DE3737649A1 - Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrensInfo
- Publication number
- DE3737649A1 DE3737649A1 DE19873737649 DE3737649A DE3737649A1 DE 3737649 A1 DE3737649 A1 DE 3737649A1 DE 19873737649 DE19873737649 DE 19873737649 DE 3737649 A DE3737649 A DE 3737649A DE 3737649 A1 DE3737649 A1 DE 3737649A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- substance
- carrier
- cell culture
- luminescence
- luminescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Lumin
eszenz von Zellkulturen, wobei diese mit einer lumineszier
fähigen, die natürliche Lumineszenz verstärkende, ersten
Substanz versehen werden, anschließend mit einer, die Lumines
zenz auslösende, zweiten Substanz behandelt werden, und die
Lumineszenz photoelektronisch erfaßt wird, sowie eine Vorrich
tung zum Durchführen des Verfahrens.
Derartige Verfahren sind u.a. aus B. Becker, et al. "Applica
tion of Intracellular ATP Determination in Lymphocytes for
HLA-typing", Journal of Bioluminescence and Chemieluminescence,
Vol. 1, 47-51 (1986) bekannt. Unter Lumineszenz im weiteren
Sinne sind alle Emissionen von Strahlungsquanten, vor allem
Leuchterscheinungen, zu verstehen, die Stoffe nach quantenhafter
Anregung ohne Zuhilfenahme von thermischer Energie zeigen.
Bei der sogenannten Biolumineszenz kommt die der Aussendung
von Lichtquanten vorausgehende Anregung durch eine enzymatisch
gesteuerte Oxidation zustande. Am besten bekannt ist dabei
dieser Vorgang beim Leuchtkäfer, im Volksmund auch "Glühwürm
chen" genannt, bei dem zum Reaktionseintritt Luciferin, Mag
nesiumionen, ATP (Adenosintriphosphat) und Sauerstoff vorliegen
müssen. Das Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation des
Luciferins, wobei ein Photon ausgesandt wird. Die Zahl der
ausgesandten Photonen erlaubt Rückschlüsse auf die Aktivität
bzw. Vitalität der Zellen.
Derartige Vorgänge laufen überwiegend nicht unter der von den
Glühwürmchen bekannten intensiven Strahlung ab, so daß die
Strahlung nicht ausreicht, um direkt gemessen zu werden. In der
Lumineszenz-Technologie werden daher in die Organismen bzw.
Zellen lumineszierfähige Substanzen als Verstärker eingebracht,
die anschließend durch eine auslösende Substanz ggf. unter
Mitwirkung eines zelleigenen Enzyms oxidiert werden, wobei dann
die Lumineszenz zu beobachten ist. Aus der Intensität der
Lumineszenz kann dann auf die Aktivität des Enzyms bzw. der
Zellkultur rückgeschlossen werden. Die Lumineszenz bzw. Bio
lumineszenztechnik hat in den letzten Jahren immer breitere
Anwendung gefunden, da eine "Markierung" von Zellen durch
lumineszierfähige Substanzen wesentlich einfacher und ungefähr
licher ist, als beispielsweise die Markierung mit radioaktiven
Isotopen.
Bei der Durchführung derartiger Lumineszenz Analyse-Verfahren
werden Zellsuspensionen mit den die Lumineszenz verstärkenden
Substanzen hergestellt und in diese Suspensionen, die die
Lumineszenz auslösenden Substanzen zugefügt. Dabei senden
nicht nur die Zellen eine Strahlung aus, sondern auch die in
der Lösung noch vorhandene Verstärkersubstanz strahlt selbst.
Daraus resultiert ein nachteiliges Signal/Rauschverhältnis
zwischen dem von den Zellen ausgesandten Licht und der diese
Zellen umgebenden Lösung.
Ferner nachteilig an der Lumineszenz-Technologie ist, daß die
abgelösten, in der Suspension aufgeschlämmten Zellen sich in
ihrer Morphologie gegenüber den ursprünglich haftenden (adhären
ten) Zellen unterscheiden. Den Ausgangspunkt der überwiegend
zur Zeit verwendeten Zellkulturen bilden Zelltypen, die in
situ im Verband wachsen und entsprechende Gewebe bilden. Solche
Zellen benötigen, um sich auch in vitro teilen und vermehren
zu können, einen Untergrund, auf dem die wachsende Kultur
schließlich einen "Rasen" in Form einer Schicht bildet. Löst
man eine solche adhärente Zellkulturschicht auf dem üblichen
Weg, d.h. enzymatisch von ihrer Unterlage und bringt sie in
Suspension, so ändern diese Zellen ihre Morphologie. Sie runden
sich dabei ab und nehmen in etwa Kugelform an. Dieser Zustand
weicht morphologisch und physiologisch von jenem ab, in dem sich
adhärente oder gar in situ wachsende Zellen normalerweise
befinden. Dasselbe gilt für Zellinien, die von vornherein als
Suspensionskulturen gezüchtet werden. Soll das Verhalten von
adhärenten Zellen studiert werden und möchte man dabei brauch
bare Aussagen im Rahmen der Lumineszenz-Analytik machen, so
ist es notwendig, das jeweilige Experiment so zu gestalten,
daß man so nahe als möglich an den in vivo-Zustand der verwen
deten Zellkulturen herankommt. Dies ist gegenwärtig mit der
Suspensionstechnologie nicht im ausreichenden Maße erreicht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren
der eingangs genannten Art derart abzuwandeln, daß Lumineszenz
analysen an adhärenten Zellkulturen vorgenommen werden können,
wobei lediglich das von den Zellen ausgestrahlte Licht erfaßt
werden soll, um dadurch direkte Aussagen über die Zellaktivität
bzw. -vitalität erhalten zu können. Ferner ist Aufgabe der
Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen
Verfahrens zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch folgende Verfahrens
schritte gelöst:
- a) Kultivieren der zu untersuchenden Zellkultur auf einem Träger haftend,
- b) Behandeln der auf dem Träger haftenden Zellkultur mit einer lumineszenzfähigen ersten Substanz,
- c) Entfernen der nicht vom am Träger haftenden Zellkultur aufgenommenen ersten Substanz, und
- d) Messen der lediglich von der Zellkultur emittierten Strahlung nach Zugabe der zweiten, die Lumineszenz auslösenden Substanz.
