DE3751389T2

DE3751389T2 - Verfahren zur Trennung von Proteinen.

Info

Publication number: DE3751389T2
Application number: DE3751389T
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof Dr Vukovich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-03-27
Filing date: 1987-03-26
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2007-03-27
Also published as: AU596159B2; ATE124703T1; CA1327674C; EP0239565A2; EP0239565B1; JP2511449B2; DE3751389D1; ATA82786A; EP0239565A3; US5112949A; AU7067287A; JPS62246593A; AT399095B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von Proteinen aus humanem Plasma, aus Überständen von humanem Plasma Kryoproteinen oder Zellkulturen, bei dem die Proteine an Ionenaustauscher Gel adsorbiert werden.
Bekannt ist, daß bei Zugabe von Gelen, die an ihrer Oberfläche geladen Gruppen tragen, zu Blutplasma eine Vielzahl von Plasmaproteinen an das Gel adsorbiert werden. Welche Proteine an diese Gele gebunden werden, ist abhängig von der funktionellen Gruppe am Gel, ob diese positiv oder negativ geladen ist und daher Anionen oder Kationen angelagert werden, von der Dissoziationskonstante der geladenen Gruppe, und weiters von den Bedingungen, bei denen das Gel mit dem Bluplasma gemischt wird, wobei vor allem die Ionenstärke, die Art der gelösten Ionen und die Temperatur bedeutsam sind.
Wenn dem Blutplasma Gele zugesetzt werden, die als funktionelle Gruppe eine anionenaustauschende Wirkung haben wie zB DEAE-Gele, werden bekannterweise Plasmaproteine an das Gel gebunden, die als "Faktoren des Prothrombinkomplexes" bezeichnet werden. Das proteinbeladene Gel kann dann einfach vom Restplasma getrennt werden. Da die Bindungsfestigkeit der Plasmaproteine zu ionenaustauschenden Gelen mit steigender Ionenkonzentration in der umgebenden Lösung abnimmt, können mit Lösungen hoher Ionenstärke die Proteine von dem Gel desorbiert werden. In den Patenten DE-PS 2 715 832, DDR-Patent 148 297, DDR-Patent 141 262, Europ.Patent 0041173 sind Verfahren beschrieben, mit denen die Faktoren des Prothrombinkomplexes aus dem Blutplasma an DEAE-Gele adsorbiert und gemeinsam, daß heißt ohne Auftrennung in die einzelnen Komponenten des Prothrombinkomplexes, durch Waschen der Gele mit Lösungen hoher Ionenstärke desorbiert werden.
Es ist weiters bekannt, daß der Prothrombinkomplex verschiedene Proteine enthält, wie die Blutgerinnungsfaktoren F II, F VII, F IX, F X, als auch die Inhibitoren der Blutgerinnung wie Protein C und Protein S. Jede Komponente des Prothrombinkomplexes hat unterschiedliche biologische Wirkungen, die Wirkungen der Blutgerinnungsfaktoren sind sogar völlig gegensätzlich zu den Wirkungen der Inhibitoren der Blutgerinnung.
Die medizinische Literatur beschreibt genetische Erkrankungen, bei denen die betroffenen Patienten eine Komponente des Prothrombinkomplexes nicht synthetisieren können und daher dem Blutplasma des Patienten diese Komponente fehlt. Ein Mangel eines der Gerinnungsfaktoren, zb ein Mangel von Faktor IX bewirkt die Hämophilie B, während der Mangel einer der beiden Inhibitoren der Blutgerinnung Thrombosen bei den Patienten bewirkt. Für die Therapie dieser komplett unterschiedlicher Krankheiten wird derzeit ein und das selbe Plasmaderivat, nähmlich Prothrombinkomplex, für die Substitution des Mangelzustandes verwendet. Die gleichzeitige Zufuhr des fehlenden Gerinnungsfaktors mit Inhibitoren der Blutgerinnung könnte die Blutungsneigung bei Hämophilen erhöhen, bei Thrombosepatienten die gleichzeitige Zufuhr von Blutgerinnungsfaktoren mit den benötigten Inhibitoren das Thromboserisiko erhöhen.
Es ist sicherlich besser einen Patienten mit einem Mangel eines Gerinnungsfaktors mit einem Präparat zu behandeln, das nur den fehlenden Gerinnungsfaktor enthält und frei ist von Inhibitoren und einen Patienten mit einem Inhibitormangel mit einem Präparat zu behandeln, das nur den benötigten Inhibitor ohne Gerinnungsfaktoren enthält.
Ein Verfahren für die Auftrennung der Komponenten des Prothrombinkomplexes wurde von S.P. Bajaj und Mitarbeitern in der Zeitschrift Preparative Biochemistry 13, (3), 191-214, 1983 veröffentlicht. Dieses Verfahren umfaßt eine Reihe von Schriften: nach Sättigung des Plasmas mit Ammonsulfat auf 33% werden die präzipitierten Proteine entfernt und die verbliebene Lösung mit Ammonsulfat bis auf einen Sättigungsgrad von 66% oder 70% angereichert. Die dabei präzipitierten Proteine werden entfernt und in saliner Lösung aufgelöst. Barium Salz (BaCl oder BaSO4) wird zugegeben und die dabei präzipitierten Proteine entfernt und in saliner Lösung aufgelöst. Die Bariumsalz Präzipitation kann auch vor der Differenzialfällung mit Ammonsulfat durchgeführt werden. Danach werden die Proteine an eine DEAE-Gel Säule adsorbiert und mittels Gradientenelution mit einem Gradienten steigender Ionenstärke im Elutionspuffer fraktionell desorbiert. Nach dieser Gelchromatographie sind die Komponenten des Prothrombinkomplexes aber noch immer nicht volständig getrennt, so daß ein weiterer Schrift in Form einer präparativen Polyacrylamid-Elektrophorese vorgeschlagen wird.
Das oben beschriebene Farktionierungsverfahren ist nur geeignet, die Faktoren des Prothrombinkomplexes im Labormaßstab für biochemische in vitro Versuche oder für die Immunisierung von Tieren für die Produktion von Antiserum zu präparieren. Die Polyacrylamid-Elektrophorese kann nach dem Stand der Technik nur mit geringen Mengen Protein (unter 5.000 Plasma Einheiten von zB Faktor IX) durchgeführt werden. Die anderen Schritte dieses Verfahrens sind dermaßen langwierig, daß sie nur unter dem Schutz von Proteaseinhibitoren (zB Benzamidin) durchgeführt werden können, um den enzymatischen Abbau der Proteine während des langwierigen Verfahrens zu mindern. Diese Proteaseinhibitoren sind aber bekanntermaßen von so hoher Toxizität, daß deren Zugabe zu Proteinpreparationen für den Gebrauch an Menschen unmöglich ist. Weiters ist die Präzipitation mit Barium Salz unerwünscht, da auch dieses toxisch ist.
