzen, einschließlich alterierter Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäuregruppen durch Gruppen ersetzt sind, die in der der Sequenz einen stillen Wechsel erzeugen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminosäuregruppen innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität substituiert werden, die als ein funktionelles Äquivalent wirkt, woraus eine stille Änderung resultiert. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Verbindungen der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren umfassen Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die neutralen polaren Aminosäuren umfassen Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Aspargin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparginsäure und Glutaminsäure.
- Wenn einmal die die PBOMP-Gene enthaltenden DNA-Fragmente identifiziert wurden, können die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Gene durch Sequenzanalyse der DNA ermittelt werden. Die Sequenzanordnung der Basenpaare kann durch eines von zwei Verfahren bestimmt werden, dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Maxam und Gilbert, 1980, Methods in Enzymology, 65:49) oder die Didesoxy-DNA-Sequenzierungsmethode (Sanger et al., 1977, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 74:5463). Die tatsächlichen Start- und Stopsignale der PBOMP-Gene können durch Analyse der Nucleotidsequenz auf offene Leseraster ermittelt werden (Rosenberg et al., 1979, Ann. Rev. Genet. 13:319). Wenn mehr als ein offenes Leseraster auf einem speziellen DNA-Fragment gefunden wird, könnte die Identität des tatsächlichen Gens durch Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Genprodukts mit der Aminosäuresequenz des PBOMPS bestätigt werden. Die Lage des richtigen Leserasters kann auch durch die Verwendung von Genfusionen bestimmt werden.
- Erfahrungen mit Antikörpern des Hüllenpolysaccharids vom Typ b Haemophilus influenzae, d.h. PRP, zeigen, daß die Fähigkeit der Antikörper, die Bakterien in in vitro Assays zu töten und gegen die Infektion mit Hib in tierischen Modellsystemen zu schützen, mit der Fähigkeit, eine schützende Immunantwort in menschlichen Säuglingen hervorzurufen, eng korrelliert ist.
- Die als Reaktion auf die PBOMP-Proteine und Peptide der Erfindung hervorgerufenen Anti-PBOMP-Antikörper können unter Verwendung ähnlicher in vitro Assaysysteme und Tier-Modellsysteme getestet werden, um die Fähigkeit zu demonstrieren sowohl Hi- als auch Ilib-Zellen zu töten und in Tier-Modeilsystemen vor der Infektion mit Hib zu schützen. Die Ergebnisse aus diesen Systemen sollten eine ähnliche Korrelation mit dem Potential jedes der PBOMPs zeigen, eine schützende Immunantwort hervorzurufen und in einem Vakzin fur menschliche Säuglinge, Kinder und Erwachsene zu dienen.
- Ein in vitro Komplement-vermitteltes bakterizides Assaysystem (Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297-304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38), das früher zur Messung bakterizider Aktivität von Antikörpern von PRP und Lipopolysaccharid (LPS) gegen H. influenzae verwendet wurde, könnte verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein gegen ein bestimmtes PBOMP-Peptid oder Fragment hiervon gerichteter Antikörper bakterizide Aktivität gegen Typ b H. influenzae und nicht typisierbare H. influenzae besitzt oder nicht. Diese Assays können bei einer verhältnismäßig großen Zahl klinischer Isolierungen beider Typen von Bakterien angewandt werden, um zu bestimmen, ob eine große Zahl der Stämme getötet wurde.
- Weitere Daten über die Fähigkeit eines PBOMPs, eine schützende Antikörperreaktion hervorzurufen, können durch Verwendung des Rattensäuglings-Meningitismodellsystems erhalten werden (Smith et al., 1973, lnfect. Immun. 8:278-290). Vor dem 6ten Lebenstag mit einer geeigneten Dosis von H. influenzae Typ b infizierte Rattensäuglinge entwickeln Bakteriämie und eine tödliche Meningitis, ähnlich zu der bei menschlichen Säuglingen beobachteten. Wenn ein Antikörper, der gegen einen infizierenden Stamm bakterizid wirkt, zur passiven Immunisierung der Rattensäuglinge vor der Infizierung verwendet wird, dann sind sie vor Meningitis und dem Tod geschützt. Gegen den geläufigen Vakzin-Typ b Haemophilus, PRP, gerichtete Antikörper schützen im Rattensäuglings-Modellsystem. Passiver Schutz gegen Typ b Harmophilus-Meningitis könnte durch Immunisierung von Rattensäuglingen mit polyklonalem Kaninchen-anti-PBOMP-Antikörper und nachfolgendem Infizieren der Ratten mit einer letalen Dosis von H. influenzae Typ b demonstriert werden.
- Daten über die Fähigkeit des Antikörpers eines bestimmten PBOMPs, gegen Hi zu schützen, könnte unter Verwendung des Chinchilla-Otitis media-Tiermodellsystems erhalten werden (Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52:572-78). In diesem Tiermodell werden Chinchillas durch Inokulation des Innenohrkanals mit Hi infiziert. Otitis media, sehr ähnlich der beim Menschen beobachteten, entwickelt sich. Chinchillas, die entweder aktiv mit Hi- OMPs oder passiv mit gegen Hi-OMPs gerichtete Antikorper immunisiert wurden, sind gegen aurale Infektion mit Hi geschützt (Barenkamp et al., siehe oben). Dieses Tiermodellsystem könnte verwendet werden, um die Fähigkeit eines PBOMP-Antikörpers, gegen Hi zu schützen, zu demonstrieren.
- Es ist möglich, zu zeigen, daß Anti-PBOMP-Antikörper, verglichen mit Anti-PRP-Antikörpern durch Verwendung des Rattensäugling-Tiermodells, zusätzlichen Schutz ermöglichen. Anti-PBOMP-Antikörper, die bis zu einem Grad verdünnt wurden, bei dem sie Rattensäuglinge nicht mehr gegen Infizierung mit Hib schützen können, können gemischt mit ähnlich verdünnten Anti-PRP-Antikörpern zusätzlichen Schutz zeigen und somit den Tod der Rattensäuglinge verhindern. Dieser zusätzliche Schutz könnte für ein aus PRP oder einem Fragment oder Konjugat hiervon und dem PBOMP oder einem Fragment hiervon zusammengesetzten potentiellen Kombinationsvakzin nützlich sein.
- Viele Verfahren können verwendet werden, um die unten beschriebenen Vakzinformulierungen einem Menschen oder einem Tier zu verabreichen. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:: intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Verabreichungswege.
- Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, mit äußeren Membranproteinen von H. influenzae verwandte Proteine oder Polypeptidfragmente, PBOMPs, einschließlich PBOMP-2 und verwandte Proteine und Peptide, bereitszustellen, die als Immungene in einem Untereinheitvakzin verwendet werden, um gegen Meningitis und andere Krankheitssymptome von H. influenzae-Infektionen zu schützen. Untereinheitvakzine umfassen ausschließlich das relevante immunogene Material, das notwendig ist, einen Wirt zu immunisieren. Vakzine, hergestellt aus gentechnisch veränderten Immungenen, chemisch synthetisierten Immungenen und/oder, wie hier beschrieben isolierten, im wesentlichen reine authentische H. influenzae-PBOMPs umfassenden Immungenen, die in der Lage sind, eine schützende Immunantwort hervorzurufen, sind besonders vorteilhaft, weil es kein Infektionsrisiko der Rezipienten gibt. Somit kann das PBOMP verwandte Protein oder ein Fragment hiervon aus Rekombinanten, die die PBOMP-Epitope exprimieren, aufgereinigt werden. Derartige Rekombinanten umfassen jede der zuvor beschriebenen bakteriellen Transformanten, Hefetransformanten oder mit rekombinanten Viren infizierte Zellkulturen, die die PBOMP-Epitope exprimieren (siehe Abschnitte 5.1. und 5.2. oben). Alternativ kann das PBOMP verwandte Protein oder Peptid chemisch synthetisiert werden. Zu diesem Zweck kann die Aminosäuresequenz eines derartigen Proteins oder Peptids aus der Nucleotidsequenz des Gens, das seine Expression steuert, abgeleitet werden (siehe Abschnitt 5.2. oben).
