DE3742706A1 - Method for identifying unknown biological material - Google Patents

Method for identifying unknown biological material

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Abstract

The specificity of proteins has been used to date to identify the origin of a biological material. The invention relates to a method for identifying unknown biological material, wherein DNA of the unknown biological material is contacted with DNA of known biological material, and the degree of hybridisation between the said DNAs is determined. The method is particularly suitable for use in forensic medicine.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren unbekannten biologischen Materials.The invention relates to a method for Identify unknown biological material.

Zur Identifizierung der Herkunft eines biologischen Materials wird vorwiegend die Spezifität der Proteine herangezogen. Zur Proteinbestimmung kommen elektrophore­ tische und immunologische Untersuchungsmethoden bzw. kom­ binierte Verfahren in Betracht (Hitchcock, C.H.S., and Crimes, A.A. (1985): Methodology for meat species identification in: Biochemical identification of meat species. Elsevier applied science publishers, London, New York).To identify the origin of a biological Material is primarily the specificity of the proteins used. Electrophoresis are used for protein determination table and immunological examination methods or com binary methods (Hitchcock, C.H.S., and Crimes, A.A. (1985): Methodology for meat species identification in: Biochemical identification of meat species. Elsevier applied science publishers, London, New York).

Unter den elektrophoretischen Analysetechniken ist die Polyacrylamid-Gel-Isoelektro-Focusierung (PAGIF) beispielsweise als Untersuchungsmethode rohen Fleisches anerkannt. (Amtliche Sammlung von Untersuchungsmethoden 35, Lebensmittel und Bedarfsgegenstände-Gesetz No. L06.00-17). Bei hochgradiger Erhitzung des Proben­ materials ist jedoch wegen der resultierenden Proteinde­ naturierung die Zuordnung zu einer bestimmten Tier- oder Pflanzenart bzw. einer bestimmten Person schwierig bzw. nicht eindeutig möglich (Hofmann, K. und Blüchel, E. (1986): Bestimmung der Tierart von rohem Muskelfleisch anhand der Myoglobinmuster im pH-Gradienten-Gel. Fleisch­ wirtsch., 66,916-921.).Among the electrophoretic analysis techniques is that Polyacrylamide gel isoelectric focusing (PAGIF) for example as an examination method of raw meat accepted. (Official collection of test methods 35, Food and Consumer Goods Act No. L06.00-17). When the sample is heated to a high degree However, materials is because of the resulting protein naturation the assignment to a specific animal or Plant type or a specific person difficult or not clearly possible (Hofmann, K. and Blüchel, E. (1986): Determination of the animal species of raw muscle meat based on the myoglobin pattern in the pH gradient gel. Meat econom., 66,916-921.).

Immunologische Methoden wie Doppeldiffusionstests nach Ouchterlony und Elisa-Verfahren basieren auf spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen. Hierbei dient der Fleisch­ extrakt als Antigen und ein spezifisches Antiserum als Antikörper. Diese Untersuchungsmethoden sind prinzipiell am eindeutigsten. Bei diesen Techniken kommt der Gewin­ nung des Antiserums die größte Bedeutung zu. Dieses muß spezifisch, präzipitierend und von adäquater Empfindlich­ keit sein. Derartig hochspezifische Antiseren sind weder für alle Tierarten bzw. einzelne Personen, noch für hitzedenaturierte Proteine in ausreichender Weise zugäng­ lich (Herrmann, Ch. (1968): Gewinnung von Antiseren für den Nachweis von Fremdeiweiß in hocherhitzten Fleischer­ zeugnissen. Arch. Lebensmittelhygiene. 19, 270 ff.).Immunological methods such as double diffusion tests Ouchterlony and Elisa procedures are based on specific ones Antigen-antibody reactions. Here the meat serves  extract as an antigen and a specific antiserum as Antibody. These examination methods are basic most clearly. With these techniques, the profit comes antiserum is of the greatest importance. This must specific, precipitating and of adequate sensitivity be. Such highly specific antisera are neither for all animal species or individual people, still for heat-denatured proteins are sufficiently accessible lich (Herrmann, Ch. (1968): Obtaining antisera for the detection of foreign protein in highly heated butchers certificates. Arch. Food hygiene. 19, 270 ff.).

