DE3724016A1 - Methoden fuer die gentechnologische produktion von antigenen sowie deren nutzung in einem neuen ansatz fuer bestaetigungsteste fuer antikoerper am beispiel des humanen immundefizienz-virus (hiv) - Google Patents

Description

Einleitung

Als ein Vertreter der humanen erworbenen Immundefizienz (AIDS) sowie deren Vorstadien wurde ein Retrovirus ermittelt, dessen verschiedene Isolate zunächst "humanes T-lymphotrophes Retrovirus III (HTLVIII), Lymphadenopatie-Virus (LAV) oder AIDS-assozierter Retrovirus (ARV) benannt wurden, die aber inzwischen unter dem Sammelbegriff HIV 1 (Humanes Immundefizienz- Virus 1) vereinigt wurden. Die komplette genetische Information einer Reihe verschiedener Isolate ist inzwischen bestimmt worden (z. B. Ratner et al, Nature, 313, (1985), 277-284; Wain-Hobson et al., Cell, 40, (1985), 9-17; Muesing et al, Nature, 31, (1985), 450-458; Sanchez-Pescador et al, Science, 277, (1985), 484-492).

Die im Virus-Partikel enthaltene Erbinformation in Form von RNA wird nach Infektion von T4-Rezeptor-tragenden Zellen durch eine virale reverse Transkriptase in DNA umgesetzt und als Provirus in zelluläre Sequenzen integriert. Dieser Provirus ist zwischen 9734 bp und 9749 bp lang und besitzt an beiden Enden ein LTR (long terminal repeat), welche für Regulation und Initiation der Synthese viraler Produkte verantwortlich sind. HIV-1-Viren besitzen viele für Retroviren charakteristische genetische Merkmale (Abb. 1): am 5′-Ende sitzt nach den LTR-Sequenzen das sogenannte gag-Gen (group specific antigen), dann folgen das pol-Gen mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase und das Gen für das Hüllprotein (env).

Zusätzlich besitzt das Virus noch einige Protein-kodierende Regionen, die eine Einordnung in die Retovirus-Untergruppe der Lentiviren erlauben. Es handelt sich dabei um SOR-1, zwischen pol und env gelegen, um 3′-ORF, vor dem 3′-LTR, sowie um TAT und ART, deren kodierenden Regionen getrennt auf kurzen Leseramen vor und nach dem env-Gen liegen und deren mRNA durch "splicing" entstehen.

SOR-1, 3′-ORF, TAT und ART sind Regulationsproteine, die für Latenz des Provirus in der Zelle sowie das Anschalten der Virussynthese auf transkriptioneller und translationeller Ebene verantwortlich sind.

Das HIV-1-gag-Gen wird als 512-Aminosäure (aa)-Protein translatiert und anschließend durch eine virale Protease in die gag-Proteine p17, p24 und p15 gespalten. Diese Strukturproteine bilden die virale Proteinhülle (core) in das die RNA und reverse Transkriptase eingelagert werden.

Das pol-Gen wird ebenfalls als ein Polprotein-Vorläufer synthetisiert und dann in die Protease, die reverse Transkriptase sowie eine Endonuklease (Integrase) prozessiert.

Als weiteres Strukturprotein sitzt das env-Genprodukt in der von der infizierten Zelle stammenden Lipidmembran. Das glykosylierte Protein wird als 160 kDa großer Vorläufer (gp160) synthetisiert und in gp120 und gp41 gespalten. Die nach bisherigen Erkenntnissen gewonnene Vorstellung geht davon aus, daß gp120 keine Membranverankerung aufweist und nur durch Wechselwirkungen an das gp41 gebunden ist. Das gp41 sitzt als Transmembranprotein in der Lipidschicht wobei der N-terminale Teil außerhalb der Zelle liegt.

gp120 scheint für die spezifische Anlagerung an den T4-Rezeptor der Zielzelle verantwortlich zu sein, während gp41 wahrscheinlich die Fusion der Membranen und damit das Eindringen in die Zelle mittels hydrophober Bereich am N-terminalen Ende bewerkstelligt.

Die Übertragung von HIV 1 erfolgt in den allermeisten Fällen durch direkten Blut-Blut- Kontakt. Eine Erstinfektion kann asymptomatisch verlaufen, in vielen Fällen kommt es bedingt durch eine Virämie zu Grippe-artigen Symptomen.

Nach einem Zeitraum von einigen Wochen bis Monaten sind Antikörper gegen virale Proteine im Serum nachweisbar. Der Erreger selbst bleibt aber über Jahre hinweg latent in T4-Rezeptor- tragenden Zellen latent vorhanden. Durch nur in Ansätzen verstandene Ereignisse werden die in das Genom integrierten Viren wieder aktiviert und kommt zu einer Elimination von T4-Zellen. Als Symptome treten Lymphknoten-Schwellungen, Fieber, Gewichtsabnahme und Durchfall auf. Bedingt durch eine Infektion von Zellen des Hirnstamms kann es teilweise zu einer Demenz kommen. Schließlich erfolgen aufgrund einer fortschreitend reduzierten zellulären Immunantwort schwere opportunistische Infektionen, die das Vollbild von AIDS ergeben und in allen bekannten Fällen mit dem Tod endeten.