Die Gradientenelution von Proteinen, die an ein Anionenaustauschergel adsorbiert sind, mittels eines Puffers, der graduell in seiner Zusammensetzung geändert wird und die nachfolgende Fraktionierung des Eluates an einer einzigen Säule ist in "Ion Exchange Chromatography", Pharmacia Fine Chemicals (1983), Seiten 22, 47, 48 und 58-61 beschrieben.
Weiters beschreibt FR-A-2 210 396 die Reinigung von Proteinen durch Elution des gesamten Prothrombinasekomplexes, der alle Proteinfraktionen zusammen enthält, in der Abwesenheit von Protease Inhibitoren und Barium Salzen, in einem einzigen Schrift ohne Gradienten.
Von der Publikation "Dye-Ligand Chromatography" (C32) von Amicon ist die Anwendung sequentieller Farbstoff-Liganden Säulen mit unterschiedlichem chromatographischen Material bekannt, wobei eine Säule mit einem Salz Gradienten die nachfolgende mit NADP eluiert wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand dieser Erfindung ist ein verbessertes Verfahren für die Trennung von Proteinen, insbesondere des Prothrombinkomplexes, die an Ionenaustauschergelen adsorbiert sind unter Vermeidung der oben beschriebenen Nachteile. Dieser Gegenstand, sowiew weitere, die im folgenden offensichtlich werden, werden erzielt durch eine Gradientenelution der Proteine, die an ein Ionenaustauscher Gel in einer Chromatographiesäule adsorbiert sind mittels einer Pufferlösung als Elutionslösung, die durch zwei Parameter charakterisiert ist, wobei ein Parameter graduell geändert wird, während der andere im wesentlichen konstant gehalten wird, sodaß die Proteine graduell vom Gel desorbiert werden, wobei die Parameter die Ionenstärke und der pH Wert sind; unmittelbar nach Desorption der Proteine vom Ionenaustauschergel erfolgt eine weitere Reinigung der desorbierten Proteine durch Adsorption an proteinfreies und equilibriertes Gel vom vorzugsweise dem selben Ionenaustauscher Typ und nachfolgender Desorption der Proteine durch eine weitere Anderung der Pufferlösung mittels einer Fortsetzung der Änderung des oben gewählten variablen Parameters um ein Eluat mit verbesserter Trennung der unterschiedlichen Proteine zu erhalten; weiters Auftrennung der Eluate nach Fraktionen mit unterschiedlichen Proteinen.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet der Trennschrift die Auftrennung des Eluates in Fraktionen die voneinader getrennt Transferrin, Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S beinhalten.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung wird die Gradientenelution so durchgeführt, daß die Ionenstärke des Puffers in einem Bereich von 100 - 400 mval und 400 - 4.000 mval kontinuierlich geändert wird, wobei der pH Wert in einem Bereich von 5 bis 8 im wesentlich konstant gehalten wird.
Alternativ dazu kann der pH-Wert der Pufferlösung kontinuierlich in einem Bereich zwischen 3 und 9 geändert werden, wobei die Ionenstärke in einem Bereich von 100 bis 400 mval im wesentlichen konstant gehalten wird.
Die Verwendung eines Anionenaustauschergels, spezielle eines DEAE-Gels als Ionenaustauscher, wurde als besonder vorteilhaft gefunden.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet das Vefahren vor dem Schrift der genannten Gradientenelution eine Equilibrierung des Anionentauschergels, das mit den adsorbierten Proteinen beladen ist, mit einer Pufferlösung niedrigster Ionenstärke.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet das Vefahren vor dem Schritt der genannten Gradientenelution eine Equilibrierung des Anionentauschergels, das mit den adsorbierten Proteinen beladen ist, mit einer Pufferlösung mit höchstem pH Wert.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet der Schrift der Gradientenelution die Bildung des Elutionsgradienten durch Mischen eines ersten Puffers mit einer Ionenstärke von 100 bis 400 mval mit einem zweiten Puffer mit einer Ionenstärke von 400 bis 4.000 mval.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet der Schritt der Gradientenelution die Bildung des Elutionsgradienten durch Mischen eines ersten Puffers mit einm pH Wert von 6 bis 8 mit einem zweiten Puffer mit einem pH Wert von 5 bis 7.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhaltet der Schritt der Gradientenelution die Zugabe einer Schicht proteinfreien, equilibrierten Gels unter das proteinbeladene Gel.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung wird das Eluat, der Gradientenelution aus der ersten Chromatograpiesäule in einer zweiten Chromatograpiesäule, die mit der ersten verbunden ist und proteinfreies, equilibriertes Gel enthält weiter gereinigt.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung beinhalten der erste und der zweite Puffer Phosphat, Zitrat, NaCl und NaOH.
Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung gehen der Gradientenelution die folgenden Schrifte voran: Zugabe von Ionenaustauschergel zu einer Lösung, die Plasmaproteine enthält; rühren des Gels in der Lösung, um es in Suspension für die Adsorption der gewünschten Proteine zu halten; und Trennung des Gels mit den adsorbierten Proteinen vom restlichen Plasma.
Mit dieser Erfindung können Proteine, wie zum Bespiel die Faktoren des Prothrombinkomplexes und Transferrin im großtechnischen Maßstab ohne Verwendung toxischer Substanzen, wie Proteaseinhibitoren oder Barium Salze aufgetrennt werden. Daher sind die einzelnen Proteinfraktionen frei von toxischen Substanzen und besser als die Fraktionen, die nach der kleintechnischen Methode von S.P.Bajaj erhalten werden. Die Produkte, die nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt werden sind zur therapeutischen Anwendung geeignet und entsprechen den Anforderungen der Europäischen Pharmacopoeia.