- Egal ob das Immungen aus Rekombinanten aufgereinigt oder chemisch synthetisiert wird, das Endprodukt wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt und kann mit jedem geeigneten Vakzinhilfsmittel formuliert werden. Geeignete Hilfsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Oberflächenaktive Substanzen, z.B. Hexadecylamin, Octadecylamin, Octadecylaminosäureester, Lysolecithin, Dimethyl-dioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis-(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerol und pluronische Polyole, Polyamine, z.B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol; Peptide z.B. Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin; Ölemulsionen und Mineralgele, z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat etc. Das Immungen kann zur Verwendung in einer Vakzinformulierung ebenfalls Liposomen beigemengt oder an Polysaccharide und/oder andere Polymere konjugiert sein.
- In einer anderen Ausführungsform dieser Erscheinungsform der Erfindung ist das PBOMP verwandte Protein oder Peptid ein Hapten d h ein Molekül, das dadurch antigen ist, daß es spezifisch oder selektiv mit angeborenen Antikörpern reagiert, aber nicht immunogen ist, d.h. es kann keine Immunreaktion hervorrufen. In einem derartigen Fall kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden sein; zum Beispiel ein großes Protein wie das Protein Serumalbumin verleiht dem daran gekoppelten Hapten Immunogenität Der Haptenträger kann zur Verwendung in einem Untereinheitvakzin formuliert werden.
- Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, entweder ein lebendes rekombinantes virales Vakzin oder ein inaktiviertes rekombinantes virales Vakzin bereitzustellen, das verwendet wird, um gegen Meningitis und andere Krankheitssymptome von H. influenzae zu schützen. Zu diesem Zweck werden rekombinante Viren, die PBOMP verwandte Epitope exprimieren, hergestellt (siehe Abschnitte 5.1. und 5.2. oben). Wenn der rekombinante Virus für den zu immunisierenden Wirt infektiös ist, aber keine Krankheit hervorruft, ist ein lebendes Vakzin bevorzugt, weil Vermehrung im Wirt zu einem verlängerten Stimulus führt und daher im wesentlichen langandauernde Immunität verleiht. Wenn der infekiöse rekombinante Virus in einen Wirt eingeführt wird, kann er von seinem chimären Gen das PBOMP verwandte Protein oder Polypeptidfragment exprimieren und dadurch eine Immunantwort gegen H. influenzae-Antigene hervorrufen. In Fällen, in denen eine derartige Immunantwort gegen nachfolgende H. influenzae-Infektion schützt, kann der lebende rekombinante Virus selbst in einem Präventivvakzin gegen H. influenzae-Infektion verwendet werden. Die Herstellung eines derartigen rekombinanten Virus kann sowohl in vitro- (z.B. Gewebezellkulturen) als auch in vivo- (z.B. natürliches Wirtstier) -Systeme umfassen. Zum Beispiel können herkömmliche Verfahren zur Herstellung und Formulierung von Pockenvakzin für die Formulierung von lebendem rekombinanten Virusvakzin, das ein PBOMP verwandtes Protein oder Polypeptid exprimiert, angepaßt werden.
- Multivalente lebende Virusvakzine können aus einem einzelnen oder wenigen infektiösen rekombinanten Viren hergestellt werden, die Epitope von Organismen exprimieren, und zusätzlich zu den Epitopen von H. influenzae-PBOMPs die Krankheit hervorrufen. Zum Beispiel kann ein Vakziniavirus verändert werden, um Kodierungssequenzen fur andere Epitope, zusätzlich zu denen von H. influenzae-PBOMPs, zu enthalten. Ein derartig rekombinanter Virus kann selbst als das Immungen in einem multivalenten Vakzin verwendet werden. Alternativ kann eine Mischung von Vakzinia oder anderen Viren, von denen jeder ein unterschiedliches Gen exprimiert, das verschiedene Epitope von PBOMPs und/oder andere Epitope anderer Krankheiten verursachender Organismen kodiert, in einem multivalenten Vakzin formuliert werden.
- Egal ob das für den zu immunisierenden Wirt rekombinante Virus infektiös ist oder nicht, kann eine inaktivierte Virusvakzinformulierung hergestellt werden. Inaktivierte Vakzine sind "tot" in dem Sinne, daß ihre Infektiosität zerstört wurde, in der Regel durch chemische Behandlung (z.B. Formaldehyd). Idealerweise wird die Infektiosität des Virus zerstört ohne die Proteine, die die Immunogenität des Virus tragen, zu beeinflußen. Um inaktivierte Vakzine herzustellen, müssen große Mengen des rekombinanten Virus, das das PBOMP verwandte Protein oder Polypeptid exprimiert, in Kultur gezüchtet werden, um die notwendige Menge relevanter Antigene bereitzustellen. Eine Mischung inaktivierter Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann für die Formulierung von "multivalenten" Vakzinen verwendet werden. In bestimmten Fällen können diese "multivalenten" inaktivierten Vakzine lebenden Vakzinformulierungen vorzuziehen sein, aufgrund potentieller Schwierigkeiten mit mutueller Interferenz zusammen verabreichter lebender Viren. In jedem Fall sollte der inaktivierte rekombinante Virus oder eine Mischung von Viren in einem geeigneten Hilfsmittel formuliert werden, um die immunologische Reaktion auf die Antigene zu verstärken. Geeignete Hilfsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Oberflächenaktive Substanzen z.B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyl-dioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl- N'-N-bis-(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerol und pluronische Polyole, Polyamine, z.B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol; Peptide, z B Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin; Ölemulsionen; und Mineralgele z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat etc.
- Anstelle aktiver Immunisierung mit viralen oder Untereinheitvakzinen ist es möglich, durch die Verabreichung vorgebildeter Antikörper gegen ein Epitop von H. influenzae einem Wirt kurzzeitigen Schutz zu verleihen. Die Vakzinformulierungen können somit verwendet werden, um für den Einsatz in der passiven Immuntherapie Antikörper zu produzieren. Humanimmunglobulin ist in der Humanmedizin bevorzugt, weil ein heterologes Immunoglobulin eine Immunreaktion auf seine fremden immunogenen Komponenten auslösen kann. Eine derartige passive Immunisierung könnte im Notfall für sofortigen Schutz nicht immunisierter Individuen, die speziellen Risiken ausgesetzt sind, z.B. junge Kinder, die einem Kontakt mit Patienten mit bakterieller Meningitis ausgesetzt sind. Diese Antikörper können alternativ bei der Herstellung von Anti-Idiotyp-Antikörpern verwendet werden, die umgekehrt als Antigen zur Stimulierung einer Immunreaktion gegen H. influenzae PBOMP-Epitopen verwendet werden können.
- Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, Reagenzien für die Verwendung in diagnostischen Assays für den Nachweis von PBOMP-Antigenen (und daher H. influenzae) in verschiedenen Körperflüssigkeiten von Individuen, bei denen H. influenzae-Infektion vermutet wird, bereitzustellen.
- In einer Form dieser Ausführungsform können die PBOMP verwandten Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung als Antigene in Immunoassays zum Nachweis von H. influenzae in verschiedenen Patientengeweben und Körperflüssigkeiten einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Blut, Rückenmarksflüssigkeit, Sputum etc., verwendet werden.
- Die Antigene der vorliegenden Erfindung können in jedem im Stand der Technik bekannten Immunoassay- System verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Radioimmunoassay, ELISA-Assays, "Sandwich"-Assays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusionspräzipitinreaktion, Immunodiffusionsassays, Agglutinationsassays, Fluoreszenzimmunoassays, Protein-A-Immunoassays und Immunoelektrophoreseassays, um nur einige zu nennen.