Diagnose des HIV-1-Antikörperstatus

Es ist von höchster Wichtigkeit, bei Infizierten frühzeitig und präzise deren Status festzustellen, da latent Virus-tragende Personen über Jahre hinweg infektös bleiben und andere anstecken können. Als wichtigster und relevanter Marker wird hierzu die Bestimmung der Antikörper gegen HIV 1 benutzt. Es hat sich gezeigt, daß bevorzugt Antikörper gegen das p24 (ein gag-Protein) sowie gegen gp41 (Transmembranbestandteil von env) gebildet werden. Nach einer typisch verlaufenden Erstinfektion tauchen zuerst Antikörper gegen p24 auf, erst später folgen Antikörper gegen die env-Proteine. Umgekehrt ist es dann im Spätstadium der Krankheit; hier scheinen die anti-p24-Titer wieder zu sinken, während anti-gp41-Titer länger nachweisbar sind. Diese Charakteristika kann man sich für Diagnose und Verlaufsvorhersage zunutze machen.

Für die Diagnostik sind eine Reihe von Verfahren zur Antikörperbestimmung etabliert worden.

Zur Zeit hauptsächlich in Anwendung sind:

• - Immunfluoreszenzbestimmung mit HIV-1-infizierten Zellen
• - Western Blots mit gereinigtem viralen Antigen
• - ELISA mit rekombinant in Prokaryoten produzierten Antigen

Zusätzlich erfolgt in manchen Fällen noch eine Diagnose durch Isolierung des Virus aus Vollblut und Bestimmung der reversen Transkriptase-Aktivität im Zellkulturüberstand.

Als ein Screnning-Test wird meistens ein ELISA mit bakteriell produziertem p24 und/oder gp41 verwendet. Da die verwendeten Antigene nicht völlig frei von Bakterienproteinen sind oder als Fusionsproteine mit bakteriellen Anteilen produziert worden waren, kommt es häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Deshalb werden solche Seren grundsätzlich Bestätigungstests unterzogen, die in der Regel Western Blots mit gereinigtem viralen Antigen und Immunfluoreszenz-Tests mit HIV-1- infizierten Zellen sind.

Für den Western Blot werden große Menge an T4-Zellen herangezogen, mit HIV 1 infiziert und das Virus aus dem Überstand durch mehrere Ultrazentrifugationsschritte isoliert und pelletiert. Anschließend erfolgt eine Auftrennung der viralen Bestandteile durch eine präparative SDS- Gelelektrophorese und ein Transferrieren dieser Proteine auf Nitrozellulose. Der Nitrozellulosefilter wird dann in dünne Streifen geschnitten, mit Patientenserum inkubiert, gebundenes anti-HIV-I-IgG durch einen zweiten anti-human-IgG-Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, und eine Färbereaktion nachgewiesen.

Dieses Verfahren besitzt jedoch einige gravierende Nachteile:

• 1. Es ist sehr teuer, zeitaufwendig und auch nicht ungefährlich, die benötigte große Menge an viralem Antigen zu produzieren.
• 2. Der für eine Entscheidung wohl relevanteste Marker, gp41, ist in den Viruspartikeln in nicht allzugroßen Mengen vorhanden, zusätzlich erscheint dieses Protein aufgrund seiner Glykosylierung auf dem Blot als diffuse Bande, was eine Identifizierung der anti-gp41-Reaktion schwierig und insensitiv macht.
• 3. Aufgrund von Kreuzreaktionen mit zellulären Proteinen, die als Verunreinigung immer in der Viruspräparation sind, kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen.
• 4. Da bei dieser Art von Western Blots nur schmale Streifen verwendet werden, fehlt eine Kontrollmöglichkeit, etwa der Vergleich mit einer Präparationen aus Virus-freien Zellen. Und selbst dann wäre noch kein sicherer Abgleich möglich, da infizierte und Virus-produzierende Zellen sicherlich ein anders Spektrum von zellulären Proteinen mitexprimieren, die dann als neue Banden auf dem Blotstreifen auftauchen würden.

Gentechnologische Grundlagen

Die für das hier vorzustellende Verfahren verwendeten HIV-1-Antigene werden in prokaryotischen Escherichia-coli-JM109-Zellen (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, (1985), 102-119) produziert. Dabei handelt es sich um einen Stamm mit folgenden genetischen Markern: {recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ ^-, Δ(lac-proAB), [F′, traD96, proAB, lacI^qZΔM15]}. Entscheidend für eine Klonierung und nachfolgende Expression mit diesem Stamm ist einmal, daß die zelluläre β-Galaktosidase am N-Terminus eine Deletion aufweist, d. h. daß diese Bakterien keine Laktose oder das Strukturanalogon 5-Bromo-3-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) spalten können. Die Spaltung von X-Gal ergibt eine blaue Farbreaktion. Zum Zweiten ist dieser Stamm ein Überproduzent des lac-Repessor-Gens: Dieses Genprodukt ist normalerweise in der Zelle nur in wenigen Kopien vorhanden und verhindert durch spezifische Anlagerung an einen Bereich des lac-Promotors eine Transkription des lac-Operons. Falls das Substrat Lactose oder das Strukturalogon Isopropyl-thiogalaktosid (IPTG) in der Zelle auftaucht, lagern sich diese an den DNA-gebundenen Repressor an, was eine Strukturänderung und Ablösung von der DNA bewirkt. Nun kann eine Transkription und Translation erfolgen. Für eine Kontrolle von lac-Promotoren- tragenden Plasmiden ist ein lac-Repressorprotein-Überproduzent vonnöten, da die Plasmide in hoher Kopienzahl in der Zelle vorliegen, und deshalb auch eine entsprechend große Anzahl von Repressormolekülen benötigt wird.