BESCHREIBUNG EINER ANWENDUNG

Das folgende Beispiel soll daserfingungsgemäße Verfahren anhand der Trennung des Prothrombinkomplexes in seine Komponenten beschreiben. Dies stellt nur ein Beispiel dar und soll das Verfahren nicht auf diese Anwendung einschränken.

1. Adsorption von Plasmaproteinen an Ionenaustauscher Gel.

Ionenaustauschergel zum Beispiel DEAE Gel in trockener Form oder in wässriger Lösung gequollen wird zu Blutplasma oder einer Fraktion des Blutplasmas, wie Blutplasma nach Entfernung der Kryoproteine zugegeben. Das Gel wird in der Proteinlösung solange gerührt bis die gewünschten Proteinkomponenten weitgehend an das Gel adsorbiert sind. Transferrin und die Faktoren des Prothrombinkomplexes (F II, F VII, F IX, F X, Protein C und Protein S) werden auf diese Weise an das DEAE-Gel adsorbiert.
Dem Blutplasma, aus dem die Kryoproteine entfernt wurden, wird zu diesem Zweck bei einer Temperatur von 0-20 Grad C, vorzugsweise 0 Grad C, DEAE Gel, vorzugsweise DEAE Sephadex A50 in einer Menge von 0.2-10 Gramm pro Liter Plasma, vorzugsweise 0.5 Gramm pro Liter Plasma zugegeben. Das Gel wird in der Plasmalösung durch Rühren während 1/4-10 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden in Suspension gehalten. Anschließend wird das Gel vom verbleibenden Restplasma getrennt; dies kann durch Sedimentation des Gels im Schwerefeld der Erde oder durch Zentrifugieren und nachfolgendes Abheben des überstehenden Restplasmas erfolgen.