Andere Untersuchungsmethoden um unbekanntes biologisches Material eindeutig zu identifizieren, werden seltener an­ gewandt. Hitzestabile Histidin-Dipeptide werden zwar im Skelettmuskel, jedoch nicht in inneren Organen nachgewie­ sen (Carnegie, P., Hee, R.D.P. and Bell, A.W. (1982): Ophidine (β-Alanyl-L-3-methylhistidine, "Balanine") and other histidine dipeptides in pig muscles and tinned hams. J. Sci. Food Agric., 33, 795-801.). Die Bestimmung des Fettsäuremusters ist nicht ausreichend spezifisch (Hitchcock, C.H.S., and Crimes, A.A. (1985): Methodology for meat species identification in: Biochemical identification of meat species Elsevier applied science publishers, London, New York.). Massenspektrometrische Untersuchungen erfordern einen hohen apparativen Aufwand (Puckey, D.J., and Jones, S.J. (1984): The differentiation of meat species by direct probe mass spectrometry. Proc. 30th Eur. Meeting Meat Res. Workers, Bristol 379-380.).Other methods of investigation to uniquely identify unknown biological material are used less frequently. Heat-stable histidine dipeptides are detected in the skeletal muscle, but not in internal organs (Carnegie, P., Hee, RDP and Bell, AW (1982): Ophidine (β- alanyl-L-3-methylhistidine, "Balanine") and other histidine dipeptides in pig muscles and tinned hams. J. Sci. Food Agric., 33, 795-801.). The determination of the fatty acid pattern is not sufficiently specific (Hitchcock, CHS, and Crimes, AA (1985): Methodology for meat species identification in: Biochemical identification of meat species Elsevier applied science publishers, London, New York.). Mass spectrometric studies require a lot of equipment (Puckey, DJ, and Jones, SJ (1984): The differentiation of meat species by direct probe mass spectrometry. Proc. 30th Eur. Meeting Meat Res. Workers, Bristol 379-380.).

Es war daher Aufgabe der Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Identifizierung biologischen Materials zur Verfügung zu stellen, das dennoch in bisher nicht erreichter Zuverlässigkeit die Identifizierung ermöglicht.It was therefore an object of the invention, a simple one Methods of identifying biological material for To make available, but not in so far identification achieved  enables.

Dieser Aufgabe wird, ausgehend von einem Verfahren zum Identifizieren unbekannten biologischen Materials dadurch gelöst, daß DNA des unbekannten biologischen Materials mit DNA bekannten biologischen Materials in Berührung gebracht und der Hybridisierungsgrad zwischen den genannten DNAs bestimmt wird.This task is based on a process for Identify unknown biological material solved that DNA of unknown biological material in contact with known biological material brought and the degree of hybridization between the named DNAs is determined.

DNA ist bei allen Ein- und Vielzellern die genetische Substanz. Ihre Grundbausteine heißen Nukleotide. Sie bestehen aus einem Phosphatteil, einem Zuckerteil (Desoxyribose) und einer Base, Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin. Die DNA setzt sich aus 2 linearen Poly­ nukleotidketten zusammen. Sie werden durch Wasserstoff­ brücken zwischen den gegenüberliegenden Basen zusammenge­ halten. Adenin paart immer mit Thymin, Guanin mit Cytosin. Die Stränge sind einander komplementär. Durch Hitze oder alkalische Behandlung werden die komplemen­ tären Stränge getrennt (Denaturierung). Unter renaturie­ renden Bedingungen (Abkühlung, Neutralisation) bilden einzelsträngige DNA-Moleküle mit komplementären Basense­ quenzen einen Doppelstrang (Hybridisierung).DNA is genetic in all single and multicellular cells Substance. Its basic building blocks are called nucleotides. they consist of a phosphate part, a sugar part (Deoxyribose) and a base, adenine, guanine, cytosine or thymine. The DNA consists of 2 linear poly nucleotide chains together. They are made by hydrogen bridge between the opposite bases hold. Adenine always pairs with thymine, guanine with Cytosine. The strands are complementary to each other. By Heat or alkaline treatment will complicate them tary strands separated (denaturation). Under renaturie conditions (cooling, neutralization) single-stranded DNA molecules with complementary bases sequence a double strand (hybridization).

Die genetische Information ist in der Basensequenz niedergelegt. Sie weist bei Angehörigen einer Spezies eine hohe Übereinstimmung auf. Deshalb hybridisieren ein­ zelsträngige DNA-Moleküle verschiedener Individuen einer Art sehr stark miteinander. Hybridisierungsstudien können somit zur Speziesidentifizierung herangezogen werden.The genetic information is in the base sequence laid down. It shows in members of a species a high match. Therefore hybridize one cell-stranded DNA molecules of different individuals one Kind of very strong with each other. Hybridization studies can thus be used for species identification.

Mit der vorliegenden Erfindung ist gezeigt worden, daß die DNA-Hybridisierung als eine zuverlässige Methode zur Identifizierung biologischen Materials unbekannter Herkunft geeignet ist. Der apparative und zeitliche Aufwand sind dabei vergleichsweise gering.The present invention has shown that DNA hybridization as a reliable method for Identification of biological material unknown Origin is suitable. The apparative and temporal  Effort is comparatively low.