Durch einen zweiten Regulationsmechanismus wird verhindert, daß das lac-Gen in der Gegenwart von Glukose transkribiert wird (CAP). Dies wird umgangen, indem ein Medium verwendet wird, das keine Glucose enthält.

Für die Expression wurden die von Messing et al. (Yanisch-Perron et al, siehe oben; Vieira und Messing, Gene, 19, (1982), 259-268) geschaffenen pUC-Vektoren verwendet. Diese kleinen ca. 2,7 kb großen Plasmide besitzen das Gen für β-Lactamase, was als Resistenzmarker bei der Klonierung benutzt wird, sowie den lac-Promotor mit dem Transkriptions- und Translationstart des β-Galaktosidase-Gens. Nach den kodierenden Sequenzen für vier Aminosäuren folgen Restriktionsenzym-Schnittstellen, die sich in Anzahl und Orientierung in den einzelnen Vektoren unterscheiden (Abb. 2).

3′ dieser Insertionsstellen für zu exprimierende DNA-Fragmente folgt die kodierende Region für das lacZα-Peptid sowie (im selben Leserahmen) noch ca. 50 durch pUC-kodierte Aminosäuren. Dieses ca. 11 kDa große Proteinsegment ist in der Lage, die zuvor beschriebene N-terminale Deletion der zellulären β-Galaktosidase zu komplementieren und die Enzymaktivität wieder herzustellen (α-Komplementation). Das bedeutet, daß JM109 mit pUC-Plasmiden auf X-Gal- Platten als blaue Kolonien erscheinen, Plasmide mit einer Insertion dagegen aufgrund fehlender α-Peptid Produktion keine Farbreaktion mehr verursachen können.

Ausnahmen ergeben sich, wenn die Insertion nicht allzu groß ist und der Leserahmen an den 5′- und 3′-Integrationsstellen mit dem lacZ-Leserahmen übereinstimmt. Es entsteht dann ein Fusions- lacZα-Peptid, das in einigen Fällen durchaus noch in der Lage ist, zu einer aktiven β- Galaktosidase zu komplementieren. Eine andere Möglichkeit blaue Kopien trotz eines Inserts zu erhalten, kann durch Translationssignale (Shine-Dalgarno Sequenz) und ein Methionin im lacZα- Leserahmen verursacht werden.

Eine Expression von DNA-Fragmenten in diesen pUC-Vektoren wird durch folgende Schritte erreicht: Isolation und Insertion des gewünschten Fragments in den geeigneten pUC-Vektor im selben Leseraster, Charakterisierung durch Restriktionsenzym-Verdau, Anzucht des Klons in Flüssigkultur und Induktion des lac-Promotors durch IPTG, gefolgt von einer zwei- bis dreistündigen Synthesephase.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Das hier vorzustellende Verfahren umgeht die vorher aufgeführten Restriktionen bei der Bestimmung des HIV-1-Antikörperstatus (Bestätigungs-Western Blot), ist zudem extrem billig in der Herstellung und ungefährlich, da bakteriell exprimierte Antigen verwendet werden. Es handelt sich dabei um einen Western Blot mit verschiedenen bakteriellen Lysaten, die unterschiedliche HIV-1-Antigene enthalten. Hierzu wurden Escherichia-coli-Klone geschaffen, die gp41, p24, p17 und pol exprimieren.

Von gp41, dem Transmembran-Protein aus der Lipidhülle des Virus, wurde ein Bereich von ca. 160 Aminosäuren verwendet, von dem bekannt ist, daß er in allen Isolaten sehr konserviert ist und daß bei einem Großteil der HIV-1-Positiven Antikörper dagegen vorhanden sind. Kloniert wurde dieser Bereich aus dem WMJ-I-Isolat aus dem Labor von B. Gallo (Hahn, B. H., Shaw, G. M., Taylor, M. E., Redfield, R. R., Markham, P. D., Salahuddin, S. Z., Wong-Staal, F., Gallo, R. C., Parks, E. S. and Parks, W. P.: Genetic Variaton in HTLV-III/LAV over time in patients with Aids or at risk of Aids. Science, 232, (1986) 1548-1554); das resultierende Expressionsplasmid pUC8RRstop besitzt am 3′-Ende ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches für einen Translations- und Transkriptions-Stop sorgt. Exprimiert wird der gp41 Bereich fusioniert am N- und C-Terminus nur mit wenigen Fremdaminosäuren.

Das Plasmid pUC9HPvBg10 kodiert und exprimiert den gesamten p24-kodierenden Bereich und zusätzlich noch einige Aminosäuren der flankierenden Proteine, dem p17 sowie p15. Aufgrund einer zweifachen Insertion in Tandemorientierung des kodierenden Bereichs exprimierte dieser Klon eine ungewöhnliche große Menge des rekombinanten p24.

Das Plasmid pUC18Xmnstop enthält den p17-kodierenden Bereich und weist am 3′-Ende des Inserts denselben Stop-Linker wie das gp41-Konstrukt auf.

Das pol-Gen schließlich ist durch zwei Plasmid-Konstruktionen vertreten: Einmal pMFPOL, welches ein Fusionsprotein mit dem C1-Repressormolekül der reversen Transkriptase kodiert; zum Zweiten pUC19EBg, welches die Protease, die reverse Transkriptase sowie einen Teil der Integrase kodiert.

pol- und p17-Expressionsprodukte müssen nicht in jedem Fall in dem vorgestelltem Test miteingesetzt werden, da Antikörper gegen p24 in den allermeisten Fällen dieselbe Signifikanz aufweisen.