2. Gelchromatographische Trennung der an das Gel adsorbierten Proteine.

Für die genauere Beschreibung dieses Verfahrensschriftes ist auf die beiliegenden Abbildungen Bezug zu nehmen: Abbildung 1 stellt schematisch einen Apparat für die erfindungsgemäße Auftrennung eines Proteinkomplexes in seine Komponenten dar; und Abbildung 2 ist eine graphische Darstellung eines Chromatogramms.
Abbildung 1 zeigt schematisch einen Apparat für die erfindungsgemäße Auftrennung komplexer Proteine in ihre Komponenten, bestehend aus einer ersten Chromatographiesäule GS1, die über eine Pumpe P1 und ein Dreiwegventil V1 mit einem ersten Behälter verbunden ist, der eine Puffer Lösung PR1 enthält, die eine entsprechende Salzkonzentration und einen pH Wert hat, bei der die zu fraktionierenden Proteine am Gel adsorbiert bleiben, aber ungewünschte Proteine mit geringerer Affinität zum Gel ausgewaschen werden.
Über die Dreiwegventile V2 und V3 ist die Chromatographiesäule GS1 mit mit einer zweiten Chromatographiesäule GS2 verbunden, die auch über eine Pumpe P2 mit dem Behälter R1 verbunden ist. Das Dreiwegventil V4 verbindet die Säule GS2 mit einem Fraktionssammler FR. Weiters ist die Säule GS1 über das Ventil V1 mit einem zweiten Behälter verbunden, der zwei über eine Leitung VR miteinander kommunizierende Räume R2a und R2b hat. Der Raum R2a enthält eine Pufferlösung PR2, die gleich ist der Pufferlösung PR1 im Behälter R1 und einen Rührer M zum mischen der enthaltenen Lösung. Der Raum R2b enhält eine Pufferlösung PR3 mit höherer Elutionskraft als Pufferlösung PR2, mit einer Salz und Wasserstoffionen Konzentration, die ausreicht alle gewünschten Plasmaproteine vom Gel zu desorbieren.
Durch Verbindung der Räume R2a und R2b über die Leitung VR wird ein Gradient gebildet, bei dem die Ionenestärke der Pufferlösung PR2 durch Einleitung der Pufferlösung PR3 graduell ansteigt, wobei der pH Wert im wesentlichen konstant bleibt oder bei dem die Wasserstoffionen Konzentration graduell ansteigt, wobei die Ionenstärke im wesentlichen konstant bleibt. Im ersten Fall wird die Ionenstärke der Pufferlösung, die in die Säule GS1 eingeleitet wird graduell im Bereich von 100 bis 4.000 mval, vorzugsweise 100 und 400 mval geändert, wobei der pH Wert im wesentliche im Bereich von 5 bis 8 konstant gehalten wird. Im zweiten Fall wird der pH Wert kontinuierlich im Bereich von 3 bis 9 geändert, wobei die Ionenstärke konstant bei einer Konzentration im Bereich von 100 - 400 mval und 400 - 4.000 mval gehalten wird.
Je ein ultravioleft (UV) Messgerät UV1, UV2 ist am Auslaß der Säulen GS1, GS2 angebracht. Wie die Pfeile anzeigen senden die UV-Messgeräte UV1,UV2 ein Signal zu einer Kontrolleinrichtnng K, welches zum Beispiel abhängig ist von der UV-Adsorption der Proteine im Eluat der Säulen GS1, GS2 um das Ende des Equilibrierungs- und Waschschrittes in den Säulen GS1, GS2 und die Fraktionierung des Eluates anzuzeigen. In Abhängigkeit von den Informationen, die die UV-Messgeräte UV1, UV2 geben, steuert die Kontrolleinrichtung K die Ventile V1, V2, V3, V4, die Pumpen P1, P2 und den Rührer M, wie die gebrochenen Linien zeigen.
Der erfindungsgemäße Apparat in der dargestellten Art erlaubt die computergesteuerte Fraktionierung, der an das Gel adsorbierten Proteine und funktioniert wie folgt:
Das proteinbeladene Gel wird in Säule GS1 und proteinfreies Gel in Säule GS2 gefüllt. Beide Säulen GS1, GS2 werden verschlossen. Über die Ventile V1, V3 werden die Säulen GS1, GS2 mit Puffer Lösung PR1 aus dem Behälter R1 eluiert. In Säule GS1 werden ungewünschte Proteine vom Gel ausgewaschen, während Säule GS2 mit der Puffer Lösung PR1 equilibriert wird. Um eine ausreichende Waschung von Säule GS1 und Equilibrierung von Säule GS2 zu erzielen, wird das dreifache Volumen des Säulenvolumens an Puffer benötigt.