Durch Kultivieren der Zellkultur auf einem Träger haftend,
weisen die Zellen eine Morphologie auf, die einem in vivo
gewachsenen Verband bzw. Gewebe entspricht. Durch Behandeln
der am Träger haftenden Zellen mit der lumineszenzfähigen
ersten Substanz, wird diese in die Zellkultur eingebracht,
ohne daß dabei die Zellen abgelöst werden, d.h., ohne daß
sich deren morphologische oder physiologische Eigenschaften
ändern. Die nicht von der Zellkultur aufgenommene erste Substanz
kann durch Waschen entfernt werden, so daß, falls die die
Strahlung auslösende zweite Substanz zugegeben wird, Strahlung
lediglich in den Zellen erzeugt wird. Damit entspricht die
ausgestrahlte und somit meßbare Strahlung exakt der Aktivität
bzw. Vitalität der Zellen, und die Messung wird nicht durch
außerhalb des Zellverbandes entstehende Strahlung verfälscht.
Dadurch sind beispielsweise sehr einfache Absolutmessungen
möglich, ohne daß beispielsweise das Grundrauschen kompen
sierende Vergleichsmessungen durchgeführt werden müssen. Bei
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens ist eine von der Außenwelt abschließbare Kultur
schalenvorrichtung vorgesehen, in der zumindest ein Träger
lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und der
zumindest eine aufgenommene Träger ist abwechslungsweise mit
Nährlösungen, Waschlösungen, der lumineszenzfähigen ersten
Substanz, sowie der die Lumineszenz auslösenden Substanz behan
delbar. Die zu untersuchende Zellkultur wird auf dem Träger
kultiviert und alle weiteren Behandlungsschritte werden dann
an der fest am Träger haftenden Zellkultur durchgeführt. Dabei
bleiben die morphologischen Eigenschaften durchweg erhalten.
Dabei ist es auch ermöglicht, nach einer erfolgten Messung,
die auf dem Träger haftende Kultur weiter zu züchten, und
ggf. zu einem späteren Zeitpunkt weitere Messungen durchzufüh
ren.
Mit der auf dem Träger haftenden Zellkultur können außerdem
auch Toxizitäts-, Konzentrations-, Wirkungs- und Wirksamkeits
tests durchgeführt werden. D.h. die adhärente Zell- bzw.
Gewebestruktur kann mit toxischen Substanzen verschiedener
Konzentrationen versehen werden, die die enzymatische Tätigkeit
bzw. die Lumineszenz beeinflussen. Durch Vergleichsmessungen,
d. h. Vergleiche zwischen Zellkulturen auf Trägern ohne Gift
stoffe und solchen mit Giftstoffen, kann sehr einfach der
Einfluß derartiger Substanzen mittels dem erfindungsgemäßen
Verfahren bzw. der Vorrichtung durchgeführt werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens
wird in Schritt a) als Träger ein dünnes Plättchen aus Kunst
stoff, Glas oder dgl. verwendet, dessen eine Oberfläche mit
einem Zellkultur-Monolayer kultiviert wird. Dies hat den
Vorteil, daß auf dünnen Plättchen, sogenannte Cover Slips,
die Zellen in einer Schicht (sogenannte Monolayer) wachsen
können. Durch Konfluenz, d.h. eine dichtest mögliche Anordnung
von adhärenten Zellen als Monolayer in einer Kultur, ist eine
gleichmäßige dichte einschichtige Zellstruktur auf dem Träger
erreicht, die zum einen fest haftend ist und außerdem eine
gleichmäßige Strahlungsquelle darstellt. Lumineszenzmessungen
mit auf dem Träger haftenden Zellen sind jedoch auch möglich,
ohne daß Konfluenz erreicht ist.
Eine besonders gute Haftung auf der Oberfläche des Trägers
ist dadurch erreicht, daß die Zellkultur zunächst auf die
Oberfläche des Trägers aufgebracht wird und dieser ein gewisser
Zeitraum, vorzugsweise etwa 3 Minuten, gegeben wird, um sich
auf der Trägeroberfläche festzusetzen und anschließend eine
Nährlösung zugegeben wird. Die "nackte" Zellkultur findet in
der kurzen Zeitspanne Kontakt mit der Oberfläche des Trägers
und wird dann durch die anschließend vorsichtig aufgebrachte
Nährlösung nicht abgespült, so daß ein gezieltes Vermehren
nur auf dem Träger stattfindet.
Dies wird besonders vorteilhaft dadurch verwirklicht, daß der
Träger waagrecht gehalten ist, die Zellkultur auf die obere
Fläche aufgebracht wird und mit der Nährlösung überschichtet
wird. Die Vermehrung der Zellen erfolgt im Brutschrank. Nach
2 bis 3 Tagen ist Konfluenz erreicht.
Ein besonders gutes Trennen von aufgebrachter Schicht und
Nährlösung wird dadurch erreicht, daß der Träger nachfolgend
an Schritt a) in eine Waschlösung eingelegt wird. Dabei besteht
zweckmäßigerweise die Waschlösung aus einer phosphatgepufferten
Salzlösung. Dies hat den Vorteil, daß die Zellkultur mit einer
für sie verträglichen und lebensgerechten Umgebung versorgt ist.
Ein dauerhafter fester Sitz der Schicht am Träger ist auch
dadurch gewährleistet, daß bei dem Waschvorgang, die mit der
Zellkultur bewachsene Fläche andauernd nach oben weist.
Eine besonders aussagekräftige Lumineszenzmessung ist dadurch
ermöglicht, daß nachfolgend an Schritt a) vor Schritt b) eine
Kontrolle der auf dem Träger haftenden Zellkultur durchgeführt
wird. Die Monolayerschicht auf dem dünnen Plättchen ermöglicht
eine Betrachtung beispielsweise durch ein gebräuchliches
Lichtmikroskop, ohne daß eine besondere Präparation dafür
notwendig ist. Man kann somit vor der eigentlichen Lumineszenz
messung exakt die Oberflächenbesetzung des Trägers feststellen.