Die Probleme, die bei der Identifizierung biologischen Materials, wie oben diskutiert, auftraten, wenn die zu untersuchenden biologischen Materialien bereits hitzedenaturiert waren, beispielsweise im Falle von gekochtem oder gebratenem Fleisch, sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr von Bedeutung.The problems involved in identifying biological Materials, as discussed above, occurred when the too investigating biological materials already were heat denatured, for example in the case of cooked or roasted meat are included in the The method according to the invention is no longer of importance.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß die DNA in allen kernhaltigen Zellen eines Individuums identisch vorliegt. Anders als bei den bisher zu den Identifizierungsverfahren verwendeten Proteinen, die nicht in allen Organen zur Ausprägung kommen, kann somit die Spezies-Identifizierung im Prinzip an jedem Organ erfolgen.A particular advantage of the method according to the invention is that the DNA in all nucleated cells of an individual is identical. Different from the previously used for identification procedures Proteins that are not expressed in all organs the species identification can come in principle at every organ.

Besonders überraschend an dem vorliegenden, erfindungsgemäßen Verfahren war, daß die erwarteten Kreuz-Hybridisierungen nicht in dem Maße auftraten, wie sie an sich das Verfahren vorerst als aussichtslos erscheinen ließen. Die Kreuz-Hybridisierungen, die auf partielle Basenkomplementarität der DNA verschiedener Spezies zurückzuführen sind, konnten durch densitometrische Messungen quantifiziert werden, wobei sich herausstellte, daß die auftretenden Kreuz-Hibridisierungen so gering waren, daß eine eindeutige Identifizierung der Spezies der untersuchten DNA möglich war. Dank der unerwarteterweise nur schwach auftretenden Kreuz-Reaktionen stellt die Erfindung somit eine hervorragende Möglichkeit zur Verfügung, sowohl frische, als auch hitzedenaturierte Materialien biologischen Charakters eindeutig zu bestimmen.Particularly surprising about the present The inventive method was that the expected Cross-hybridizations did not occur to the extent that the process itself is initially hopeless released. The cross hybridizations based on partial base complementarity of different DNA Could be attributed to species densitometric measurements are quantified, whereby it turned out that the occurring Cross hibridations were so low that one clear identification of the species of the examined DNA was possible. Thanks to the unexpectedly weak The invention thus presents cross reactions an excellent option available, both fresh and heat-denatured materials biological character clearly.

Das Verfahren kann durchgeführt werden, indem die DNA des unbekannten Materials für die Hybridisierungsversuche in einer Weise markiert wird, daß die Messungen möglich sind.The method can be carried out by the DNA of the  unknown material for the hybridization experiments in is marked in such a way that measurements are possible are.

Es ist jedoch ebenfalls möglich, die DNA des bekannten, gewissermaßen als Testsubstanz verwendeten biologischen Materials auf eine dem Fachmann bekannte Weise zu markieren.However, it is also possible to use the DNA of the known biological as a test substance Material in a manner known to those skilled in the art to mark.

Bevorzugt eignet sich eine Markierung mit radioaktiven Phosphor 32P, daß beispielsweise mittels der bekannten Technik der Nicktranslation in die zu markierende DNA eingebaut wird.A label with radioactive phosphorus 32 P is preferably suitable that is incorporated into the DNA to be labeled, for example by means of the known technique of pitch translation.

Eine Markierungsmethode der DNA, die die 32P-Markierung an Empfindlichkeit übertrifft, ist die Markierung mittels Biotin, wobei ein biotinyliertes Analog des dUTP, eines Nukleosids der DNA, als Substrat verwendet wird. Dank der hohen Bindungskonstanten der Interaktion zwischen Biotin und Avidin, einem 68 kD großen Glykoprotein aus Hühnereiweiß, lassen sich über eine Kopplung des Avidins mit geeigneten Indikatormolekülen (z. B. Antikörpern, Enzymen und fluoreszierenden Farbstoffen), auch kleinste Mengen an Biotin und damit auch der Nukleinsäureprobe nachweisen.One method of labeling the DNA which exceeds the 32 P label in terms of sensitivity is labeling using biotin, a biotinylated analogue of dUTP, a nucleoside of the DNA, being used as the substrate. Thanks to the high binding constants of the interaction between biotin and avidin, a 68 kD glycoprotein made from chicken protein, the avidin can be coupled with suitable indicator molecules (e.g. antibodies, enzymes and fluorescent dyes), even the smallest amounts of biotin and therefore also detect the nucleic acid sample.