Sobald alle Proteine ausgewaschen sind, die bei der gewählten Zusammensetzung von Puffer PR1 keine Affinität zum Gel haben, sinkt die UV-Extinction des Eluates ab und das UV- Messgerät UV1 überträgt ein entsprechendes Signal zur Steuereinrichtung K, die den Waschvorgang beendet. Zugleich steuert die Kontrolleinrichtung K die Ventile V1, V2, V3 so, daß die Säule GS1 mit Pufferlösung PR2 aus dem Raum R2a des Behälters R2 versorgt wird und das Eluat von Säule GS1 in Säule GS2 eingeleitet wird, die zugleich über Ventil V3 vom Behälter PR1 abgekoppelt wird. Gleichzeitig mit der offenen Verbindung von Säule GS1 mit dem Raum R2a des Behälters R2, wird der Rührer M gestartet und Pufferlösung PR3 über die Leitung VR mit einer Pumpe (nicht dargestellt) vom Raum R2b in Raum R2a gepumpt, wobei Pumpe P2 abgeschalten wird. Durch die Verbindung von R2a mit R2b im Behälter R2 wird ein Gradient gebildet durch den die verschiedenen Proteine, die in Säule GS1 am Gel adsorbiert sind in Abhängigkeit ihrer Affinität zum Gel eluiert werden. In Säule GS2, deren Gel freie funktionelle Gruppen trägt werden die Proteine wieder für eine kurze Zeit adsorbiert. Mit weiterem Anstieg des Gradienten werden die Proteine wieder desorbiert, wobei eine deutliche Steigerung der Trennschärfe der Chromatographie erreicht wird.
Sobald die UV-Extinktion im Eluat von Säule GS2 ansteigt wird über das Ventil V4 das Eluat in den Fraktionssammler FR geleitet. Der Fraktionssammler FR kann die Fraktionen nach konstantem Volumen oder nach den Extinktionsgipfeln bilden.
Es wird festgehalten, daß die Verwendung zweier Säulen nicht unbedingt nötig ist; das erfindungsgemäße Verfahren kann auch an einer einzigen Säule durchgeführt werden. Darüber hinaus kann das beschriebene Verfahren auch dahingegen modifiziert werden, daß in der Chromatographiesäule eine Schichte, bestehend aus unbeladenen, equilibrierten Gels unter dem proteinbeladenen Gel eingebracht wird.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren und die Apparatur an Hand eines Beispiels beschrieben, das die Auftrennung von Transferrin und Faktoren des Prothrombinkomplexes durch Chromatographie an DEAE-Gel zeigt. Dieses Beispiel dient nur der Illustration und soll das Verfahren nicht auf diese Anwendung einschränken.
Säule GS1 wird mit proteinbeladenem DEAE Gel, und Säule GS2 mit dem selben Volumen wie Säule GS1 mit DEAE Gel (vorzugsweise DEAE-Sephadex A 50) gefüllt. Das Gel ist in Puffer PR1 gequollen, der vorzugsweise aus 0.02 mol Phosphat, 0.01 mol Zitrat und 0.15 mol NaCl in Wasser, bei einem, mit NaOH eingestellten, pH Wert von 6 bei 20 Grad C besteht. Die Säulen GS1, GS2 werden getrennt mit Puffer PR1 gewaschen, vorzugsweise mit 3 Liter Puffer pro Liter Säuleninhalt. Nachdem die Säulen GS1 und GS2 sequentiell verbunden wurden, wird die Gradientenelution durch Einleitung von Puffer PR3 aus dem Raum R2b in den Raum R2a gestartet. Das Volumen von Puffer PR3 in dem Raum R2b soll vorzugsweise gleich groß wie das von Puffer PR2 im Raum R2a sein. Pufferlösung PR3 besteht vorzugsweise aus 0.02 mol Phosphat, 0.01 mol Zitrat, 0.5 mol NaCl in Wasser und ist mit NaOH bei 20 Grad C auf pH 6 eingestellt.
Sobald das UV Messgerät UV2, das sich am Ausfluß von Säule GS2 befindet, einen Anstieg der UV Extinktion registriert, werden die Fraktionen gesammelt. Wenn das Gesamtvolumen in den Räumen R2a, R2b im Behälter R2 20 Liter ist werden vorzugsweise 1/2 Liter pro Fraktion gesammelt = 40 Fraktionen. Von jeder Fraktion wird eine Probe zur Analyse gezogen. Die Proben werden auf den Gehalt an Protein, Faktoren II,VII,IX,X sowie Protein C und Protein S nach den unten angeführten Methoden getestet.
Abbildung 2 zeigt ein typisches Elutionsdiagramm bestehend aus Transferrin und den Komponenten des Prothrombinkomplexes. Wenn eine Proteinkomponente in einigen benachbarten Fraktionen eluiert wurde, werden diese Fraktionen zusammengefaßt und nach bekannten Methoden wie Dialyse, Hitzebehandlung zur Virusinaktivierung, "bulk" Lyophilisierung, Auflösung in Wasser, Einstellung des Salzgehaltes und pH Wertes, Sterilfiltration, Verfüllung in Flaschen, Lyophilisierung des Endproduktes weiterbehandelt.
Die Reihenfolge der Elution kann bei unterschiedlichen Bedingungen des Ausgangsmaterials und der Methodenparameter verändert werden. Das Verfahren ist besonder für die Isolierung von Protein C und Protein S geeignet.
Im folgenden werden die Methoden zur Bestimmung von Transferrin, Faktor II, VII, IX und X, Protein C und Protein S angeführt.