- In einer weiteren Form dieser Ausführungsform kann die neue Nucleotidsequenz der die mit dem Protein und den Peptiden verwandten PBOMP kodierenden Gene der vorliegenden Erfindung als Sonde in Nucelinsäurehybridisierungsassays für den Nachweis von H. influenzae in verschiedenen Patientenkörperllüssigkeiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Blut, Rückenmarksflüssigkeit, Sputum etc., verwendet werden.
- Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können in jedem im Stand der Technik bekannten Nucleinsäurehybridisienungsassaysystem verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Southern Blots (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508); Northern Blots (Thomas et al., 1980, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 7 7:5201-05); Colony Blots (Grunstein et al., 1975, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72:3961-65), etc.
- Die nachfolgende Reihe an Beispielen wird zum Zwecke der Veranschaulichung vorgestellt und keinesfalls zur Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
- Restriktionsendonucleasen wurden von BRL (Bethesda, MD), IBI (New Haven, CT), New England Biolabs (Beverly, MA) oder US Biochemical Corporation (Cleveland, OH) bezogen.
- Restriktionsenzymverdau wird durch Suspendierung von DNA im geeigneten Restriktionspuffer, Zugabe von Restriktionsendonuclease und Inkubation für eine geeignete Zeitdauer, um vollständigen Verdau zu gewährleisten, durchgeführt. Eine Einheit des Enzyms ist definiert als die Menge, die für den vollständigen Verdau von 1,0 µg Phase lambda DNA in 1 Stunde in einer Gesamtreaktionsmischung von 20 µl Volumen benötigt wird. Die mit den verschiedenen Enzymen verwendeten Puffer sind nachfolgend aufgelistet:
- Der für ClaI-, HpaI, HpaII- und KpnI-Verdau verwendete niedrige Salzpuffer bestand aus: 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreitol (DTT).
- Der für AluI-, AvaI-, EcoRII-, EcoRV-, HaeII-, HaeIII-, HincIII-, HindIII-, PstI-, Sau3AI-, SphI-, SstI-, SstII-, TaqI- und XhoI-Verdau verwendete mittlere Salzpuffer bestand aus: 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 10 mM DTT.
- Der für BamHI-, EcoRI-, PvuI-, SalI- und XbaI-Verdau verwendete hohe Salzpuffer bestand aus: 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl und 10 mM DTT.
- Der für SmaI-Verdau eingesetzte Puffer bestand aus: 10 mM Tris (pH 8,0), 20 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT. Jeder Restriktionsverdau wurde bei 37ºC ausgeführt, mit Ausnahme von TaqI, der bei 60ºC durchgeführt wurde.
- Nach dem Restriktionsenzymverdau wurden die DNA-Fragmente varuerender Größe unter Verwendung von Gelelektrophorese in niedrigschmelzender Agarose (FMC LOT Agarose) unter Verwendung von 50 mM Trisacetat, 1 mM EDTA-Puffer pH 7,8 bei 10 Volt/cm getrennt und gereinigt. Die Agarosekonzentrationen variierten von 0,8% bis 1,5% in Abhängigkeit von der Größe der wiederzugewinnenden Fragmente. Die DNA-Banden wurden mit Ethidiumbromidfluoreszenz sichtbar gemacht und aus dem Gel ausgeschniffen. Die DNA wurde durch Schmelzen der Agarose bei 65ºC, Zugabe von 4 Vol.-Einheiten 0,65 M NaCl, 10 M Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, um die Mischung auf eine Endkonzentration von 0,5 M NaCl zu bringen, Beladen einer mit 0,5 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA (Beladungspuffer) equilibrierten NACS-Säule (BRL, Bethesda, MD) mit der DNA, Waschen der Säule mit 3-5 Vol.-Einheiten des Beladungspuffers und Eluieren mit 2-3 Vol.-Einheiten 2 M NACI, 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, wiedergewonnen. Das DNA-Eluat wurde 1:1 mit doppelt destilliertem H&sub2;O verdünnt und mit 3 Vol.-Einheiten Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 1 mM EDTA (TE-Puffer) enthält, resuspendiert.
- Alle Ligationen wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase durchgeführt. T4-DNA-Ligase wurde von BRL (Bethesda, MD), United States Biochemicals (Cleveland, OH) oder Boehringer (Indianapolis, IN) bezogen. Eine Einheit (U) von T4-DNA-Ligase ist definiert als die Menge, die benötigt wird, um 50% Ligation von HindIII- Fragmenten von Bakteriophage lambda DNA in 30 Minuten bei 16ºC in 20 µl Volumen Ligasepuffer bei einer 5'- DNA-Endenkonzentration von 0,12 µM (300 µg/ml) zu erzielen. Die DNA-Ligationen wurden in Ligasepuffer, bestehend aus: 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM Adenosintriphosphat, durchgeführt. Normalerweise wurden eine DNA-Konzentration von 20-30 µg/ml und ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:1 verwendet. T4-DNA-Ligase wurde mit einem Verhältnis von 1 U pro 20 µl Reaktionsvolumen zugegeben. Die Inkubationen wurden für 18-24 Stunden durchgeführt. Die verwendeten Temperaturen waren 15ºC für kohäsive Endligationen und 22ºC für stumpfe Endligationen. Wenn genügend Material verfügbar war, wurden die Ligationen durch Analyse eines Teils der Reaktionsmischung durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
- Die Proteine wurden für die Immunoblotanalyse durch verschiedene Techniken in Abhängigkeit von der besonderen Anwendung auf Cellulosenitratfolien fixiert. Phagenplaques wurden von Agarpiatten durch vorsichtiges Plazieren einer sterilen Cellulosenitratscheibe mit 8,1 cm Durchmesser auf die Oberfläche einer Phagentiterpiatte mit 10 cm Durchmesser übertragen. Man ließ die Folie vollständig befeuchten, wobei die Positionen durch Durchstechen des Filters mit einer sterilen Nadel markiert und der Filter nach 2 Minuten abgehoben wurde.
- Colony Blots wurden durchgeführt, indem Bakterienkolonien auf eine Cellulosenitratfolie übertragen wurden, man ließ die Kolonien durch Plazierung der Folie (Kolonieseite oben) 4-6 Stunden auf Nähragar wachsen und setzte die Folie 30 Minuten Chloroformdampf aus, um die Kolonien zu lysieren. Die Proteingeltransfers wurden durchgeführt, indem ein die zu analysierende Proteinmischung enthaltendes SDS-PAGE-Gel auf einer Cellulosenitratfolie plaziert wurde und horizontale Elektrophorese in einer Hoeffer-Transphor-Apparatur bei 0,5 A für 14 Stunden in einem 25 mM Tris-0,38 M Glyzin-pH 8,8-Puffer durchgeführt wurde.
- Nachdem der Proteintransfer abgeschlossen war, wurden die Filter mit 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5% fettfreier Trockenmilch (BLOTTO) bei 37ºC eine Stunde getränkt, in allen Fällen mit Ausnahme der Colony Blots. Wenn Colony Blots durchgeführt wurden, wurden die Filter über Nacht bei 4ºC in 1 mg/ml Lysozym enthaltendem BLOTTO getränkt, um Zellbruchstücke zu verdauen. Die Filter wurden dann mit einer ersten Antikörpersonde bei einer geeigneten Verdünnung (bestimmt durch Versuche) in BLOTTO für 3 Stunden bei 37ºC getränkt, dreimal 15 Minuten mit BLOTTO gewaschen, mit einem mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten zweiten Antikörper (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) bei einer Verdünnung von 1:500 in BLOTTO für eine Stunde bei 37ºC getränkt und dreimal 15 Minuten mit BLOTTO gewaschen. Die Filter wurden in 50 mM Tris (pH 7,0), 150 mM NaCl, 0,01% Wasserstoffperoxid plaziert und 0,06% 4-Chlor-1-naphthol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Methanol wurde zugegeben. Wenn sich innerhalb von 20 Minuten keine blaue Farbe entwickelte, wurde die Reaktion als negativ angesehen. Die Reaktion wurde durch Überführung des Filters in destilliertes Wasser und trockenes Abtupfen beendet.