Eine weitere Markierungsmethode ist die chemische, vorzugsweise Cytosin-Sulfonierung der DNA.Another method of labeling is chemical, preferably cytosine sulfonation of the DNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugt anwendbar bei der Identifizierung von biologischem Material in der forensischen Medizin. Es kann sich dabei um alle Arten von Spuren biologischen Materials wie Blut, Sperma oder Hautzellen handeln. Ebenso müssen jedoch auch sehr oft gebratenes oder gekochtes Fleisch, sei es als zu untersuchende Konserve, sei es als verdauter Mageninhalt identifiziert werden.The method according to the invention is preferably applicable in the identification of biological material in the forensic medicine. It can be of all types of traces of biological material such as blood, sperm or Act skin cells. Likewise, however, must also very often roasted or cooked meat, be it as too  investigating canned food, be it as digested stomach contents be identified.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich ebenso für das Identifizieren von Pflanzen oder Mikroorganismen.The inventive method is also suitable for Identify plants or microorganisms.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, daß nach dem Isolieren aus dem bekannten oder unbekannten biologischen Material die DNA durch Erhitzen in Einzelstränge zerlegt und die auf diese Weise denaturierte DNA in an sich bekannter Weise an Membranen gebunden wird.The method according to the invention can be carried out in this way be that after isolating from the known or unknown biological material the DNA by heating broken down into single strands and that way denatured DNA on membranes in a manner known per se is bound.

Besonders zweckmäßig ist es, entweder die eine oder die andere DNA auf diese Weise an Teststreifen zu binden, die dann auf einfache und schnelle Weise verwendet werden können. Diese Konfektionierung ist für kommerzielle Zwecke besonders geeignet.It is particularly useful to use either one or the to bind other DNA to test strips that can then be used easily and quickly can. This packaging is for commercial Purposes particularly suitable.

Es kann sowohl die DNA unbekannter Herkunft als auch die bekannte DNA, die als Test-DNA verwendet werden soll, auch als DNA-Sonde verwendet werden, die durch die Hybridisierung an dem an eine Membran gebundenen DNA-Material, die Identifizierung der DNA unbekannter Herkunft ermöglichen soll.It can contain both the DNA of unknown origin and the known DNA to be used as test DNA can also be used as a DNA probe by the Hybridization to that bound to a membrane DNA material, the identification of DNA unknown Origin should enable.

Die DNA kann in hochmolekularer Form vorliegen, wenn beispielsweise in an sich bekannter Weise routinemäßig DNA aus einem bestimmten Gewebe isoliert wird.The DNA can be in high molecular weight if for example in a manner known per se routinely isolated DNA from a particular tissue becomes.

Insbesondere bei vorverdautem Material liegt die DNA jedoch auch in niedermolekularer Form vor. Auch für die Bestimmung der DNA dieser Art eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren. The DNA lies especially with pre-digested material however also in low molecular weight form. Also for them Determination of this type of DNA is suitable inventive method.  

Das Verfahren ist, insbesondere durch seine Einfachheit, prädestiniert dafür, das gesamte, aus einem bestimmten Gewebe isolierte DNA-Material für die Hybridisierungsverfahren zu verwenden.The process, particularly due to its simplicity, is predestined for the whole, from a certain Tissue isolated DNA material for the To use hybridization methods.

Die Erfindung wird im folgenden mittels der Figuren und in den Beispielen näher erläutert. Es zeigtThe invention is in the following by means of the figures and explained in more detail in the examples. It shows

Fig. 1 Agarosegelelektrophorese der DNA aus Lymphozyten (1-4) und Fleischproben (5-8). Rind (1), Schwein (2), Huhn (3), Mensch (4), Rind roh (5), Rind gebraten (6), Schwein roh (7), Schwein gebraten (8). Längenstandard (K); Kilobasen (Kb). Fig. 1 agarose gel electrophoresis of DNA from lymphocytes ( 1-4 ) and meat samples ( 5-8 ). Beef ( 1 ), pork ( 2 ), chicken ( 3 ), human ( 4 ), raw beef ( 5 ), roasted beef ( 6 ), raw pork ( 7 ), roasted pork ( 8 ). Length standard (K) ; Kilobases (Kb) .

Fig. 2 Dot blot-Hybridisierung mit Schweine-DNA als Sonde. Hochmolekulare DNA aus Lymphozyten von Rind (R), Schwein (S), Menschen (M) und Huhn (H); DNA aus rohem Rindfleisch (Rr), denaturiertem Rindfleisch (Rd), rohem Schweinefleisch (Sr) und denaturiertem Schweinefleisch (Sd). Fig. 2 Dot blot hybridization with pig DNA as a probe. High molecular weight DNA from lymphocytes from bovine (R) , pig (S) , human (M) and chicken (H) ; DNA from raw beef (Rr) , denatured beef (Rd) , raw pork (Sr) and denatured pork (Sd) .