Dagegen ist ein Fusionskonstrukt aus p24 und gp41 von entscheidender Wichtigkeit für den Test. Dieses von pUC19RRPvBg kodierte Protein besteht aus einem gp41-kodierenden Fragment gefolgt von dem p24-Tandem-Insert und wird sowohl von anti-p24- als auch von anti-gp41- Antikörpern erkannt. Die beiden Antigene sind also jeweils doppelt im Test vorhanden, für den Fall, daß aufgrund von unspezifischen Reaktionen gegen E. coli-Proteine eines der beiden Nicht- Fusionsantigene nicht auswertbar ist.

Entscheidend dabei ist, daß diese rekombinanten Antigene nur mit einigen wenigen Aminosäuren - durch Klonierung bedingt - fusoniert sind. Dadurch kann mit einiger Sicherheit eine Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen bakterielle Proteine ausgeschlossen werden.

Für den hier vorzustellenden Test sind diese Expressionsplasmide jedoch nicht bindend; es können genauso andere Konstruktionen, die eine Expression derselben HIV-1-Proteinsegmente zulassen, verwendet werden. Ebenso können DNA-Sequenzen aus anderen HIV-1-Isolaten benutzt werden, da die exprimierten Segmente aus konservierten Regionen des viralen Genoms stammen. Die hier vorgestellten und im Folgenden genauer beschriebenen Plasmidkonstruktionen sind also nur Beispiele, andere liegen ebenfalls vor und können analog eingesetzt werden. Dasselbe gilt für einen Einsatz von HIV-2-Expressionsplasmiden, die für einen gleich gestalteten Einsatz in der Diagnostik eingesetzt werden können.

Die verschiedenen bakteriellen Lysate werden nebeneinander durch SDS-Elektrophorese aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferriert, wobei entweder alle oben aufgeführten Antigene oder aber nur p24, gp41 sowie ein daraus resultierendes Fusionsprodukt, auf das später eingegangen wird, genügen.

Die direkte Verwendung bakterieller Lysate bringt wesentliche Vorteile mit sich. Zum einen sind sie extrem leicht und ohne Aufwand herzustellen, sehr billig und vor allem völlig ungefährlich. Ein weiterer Vorteil ist es, daß keinerlei Aufreinigung der Antigene vonnöten ist. Gerade in der Verwendung von Bakterienlysaten liegt ein wesentlicher Vorteil des hier vorgestellten Verfahrens, denn dadurch ist im Gegensatz zu den konventionellen Western Blots mit viralem gereinigten Antigen jederzeit eine sichere und vollständige Kontrolle von spezifischer bzw. unspezifischer Reaktion gegeben. Da die verwendeten rekombinanten Antigene alle verschiedene Molekulargewichte aufweisen, genügt ein Vergleich mit der Nachbarspur, um eine Entscheidung zu treffen; d. h. es ist völlig unwichtig, wie stark die Reaktion gegen bakterielle Proteine ist, da diese dann in allen Spuren auftritt; hingegen spezifische anti-HIV-1-Reaktionen nur an jeweils einer definierten Stelle zu finden sein werden.

Theoretisch könnte ein HIV-1-Antigen durch eine Reaktion mit einem bakteriellen Protein derselben Größe überlagert werden. Aus diesem Grund wird bei dem Test auch ein Lysat verwendet, das ein schon angesprochenes Fusionskonstrukt von p24 und gp41 enthält und das aufgrund seiner Größe auch an anderer Stelle eine Reaktion verursachen wird. Die beiden wichtigsten diagnostischen Marker sind also doppelt vorhanden, für den Fall, daß eines der beiden aufgrund einer überlagernden unspezifischen Reaktion nicht auswertbar ist.

Ein weiterer entscheidender Vorteil des Systems ist die erheblich bessere Sensitivität der anti-gp41-Reaktion. Wie schon ausgeführt, erscheint das aus Viruspartikeln gewonne gp41 als schwache, diffuse Bande im Blot und ist zudem oft von Reaktionen gegen zelluläre Proteine überlagert. Das im Bakterienlysat benutzte rekombinante Fragment von gp41 ist dagegen in ausreichender Menge vorhanden und erscheint zudem als scharfe Bande. Eine anti-gp41-Reaktion kann wohl als spezifisch für eine HIV-1-Infektion gewertet werden, da hier keine Kreuzreaktionen mit verwandten Retroviren auftreten werden. Die erheblich höhere Sensitivität des rekombinanten gp41 kann als die entscheidende Verbesserung dieses Testes angesehen werden.

Das vorgestellte Verfahren verbindet die Vorteile des bisher benutzten Western Blots, die in der Darstellung einer Reaktion als spezifische Bande liegt, mit der von rekombinant produzierten Antigenen, die sehr kostengünstig sind, ohne Aufreinigung hier eingesetzt werden können, sensitiver sind und von unspezifischen Reaktionen unterschieden werden können.

Die eben geschilderten Vorteile dieses Systems können jedoch auch auf andere Bereiche von serologischer Diagnostik angewendet werden. Voraussetzung ist dabei lediglich, daß rekombinante Bakterienklone vorliegen, die relevante Antigene in ausreichend großer Menge als unfusionierte Proteine produzieren.

Kurze Beschreibung der Abbildungen Abb. 1  Genom und kodierende Regionen von HIV 1

Der obere Teil stellt das über 9000 bp lange Genom von HIV 1 mit den beiden LTR's dar. Im unteren Teil die Lage der Protein-kodierenden Bereiche, sowie die nach Spaltung entstehenden Produkte.