- Fusionen eines ein PBOMP-Protein oder Peptid kodierenden Gens oder Genfragments mit einem anderen Gen, wie dem die alkalische Phosphatase (PhoA) kodierenden Gen, wurden, wie bei Manoil und Beckwith beschrieben (1985, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:8129-8133), ausgeführt. Rekombinante Plasmide wurden in einen E. coli-Stamm eingeführt, bei dem das natürliche PhoA-Gen entfernt wurde und der einen Abkömmling des Transposons Tn5 (TnPhoA) trägt, der ein in die linke terminale Wiederholung von Tn5 auf einem F-prime Plasmid eingeführtes alkalisches Phosphatasegen enthält, dem sowohl ein Promotor, als auch eine Membrantransportsignalsequenz fehlt. Damit erfordert die Herstellung eines aktiven alkalischen Phosphataseenzyms eine derartige Transposition von TnPhoA, daß das PhoA-Gen im Raster in ein aktiv transkribiertes Gen, das ein Membrantransportsignalpeptid enthält, fusioniert wird. Derartige Transpositionen wurden durch Plattieren von Zellen in Gegenwart von 40 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nachgewiesen. In Gegenwart dieses Farbstoffs erscheinen Kolonien, die aktives alkalisches Phosphataseenzym herstellen, in intensiv blauer Farbe, wohingegen Kolonien ohne aktive alkalische Phosphatase weiß erscheinen.
- Die DNA-Filter-Hybridisierungsanalyse wurde entsprechend dem Verfahren von Southern (1975, J. Mol. Biol. 98:508) durchgeführt. Die durch Filterhybridisierung zu analysierende DNA wurde mit geeigneten(er) Restriktionsendonuclease(n) verdaut und durch Agarosegelelektrophorese in 0,8% Agarose (Seakem Portland, ME) unter Verwendung von 90 mM Tris-Borat, 8 mM EDTA-Puffer und 10 Volt/cm getrennt. Die DNA im Gel wurde durch Tränken des Geis mit 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH für 1 Stunde und Neutralisieren durch Tränken mit 1,5 M NaCl/1,0 M Tris/HCl für 1 Stunde denaturiert. Die denaturierte DNA wurde durch Blotten auf Cellulosenitratfilterpapier Übertragen. Der Übertragung der DNA folgend wurde der Filter mit 6 X SSC (hergestellt durch Verdünnung einer 20 X SSC-Stammlösung, die 175,5 g NaCl und 88,2 g Na-Citrat/Liter enthält) gewaschen und luftgetrocknet. Die DNA- Fragmente wurden auf dem Filter durch Erwärmen bei 80ºC für 2 Stunden unter Vakuum fixiert.
- Die DNA-Hybridisierungssonden wurden durch Nick-Translation nach dem Verfahren von Rigby et al. (1977, J. Mol. Biol., 113:237-244) hergestellt. Die DNA für die Sonde (1-2 µg) wurde in einem 100 u Nick-Translations-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM DTT, 5 µg/ml Rinderserum-Albumin und jeweils 20 µm dGTP, dCTP und dTTP) gelöst. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 100 µCi alpha-³²P-dATP (Amersham, 2-3000 Ci/mMol), 1,0 ng Desoxyribonuclease I (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 10 U E. coli-DNA-Polymerase I (Boehringer) zugegeben und die Mischung bei 15ºC 45 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von BDTA zu 50 mM gestoppt und auf 65ºC 10 Minuten erwärmt, um die Enzyme zu inaktivieren. Die markierte DNA wurde durch Zugabe von 3 Volumeneinheiten Ethanol gelällt und mit 50 µl 0,3 M Ammoniumacetat (NH&sub4;OAc) resuspendiert. Die Probe wurde auf eine mit 0,3 M NH&sub4;OAc equilibriertel ml Biogel P-50-Spinsäule aufgebracht und durch Zentrifugieren bei 500 x g für 5 Minuten eluiert. Die Säule wurde mit 100 µl 0,3 M NH&sub4;OAc gewaschen und die Eluate wurden vereinigt und mit 3 Volumeneinheiten Ethanol gefällt. Der Niederschlag der markierten DNA wurde vakuumgetrocknet, in TE-Puffer resuspendiert und die radioaktive Einlagerung in einem Beckmann (LS9000) Szintillationszähler durch Cherenkov-Streuung gemessen.
- Zur Hybridisierung wurden die Filter mit gebundener DNA mit 6 x SSC befeuchtet und 6 x SSC/0,5% SDS/5X Denhardt's Lösung/100 µg/ml tRNA bei 68ºC für 2 Stunden vorhybridisiert, um Überschüssige Bindungskapazität des Filters zu blockieren (1 X Denhardt's Lösung ist 0,02% Ficoll., 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserum-Albumin in Wasser). Die Hybridisierungsreaktion wurde im selben Puffer ausgeführt, zu dem 0,01 M EDTA und 5-10.000.000 CPM (Cherenkov) markierte Sonde zugegeben wurde. Die Sondenlösung wurde vor der Anwendung 10 Minuten auf 90ºC erwärmt, um die DNA-Stränge zu denaturieren, auf 68ºC gekühlt und mit dem Filter bei 68º für 18 - 24 Stunden inkubiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter unter mehrmaligem Wechsel mit 0,1 X SSC/0,5% SDS bei 68ºC gewaschen, um nichtspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Unter den verwendeten Bedingungen würden 90% oder mehr der DNA-Homologen eine positive Bindung der DNA-Sonde zeigen. Die Filter wurden luftgetrocknet und auf Kodak XAR-Film bei -70ºC unter Verwendung von Dupont CRONEX "Lightning Plus" Verstärkerschirmen belichtet.
- Die Quelle von H. influenzae chromosomaler DNA für die Klonierung der PBOMP-Gene war entweder H. influenzae KW20b (HiKW20b), ein Abkömmling eines hüllenlosen Rd-Stamms von Hi, zum Typ b+ transformiert durch DNA von Stamm b-Eagan (Moxon et al., 1984, Clin. Invest. 73:298-306), oder H. influenzae S2 (HiS2), eine spontane Hüllen-Minus-Mutante von Hib Eagan.
- Um eine Phage lambda-Bibliothek zu erzeugen, wurde chromosomale DNA von Hi auf eine durchschnittliche Länge von ungefähr 15.000 Basenpaaren (bp) geschert, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen, mit EcoRI-DNA-Methylase modifiziert, an synthetische EcoRI-Linker gebunden und in den rekombinanten lambda-Phagenvektor Charon 4 kloniert.
- Um eine Plasmidbibliothek zu erzeugen, wurde chromosomale HiS2-DNA partiell mit Sau3A gespalten, die derart erzeugten 3-8 Kilobasen (kb) langen Restriktionsfragmente wurden isoliert und an der BamHI-Restriktionsstelle in den Plasmidvektor pGD103 insertiert. Dieses Plasmjd ist ein Abkömmling von pLG339 (siehe Fig. 1; siehe auch Stoker et al., 1982, Gene 18:335-41), und ist in 6-8 Kopien/Zelle vorhanden. Es enthält ebenfalls das lac- Z-alpha-Peptid und die Polylinkerregion des Plasmids pUC8; und wenn es in einen geeigneten E. coli-Stamm (so wie JM83) transformiert wird, ermöglicht es daher die Selektion von rekombinanten Plasmiden durch Screening auf den Verlust des Lac+-Phenotyps. Es ist ebenfalls möglich, daß ein kloniertes Gen, das in E. coli schwach exprimiert wird unter Kontrolle des starken, regulierten lac-Promotors gelangt, wenn es in der richtigen Orientierung kloniert wird. Rekombinante Plasmide enthaltende E. coli wurden auf die Produktion von PBOMPs unter Verwendung eines vereinigten Gemisches monoklonaler Antikörper oder polyklonalen Anti-PBOMP-Antiserums einem Screening unterworfen.