Das Einbringen der lumineszenzfähigen ersten Substanz in die
Zellkultur des Trägers, erfolgt besonders schonend und ohne
Ablösungsgefahr dadurch, daß in Schritt b) der Träger mit einer
die erste Substanz aufweisenden Flüssigkeit überschichtet
wird.
Zweckmäßigerweise ist dabei diese erste Substanz Luminol.
Ein besonders günstiges Entfernen der überschüssigen ersten
Substanz in Schritt c) ist dadurch erreicht, daß der Träger in
eine Waschlösung getaucht und die erste Substanz abgewaschen
wird, ohne dabei die anhaftenden Zellen zu lösen.
Ein besonders günstiger, die Aktivität bzw. Vitalität der auf
dem Träger haftenden Zellkultur nicht beeinflussender Ent
fernungsvorgang in Schritt c), ist dadurch erreicht, daß die
Waschlösung dieselbe, wie die zum Abwaschen der Nährlösung
ist. Dadurch ist erreicht, daß die auf dem Träger haftende
Zellkultur auch nach diesem Waschvorgang in demselben für sie
verträglichen und lebensnotwendigen Medium aufgenommen ist.
Dadurch ist es auch möglich, zwischen den einzelnen Verfah
rensschritten, beispielsweise bei einer Automatisierung des
Verfahrens, gewisse Stauzeiten durch Aufbewahren des Trägers
in dieser Lösung zu überbrücken.
Eine besonders exakte und aussagekräftige Messung kann dadurch
erreicht werden, daß in Schritt d) der plattenförmige Träger
in ein eine Meßlösung aufweisendes Gefäß gestellt wird, wobei
die Bewuchsfläche auf das photoelektronische Meßgerät zu ge
richtet ist. Die "Strahlungsquelle" entspricht somit exakt
der mit der Zellkultur bewachsenen Trägeroberfläche, die einen
konstanten Abstand zum fotoelektronischen Gerät aufweist, so
daß eine besonders einfach zu justierende Meßanordnung er
möglicht ist.
Besonders vorteilhaft stellt das Meßmedium dasselbe Medium
wie das Waschmedium zum Abwaschen der Nährlösung bzw. zum Ab
waschen der lumineszenzfähigen Substanz dar. Dadurch ist die
Zellkultur auch während des eigentlichen Meßvorganges mit
der Lösung umspült, mit der sie schon in den vorbereitenden
Schritten in Kontakt stand, so daß kein wechselnder Einfluß
durch dieses Medium auf die Zellkultur ausgeübt wird.
Bei einem Verfahren, bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur
beeinflussenden dritten Substanz gemessen werden soll, wird
diese besonders vorteilhaft vor Schritt b) mit der anhaftenden
Zellkultur in Berührung gebracht und anschließend wird diese
Substanz abgewaschen.
Gemäß einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei dem die Wirkung einer die Zellstrukturen beeinflussenden,
dritten Substanz gemessen werden soll, kann diese bereits in
Schritt a) der Nährlösung zugemischt werden.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine von der Außenwelt
abschirmbare Kulturschalenvorrichtung auf, in der zumindest
ein Träger lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist,
und der zumindest eine Träger ist abwechslungsweise mit Nähr
lösung, Waschlösung und erster Substanz behandelbar.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der erfin
dungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens,
weist der zumindest eine Träger die Form einer dünnen Platte
aus Glas, Kunststoff oder dgl. auf, die in waagrechter Position
unter eine Fixierleiste einer Kulturschale schiebbar ist, und
die Kulturschalenvorrichtung weist mehrere untereinander verbun
dene Trägeraufnahmebereiche auf. Dadurch können die Träger
in der waagrechten Position mit auf der oberen Oberfläche
aufgebrachten Kulturschicht gehalten werden, und mehrere
derartige Träger gleichzeitig unter gleichen Bedingungen
kultiviert werden. Die einzelnen Träger, die mit gleicher und
gleichmäßiger Zellkulturschicht versehen sind, können dann mit
verschiedenen, beispielsweise toxischen Substanzen behandelt
werden, so daß die dann erfolgenden vergleichenden Messungen
besonders aussagekräftig sind, da ja von exakt gleichen Zell
kulturschichten ausgegangen worden ist.
Die Erfindung wird anhand einiger ausgewählter Ausführungsbei
spiele im Zusammenhang mit der beiliegenden Zeichnung näher
beschrieben und erläutert. Es zeigt
die einzige Figur stark schematisiert eine ausgewählte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird.
die einzige Figur stark schematisiert eine ausgewählte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird.
Die in Fig. 1 schematisch gezeigte Kulturschalte 10 einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung, besteht aus einer rechteckigen
Kunststoffwanne mit einem diese überlappenden Deckel (hier
nicht gezeigt). Der Innenraum ist durch eine nicht über die
gesamte Länge durchreichende Längsleiste 12 sowie mehrere
davon abstehende Querleisten 14, die sich ebenfalls nicht
über die ganze Breite erstrecken, in mehrere Bereiche 18
unterteilt. In dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel sind
sechs Bereiche 18 gezeigt, in weiteren Ausführungsbeispielen
sind zehn solche Bereiche vorgesehen.
Jeder Bereich 18 ist dazu vorgesehen, einen Träger 20 aufzuneh
men.
Jeder Träger 20 kann dabei unter eine von der Längsleiste 12
etwa mittig zwischen zwei Querleisten 14 ebenfalls in Querrich
tung vorspringende Fixierleiste 16 geschoben werden, die
ausreichend lang ist, einen Träger 20 in einem Bereich 18 zu
halten, es jedoch andererseits ermöglicht, einen Träger 20
durch Ergreifen mit einer Pinzette aus einem Bereich 18 heraus
zuziehen.