Fig. 3 Dot blot-Hybridisierung mit verschiedenen Tier-DNA-Sonden Fig. 3 Dot blot hybridization with different animal DNA probes

Rind-DNA-Sonde (S R )
Schweine-DNA-Sonde (S S )
Huhn-DNA-Sonde (S H )
Menschliche DNA (M), Rinder-DNA (R), Schweine-DNA (S), Hühner-DNA (H);Bovine DNA Probe (S R )
Pig DNA probe (S S )
Chicken DNA Probe (S H )
Human DNA (M) , Bovine DNA (R) , Pig DNA (S) , Chicken DNA (H) ;

DNA aus:
Hühnerfleisch aus dem Römertopf (1)
Hünerleber gebraten (2)
Hühnerfleisch im Römertopf zubereitet, ca. 30 Minuten im Magen (3)
Rindfleisch aus dem Dampftopf (4)
Rindfleisch gebraten (5)
Kalbfleisch aus dem Dampftopf (6)
Schweinefleisch gebraten (7)
gebratenes Schweinefleisch ca. 45 Minuten im Magen (8)
Rindfleisch aus der Dose (9)
rohes Schweinefleisch (10).DNA from:
Chicken from the Roman pot ( 1 )
Chicken liver fried ( 2 )
Chicken prepared in the Roman pot, about 30 minutes in the stomach ( 3 )
Steamed Beef ( 4 )
Fried beef ( 5 )
Veal from a steam pot ( 6 )
Fried pork ( 7 )
fried pork in the stomach for about 45 minutes ( 8 )
Canned Beef ( 9 )
raw pork ( 10 ).

Fig. 4 Dot-blot Hybridisierung mit DNA unbekannter Identität.
M = menschliche DNA, R = Rind-DNA, S = Schweine-DNA, H = Hühner-DNA fixiert auf der Membran Fig. 4 Dot blot hybridization with DNA of unknown identity.
M = human DNA, R = bovine DNA, S = pig DNA, H = chicken DNA fixed on the membrane

I hybridisiert mit DNA aus 6 Wochen alter menschlicher Blutspur (12 ul Äquivalent)
II hybridisiert mit DNA aus 6 Wochen alter Blutspur vom Schwein (12 ul Äquivalent)
III hybridisiert mit DNA aus Fleisch von vomiertem Mageninhalt
IV hybridisiert mit DNA aus 6 Wochen alter Blutspur vom Rind (12 ul Äquivalent).I hybridizes with DNA from 6 weeks old human blood trail (12 µl equivalent)
II hybridizes with DNA from 6 weeks old pig blood trail (12 ul equivalent)
III hybridizes with DNA from meat from the abdominal contents
IV hybridizes with DNA from 6 weeks old bovine blood trail (12 ul equivalent).

Die Qualität isolierter DNA kann durch Gelelektrophorese überprüft werden. Hochmolekulare DNA erscheint im Gel als diskrete, langsam wandernde Bande. Degradierte bzw. de­ naturierte DNA schliert in den niedermolekularen Bereich.The quality of isolated DNA can be determined by gel electrophoresis be checked. High molecular DNA appears in the gel as discreet, slowly wandering gang. Degraded or de natured DNA streaks into the low molecular weight range.

Um zu prüfen, ob aus hitzedenaturierten Fleischproben DNA gewonnen werden kann, wurden an jeweils 100 mg nach Haus­ frauenart zubereitetem Schweine- bzw. Rinderschnitzeln und an frischem Fleisch von Rind und Schwein DNA-Präparationsverfahren angewandt. Aliquots der Präpa­ rationen und Kontroll-DNA aus Lymphozyten wurden elektro­ phoretisiert (Fig. 1). Es zeigt sich, daß sowohl aus rohem, als auch zubereitetem Fleisch DNA isoliert werden kann. Bei rohem Fleisch (Fig. 1, Spur 5 und 7) liegt die DNA größtenteils, bei den Kontrollen (Fig. 1, Spur 1 bis 4) ausschließlich in hochmolekularer Form vor. Bei den hitzedenaturierten Proben (Fig. 1, Spur 6 und 8) er­ scheint die DNA überwiegend als Schlier in den nieder­ molekularen Bereich. Um zu testen, ob die Tierartidenti­ fizierung an rohen und zubereiteten Fleischproben durch DNA-Hybridisierung möglich ist, wurden jeweils 1500 ng der daraus isolierten DNAs und jeweils 250 ng Kontroll-DNAs von Rind, Schwein, Mensch und Huhn mit radioaktiv markierter Schweine-DNA hybridisiert. Das Ergebnis zeigt Fig. 2. Man erkennt, daß bei den Kontrol­ len lediglich die Schweine-DNA mit der Sonde reagiert. Bei den Fleischproben bindet die Sonde an isolierte DNA aus rohem und gebratenem Schweinefleisch. Mit der DNA aus rohem und zubereitetem Rindfleisch wurde keine Hybridi­ sierung beobachtet.In order to check whether DNA can be obtained from heat-denatured meat samples, 100 mg pork or beef schnitzel prepared in the manner of a woman and in fresh meat from beef and pork DNA preparation methods were used. Aliquots of the preparations and control DNA from lymphocytes were electrophoresed ( FIG. 1). It turns out that DNA can be isolated from both raw and prepared meat. For raw meat ( Fig. 1, lanes 5 and 7 ), the DNA is mostly, in the controls ( Fig. 1, lanes 1 to 4 ) only in high molecular form. In the heat-denatured samples ( Fig. 1, lanes 6 and 8 ), the DNA appears predominantly as a streak in the low molecular weight range. In order to test whether the identification of animal species on raw and prepared meat samples by DNA hybridization is possible, 1500 ng of the DNAs isolated therefrom and 250 ng of control DNA from cattle, pork, human and chicken were hybridized with radioactively labeled pig DNA . The result is shown in FIG. 2. It can be seen that only the swine DNA reacts with the probe in the controls. In the meat samples, the probe binds to isolated DNA from raw and roasted pork. No hybridization was observed with the DNA from raw and prepared beef.