- Es ist möglich, daß das PBOMP-Protein auflambda-Phage nicht exprimiert wird oder mit diesem inkompatibel ist. Um dies zu Überprüfen, konstruierten wir eine chromosomale Plasmid-Bibliothek von HiS2. Es wurde gezeigt, daß die Klonierung von E. coli-OMP-Genen auf Plasmiden hoher Kopienzahl toxisch ist (siehe zum Beispiel Beck et al., 1980, Nucleic Acid Res. 8:3011-3024). Um dieses Problem zu vermeiden, verwendeten wir das Plasmid pGD103 mit geringer Kopienanzahl (siehe Fig. 1).
- Chromosomale DNA aus einem HiS2 wurde partiell mit Restriktionsendonuclease Sau3A verdaut (BRL, Bethesda, MD). 500 Mikrogramm DNA wurden in 5 ml Restriktionspuffer mit 50 Einheiten Sau3A für 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Die Fragmente wurden durch Geschwindigkeitssedimentation in einem Beckmann SW28-Rotor mit einem, 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mm EDTA, 1 M NaCl enthaltenden 10-40% Saccharosegradienten bei 140.000 x g für 24 Stunden getrennt. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Aliquots durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Restriktionsfragmente mit einer Länge von 3-8 Kb enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in TE-Puffer konzentriert. Die Plasmid pGD103-DNA wurde mit BamHI-Endonuclease verdaut und mit alkalischer Kälberphosphatase (Boehringer, Indianapolis, IN) (1 Einheit/µg DNA, 37ºC × 30 Minuten in Restriktionspuffer) behandelt. Die DNA wurde durch Phenolextraktion und Ethanolfällung aus der Reaktionsmischung gereinigt und in TE-Puffer resuspendiert. Da BamHI- und Sau3A-Restriktionsenzyme kohäsive Enden bilden, war keine weitere Behandlung der DNAs vor der Ligation nötig.
- Ungefähr 25 µg jeder der HiS2-Sau3A-verdauten DNA und pGD103/BamHI/CAP-verdauten DNA wurden in 500 ml 25 U T4-Ligase (Boehringer, Indianapolis, IN) enthaltendem Ligationspuffer gemischt und bei 15ºC für 18 Stunden inkubiert. Ein 20 µl Aliquot der Reaktionsmischung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, um die Ligationsreaktion zu verifizieren (das Ausgangsmaterial ließ man in einer benachbarten Spur laufen). Die Ligationsmischung wurde dann in kompetente E. coli JM83 transformiert (siehe Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 250), 1 Stunde in LB-Brtlhe bei 37ºC inkubiert und auf 50 µg/ml Kanamycinsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 40 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galctopyranosid (X-gal, BRL, Bethesda, MD) enthaltenden LB-Agarplatten plattiert und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ungefähr 50% der kanamycinresistenten (kanR) Kolonien, die sich entwickelten, wurden weiß (Lac-), was die Insertion von S2-DNA an der BamHI-Stelle im Lac-Bereich von pGD103 anzeigt (Lac+-nichtrekombinante sind blau). Zehn weiße Kolonien wurden zufällig ausgewählt, vergrößert und zeigten, daß sie 4-8 Kb größere Piasmide als pGD103 mit Insertionen an der Vektor-BamHI-Stelle enthalten.
- Eintausendfünfhundertfünfundzwanzig weiße Kolonien wurden herausgegriffen, einzeln amplifiziert und bei -70ºC in LB-Brühe, die 18% steriles Glycerol in Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen enthielt, gefroren gelagert.
- Chromosomale DNA hohen Molekulargewichts von Hi KW20b wurde in TE-Puffer bei einer Konzentration von 200 µg/ml suspendiert und auf eine Durchschnittslänge von 15.000 bp durch Passage durch eine Nadel von 25 gauge geschert. Die vorstehenden Enden wurden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase in 50 mM Tris (pH 8,8), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM DTT, 50 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP bei 37ºC für 20 Minuten entfernt. Die DNA wurde dann mit EcoRI-DNA-Methylase (1 U/g DNA) (BRL, Bethesda, MD), in 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,1 mM S-Adenosyl-methionin für 3 Stunden bei 37ºC modifiziert. Die Methylierung der DNA wurde durch Entfernung von 1 µg DNA aus der Reaktion, Mischen mit 1 µg unmodifizierter lambda-DNA und Verdau in 20 µl hohem Salzrestriktionspuffer mit 5 Einheiten von EcoRI für 1 Stunde bei 37ºC verifiziert. Unter diesen Bedingungen wurde die modifizierte Hi-DNA nicht verdaut, wohingegen die zugegebene lambda-DNA vollständig verdaut wurde.
- Zwanzig Mikrogramm modifizierter Hi-DNA wurden mit 1 µg chemisch synthetisierten EcoRI-Linkern (BRL, Bethesda, MD) in einer 100 µl Reaktionsmischung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (5 U) ligiert. Nach 18 Stunden wurde die Reaktion durch Erwärmen auf 60ºC für 20 Minuten abgebrochen, NaCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben und die Mischung mit 10 U EcoRI für 6 Stunden verdaut. Der modifizierte Hi-DNA+ Linker wurde durch Agarose-Gelelektrophorese, wie oben beschrieben, von gespaltenen und nicht verknüpften Linkern abgetrennt.
- Die hergestellte Hi-DNA wurde mit den linken und rechten EcoRI-Fragmenten von lambda-Charon 4-DNA bei einem 1:1:1 molaren Verhältnis gemischt und mit T4-DNA-Polymerase für 18 Stunden ligiert. Die ligierte DNA-Mischung wurde in lambda-Phage-Partikel unter Verwendung einer in vitro-Verpackungsreaktion gepackt. 5 µg ligierter DNA in 4 µl H&sub2;O wurden zu 7 µl 20 mM Tris (pH 8), 10 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 3 mM MGCI&sub2;, 1 µl von 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM Spermidin, 2 mM Putrescin, 10 mM MgCl&sub2;, 1,5 mM ATP, 5 mM 2-ME und 5 µl Beschallungsextrakt von E. coli BHB2690 (-1 imm 434, cIts, b2.red3, Eam 15, Sam7) Lysat (Hohn et al., 1977, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 74:3259) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 22ºC flir 1 Stunde inkubiert, und die gepackten Phagen wurden durch Zentrifgutaion in einer 3 M bis 5 M CsCl [in 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 0,02% Gelatine (TMG-Puffer)J mit einem Stufengradienten für 250.000 x g für 4 Stunden in einem Beckmann SW50. 1-Rotor abgetrennt. Die Phagen wurden von der Grenzfläche entfernt und gegen TMG dialysiert. Die Titrierung der derart hergestellten Phagen gab an, daß eine Bibliothek von 25-30.000 unabhängigen Klonen des Hi-Genoms erzeugt worden waren. Die Phagen-Bibliothek wurde durch Plattieren unter Verwendung von E. coli KH802 als Phagenwirt vermehrt, um 5 ml Phagensuspension zu erhalten, die 10&supmin;&sup9; plaquebildende Einheiten (P FU)/ml enthält.