In der zuvor angesprochenen Ausführung einer Kulturschale mit
zehn Bereichen, weist diese ein inneres Längenmaß von 290 mm
und eine Innenbreite von etwa 130 mm auf. Die Längsleiste
kann, in Abwandlung der oben beschriebenen Ausführung, auch über
die gesamte Schalenlänge verlaufen und diese in zwei abgeschlos
sene Hälften von jeweils fünf Bereichen teilen. Dadurch wird
die Möglichkeit geschaffen, in einem abgeschlossenen System
gleichzeitig Versuchs- und Kontrollbedingungen zu schaffen,
indem die Zellen einer Reihe mit einer Testsubstanz behandelt
werden, die gegenüberliegende Reihe aber unbeeinflußt bleibt.
Die lichte Höhe des Innenraums der Kulturschale beträgt 18
mm, die Höhe der Längs- bzw. Querleisten ab Innenboden etwa
15 mm. Die Länge der Fixierleiste beträgt 15 mm und sie ent
springt aus dem unteren Bereich der Längsleiste knapp oberhalb
des Wannenbodens, so daß ein darunter geschobener Träger in
der Nähe des Bodens der Kulturschale gehalten ist. Dadurch
ist sichergestellt, daß der Träger bei gefüllter Kulturschale
stets ausreichend mit Medium bedeckt ist und außerdem das
Zellwachstum bei geschlossener Schale unter dem Umkehrmikroskop
kontrolliert werden kann. Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführung
mit sechs Bereichen 18, ist der Übersicht halber nur eine
Fixierleiste 16 mit darunter eingeklemmten Träger 20 gezeigt,
es ist selbstverständlich, daß auch die anderen fünf Bereiche
18 gleichermaßen mit Fixierleisten 16 versehen sind und einen
Träger 20 aufnehmen können.
Die Kulturschale 10 ist mit einer Leitung 11 verbunden, über
die ein Medium in den Innenraum, wie dies durch einen Pfeil 26
angedeutet ist, eingeführt werden kann.
Bei der Durchführung des Verfahrens wird auf einen eingelegten
Träger 20 mittels einer Pipette 22 eine Zellkultur, bestehend
aus Mäusefibroblasten der Linie L 929, wie dies durch den
Pfeil 24 angedeutet ist, aufgebracht. Der Innenraum der Kul
turschale 10 ist dabei leer. Soll die Zellkultur unter sterilen
Bedingungen aufwachsen, so ist auf der Kulturschale 10, der
hier nicht gezeigte Deckel aufgebracht und der Innenraum wurde
zuvor mit den bereits eingebrachten Trägern 20 sterilisiert.
Der (hier nicht gezeigte) Deckel wird dann unter Sterilbedin
gungen abgenommen. Mittels der Pipette 22 wird anschließend
die Zellsuspension auf den Träger 20 aufpipettiert. Es wird
anschließend etwa 3 Minuten gewartet, bis die Zellen Kontakt
auf der Oberfläche gefunden haben, dann wird über die Leitung
11 ein Nährmedium zugeführt, wobei die Menge so bemessen wird,
daß das Nährmedium die Oberfläche des Trägers 20 überdeckt.
Je nach Nährmedium wird bereits nach einem, spätestens nach
zwei Tagen Konfluenz auf dem Träger 20 erreicht. Konfluenz
bedeutet eine dichtest mögliche Anordnung von haftenden, bzw.
adhärenten Zellen, als Monolayer in Kultur.
Ein derart mit einer Zellkultur 28 an adhärenten Zellen bewach
sener Träger 20, auch Cover Slip (CS) genannt, wird mit einer
Pinzette vorsichtig aus der Kulturschale 10 entnommen und in
eine weitere Kulturschale 30 eingelegt, die im Prinzip gleich
wie die Kulturschale 10 aufgebaut ist, so daß insoweit gleiche
Bezugszeichen verwendet werden. Die Kulturschale 30 ist dabei
mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS = phosphate
buffered saline) gefüllt, die als Waschlösung zum Abwaschen
der Nährlösung von der Zellkultur 28 dient. Der Träger 20
wird dabei derart unter die Fixierleiste 16 der Kulturschale
30 geschoben, daß die mit der Zellkultur 28 bewachsene Ober
fläche nach oben weist. Durch vorsichtiges Schwenken der
Kulturschale 30 oder des Trägers 20 wird die adhärente Zell
fläche gewaschen. Der Waschgang kann auch dadurch erfolgen,
daß der PBS-Waschpuffer durch die Kulturschale 30 durchgeführt
wird, wie dies durch die Pfeile 32 bzw. 34 angedeutet ist.
Dadurch, daß die Längs- bzw. Querleisten 12 bzw. 14 sich nicht
über die gesamte Kulturschale 30 ausbreiten, können mehrere
Träger gleichzeitig (d.h. im hier gezeigten Ausführungsbeispiel
sechs Träger 20) gespült werden.
Vor einer weiteren Behandlung wird die geschlossene Kulturschale
30 unter ein Lichtmikroskop 36 geschoben, um den Aufbau und
die Struktur der Zellkultur 28 zu kontrollieren. Dabei wird
festgestellt, ob tatsächlich Konfluenz erreicht ist, und ob
auch lediglich die gewünschte Kultur sich auf dem Träger 20
angesiedelt hat.
Die Größe der Kulturschale 30 ist dabei derart, daß sie direkt
in gängige Lichtmikroskope mit Umkehrvorrichtung eingeführt
werden kann, so daß diese Kontrolltätigkeit unter sterilen
Bedingungen durchgeführt werden kann.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird der mit adhärenten
Zellen versehene Träger 20 aus der Kulturschale 30 entnommen
und in eine weitere Kulturschale 40, die was die Ausmaße bzw.
die Raumaufteilung betrifft, gleich aufgebaut ist, wie die
zuvor beschriebenen Kulturschalen 10 bzw. 30.
Auch hier wird der Träger 20 mit der mit adhärenten Zellen
versehenen Fläche nach oben gerichtet unter eine Fixierleiste
16 geschoben.