Abb. 2  pUC-Plasmide, Polyklonierungsstelle und Leserahmen

Im unteren Teil ist der für alle ca. 2,7 kb großen pUC-Plasmide gleiche Aufbau gezeichnet mit dem "Origin of replication" (ori), dem β-Laktamase-Gen (Ap^R), dem lac-Promotor und Operator (lacPO) sowie dem lacZα-kodierenden Bereich (Balken). Am 5′-Ende dieser Sequenz befinden sich die Insertionsstellen mit den für die einzelnen Vektoren unterschiedlichen Restriktionsenzyme. Diese sowie die sich daraus ergebenden Leserahmen mit den Aminosäuresequenzen sind im oberen Teil aufgeführt. Die Translation des von lacP gestarteten Transkrips beginnt mit dem ATG am linken Ende der Sequenzen.

Abb. 3  gp41-kodierende Region und exprimiertes Segment

Im oberen Teil ist das 160 kDa große env-Produkt als Balken eingezeichnet mit den Transmembranregionen (TM), von denen die rechte wahrscheinlich für die Verankerung in der Zellmembran sorgen, während die beiden linken mehr hypothetisch sind und eventuell bei der Fusion beteiligt sind. Darunter ist die Lage einiger Restriktionsenzyme angegeben (B, BglII; R, RsaI; P, PstI). Der ganz unten eingezeichnete Balken gibt die Lage des für die Expression verwendeten RsaI-RsaI Fragments an.

Abb. 4  DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC18RRstop

Der Computerdruck listet die für die Expression von rekombinanten gp41 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt. Das synthetische Desoxyoligonuleotid ist als PstI/HindIII-Fragment zwischen bp 540 und 590 inseriert worden und beinhaltet Translationsstops in allen drei Rastern bis zu der Bgl-II-Stelle und danach einen Transkriptionsstop.

Abb. 5  gag-kodierende Region mit p17 und p24 exprimierten Regionen

Im oberen Teil ist als Balken der 55 kDa große gag-Vorläufer mit den einzelnen Teilen, p17, p24 und p15 eingezeichnet; darunter die Lage einiger Restriktionsenzym-Stellen (X, XmnI; P, PvuII; HindIII, B, BglII). Die für die Expression klonierten Bereiche sind als dünne Balken ganz unten eingezeichnet.

Abb. 6  DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC9HPvBg10

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten p24 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen mit den kodierenden Bereichen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym-Stellen aufgeführt. Die Fusion des Tandem-Inserts bei Basenpaar 983 erfolgte wahrscheinlich durch eine Ligierung bei der das Bgl-II-"sticky end" als "blunt end" wirkte, indem zuerst das 3′-zurückstehende Ende mit dem PvuII-Ende verknüpft wurde. Die Verbindung des zweiten Strangs mit dem zuvor nötigen Abbau des 5′-überstehenden Bgl-II-Endes wurde dann von der E. coli-DNA-Polymerase nach der Transformation besorgt.

Abb. 7  DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC18Xmnstop

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten p17 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt. Das synthetische Desoxyoligonuleotid ist als PstI/HindIII-Fragment zwischen bp 480 und 540 inseriert worden und beinhaltet Translationsstops in allen drei Rastern bis zu der Bgl-II-Stelle und danach einen Transkriptionsstop.

Abb. 8  pol-kodierende Region mit exprimiertem Segement

Oben ist der pol-kodierende Bereich (pol-ORF) mit seinen nach Prozessierung entstehenden Bestandteilen, Protease (PRT), reverse Transkriptase (RT, 66 und 51 kDa) und Integrase (INT) gezeichnet; sowie darunter einige Restriktionsschnitt-Stellen (B, BglII; H, HincII; K, KpnI; E, EcoRI). Der untere dünne Balken gibt die Lage und Ausdehnung des in pUC19BgE exprimierten Segments an.

Abb. 9  DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC19EBg

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten pol relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt.

Abb. 10  DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC19RRPvBg

Der Computerausdruck listet die für die relevanten Sequenzen des Plasmids für die Expression des gp41/p24-Fusionsprodukts auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtige Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt.

Abb. 11  Reaktivität der HIV-1-Expressionsprodukte

Die in Beispiel 1 bis 5 beschriebenen Bakterienklone mit den jeweiligen Plasmiden wurden, wie in Beispiel 6 aufgeführt, induziert, durch 17,5%ige (Spuren 1-4) oder 15%ige (5 + 6) PAGE aufgetrennt, elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferriert und mit einem hochtitrigen anti-HIV 1 Serum inkubiert und immun-gefärbt.

Abb. 12  Reaktivität von verschiedenen Seren mit den E. coli Expressionsprodukten

SDS-17%ige PAGE mit 6 × 6 cm Gelgröße wurden mit je 5 µl der in Beispiel 6 beschriebenen Lysate beladen, elektrophoretisiert und nach Western Blot mit verschiedenen Seren immun-gefärbt.

Der Auftrag erfolgte von links nach rechts in folgender Reihenfolge: p24 (pUC9HPvBg10), p24/gp41 (pUC19RRPvBg), gp41 (pUC18RRstop), p17 (pUC18Xmnstop) und pol (cl- Fusionskonstrukt pMFpol).

Abb. 13  Reaktivität von fraglich-positiven Seren

Versuchsanordnung und Durchführung wie Abb. 13, jedoch mit Seren aus der HIV-Diagnostik, bei denen aus verschiedensten Gründen aufgrund der Western Blot-Ergebnisse keine eindeutige Aussage möglich war. Aufgrund der hier gezeigten Ergebnisse lassen sich alle Seren eindeutig bestimmen (bis auf G10 239 alle positiv).