A) Transferrin:

Bestimmung mittels der Elektroimmunodiffusionsmethode nach Laurell unter Verwendung eines Antiserums, das spezifisch für humanes Transferrin ist.

B) Faktor II:

Bestimmung mittels der Elektroimmunodiffusionsmethode nach Laurell unter Verwendung eines Antiserums, das spezifisch für humanen Faktor II ist. Funktionelle Bestimmung mit der Thromboplastin Zeit (Zeit für die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin) unter Verwendung eines Faktor II Mangelplasmas.

C) Faktor VII:

Funktionelle Bestimmung mit der Thromboplastin Zeit unter Verwendung eines Faktor VII Mangelplasmas.

D) Faktor IX:

Bestimmung mittels der Elektroimmunodiffusionsmethode nach Laurell unter Verwendung eines Antiserums, das spezifisch für humanen Faktor IX ist. Funktionelle Bestimmung mit der aktivierten partiellen Thromboplastin Zeit unter Verwendung eines Faktor IX Mangelplasmas.

E) Faktor X:

Funktionelle Bestimmung mit der Thromboplastin Zeit unter Verwendung eines Faktor X Mangelplasmas.

F) Protein C:

Bestimmung mit einer Enzymimmunologischen Methode mit einem komerziellen Test, der unter der Bezeichnung "ELISA Protein C" erhältlich ist.
Funktionelle Bestimmung nach der Methode, die in der Wiener Klinischen Wochenschrift 97,9,1985,445 von Th.Vukovich beschrieben ist, oder mit einem Test, der bei Behring Diagnostika käuflich ist. Die letztere Methode ist vorzugsweise für die Qualitätskontrolle des Endproduktes zu verwenden.
Eine beispielhafte Methode für die Auffindung der Fraktion Protein C ist folgende:
eine Probe des Eluates wird mit insolublem Thrombin inkubiert, das danach durch Zentrifugation entfernt wird, und dar Überstand mit in einem 1 + 1 Verhältnis mit Standard Plasma gemischt. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit dieser Mischung wird im Vergleich zu einer Kontrollpräparation bestehend aus Standardplasma und Puffer bestimmt. Der Gehalt an Protein C in der Probe wird durch eine Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit gegenüber der Kontrollpräparation angezeigt, während eine Verkürzung die Anwesenheit von Gerinnungsfaktoren in der Probe anzeigt.

G) Protein S

Funktionelle Bestimmung über die Bestimmung der Verstärkung des Hemmefektes von Thrombin-Sepharose aktiviertem Protein C auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit von Protein S Mangelplasma.

Indikation der mit dem Verfahren trennbaren Proteinfraktionen.

1. Fraktion Transferrin:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Transferrin, bei Eisenmangel-Anämie, bei bakteriellen Infekten, bei malignen Neoplasien.

2. Fraktion Faktor II:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Faktor II, Anwendung zusammen mit Fibrinogen als "Fibrinkleber" bei der Wundbehandlung.