Die Kulturschale 40 wird anschließend mit einer 0,01%igen
Lösung von Luminol (3-Aminophthalsäurehydrazid) derart gefüllt,
daß die bewachsene Oberfläche des Trägers 20 überschichtet
wird. Dabei kann die Luminollösung, wie dies durch einen Pfeil
42 angedeutet ist, vollautomatisch in die Zellkulturschale
40 eingeführt werden, so daß auch diese Behandlung auch wieder
unter sterilen Bedingungen ablaufen kann.
Die Luminol-Einwirkzeit beträgt etwa 1 bis 3 Minuten. Je nach
Zellkultur bzw. Versuchsbedingungen können selbstverständlich
auch andere Luminol-Konzentrationen verwendet werden.
Nach Ablauf der Einwirkungszeit wird der Träger 20 aus der
Kulturschale 40 entnommen und in eine weitere Kulturschale 50
überführt, in der eine auf etwa 37°C erwärmte PBS-Waschpuffer
lösung eingebracht ist, und in der das überschüssige, d.h.
nicht von der Zellkultur 28 aufgenommene Luminol abgewaschen
wird. Dieser Vorgang kann wiederum, wie zuvor beschrieben, durch
Schwenken der Kulturschale 50 bzw. des Trägers 20 oder auch,
wie in Fig. 1 gezeigt, durch Durchströmen der Kulturschale
50 mit dem PBS-Waschpuffer, wie dies durch die Pfeile 52 bzw.
54 angedeutet ist, durchgeführt werden.
Der Träger 20 ist nun so präpariert, daß er der eigentlichen
Messung zugeführt werden kann.
Dazu wird der Träger 20 in eine Quarzküvette 60 eingebracht,
die mit vertikal verlaufenden Führungsrillen 62 versehen ist,
zwischen die der Träger 20 eingeschoben werden kann.
Die Führungsrillen 62 sind dabei in der Nähe einer Rückwand
63 der Küvette 60 angeordnet. Die mit Zellen bewachsene Ober
fläche des Trägers 20 ist dabei auf eine Vorderseite bzw.
Vorderwand 65 der Küvette 60 zu gerichtet.
Die Küvette 60 ist mit einem Meßmedium gefüllt, das im vor
liegenden Fall wiederum dieselbe phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS) ist, die bereits zuvor beschrieben wurde und als Wasch
lösung diente.
Auf dem Boden der Küvette liegt ein mit Teflon überzogenes Ma
gnetstäbchen, ein sogenannter Rührfisch, das über eine hier
nicht gezeigte, unterhalb der Küvette angeordnete Rührvorrich
tung in Drehung versetzt wird, um das Meßmedium zu rühren.
Durch den Rührvorgang wird die die Lumineszenz auslösende
Substanz sofort und gleichmäßig mit den Zellen in Kontakt
gebracht. Die Meßküvette 60 weist eine Länge von 40 mm, eine
Breite bzw. Höhe von 50 mm auf und faßt in etwa 100 ml Flüssig
keit. Die Küvette wird in einer lichtdicht abgeschirmten,
hier nicht gezeigten Meßkammer auf einem Sockel, der auf einer
drehbaren Scheibe steht, deponiert. Die Meßkammer weist dabei
folgende Innenmaße auf: Länge und Breite jeweils etwa 290 mm,
Höhe etwa 265 mm. Im Abstand von der Küvette ist ein Photomul
tiplier 68 angeordnet, der von der Küvette 60 kommende
Strahlung, wie dies durch ein Pfeil 66 angedeutet ist, erfaßt.
Die lichtempfindliche Kathode des Photomultipliers ist dabei
auf -30°C gekühlt. Die einfallenden Photonen werden durch den
Photomultiplier 68 in Spannungsimpulse umgewandelt, die von
einer nachgeschalteten Elektronik 70 verstärkt und durch einen
angeschlossenen Computer 72 gespeichert und verarbeitet werden
können. Die Ergebnisse können graphisch oder numerisch durch
einen Drucker 74 mittels eines Ausdrucks 76 ausgedruckt werden.
Bei der eigentlichen Messung wird nach einer je nach Fragestel
lung beliebig langen Vorlaufzeit, während der das Meßobjekt,
d.h. die adhärenten Zellen auf dem Träger 20 unbeeinflußt
bleibt, 1 ml einer 1%igen Peroxidase-Lösung über eine lichtdichte
Zuleitung von außen, wie dies durch den Pfeil 64 angedeutet
ist, in die in der Meßkammer befindliche Küvette 60 injiziert.
Die Peroxidase löst die Oxidationsreaktion des Luminols aus,
die mit einer Lichtemission verbunden ist, d.h. es tritt jetzt
die zu messende Lumineszenz auf. Die Strahlungsintensität ist
abhängig von der durch die adhärenten Zellen des Trägers 20
aufgenommenen Menge an Luminol, die wiederum in Abhängigkeit
von der Aktivität bzw. Vitalität der Zellen steht. Dadurch
können direkt aus der Strahlungsintensität Rückschlüsse auf
die Aktivität bzw. Vitalität der Zellen gezogen werden.
Die Meßzeit kann beliebig lange gewählt werden. Da jedoch die
meßbare Photonen-Emission relativ schnell abklingt, ist es
sinnvoll, die Meßzeit auf maximal 5 Minuten zu beschränken,
wobei die Vorlaufzeit etwa höchstens 2 Minuten betragen soll.
Gemessen wird (in counts per second = cps) die Anfangsintensität
und die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe von Peroxi
dase. Es können auch andere geeignete Enzyme bzw. Enzymgruppen
verwendet werden.
In dem zuvor beschriebenen schematischen Verfahrensablauf
wurde die Präparation lediglich der Zellkultur beschrieben, so
daß die letztendliche Messung Aussagen über die Zellkultur
als solche gibt.
Dies ist aber nur ein kleiner Anwendungsbereich des erfin
dungsgemäßen Verfahrens. Ein weiteres Hauptanwendungsgebiet
ist die Untersuchung der Toxizität von Verbindungen, die mit
der Zellkultur in Verbindung gebracht wurden. Das bedeutet,
toxische Substanzen vermindern die Aktivität bzw. Vitalität
der Zellkulturen, was bei einer Lumineszenzmessung zu einer
verminderten Photonen-Emission führt.