In einem weiteren Experiment wurden parallel 3 Dot blot- Hybridisierungen durchgeführt, wobei als Sonden Rind (S R ), Schwein (S S ) bzw. Huhn (S H )-DNA eingesetzt wurden. Auf jede der 3 Membranen wurden definierte Mengen Kontroll-DNA (1 ug) und unbekannte DNA-Mengen aus 10 ver­ schiedenen Fleischproben aufgetragen (Fig. 3). Es zeigte sich, daß menschliche DNA mit keiner der verwendeten Tier-DNA-Sonden reagiert. Rind-Kontroll-DNA und Huhn-Kontroll-DNA reagierte stark mit S R bzw. S H, Schweine-Kontroll-DNA reagierte stark mit S S und schwach mit S R . Aus der densitometrischen Auswertung dieser beiden Spots errechnete sich eine ca. 23 × höhere Hybridi­ sierungsstärke der Schweine-Kontroll-DNA mit S S als mit S R . Die Fleischproben 1 mit 10 konnten eindeutig Rind, Schwein bzw. Huhn zugeordnet werden. Jedoch zeigten die Proben 8 mit 10 geringe Kreuzreaktionen. Die densitome­ trische Auswertung dieser Spots ergab, daß, wie bei der Schweine-Kontroll-DNA, DNA aus denaturiertem und rohem Schweinefleisch mit S S ca. 20 × stärker reagiert als mit S R (Probe 8 und 10). Die Rind-DNA aus Probe 9 reagierte mit S R ca. 35 × stärker als mit S S . In keinem Fall wurde eine Kreuzhibridisierung von Rind- bzw. Schweine-DNA mit S H beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Methode geeignet ist, rohes und hitzedenaturiertes Fleisch von Rind, Schwein und Huhn eindeutig zu differenzieren. Ferner zeigt sich (Proben 3 und 8), daß eine Spezies-Identifizierung auch am Mageninhalt möglich erscheint.In a further experiment, 3 dot blot hybridizations were carried out in parallel, using beef (S R ), pig (S S ) or chicken (S H ) DNA as probes. Defined amounts of control DNA (1 μg) and unknown amounts of DNA from 10 different meat samples were applied to each of the 3 membranes ( FIG. 3). It was found that human DNA did not react with any of the animal DNA probes used. Bovine control DNA and chicken control DNA reacted strongly with S R and S H , pig control DNA reacted strongly with S S and weakly with S R. From the densitometric evaluation of these two spots, an approximately 23 × higher hybridization strength of the pig control DNA with S S than with S R was calculated. The meat samples 1 with 10 could be clearly assigned to beef, pork or chicken. However, samples 8 with 10 showed minor cross-reactions. The densitometric analysis of these spots showed that, as with the pig control DNA, DNA from denatured and raw pork reacts with S S about 20 × more than with S R (samples 8 and 10 ). The bovine DNA from sample 9 reacted with S R approximately 35 times more strongly than with S S. In no case was cross-hibridization of bovine or porcine DNA with S H observed. These results show that the method is suitable for clearly differentiating raw and heat-denatured meat from beef, pork and chicken. It also shows (samples 3 and 8 ) that species identification also appears possible on the stomach contents.