Abb. 14  Reaktivität von fraglich-positiven Seren

Wie Abb. 13, jedoch wurden hier nur p24, p24/gp41 und gp41 als Antigen aufgetragen, außerdem erfolgte die Auftrennung in Gelen mit 12 cm Laufstrecke. Es soll hier demonstriert werden, daß die Verwendung von nur drei Antigenen völlig ausreichend ist.

Abb. 15  Anwendung des Testprinzips für die EBV-Serologie

Testdurchführung wie Abb. 13 und 14, jedoch wurden hier ungereinigte Bakterienlysate mit rekombinant produzierten EBV-Antigenen verwendet und die Reaktion gegen diese von vier Seren bestimmt, wobei jeweils zusätzlich die IgG, die IgA und IgM spezifische Reaktion bestimmt wurde. M. Molekulargewichtsmarker, 1, negatives E. coli-Lysat; 2, p138 (pUCARG1140); 3, EBNA 1 (pUC8KSH1,2); 4, p54 (pUC9MBcE3,2); 5, p150 (pUR288CXH580); 6, gp350 (pURLP1,9); 7, gp350 (pUCLP1,9). Die Immunglobulin-Klassen spezifische Bestimmung wurde mittels Peroxidase- konjugierter zweiter Antikörper bestimmt, die gegen humanes IgG, IgA oder IgM gerichtet waren.

Beispiel 1 Konstruktion von Expressionsplasmiden für gp41

Von env-Gen wurde das in Abb. 3 dargestellte Segment für eine Expression in JM109 verwendet. Es handelt sich dabei nach der gängigen Vorstellung um den extrazellulären Bereich dieses Transmembranproteins ohne den N-terminalen Bereich, der wie schon erwähnt hydrophobe Segmente aufweist. Im Vergleich zu anderen gentechnologisch produzierten gp41-Segmenten reicht die hier benutzte Sequenz bis in die Transmembranregion und sollte damit mehrere Epitope abdecken.

Hierzu wurde das Plasmid pWMJI/env, welches einem Genomteil des schon oben angesprochenen HIV-1-Isolats WMJI mit dem env-Gen trägt, mit PstI und BglII verdaut, eine 1,0 kb-Bande isoliert und in die entsprechenden Stellen des Vektors pUC18 (Abb. 2) inseriert. (Bei diesen und allen folgenden Prozeduren wurde nach den üblichen und oft beschriebenen Methoden vorgegangen, z. B. Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J.: Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1982), Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurde wie von den Herstellern beschrieben eingesetzt.) Von dem so entstandenen Plasmid pUC18BgP1,0 wurde das HIV-1-Insert als EcoRI-PstI Fragment wiederum isoliert und mit RsaI verdaut. Ein daraus resultierendes 486 bp-Fragment wurde nach Isolation in die HincII-Stelle von pUC18 kloniert. Dieses Segment kodiert nun von Aminosäure (aa) 530 bis 692 von gp160 oder von aa28 bis 190 von gp41. Bei dieser Klonierung wurde das Insert in beiden Orientierungen erhalten, die Charakterisierung erfolgte durch Spaltung mit EcoRI und AvrII. pUC18RR enthält das RsaI-RsaI Segment in derselben 5′-3′-Orientierung wie das vom lac-Promotor gestartete Transkript. Der Leserahmen am 5′-Ende stimmt mit dem des lacZα-kodierenden Transkripts überein. Bei pUC18RR sitzt das Insert in der anderen Orientierung.

Von pUC18RR wurde das gp41-Segment wiederum nach EcoRI und PstI Verdau isoliert und in die entsprechenden Stellen von pUC18stop inseriert. Dieser Vektor weist 3′ der PstI-Stelle ein sythetisches Oligodesoxynukleotid mit Translations- und Transkriptions-Stopsignalen auf.

Die DNA-Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge des Expressionsprodukts mit den wenigen pUC-kodierten fusionierten Aminosäuren sind in Abb. 4 gezeigt.

Beispiel 2 Konstruktion von Expressionsplasmiden für p24

In Abb. 5 ist der gag-kodierende Bereich von HIV 1 gezeigt. p24 wird von p17 und p15 flankiert. Für eine Subklonierung wurde das Plasmid pBH10-R3, welches das Genom des HIV-1-Isolats BH10 (Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, K. J., Starcich, B., Josephs, S. F., Doran, E. R., Rafalski, J. A., Whitehorn, E. A., Baumeister, K., Ivanoff, L., Petteway, S. R., Pearson, M. L., Lautenberger, J. A., Papas, T. S., Ghrayeb, J., Chang, N. T., Gallo, R. C. and Wong-Staal, F.: Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III, Nature, 313, (1985), 277-284) enthält, mit BglII und PvuII verdaut, ein 949 bp großes Fragment isoliert und in den mit HincII und BamHI linearisierten Vektor pUC9 inseriert. Nach Ligierung der HincII- mit der PvuII- "blunt ends", sowie der BglII mit der BamHI überstehenden Enden stimmt der Leserahmen mit dem vom lac- Promotor gestarteten Transkripts am 5′- und 3′-Ende des Inserts überein.