Soll die Wirkung einer toxischen Substanz auf die Zellkultur
28 getestet werden, so sind verschiedene Möglichkeiten gegeben,
diese toxische Substanz einwirken zu lassen.
Eine erste Möglichkeit besteht darin, einen Träger 20, nachdem
er aus der Kulturschale 30 entnommen wurde, d.h. nachdem die
Bewuchsdichte mit einem Mikroskop 36 überprüft wurde, und
bevor er in die Kulturschale 40 mit Luminol eingebracht wird,
in eine weitere, hier nicht gezeigte, gleich ausgebildete
Kulturschale einzubringen, in der er dann mit der Lösung der
zu testenden Substanz überschichtet wird. Die Einwirkzeit
richtet sich nach der angenommenen Toxizität bzw. nach der
entsprechenden Fragestellung. Beim Testen beispielsweise der
Toxizität von Methanol auf die zuvor genannte Mäusefibroblasten
der Linie L 929 wurden Einwirkzeiten zwischen 1 bis 5 Minuten
gewählt, wobei verschiedene Konzentrationen an Methanol (100,
90, 80, 70, 40, 10 und 1%) getestet wurden. Nach Ablauf der
Einwirkzeit wird der Träger 20 wiederum, wie zuvor beschrieben,
in PBS-Puffer gewaschen und danach in die Kulturschale 40 zum
Überschichten mit Luminol gegeben.
Im eigentlichen Meßvorgang werden dann in der Küvette 60 einmal
die Zellkultur 28 ohne Einfluß der toxischen Substanz Methanol
gemessen und anschließend die mit den verschiedenen Konzentra
tionen behandelten weiteren Proben.
Durch die Abnahme der jeweiligen Photoemission kann dann der
Einfluß bzw. die Toxizität ermittelt werden.
Die Messungen sind deshalb besonders aussagekräftig, da die
Züchtung der adhärenten Zellen auf den Trägern 20, wie dies
zuvor in Zusammenhang mit den Kulturschalen 20 bzw. 30 be
schrieben wurde, unter exakt gleichen Bedingungen möglich
ist, so daß dann lediglich die Parameter der verschiedenen
Toxizitätmengen bzw. Einwirkzeiten zu berücksichtigen sind.
Diese Verfahrensweise eignet sich als Schnelltest zur Bestimmung
von Wirkungs- bzw. Toxizitätsgrenzen der eingesetzten Testsub
stanzen, z.B. von Umweltgiften, Arzneistoffen o. dgl.
Eine weitere Möglichkeit zum Einbringen der zu testenden
Substanzen besteht darin, diese bereits bei der Anzucht der
Zellen diesen beizumischen. Dabei wird die Testsubstanz dem
Nährmedium zugemischt, das, wie zuvor beschrieben, im ersten
vorbereitenden Schritt der Kulturschale 10 über die Leitung
11 zugeführt wird. Die durchgeführten Emissionsmessungen geben
dann aussagekräftige Informationen darüber, welchen Einfluß
diese Substanzen auf die Wachstumsrate bzw. die Vitalität der
Zellkulturen ausüben. Diese Möglichkeit bietet sich insbesondere
für längerfristige bzw. Langzeittests an und vor allem für
die Bestimmung von Wirkungs- bzw. Toxizitätsgrenzen hochver
dünnter Testsubstanzen.
Bei der Emissionsmessung wird dann die Anfangsintensität und
die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe der Peroxidase
gemessen. Der Vergleich von vitalen (d.h. unbeeinflußten)
Zellen zu toxisch beeinflußten Zellen (hier verschiedene
Konzentrationen an Methanol) ergibt eine unterschiedliche
Anfangsintensität, wobei die Strahlungsintensität der vitalen
Zellen jeweils deutlich höher liegt als diejenige von Zellen,
die geschwächt bzw. abgetötet wurden. Es konnte auch bei
abgetöteten Zellen noch eine gewisse Strahlung gemessen werden,
die damit erklärt werden kann, daß nicht alle Proteine von
abgetöteten Zellen sofort denaturieren und daher noch gewisse
Mengen an Luminol binden können.
Das zuvor anhand der schematischen Darstellung von Fig. 1
beschriebene Verfahren bediente sich in den einzelnen Behand
lungsschritten verschiedener Kulturschalen 10, 30, 40, 50.
Diese Aufteilung in verschiedene Schalen ist insbesondere
für wissenschaftliche Untersuchungen, die mit verschiedenen
zahlreich variierten Versuchsbedingungen ablaufen sollen,
geeignet.
Soll das Verfahren zur routinehaften Messung der Einflüsse
bestimmter Substanzen auf Zellkulturen gemessen werden, bei
spielsweise die Einwirkung eines Giftes oder Medikamentes auf
menschliche Zellen, so kann anstatt der verschiedenen Kul
turschalen nur eine einzige verwendet werden, in der dann
die einzelnen Schritte aufeinanderfolgend durchgeführt werden.
Wie zuvor beschrieben, sind die Kulturschalen 10, 30, 40 und
50 jeweils gleich aufgebaut gewesen, so daß die darin ablaufen
den Tätigkeiten auch in einer einzigen Kulturschale durchgeführt
werden können. Dabei ist die Kulturschale dann mit entsprechen
den Anschlüssen versehen, durch die nacheinanderfolgend die
Nährlösung beim Kultivierungsvorgang, anschließend die diversen
Waschlösungen bzw. Luminollösungen zugeführt bzw. abgeführt
werden können. Es ist dann nur noch erforderlich, den für die
Messung fertig präparierten Träger in eine Meßküvette zu
überführen, wobei auch dieser Vorgang vollautomatisch bzw.
unter sterilen Bedingungen ablaufen kann, so daß eine voll
automatische Durchführung des Verfahrens mit der erfindungs
gemäßen Vorrichtung möglich ist.