Beispiel 1example 1 DNA-IsolierungDNA isolation

Hochmolekulare DNA wurde aus frischen EDTA-Blutproben von Mensch, Rind, Schwein und Huhn nach der bei MANIATIS et al. 1982 beschriebenen Standardmethode isoliert (Maniatis, T., et al., (1982): Molecular Cloning a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.) High molecular weight DNA was obtained from fresh EDTA blood samples from Human, beef, pork and chicken according to the MANIATIS et al. Standard method described in 1982 isolated (Maniatis, T., et al., (1982): Molecular Cloning a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.)  

Diese DNAs dienten als Kontrollen bzw. DNA-Sonden. 100-300 mg Fleischproben wurden jeweils mit sterilem Skalpell zerkleinert. Die anschließende DNA-Isolierung erfolgte nach der oben angegebenen Methode. Die Quantität der DNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.These DNAs served as controls or DNA probes. 100-300 mg meat samples were each made with sterile Shredded scalpel. The subsequent DNA isolation was carried out according to the method given above. The Quantity of DNA was measured photometrically Wavelength of 260 nm determined.

Beispiel 2Example 2 GelelektrophoreseGel electrophoresis

Um die Qualität der isolierten DNA-Proben zu bestimmen, wurden jeweils 10 ul der in A. bidest gelösten DNA Proben mit 2 ul 150 g/l Ficoll 400 + 2,5 g/l Bromphenolblau + 2,5 g/l Xylenololblau versetzt und im 8 g/l Agarose-Gel 3 Stunden bei 80 V in 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Tris-Acetat-Puffer (pH 8,0) elektrophoretisiert. Als Längenstandard wurden Hin d III - Restriktionsfragmente des Phagen Lambda verwendet. Die DNA wurde durch Anfärben mit Ethidiumdbromid im UV-Licht sichtbar gemacht.To determine the quality of the isolated DNA samples, 10 μl each of the DNA samples dissolved in A. bidest with 2 ul 150 g / l Ficoll 400 + 2.5 g / l bromophenol blue + 2.5 g / l of xylenolol blue and added in 8 g / l agarose gel 3 Hours at 80 V in 1 mmol / L EDTA, 40 mmol / L Tris acetate buffer (pH 8.0) electrophoresed. As Hin d III restriction fragments became the standard length of the phage lambda used. The DNA was stained visualized with ethidium dbromide in UV light.

Beispiel 3Example 3 Dot blot-HybridisierungDot blot hybridization

Die zu analysierenden DNA-Proben sowie die Kontroll-DNAs wurden durch 5minütiges Erhitzen bei 100°C in Einzel­ stränge zerlegt, dann 2 Minuten auf Eis gekühlt. Jeweils 3 ul Aliquots wurden auf eine Nylonmembran (Hybond N, Fa. Amersham) aufgetropft. Nach Lufttrocknung wurde die Mem­ bran eine Minute in einer Denaturierungslösung (0,5 mol/L NaOH, 1,5 mol/L NaCl) und anschließend eine Minute in Neutralisierungslösung (1,5 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0,5 mol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,2)) inkubiert. Nach Trocknen der Membran wurde diese in eine Plastikfolie eingeschweißt und 2 Minuten mit U-Licht (302 nm) be­ strahlt. Dadurch wird die denaturierte DNA an die Membran gebunden. Die Hybridisierung der gebundenen DNA mit der Sonden-DNA wurde bei 65°C entsprechend dem von der Fa. Amersham empfohlenen Hybridisierungsprotokoll durchge­ führt (Membrane transfer and detection methods. Versuchsprotokoll der Firma Amersham International plc.)The DNA samples to be analyzed and the control DNAs were isolated by heating for 5 minutes at 100 ° C strands disassembled, then chilled on ice for 2 minutes. Each 3 ul aliquots were placed on a nylon membrane (Hybond N, Fa. Amersham). After air drying, the mem bran for one minute in a denaturing solution (0.5 mol / L NaOH, 1.5 mol / L NaCl) and then one minute in Neutralizing solution (1.5 mol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA,  0.5 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.2) incubated. To The membrane was dried in a plastic wrap welded in and 2 minutes with U light (302 nm) shine. This will bring the denatured DNA to the membrane bound. Hybridization of the bound DNA with the Probe DNA was at 65 ° C according to the. Amersham recommended hybridization protocol leads (membrane transfer and detection methods. Test protocol of the company Amersham International plc.)