Darüber hinaus wurde ein Klon erhalten, bei dem das Insert zweifach in Tandem-Orientierung vorhanden ist (pUC9HPvBg10). Durch ein fehlerhaftes Verbinden des 3′-BglII-Endes mit einem 5′- PvuII-Ende ist diese Konstellation möglich geworden. Die Sequenz des Übergangs der beiden Insertionen wurde nach Subklonierung in m13-Phagen, Anlagerung eines "sequencing primers" und der Dideoyx-"chain-termination" Methode bestimmt. Aus den Sequenzierungsdaten geht hervor, daß die Translation einen Aminosäure-Codon nach den Übergang in das zweite Insert gestoppt wird. Die DNA-Sequenz mit diesem Übergang sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 6 gezeigt. Das rekombinante p24 besitzt 13 N-terminal fusionierte Aminosäuren von p17, sowie 59 Aminosäuren von p15 an seinem C-Terminus.

Beispiel 3 Konstruktion eines Expressionsplasmids für p17

Wie in Abb. 5 gezeigt, wurde für die Subklonierung des p17-kodierenden Bereiches ein 424 bp langes Fragment durch XmnI-Verdau aus dem Plasmid pBH10-R3 isoliert und in die HincII-Stelle des Vektors pUC19 inseriert. Aufgrund der "blunt end"-Ligierung sind beide Orientierungen möglich. pUC19Xmn19 das Fragment in richtiger Orientierung und Leserahmen zum lac-Promotor, pUC19Xmn21 in der entgegengesetzten Orientierung. Von pUC19Xmn21 wurde erneut das HIV-1- Segment nach BamHI und PstI Verdau isoliert und in die entsprechenden Stellen von pUC18stop inseriert (pUC18Xmnstop). Die DNA-Sequenz des relevanten Bereichs sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 7 gezeigt.

Beispiel 4 Konstruktion eines Expressionsplasmids für pol

Von dem Plasmid pBH10-R3 wurde ein 2787 bp langes Fragment nach BglII und EcoRI Verdau (Abb. 8) isoliert und in pUC19 inseriert. Der entstandene Klon, pUC19BgE, enthält nun die kodierende Region der Protease, der gesamten reversen Transkriptase, sowie 121aa der Integrase. Die DNA Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge mit den Übergängen von und in den lacZa-Bereich ist in Abb. 9 gezeigt.

Beispiel 5 Konstruktion eines Expressionsplasmides für ein aus gp41 und p24 fusioniertes Protein

Das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pUC18RR-, welches das RsaI-RsaI-Fragment von gp41 in minus-Orientierung relativ zum lac-Promotor enthält, wurde mit HindIII geschnitten und das dabei entstehende 318 bp lange Fragment in die HindIII-Stelle von pUC19 inseriert. Durch Verdau mit PstI wurde die Orientierung der entstandenen Klone getestet und davon einer weiter verwendet, bei dem der gp41-Leserahmen dieselbe Orientierung hatte, wie das lacZ-Transkript des Vektors (pUC19RR). Dieses Plasmid wurde mit HindIII partiell geschnitten und die lineare Form nach Gelelektrophorese isoliert. Durch erneuten Verdau mit EcoRI und Isolierung des DNA- Fragments in der Größe der linearen Form ist nun ein Vektor entstanden, der das gp41-kodierende Fragment mit einer 3′-terminalen HindIII-Stelle noch enthält, während das andere Ende ein EcoRI-Ende besitzt.

Das in Beispiel 2 beschriebene Plasmid pUCHPvBg10, welches das p24-kodierende PvuII-BglII Fragment in Tandem-Orientierung enthält, wurde mit EcoRI linearisiert und anschließend mit HindIII partiell verdaut. Ein dabei entstehendes ca. 1,8 kb großes Fragment, welches dem gesamten Tandem-Insert entspricht, wurde isoliert und in den oben beschriebenen EcoRI und HindIII geschnittenen Vektor pUC19RR inseriert. Das entstehende Plasmid, pUCRRPvBg, enthält nun 3′ des lac-Promotors das RsaI-HindIII Fragment von gp41 gefolgt von dem p24-Tandem-Insert im richtigen Leserahmen. Die DNA-Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 10 aufgeführt.

Beispiel 6 Bestimmung der Reaktivität von humanen Seren gegen die rekombinanten HIV-1-Antigene

Von den in Beispiel 1 bis 5 beschriebenen Bakterienklonen mit den Plasmiden für p24-, gp41-, p17-, pol- und gp41/p24-Expression wurde jeweils eine 5-ml-Flüssigkeit mit L-Broth/Ampicillin (50 µg/ml) über Nacht bei 37°C gewachsen und dann in einen 250-ml-Schüttelkolben mit 100 ml L-Broth/ Ampicillin-Medium überführt. Die Kultur bei 37°C im Schüttelinkubator gehalten bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht hatte. Bei diesem Zeitpunkt wurde mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM induziert und anschließend die Kultur für weitere 2,5 h intensiv geschüttelt.

Anschließend erfolgte eine Pelletierung der Bakterien in einem SS34-Rotor bei 6000 rpm in 10 min bei 4°C und ein Resuspendieren in 10 ml "boiling mix" (20% Saccharose, 2% SDS, 5% Mercaptoethanol, 2% Bromphenolblau, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Die Suspension wurde in 500 µl Fraktionen in Eppendorf-Hütchen aliquotiert, für 10 min bei 100°C erhitzt und die Lysate schließlich bei -20°C gelagert.