Nach Beenden einer Lumineszenzmessung haftet die Zellkultur
28 weiterhin am Träger 20, so daß es möglich ist, diesen Träger
nach der Messung wieder aus der Küvette 60 herauszunehmen,
beispielsweise mit dem Phosphatpuffer abzuwaschen und erneut
in eine Nährlösung oder Pufferlösung zu geben, d.h. die Zell
kultur ist nach einer Emissionsmessung nicht verloren, sondern
kann zu weiteren Untersuchungszwecken verwendet werden oder
auch lediglich aufbewahrt werden.
Claims (19)
1. Verfahren zur Bestimmung der Lumineszenz von Zellkul
turen, wobei diese mit einer lumineszierfähigen, die
natürliche Lumineszenz verstärkende, ersten Substanz
versehen werden, anschließend mit einer, die Lumineszenz
auslösende, zweiten Substanz behandelt werden, und die
Lumineszenz photoelektronisch erfaßt wird, ge
kennzeichnet durch,
- a) Kultivieren der zu untersuchenden Zellkultur auf einem Träger haftend,
- b) Behandeln der auf dem Träger haftenden Zellkultur mit der lumineszenzfähigen ersten Substanz,
- c) Entfernen der überschüssigen, nicht von der am Träger haftenden Zellkultur aufgenommenen ersten Substanz, und
- d) Messen der lediglich von der Zellkultur emittierten Strahlung nach Zugabe der zweiten, die Lumineszenz auslösenden Substanz.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge
kennzeichnet, daß in Schritt a) als Träger
ein dünnes Plättchen aus Kunststoff, Glas o. dgl.
verwendet wird, dessen eine Oberfläche mit einem Zell
kultur-Monolayer kultiviert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß auf die Oberfläche
des Trägers zunächst nur die Zellkultur aufgebracht
wird und dieser ein gewisser Zeitraum, vorzugsweise
etwa 3 Minuten, gegeben wird, und anschließend eine
Nährlösung zugegeben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge
kennzeichnet, daß der Träger waagrecht
gehalten ist, daß die Zellkultur auf die obere Fläche
aufgebracht wird, und daß der Träger mit der Nährlösung
überschichtet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß der
Träger nachfolgend an Schritt a) in eine Waschlösung
eingetaucht wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Waschlösung eine
phosphatgepufferte Salzlösung ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß die
mit der Zellkultur bewachsene Fläche des Trägers jeweils
nach oben weist oder senkrecht eingetaucht wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß
nachfolgend an Schritt a), jedoch vor Schritt b), eine
Kontrolle der auf dem Träger haftenden Zellkultur
durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt b) die auf dem Träger haftende Zellkultur mit
einer die lumineszenzfähige erste Substanz aufweisenden
Flüssigkeit überschichtet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch ge
kennzeichnet, daß die erste Substanz Luminol
oder eine andere, die Lumineszenz hervorrufende und/oder
verstärkende Substanz ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt c) der Träger in eine Waschlösung getaucht
und in dieser die erste Substanz abgewaschen wird,
soweit sie nicht von den Zellen gebunden wurde, ohne
dabei die adhärenten Zellen zu lösen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch ge
kennzeichnet, daß bei dem Waschvorgang
der plattenförmige Träger waagrecht mit der Zellkultur
schicht nach oben gerichtet oder senkrecht eingetaucht
wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Waschlösung
dieselbe wie die zum Abwaschen der Nährlösung ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt d) ein plattenförmiger Träger in ein eine
Meßlösung aufweisendes Gefäß gestellt wird, wobei die
mit der Zellkultur bewachsene Fläche auf ein photoelek
tronisches Meßgerät zu gerichtet ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Meßlösung dasselbe
Medium ist, wie das Waschmedium zum Abwachen der Nähr
lösung bzw. der lumineszenzfähigen Substanz.
16. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden,
bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussen
den dritten Substanz gemessen wird, dadurch
gekennzeichnet, daß vor Schritt b) die
anhaftende Zellkultur mit der beeinflussenden Substanz
in Berührung gebracht wird, und daß anschließend diese
Substanz abgewaschen wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem
die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussenden
dritten Substanz gemessen wird, dadurch ge
kennzeichnet, daß in Schritt a) einer
Nährlösung zur Kultivierung der Zellkultur die beein
flussende Substanz zugemischt ist.
18. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach einem
der Ansprüche 1 bis 17, mit einer Küvettenvorrichtung
(60) zur Aufnahme einer mit einer lumineszierfähigen
Substanz versehenen Probe, wobei in die Küvettenvorrich
tung (60) eine zweite, die Lumineszenz auslösende
Substanz einführbar ist, sowie mit einer Photomulti
pliervorrichtung (68, 70, 72, 74, 76) zum Erfassen,
Zählen und Auswerten der von der Probe ausgestrahlten
Strahlung, dadurch gekennzeich
net, daß zumindest eine von der Außenwelt abschirm
bare Kulturschalenvorrichtung (10, 30, 40, 50) vorgesehen
ist, in der zumindest ein Träger (20) lösbar unter
sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und daß der
zumindest eine aufgenommene Träger (20) abwechslungsweise
mit Nährlösung, Waschlösung, lumineszenzfähiger ersten
Substanz behandelbar ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch ge
kennzeichnet, daß der zumindest eine Träger
(20) die Form eines dünnen Plättchens aus Glas, Kunst
stoff o. dgl. aufweist, das in waagrechter Position
unter eine Fixierleiste (16) einer Schale (20, 30, 40,
50) schiebbar ist, und daß die Schale mehrere untereinan
der verbundene Trägeraufnahmebereiche (18) aufweist.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873737649 DE3737649A1 (de) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
CH409188A CH677407A5 (de) | 1987-11-06 | 1988-11-03 | |
FR8814418A FR2622973A1 (fr) | 1987-11-06 | 1988-11-04 | Procede de determination de la luminescence de cultures cellulaires et dispositif pour mettre en oeuvre ce procede |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873737649 DE3737649A1 (de) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3737649A1 true DE3737649A1 (de) | 1989-05-24 |