Beispiel 4Example 4 Präparation der DNA-SondenPreparation of the DNA probes

Es wurde die hochmolekulare DNA aus den Lymphozyten von Rind, Schwein bzw. Huhn verwendet. Die Sonden wurden mit 32P dATP und 32P dCTP (spezifische Aktivität 800 Ci/mmol) durch Nicktranslation (Rigby, P.W., et al. (1977): Labelling desoxyribonucleid acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Mol. Biol., 113, 237-251) mit einem im Handel erhältlichen Nicktranslationskit markiert.The high-molecular DNA from the lymphocytes of beef, pork and chicken was used. The probes were treated with 32 P dATP and 32 P dCTP (specific activity 800 Ci / mmol) by nick translation (Rigby, PW, et al. (1977): Labeling deoxyribonucleid acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase IJ Mol Biol., 113, 237-251) with a commercially available nick translation kit.

Beispiel 5Example 5 AutoradiographieAutoradiography

Die Hybridisierungsprodukte wurden autoradiographisch dargestellt. Dazu wurden die Nylonmembranen 15 Minuten bis 3 Stunden mit zwei Verstärkerfolien bei -80°C einem Kodak-X-Omat-Röntgenfilm exponiert. The hybridization products were autoradiographically shown. For this, the nylon membranes were 15 minutes up to 3 hours with two amplifier foils at -80 ° C one Kodak-X-Omat X-ray film exposed.  

Beispiel 6Example 6 DensitometrieDensitometry

Die Autoradiogramme wurden densitometriert (Elscript 400, Fa. Hirschmann).The autoradiograms were densitometrized (Elscript 400, Hirschmann).

Claims (17)

1. Verfahren zum Identifizieren unbekannten biologischen Materials, dadurch gekennzeichnet, daß DNA des unbekannten biologischen Materials mit DNA bekannten biologischen Materials in Berührung gebracht und der Hybridisierungsgrad zwischen den genannten DNA's bestimmt wird.1. A method for identifying unknown biological material, characterized in that DNA of the unknown biological material is brought into contact with DNA known biological material and the degree of hybridization between the said DNAs is determined. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des unbekannten biologischen Materials für das Bestimmen des Hybridisierungsgrades markiert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the DNA of the unknown biological material for the Determining the degree of hybridization is marked. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des bekannten biologischen Materials für das Bestimmen des Hybridisierungsgrades markiert wird.3. The method according to claim 1, characterized in that the DNA of the known biological material for the Determining the degree of hybridization is marked. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mittels radioaktivem Phosphor 32P markiert wird.4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the DNA is marked by means of radioactive phosphorus 32 P. 5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA chemisch, vorzugsweise mittels Cytosin-Sulfonierung, markiert wird.5. The method according to claim 2 or 3, characterized characterized in that the DNA is chemically, preferably by means of cytosine sulfonation. 6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit Biotin markiert wird.6. The method according to claim 2 or 3, characterized characterized in that the DNA is labeled with biotin. 7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte biologische Material Fleisch, insbesondere gekochtes oder gebratenes Fleisch ist.7. The method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the unknown biological Material meat, especially cooked or roasted Meat is. 8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte biologische Material Blut ist.8. The method according to at least one of claims 1 to 6,  characterized in that the unknown biological Material is blood. 9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte biologische Material menschlichen Ursprungs ist, insbesondere aus Blut, Sperma oder Hautzellen besteht.9. The method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the unknown biological Material is of human origin, especially from There is blood, sperm or skin cells. 10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte biologische Material pflanzlichen Ursprungs ist.10. The method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the unknown biological Material is of vegetable origin. 11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte biologische Material mikrobiellen Ursprungs ist.11. The method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the unknown biological Material is of microbial origin. 12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach dem Isolieren aus dem bekannten oder unbekannten biologischen Material durch Erhitzen in Einzelstränge zerlegt und die auf diese Weise denaturierte DNA in an sich bekannter Weise an Membranen gebunden wird.12. The method according to at least one of claims 1 to 11, characterized in that the DNA after Isolate from the known or unknown biological Material broken down into individual strands by heating and the in this way denatured DNA in a known manner Way is bound to membranes. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran als Teststreifen ausgebildet ist.13. The method according to claim 12, characterized in that that the membrane is designed as a test strip. 14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach dem Isolieren aus dem bekannten oder unbekannten biologischen Material als DNA-Sonde verwendet wird.14. The method according to at least one of claims 1 to 11, characterized in that the DNA after Isolate from the known or unknown biological Material is used as a DNA probe. 15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA in hochmolekularer Form vorliegt. 15. The method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the DNA in high molecular form is present.   16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA in niedermolekularer Form vorliegt.16. The method according to at least one of claims 1 to 14, characterized in that the DNA in low molecular weight form. 17. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA aus dem unbekannten biologischen Material nach dem Isolieren in ihrer Gesamtheit für das Bestimmen des Hybridisierungsgrades mit der DNA des bekannten biologischen Materials in Berührung gebracht wird.17. The method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the DNA from the unknown biological material after isolation in their entirety for determining the Degree of hybridization with the DNA of the known biological material is brought into contact.
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