- Die wie oben in Abschnitt 6.2.1. beschrieben hergestellte, vermehrte Phagenbibliothek wurde auf 1-2000 PFU in 1 ml TMG verdünnt und 50 µl E. coli KH802 (5 × 10&sup9; Zellen/ml) wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC 20 Minuten inkubiert und mit 3 ml Weichagar auf NZYCM-Medium enthaltende Agarpiatten plattiert: 10 g NZ-Amin A, 5,0 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4;. 7 H&sub2;O, 5 g Hefeextrakt, 1 g Casaminosäuren (pro Liter). Die Platten wurden Über Nacht inkubiert, 30 - 60 Minuten auf 4ºC gekühlt und die Plaques wurden auf Cellulosenitrat Überführt. Die Filter wurden mit polyklonalem Anti-PBOMP-1, wie oben in Abschnitt 6.1.4. beschrieben, sondiert. Mehrere positive Plaques wurden auf diese Art und Weise nachgewiesen. Jedoch wurden keine positiven Plaques nachgewiesen, wenn monoklonale PBOMP-1-Antikörper als Sonde eingesetzt wurden. Positive Plaques wurden von den Platten aufgenommen und durch Wachstum in E. coli KH802 vermehrt. Die Klone wurden durch SDS-PAGE- Gell Western-Blot-Analyse von Phagelysaten verifiziert. Alle positiven Klone exprimierten ein Protein, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16.000 Dalton, das mit den polyklonalen Antikörpern gegen PBOMP-1 reagierte. Dieses Protein war in Kontrollysaten von Charon 4-Phage nicht vorhanden. In ähnlichen Experimenten reagierten Lysate der positiven Klone nicht mit monoklonalen Antikörpern auf PBOMP-1.
- Ein positiver Phage, bezeichnet als lambda 16-3, wurde für weitere Analysen ausgewählt. Dieser isolierte Phage wurde durch Wachsen in E. coli KH802 in NZYCM-Brühe vermehrt, durch Auslällen mit 20%igem Polyethylenglykol 6000 wiedergewonnen und im CsCl-Gleichgewichtsgradienten in Banden aufgespalten (4 M CsCl in TMG, Beckmann 50.1-Rotor, bei 300.000 x g für 24 Stunden). Die Phagen-DNA wurde durch Behandlung mit 0,1% SDS und 20 µg/ml Proteinase K (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) bei 55ºC für 1 Stunde, gefolgt von Extraktion mit Phenol und Ethanolfällung, isoliert.
- Die lambda 16-3-DNA wurde mit EcoRI verdaut und eine partielle physikalische Karte des chromosomalen Hi-Inserts wurde erhalten. Die EcoRI-Fragmente des Inserts wurden isoliert und in dem Plasmidvektor pGD103 subkloniert. Klone, die das PBOMP-1-kreuzreaktive Protein mit 16.000 Dalton exprimierende Fragmente tragen, wurden durch Western-Blot-Transfer-Analyse von Zellysaten identifiziert. Einer von diesen wurde als pAA130 bezeichnet. Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte dieses Plasmids mit einem 5.7 Kb-Fragment von Hi-DNA, kloniert in das pGD103-Plasmid.
- Monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1 reagierten nicht mit dem 16.000 Dalton Protein, das von pAA 130 exprimiert wurde (Daten sind nicht gezeigt). Das durch dieses rekombinante Plasmid exprimierte Protein wurde jedoch von polyklonalen Anti-PBOMP-1-Antiseren erkannt (siehe Fig. 3 zum Beispiel).
- Die Analyse von pAA130 tragenden Minizellen (Achtmann et al., siehe oben) gab an, daß die klonierte Hib-DNA Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 16.000 bis 17.000 Dalton kodiert. Das markierte 16.000 Dalton Protein wurde durch polyklonales Anti-PBOMP-1 spezifisch immunogefällt (Daten nicht gezeigt). Somit steuert das Plasmid pAA130 die Expression eines PBOMPs mit Molekulargewicht von 16.000 Dalton.
- Eine durch Exzision von zwischen der einzigen PstI-Stelle des lnserts und dem einzelnen PstI im Polylinker insertierten DNA erzeugte interne Deletion beeinflußte die Expression des kreuzreagierenden Proteins nicht. Das XbaI-Fragment dieses Piasmids wurde durch ein ähnliches Verfahren deletiert und Expression des PBOMP-kreuzreagierenden Proteins wurde beibehalten (Fig 2.). Ein zusätzlicher Deletionsabkömmling dieses Plasmids wurde durch erneute Ligation der beiden internen Bglll-Stellen erzeugt und dieser Abkömmling behielt ebenfalls die Expression des PBOMP-kreuzreaktiven Proteins bei.
- Das 781-Basenpaar BstEII-XmnI-Fragment wurde durch Isolierung des Fragments aus einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt, durch Auffüllen am BstEII-Ende mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und Klonierung des Fragments an der HincII-Stelle von pGD103 kloniert. Die Western Blot Analyse unter Verwendung polyklonalen Anti-PBOMP-1 zeigte, daß dieses Plasmid die Expression des 16.000 Dalton PBOMPs beibehielt. Wie mit pAA130 reagierte das aus diesem Plasmid hergestellte PBOMP nicht mit monoklonalen Antikörpern gegen PBOMP-1.
- Als ein unabhängiges Verfahren zur Verifizierung der Lage dieses PBOMP-Gens wurde das große EcoRI- PvuII-Fragment von pAA130 mit dem EcoRI-PvuII-Fragment von pLG339 ligiert, um ein neues tetracyclinresistentes, als pAA136 bezeichnetes Plasmid zu erzeugen. Dieses Plasmid exprimiert das PBOMP, wie durch Western Blots verifiziert wurde. Dieses Plasmid wurde in einen E. coli-Stamm transformiert, bei dem das chromosomale alkalische Phosphatasegen (phoA) entfernt wurde, und der das transponible Element Tnphoa trug. Drei unabhängige Transpositionen des TnPhoA-Elements in pAA136, welche die alkalische Phosphataseaktivität wieder herstellten, wurden isoliert. Die Stellen der TnPhoA-Insertionen in pAA136 wurden unter Verwendung der einzigen Dral-Restriktionstelle nahe der linken Endregion von Tnphoa und der HindIII-, BstEII-, XmnI- und PstI-Stellen von pAA136 bestimmt. Von allen drei Inserts wurde festgestellt, daß sie im BstEII-XmnI-Fragment von pAA136 lagen. Alle drei TnphoA-Inserts waren in derselben Orientierung, die angibt, daß die Transkription des PBOMP-Gens von der BstEII-Stelle in Richtung der XmnI-Stelle in pAA136 gerichtet ist. Alle drei TnPhoA-Transpositionen resultierten im Fehlen des 16.000er Proteins, was durch polyklonales Anti-PBOMP-1-Antiserum, genauso wie durch Western Blot nachgewiesen wurde. Eine Fusion erzeugte eine neue Bande in den Western Blots bei 60.000 Dalton, die durch polyklonales Anti-PBOMP-1-Antiserum nachgewiesen wurde. Diese Größe liegt innerhalb des vorhergesagten Bereichs der Fusionsproteine, die durch Fusion alkalischer Phosphatase (45.000 Dalton MW) mit einem 16.000 Dalton MW-Protein erzeugt werden könnten. Die Wiederherstellung der Phoa-Aktivität in diesen Transpositionen bestätigt, daß das PBOMP-Protein ein Peptidsignal für den Membrantransport enthält und daher möglicherweise ein Membranprotein ist.
- Die TnPho-Fusionen wurden durch Subklonierung der Vereinigung zwischen TnPhoA und den Hi-klonierten DNA-Sequenzen in M13 abgeschieden. In allen Fällen wurde von den PhoA-kodierenden Sequenzen festgestellt, daß sie im Rahmen des vorhergesagten offenen Leserasters für das PBOMP-2-Gen von pAA130 liegen (siehe Abschnitt 6.4.1. unten).