Family
ID=6339892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19873737649 Ceased DE3737649A1 (de) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CH (1) | CH677407A5 (de) |
DE (1) | DE3737649A1 (de) |
FR (1) | FR2622973A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19538768A1 (de) * | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Popp Fritz Albert Prof Dr | Verfahren zum Nachweis mikrobieller Infektion |
DE10058095A1 (de) * | 2000-11-03 | 2002-05-16 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten durch Chemilumineszenz |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2659981B1 (fr) * | 1990-03-22 | 1992-07-24 | Vef Sa | Procede et dispositif d'analyse bacteriologique. |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1598855B2 (de) * | 1965-01-28 | 1975-11-13 | Bausch & Lomb Inc., Rochester, N.Y. (V.St.A.) | Verfahren und Detektor zur Überwachung von Luft auf die Anwesenheit toxischer Substanzen |
DE2722391A1 (de) * | 1976-12-14 | 1978-06-15 | Univ California | Verfahren zur bestimmung eines chemischen stoffes durch ermittlung freigesetzter elektromagnetischer strahlung |
DE2849708A1 (de) * | 1977-11-17 | 1979-05-23 | Welsh Nat School Med | Verfahren zur feststellung und quantitativen bestimmung biologisch wichtiger substanzen |
GB2178847A (en) * | 1985-08-07 | 1987-02-18 | Philips Electronic Associated | Testing for the presence of living organisms at the surface of an object |
-
1987
- 1987-11-06 DE DE19873737649 patent/DE3737649A1/de not_active Ceased
-
1988
- 1988-11-03 CH CH409188A patent/CH677407A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-04 FR FR8814418A patent/FR2622973A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1598855B2 (de) * | 1965-01-28 | 1975-11-13 | Bausch & Lomb Inc., Rochester, N.Y. (V.St.A.) | Verfahren und Detektor zur Überwachung von Luft auf die Anwesenheit toxischer Substanzen |
DE2722391A1 (de) * | 1976-12-14 | 1978-06-15 | Univ California | Verfahren zur bestimmung eines chemischen stoffes durch ermittlung freigesetzter elektromagnetischer strahlung |
DE2849708A1 (de) * | 1977-11-17 | 1979-05-23 | Welsh Nat School Med | Verfahren zur feststellung und quantitativen bestimmung biologisch wichtiger substanzen |
GB2178847A (en) * | 1985-08-07 | 1987-02-18 | Philips Electronic Associated | Testing for the presence of living organisms at the surface of an object |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, Vol. 1, 1976, S. 47-50 * |
Journal of Cellular an Comparative Physiology, Bd. 53, Jg. 1959, S. 279-305 * |
Nachr. Chem. Techn., Bd. 20, 1972, S. 478 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19538768A1 (de) * | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Popp Fritz Albert Prof Dr | Verfahren zum Nachweis mikrobieller Infektion |
DE19538768C2 (de) * | 1995-10-18 | 2003-02-27 | Buehler Ag | Verfahren zum Nachweis einer mikrobiellen Infektion |
DE10058095A1 (de) * | 2000-11-03 | 2002-05-16 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten durch Chemilumineszenz |
DE10058095C2 (de) * | 2000-11-03 | 2003-12-18 | Fraunhofer Ges Forschung | Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten durch Chemilumineszenz |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2622973A1 (fr) | 1989-05-12 |
CH677407A5 (de) | 1991-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69624593T2 (de) | Verfahren zum nachweis von bakterien | |
DE2823916C2 (de) | ||
DE2512730C2 (de) | Vorrichtung zum Durchführen immunologischer Nachweisreaktionen und Verfahren unter Verwendung einer solchen Vorrichtung | |
DE2021558A1 (de) | Behandlungsbehaelter fuer mikrobiologische,serologische,immunologische,klinisch-chemische und aehnliche Laboratoriumsarbeiten | |
DE2121994C3 (de) | Ermitteln der Empfindlichkeit von Bakterienstämmen auf antibiotische und/oder chemotherapeutische Mittel | |
DE69430645T2 (de) | Einheit zur Bestimmung von Rückständen antibakterieller Verbindungen in Flüssigkeiten | |
DE69026602T3 (de) | Vorrichtung und verfahren zum testen der antimikrobiellen empfindlichkeit von mikroorganismen | |
DE68914871T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von mikro-organismen. | |
WO2003006684A2 (de) | Vorrichtung und verfahren zum nachweis der photosynthese-hemmung | |
DE2649902C3 (de) | Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben | |
DE60130970T2 (de) | Reagenziensatz zur detektion von mikroorganismen, vorrichtung zur quantifizierungvon mikroorganismen und verfahren zur quantifizierung von mikroorganismen | |
DE3737649A1 (de) | Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens | |
DE102006010907A1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Molekülen oder Molekülteilen in biologischen Proben | |
Robbins et al. | Quantitative study of motor endplates in muscle fibres dissociated by a simple procedure | |
DE19751581C2 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Adhäsion auf ihrer Oberfläche | |
Serafini-Fracassini et al. | Histochemical observations on the carotid body of the dog | |
Bereczky | Fixations-und Färbungsschnellverfahren bei quantitativen ökologischen Untersuchungen von Protozoen in Binnengewässern | |
DE102009013957B4 (de) | Verfahren und Mittel zum Nachweis der Aktivität von Osteoklasten | |
DE19945553B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von mindestens einer multiresistenten Keimart, insbesondere MRSA- und VRE-Keimen | |
Hall | Cytoplasmic inclusions of Trichamoeba and their reaction to vital dyes and to osmic and silver impregnation | |
DE102008010436A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Messung von Lumineszenz und Fluoreszenz von transfizierten Zellen oder Organteilen | |
DE2004560A1 (de) | Diagnostische Methode und Vorrichtung zum Nachweis von Bakterien | |
EP1586656B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Photosynthese-Aktivität von Algen | |
EP0727480A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Pharmakokinetik bzw. Toxikokinetik von Testsubstanzen mit Hilfe von in-vitro-Zellkultursystemen und dafür geeignete Vorrichtungen | |
DE2212573A1 (de) | Pruefmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8131 | Rejection |