3. Fraktion Faktor VII:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Faktor VII, Anwendung bei der Hämophilie A und Hämophilie B.

4. Fraktion Faktor IX:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Faktor IX, Anwendung bei Hämophilie A und Hämophilie B.

5. Fraktion Faktor X:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Faktor X, Anwendung bei Hämophilie A und Hämophilie B.

6. Fraktion Protein C:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Protein C, bei peripheren und zentralen Gefäßkrankheiten, Venenerktankungen, Thromboembolie, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, für die Thromboseprophylaxe und Therapie der Markoumarinduzierten Hautnekrose, bei "respiratory distress syndrom", Protein S Mangel, Chemotherapie.

7. Fraktion Protein S:

Anwendung bei angeborenem oder erworbenen Mangel an Protein S, Mangel an Protein C, alle Applikationen, die unter Punkt 6 angeführt sind.

8. Kombinierte Fraktion aus Protein C und Protein S:

Alle Applikationen, die unter Punkt 6 und 7 angeführt sind.

Charakteristische Zusammensetzung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren getrennten Proteinfraktionen (Reinheitskriterien)

1. Fraktion Transferrin:

Mehr als 90% des enthaltenen Protein ist Transferrin, keine Isohämagglutinine Anti-A, Anti- B nachweisbar. Weniger als 10 Plasmaeinheiten Faktor II,VII,IX,X, Protein C und Protein S pro Gramm Transferrin.

2. Fraktion Faktor VII:

Keine Isoagglutinine Anti-A, Anti-B nachweisbar. Weniger als 0.2 Plasmaeinheiten Faktor II,IX,X, Protein C und Protein S pro Plasmaeinheit Faktor VII.

3. Fraktion Protein S:

In einer Konzentration von 50 Plasmaeinheiten Protein S pro ml Lösung: keine Agglutination mit Erytrozyten der Blutgruppe A oder B sichtbar nachweisbar; weniger als 10 Plasmaeinheiten Faktor II,VII,IX,X enthalten, mittels nicht aktivierter partieller Thromboplastinzeit keine aktivierten Gerinnungsfaktoren nachweisbar, nach Inkubation mit Thrombin-Sepharose (40 NIH-Einheiten pro ml für 2 Stunden bei 37 Grad C) und Entfernung der Thrombin-Sepharose in einer Mischung mit Normalplasma (1+1 Teile) keine Verkürzung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit feststellbar, weniger als 10 mg Protein enthalten.

4. Fraktion Protein C:

In einer Konzentration von 50 Plasmaeinheiten Protein C pro ml Lösung: keine Agglutination mit Erytrozyten der Blutgruppe A oder 13 sichtbar nachweisbar; weniger als 10 Plasmaeinheiten Faktor II,VII,IX,X enthalten, mittels nicht aktivierter partieller Thromboplastinzeit keine aktivierten Gerinnungsfaktoren nachweisbar, nach Inkubation mit Thrombin-Sepharose (40 NIH-Einheiten pro ml für 2 Stunden bei 37 Grad C) und Entfernung der Thrombin- Sepharose in einer Mischung mit Normalplasma (1+1 Teile) keine Verkürzung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, sondern Verlängerung dieser Zeit feststellbar, weniger als 10 mg Protein enthalten.

5. Fraktion Faktor IX:

In einer Konzentration von 50 Plasmaeinheiten Faktor IX pro ml Lösung: keine Agglutination mit Erytrozyten der Blutgruppe A oder B sichtbar nachweisbar; weniger als 10 Plasmaeinheiten Protein C und Protein S enthalten, mittels nicht aktivierter partieller Thromboplastinzeit keine aktivierten Gerinnungsfaktoren nachweisbar (ohne Zugabe von Heparin und/oder Antithrombin III), weniger als 10 mg Protein enthalten.

6. Fraktion Faktor II:

In einer Konzentration von 50 Plasmaeinheiten Faktor II pro ml Lösung: keine Agglutination mit Erytrozyten der Blutgruppe A oder B sichtbar nachweisbar; weniger als 10 Plasmaeinheiten Protein C und Protein S enthalten.