- Die Nucleotidsequenz des PBOMP-Gens von pAA130 wurde durch die Didesoxynucleotidsequenzierung (Sanger et al., siehe oben) des 789 Basenpaar BstEII-XmnI-Fragments von pAA130 nach Subklonierung in M13 mp18 und mp19-Phage bestimmt. Diese rekombinanten Phagen wurden jeweils als M18001 und M19001 bezeichnet. Der Universal-17-Base-Oligonucleodtid-Seuqenzierungs-Primer (New England Biolabs) wurde eingesetzt, um die Sequenz von beiden Enden des BstEII-XmnI-Fragments zu bestimmen (siehe Fig. 4). Zwei zusätzliche Oligonucleotide wurden synthetisiert und als Primer für die Didesoxynucleotidsequenzierung eingesetzt (M18PR1, M19PR2). Alle anderen Sequenzierungsprimer wurden bei Praxis Biologics, Rochester, N.Y., auf einem Applied Biosystems 380 B DNA-Synthesizer hergestellt. Die Primer wurden auf einer 1 µMol Säule mit Glas mit kontrollierten Poren mit beta-Cyanethylphosphat-Schutzgruppen-Chemie hergestellt. Die Ausbeute an Oligonucleotid war genügend rein, um die Verwendung der Primer direkt von der Säule ohne weitere Reinigung zu ermöglichen. Die beiden synthetischen Oligonucleotidprimer binden an Sequenzen, die ungefähr 200 Nucleotide von jedem Ende des Fragments, wie in Fig. 4 gezeigt, entfernt sind. Die gesamte 789 bp DNA-Sequenz des BstEII-XmnI-Fragments von pAA130 ist in Fig. 5 gezeigt. Das ORF ist, wie in Fig. 6 gezeigt, unterstrichen. Derartiges ORF kodiert ein Polypeptid mit 154 Aminosäuren. Das N-terminale-18-Reste-Peptid ähnelt einer für andere Proteine bestimmten Membrantransportsignalsequenz (Watson, 1984, siehe oben). Zusätzlich zeigten Sequenzdaten der TnPhoA-Fusionen in pAA130, daß alle drei Transpositionen im Leseraster des 154-Aminosäurepolypeptids liegen.
- Die Aminosäurezusammensetzung des vorgeschlagenen reifen Genproduktes, wie aus der DNA-Sequenz des ORF von pAA130 abgeleitet, ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Abgeleitete Aminosäurezusammensetzungen des reifen PBOMP-2
- a Das Molekulargewicht des reifen PBOMP-2 war 13.461. Die Zahl der Aminosäuregruppen war 136.
- Zusätzlich, obwohl das durch dieses Gen kodierte Produkt durch polyklonale Anti-PBOMP-1-Antiseren erkannt wird, wird es durch monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1 nicht erkannt. Aus diesen Beobachtungen ist ersichtlich, daß das durch pAA130 exprimierte Hi-Gen nicht das Gen für PBOMP-1 ist. Somit wurde das durch pAA130 kodierte PBOMP-Gen mit PBOMP-2 bezeichnet.
- Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob durch rekombinante E. coli exprimierte PBOMPs auch als Lipoproteine existieren. Zwei verschiedene in vivo-Verfahren wurden verwendet, um die Lipoproteinnatur der exprimierten PBOMPs zu verifizieren.
- In einer Reihe an Experimenten wurden Zellen, die PBOMPs exprimierende rekombinante Plasmide enthalten, in Gegenwart einer radioaktiv markierten Fettsäure kultiviert. Unter derartigen Bedingungen wird jedes die kovalent gebundene Fettsäure enthaltende gebildete Lipoprotein spezifisch radiomarkiert.
- Man ließ E. coli JM83-Zellen, die das PBOMP-2 exprimierende Plasmid pAA130 enthalten, für 2 Stunden in M9 Minimalmedium, das 50 µCi/ml ¹&sup4;C-Palmitinsäure enthält, wachsen. Die gesamten Zellysate (10.000 mit Trichloressigsäure ausfällbare cpm/Spur) wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen bei 35 mA konstantem Strom der Elektrophorese unterworfen. Die Gele wurden mit Natriumsalicylat (5 x Gelvolumen x 1 M Lösung für 20 Minuten) imprägniert, getrocknet und bei -70ºC auf einem XAR-5-Film (Eastman Kodak Company, Rochester, N.Y.) belichtet. Die gesamten Zellysate gleichzeitig kultivierter normaler E. coli JM83-Zellen ließ man als Kontrolle laufen. Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 7 dargestellt.
- Wie in Fig. 7 gezeigt, wurde ein radiomarkiertes Protein von ungefähr 15.000 Dalton in den Lysaten von pAA130 enthaltenden E. coli beobachtet, das in den Lysaten der Kontroll-E. coli-Zellen nicht beobachtet wurde. Somit wurde das durch den rekombinanten E. coli exprimierte PBOMP-2 spezifisch radiomarkiert.
- In einer anderen Reihe von Experimenten wurden PBOMPs exprimierende rekombinante Plasmide enthaltende Zellen in Gegenwart von Globomycin, einem Antibiotikum, das dafür bekannt ist, spezifisch die Verarbeitung aller bekannten bakteriellen Lipoproteine durch Inhibierung der Lipoproteinsignalpeptidase zu blockieren (Inukai et al., 1978, J. Antibiotics (Tokyo) 31:1203-1205) kultiviert.
- pAA130 enthaltende E. coli JM83-Zellen wurden in Gegenwart von 25 µg/ml Globomycin (erhalten von Dr. M. Inouye, Robert Woods Johnson Medical Dental School, Piscataway, N. J.) für 1 Stunde kultiviert. Ähnliche nicht mit Globomycin behandelte Kulturen dienten als Kontrolle. Die gesamten Zellysate wurden auf 15%igen SDS-PAGE-Gelen einer Elektrophorese unterzogen, auf Cellulosenitrat Überführt und mit polyklonalen Anti-PBOMP -1-Antiseren sondiert. Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 8 dargestellt.
- Wie in Fig. 8 gezeigt, wurde in Lysaten von Globomycin behandelten PBOMP-2 exprimierenden Zellen, eine Bande mit ungeflihr 16.500 Dalton beobachtet, die in Lysaten von Kontrollzellen oder unbehandelten Zellen nicht nachgewiesen wurde.
- Basierend auf den in beiden Reihen der in vivo-Experimente erhaltenen Resultate sind die durch PBOMP- Gene enthaltenden rekombinanten E. coii exprimierten PBOMP-2-Proteine Lipoproteine.
- PBOMP-2 wird ebenfalls auf niedrigem Niveau (weniger als 1% des Zeliproteins) von Plasmid pAA130 exprimiert. Die Expression von PBOMP-2 ist offenbar unter Kontrolle seines nativen Promotors.
- Um die Ausbeute an PBOMP-2 zu verbessern wurde das PBOMP-2-Gen in pAA130 an der einzelnen SspI- Restriktionsstelle 5 Basen 5' zum PBOMP-2-Initiationskodon gespalten und mit der SmaI-Stelle von pUC19 (Fig 9) ligiert. Die Ligation ergibt im einem offenen Hybridleseraster (ORF), das das gesamte PBOMP-2-ORF enthält (einschließlich der Signalsequenz), plus 18 Kodons von pUC19 und 2 Kodons von der Genfusionsstelle. Das Protein in dieser Genfusion besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 17.999 Dalton und wird unter Regulierung des lac-Promotors exprimiert. Dieses Plasmid wird als pPX163 bezeichnet.
- Wenn das Plasmid pPX163 in E. coli JM103 transformiert und mit IPTG induziert wurde, wurde ein Protein mit einem Molekulargewicht von 17.500 Dalton exprimiert. Zusätzlich wurde ein Proteindoublett bei einem Molekulargewicht von 15.000 Dalton beobachtet. Alle drei Proteine wurden durch Anti-PBOMP-1-Antiseren beim Western Blot erkannt (Fig. 10). Durch Coomassie-Blaufärbung von SDS-PAGE umfassen die drei Formen rekombinanten PBOMP-2 ungefähr 15% des gesamten Zellproteins nach der lac-Induktion (Fig. 10, Durchgang 3). Die drei Formen aus pPX163 exprimierten rekombinanten PBOMP-2 wurden isoliert und N-terminale Peptidanalyse zeigt, daß: 1. Die 17.500 Dalton MW-Bande das vorausgesagte pUC19/PBOMP-2-Hybridprotein ist;
- 2. Die größere der 15.000 Dalton MW-Bande bei der ersten Methionin-Gruppe der PBOMP-2-Signalsequenz (d.h. des Initiationskodons des PBOMP-2-ORF) beginnt und anscheinend für die Reinitiation der Translation an diesem Punkt verantwortlich ist; und
- 3. Die niedrigere 15.000 Dalton MW-Bande für die terminale Analyse blockiert ist und mit ¹&sup4;C-Palmitat markiert werden kann. Diese Bande besteht daher aus PBOMP-2-verarbeitetem Lipoprotein.
- Die nachfolgenden, die aufgelisteten Plasmide tragenden E. coli-Stämme wurden bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt und ihnen wurden die nachfolgenden Zugangsnummern zugeordnet:
- Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Umfang durch die hinterlegten Mikroorganismen nicht beschränkt, da die Hinterlegung als eine Veranschaulichung eines Aspekts der Erfindung gedacht ist und viele Mikroorganismen, die funktionell äquivalent sind, innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen. In der Tat sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen dem Fachmann im Stand der Technik aus der vorangehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren offensichtlich. Derartige Modifikationen sollen im Schutzbereich der beigefligten Ansprüche liegen.
- Es ist ebenfalls verständlich, daß alle für die Nudeotide angegebenen Basenpaargrößen Näherungen sind, und zum Zwecke der Beschreibung verwendet werden.
Claims (21)
1. Ein im wesentlichen reines antigenes Peptid oder Protein mit Verbindung zu einem Epitop von
Haemophilus influenzae, das ein äußeres Membranprotein, in dem das äußere Membranprotein ein äußeres
Membranprotein mit ungefährem Molekulargewicht von 16 000 Dalton mit einer Aminosäuresequenz, die im
wesentlichen die Aminosäuresequenz wie in Fig. 6 dargestellt aufweist oder irgendeinen antigenen Abschnitt
hiervon umfaßt.
2. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz wie
in Fig. 6 dargestellt von der Aminosäuregruppe 19 bis 154, oder irgendeinen antigenen Abschnitt hiervon
umfaßt.
3. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 oder 2, in dem das Peptid oder Protein aus einer Zellkultur
aufgereinigt wurde, die eine das Peptid oder Protein codierende Nucleotidsequenz enthält, die unter Kontrolle
einer zweiten Nucleotidsequenz steht, das die Genexpression reguliert, so daß das Peptid oder Protein durch
die Zellkultur aufgebaut wird.
4. Peptid oder Protein nach Anspruch 3, in dem die Zellkultur ein Mikroorganismus ist.
5. Peptid oder Protein nach Anspruch 4, in dem der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
6. Peptid oder Protein nach Anspruch 4, in dem der Mikroorganismus ein Hefepilz ist.
7. Peptid oder Protein nach Anspruch 3, in dem die Zellkultur eine tierische Zellinie ist.
8. Peptid oder Protein nach Anspruch 3, in dem die Zellkultur eine Insekten-Zellinie ist.
9. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 oder 2, in dem das Peptid oder Protein chemisch synthetisiert
wurde.
10. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 oder 2, in dem das Peptid oder Protein aus einer Zellkultur von
Haemophilius influenzae durch ein Verfahren erhalten wurde, das die Schritte aufweist:
(a) Isolierung von mit äußerem Membranprotein angereichertem unlöslichem
Zellwandanteil physikalisch zerstörter Zellen von Haemophilius influenzae; und
(b) Erhalten des Peptids oder Proteins in löslicher Form aus dem unlöslichen
Zellwandanteil entweder durch: (i) Erhitzen des Anteils in Gegenwart eines Detergens, das für die
Verabreichung an einen Menschen geeignet ist, oder (ii) Digerieren des Anteils mit Lysozym entweder in
Gegenwart oder Abwesenheit des Detergens.
11. Peptid oder Protein mit einem oder mehreren antigenen Determinanten eines äußeren
Membranproteins von Haemophilius influenzae, hergestellt durch ein Escherichia coli Bakterium, hinterlegt bei der
NRRL mit der zugeordneten Zugangs-Nr. B-18154, sowie rekombinante und gentechnische Derivate hiervon.
12. Formulierung einer Vakzine-Untereinheit, in der das Immungen eine wirksame Menge des Peptids
oder Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 gemischt mit einem pharmazeutischen Träger umfaßt.
13. Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz-Codierung für ein antigenes Terminant eines äußeren
Membranproteins von Haemophilius influenzae umfaßt, in dem das äußere Membranprotein eine
Aminosäuresequenz im wesentlichen wie in Fig. 6 dargestellt besitzt oder irgendein Abschnitt hiervon, der mindestens
sieben benachbarte Aminosäuren umfaßt, wobei die Aminosäuresequenz eine oder mehr antigene
Determinanten des äußeren Membranproteins von Haemophilius influenzae enthält.
14. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 13, in dem die DNA-Sequenz sich unter Kontrolle von
Expressionssteuerelementen befindet.
15. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 13 oder 14, in dem der Vektor pAA130 wie in Figur 2 oder
pPX163 wie in Figur 9 dargestellt ist, sowie rekombinante oder gentechnische Derivate hiervon.
16. Einzelliger Organismus, der den rekombinanten Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15
enthält.
17. Bakterium, das den rekombinanten Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 16 enthält.
18. Bakterium nach Anspruch 17, das ein Escherichia coli Bakterium, hinterlegt bei der NRRL mit den
31 zugeordneten Zugangs-Nr. B-18154, Nr. B-18285, sowie rekombinante und gentechnische Derivate hiervon
umfaßt.
19. Verfahren zur Detektion von Haemophilius influenzae in einer Gewebs- oder
Körperflüssigkeitsprobe, das aufweist: Verwendung des Peptids oder Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 als ein
Antigen in einem Assay-System, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzymimmuntest
(enzymelinked immunosorbent assay), einem Radioimmunoassay, einem Geldiffusionspräzipitin-Reaktionsassay, einem
Immunodiffiisionsassay, einem Agglutinationsassay, einem Fluoreszenz-Immunoassay, einem Protein A
Immunoassay und einem Immunoelektrophoreseassay; und Detektion jeder Reaktion mit dem Antigen, wobei
jede Reaktion die Gegenwart von Haemophilius influenzae in der Probe anzeigt.
20. Verfahren zur Detektion von Haemophilius influenzae in einer Gewebs- oder
Körperflüssigkeitsprobe, das aufweist: Verwendung einer ein Peptid oder Protein codierenden Nucleotidsequenz eines Gens, das
mit Verbindung zu einem äußeren Membranprotein von Haemophilius influenzae wie in Fig. 6 dargestellt
oder einem Fragment hiervon als Sonde in einem Nucleinsäurehybridisierungstest und Detektion jeder
Reaktion mit der Sonde, in der jede Reaktion die Gegenwart von Haemophilius influenzae in der Probe
anzeigt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, in dem der Nucleinsäurehybridisierungstest ausgewählt ist aus der
Gruppe, bestehend aus Southern-Blots, Northern-Blots und Kolonie-Blots.
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