7. Fraktion Faktor X:

In einer Konzentration von 50 Plasmaeinheiten Faktor X pro ml Lösung: keine Agglutination mit Erytrozyten der Blutgruppe A oder B sichtbar nachweisbar; weniger als 10 Plasmaeinheiten Protein C und Protein S enthalten, miftels nicht aktivierter partieller Thromboplastinzeit keine aktivierten Gerinnungsfaktoren nachweisbar (ohne Zugabe von Heparin und/oder Antithrombin III), weniger als 10 mg Protein enthalten.
Es ergibt sich somit, daß die eingangs genannten Ziele, einschließlich jener aus der vorstehenden Beschreibung erkenntlichen, effizient erreicht werden.
Darauf hingewiesen sei, daß die nachstehenden Patentänsprüche sämtliche generischen und spezifischen, hiezu beschriebenen Merkmale der Erfindung umfassen sollen.
Insbesondere sei darauf hinzuweisen, daß in den Patentansprüchen in der Einzahl genannte Zugaben bzw. Verbindungen sinngemäß auch vergleichbare Mischungen solcher Zugaben umfassen sollen.

Claims

1. Verfahren zur Trennung von Proteinen von humanem Plasma, von Rückständen humaner Plasma-Kryoproteine oder von Zellkultur-Rückständen, wobei die Proteine an ein Ionenaustauschgel adsorbiert worden sind; welches Verfahren nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:

die Gradientenelution der an dem Ionenaustauschgel adsorbierten Proteine in einer chromatographischen Säule mit einer Pufferlösung als Eluent, die von zwei Parametern definiert wird, von denen der eine allmählich verändert wird, während der andere auf einem im wesentlichen konstanten Niveau gehalten wird, um die Proteine nach und nach vom Gel zu desorbieren, wobei die genannten Parameter die Ionenstärke und der pH-Wert sind; die Reinigung der desorbierten Proteine unmittelbar nach ihrer Desorption von dem Ionenaustauschgel auf einem proteinfreien und äquilibrierten Gel von im wesentlichen der gleichen Ionenaustauschgelart und die anschließende Desorption der Proteine durch weitere Veränderung der Pufferlösung, indem mit der Veränderung des vorher gewählten variablen Parameters fortgefahren wird, so daß man ein Eluat von größerer Trennschärfe der Proteine erhält;

und

die Fraktionierung des Eluats in getrennte Proteinfraktionen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Trennschritt die Fraktioniernng des Eluats in Fraktionen, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Transferrin, Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S, einschließt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ionenstärke der Pufferlösung in einem Bereich zwischen 100 - 400 mval und 400 - 4000 mval kontinuierlich verändert wird und der pH- Wert in einem Bereich von 5 bis 8 auf einem im wesentlichen konstanten Niveau gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH-Wert der Pufferlösung in einem Bereich zwischen 3 und 9 kontinuierlich verändert wird und die Ionenstärke in einem Bereich von 100 bis 400 mval auf einem im wesentlichen konstanten Niveau gehalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ionenaustauschgel ein Anionenaustauschgel ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Anionenaustauschgel Diethylaminoethylgel (DEAE-Gel) ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 und 6, welches den Schritt der Äquilibrierung des mit den adsorbierten Proteinen beladenen Anionenaustauschgels mit einer weiteren Pufferlösung von niedrigster Ionenstärke vor dem genannten Gradientenelutionsschrift umfaßt.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 4, 5 und 6, welches den Schritt der Äquilibrierung des mit den adsorbierten Proteinen beladenen Anionenaustauschgels mit einer weiteren Pufferlösung von höchstem pH-Wert vor dem genannten Gradientenelutionsschritt umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Gradientenelutionsschritt die Einstellung des Elutionsgradienten in dem Eluenten durch Zugabe eines ersten Puffers mit einer Ionenstärke von 100 bis 400 mval zu einem zweiten Puffer mit einer Ionenstärke von 400 bos 4000 mval einschließt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Gradientenelutionsschritt die Einstellung des Elutionsgradienten in dem Eluenten durch Zugabe eine ersten Puffers mit einem pH-Wert von 6 bis 8 zu einem zweitem Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 7 einschließt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte erste Gradientenelutionsschritt die Bildung einer Schicht aus proteinfreiem, äquilibriertem Gel unter dem proteinbeladenen Gel einschließt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin das genannte Eluat, welches aus dem genannten ersten Gradientenelutionsschritt resultiert, in einer zweiten chromatographischen Säule, die der ersten chromatographischen Säule nachgeschaltet ist und das genannte proteinfreie äquilibrierte Gel enthält, gereinigt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der erste und der zweite Puffer jeweils aus der Gruppe bestehend aus Phosphat, Citrat, NaCl und NaOH gewählt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin dem genannten Gradientenelutionsschritt die folgenden Schritte vorausgehen:

- die Zugabe von Ionenaustauschgel zu einer Lösung, welche Plasmaproteine enthält;

- das Rühren des Gels in der Lösung, um es für die Adsorption der gewünschten Proteine in Suspension zu halten; und

- die Trennung des Gels mit den adsorbierten Proteinen vom übrigen Plasma.