Eine Auftrennung der Proteine der Lysate erfolgte durch SDS-Gelelektrophorese mit 17% Acrylamid, vernetzt mit DADT, entweder mit 6 × 6-m-Gelen oder großen Gelen mit 14 cm Länge. Dabei wurden jeweils 5 µl der Lysate nebeneinander aufgetragen und für 2-3 h elektrophoretisiert bis die Bromphenolblau-Bande ca. 1 cm vor den unteren Rand gewandert war. Anschließend wurden die Proteine durch Western Blotting auf Nitrocellulose transferiert und durch Poissant-Färbung sichtbar gemacht. Die Lage und Ausdehnung der zusammengehörenden Lysate wurde mit einem Stift markiert, durch Waschen mit TTBS (0,5 M NaCl, 0,05% Tween-20, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) die Proteine wieder entfärbt und der Filter für 2 h durch Inkubation mit Cohen-Puffer (1 mg/ml Ficoll-400, 1 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 16 mg/ml Rinder-Serumalbumin, 0,1% Nonidet-P40, 0,05% Gelatine, 170 mM Borat, 150 mM NaCl, pH 7,5) abgesättigt. HIV-1-positive oder -negative Seren wurden mit TTBS 1 : 100 oder 1 : 500 verdünnt und zusammen und mit den Filtern über Nacht bei leichtem Schütteln inkubiert. Aufgrund der zuvor erfolgten Markierung auf dem Filter, was ein genaues Ausschneiden der relevanten Bereiche zuläßt, reichen 5 ml eines verdünnten Serums völlig aus. Durch Waschen mit TTBS für 4 h und mehrmaligem Pufferwechsel wurden nicht gebundene Antikörper vom Filter entfernt und dann mit einem zweiten Antikörper für 2 h inkubiert. Es wurde dabei ein anti-human-IgG-Antikörper aus Kaninchen verwendet, der mit Peroxidase konjugiert ist. Durch intensives Waschen mit TTBS für 1 h mit sechsmaligem Pufferwechsel wurden dann nicht gebundene Antikörper entfernt und anschließend die Färbereaktion ausgeführt. Dazu wurde der Filter in eine Lösung aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mg/ml Diaminobenzidin und 0,5 µl/ml 30% H₂O₂ gegeben, nach dem Erreichen der gewünschten Färbereaktion mit Wasser gut gespült und auf einem Filter getrocknet. Abb. 11 zeigt die Expressionsprodukte der verschiedenen Klone, angefärbt mit einem hoch-titrigen HIV-1-Serum. Das rekombinante p24 besitzt, wie aufgrund der Sequenz zu erwarten war, ein Molekulargewicht von ca. 34 kDa und wird in ungewöhnlich großen Mengen gemacht (ca. 15-20% des Gesamtproteins, geschätzt nach Coomassie-blau Anfärbung des SDS- Gels). Das Fusionskonstrukt aus p24 und gp41 ist ca. 47 kDa groß, stellt ca. 2-5% des Gesamtproteins dar und wird teilweise wieder proteolytisch abgebaut und/oder nicht vollständig translatiert, was sicherlich an der für E. coli-Expression kritischen Größe von über 40 kDa für ein eukaryotisches Nicht-Fusionsprotein liegt. gp41 mit einem Molekulargewicht von ca. 17 kDa wird in etwas geringerer Menge produziert, reagiert aber sehr stark als eine scharf begrenzte Bande. Das rekombinante p17 wird relativ stark exprimiert (ca. 2-5% des Gesamtproteins) und besitzt eine Größe von ca. 20 kDa. Das rekombinante pol-Produkt von pUC19BgE tritt in zwei Formen mit ca. 66 und 51 kDa auf; offensichtlich ist der Protease-Anteil am N-Terminus nach E. coli-Expression noch aktiv. pMFpol exprimiert ein Produkt von über 80 kDA, daß jedoch nicht sehr stabil ist und in kleinere Fragmente gespalten wird, die jedoch noch durchaus sehr reaktiv sind.

Die ungewöhnlich hohe Expressionsausbeute von p24 bei pUC9HPvBg10 im Gegensatz zu Klonen, die das kodierende Fragment nur einmal inseriert haben (nicht gezeigt), dürfte höchstwahrscheinlich auf eine stabilere mRNA mit "loop"-Strukturen zurück zu führen sein. Diese "loop"-Strukturen nach dem Ende des ersten Inserts ergeben sich mit den Anfangssequenzen des zweiten Tandem-Teils; auf diese Erklärungsmöglichkeit soll jedoch nicht näher eingegangen werden.

Abb. 12 zeigt einige, mit verschiedenen Seren inkubierte Nitrozellulose Blot-Streifen. Für die Austestung der Reaktivität wurden Seren aus der diagnostischen Abteilung des Max von Pettenkofer-Instituts, München, verwendet, die relativ gut charakterisiert waren. Als Ergebnis läßt sich festhalten, daß bei normal-titrigen Seren die Reaktivität und damit Sensitivität des hier vorgestellten Tests ohne Probleme HIV-1-positive Seren entdeckt.

Beispiel 7 Sensitivität des "Lysat-Blots" im Vergleich mit den herkömmlichen Bestätigungs Western Blots

Als einer der Hauptvorteile des neuen Tests soll die erheblich bessere Sensitivität für anti-gp41- Antikörper heraus gestellt werden. Dabei wurde der in Beispiel 6 geschilderte Ablauf für Seren angewandt, die nach herkömmlicher Testung fraglich positiv blieben; sei es, weil keine anti- gp41-Reaktion im Western Blot zu finden war, oder aufgrund von unspezifischen Reaktionen unklar blieb.

Als Antigene wurden dabei die in Beispiel 6 verwendeten eingesetzt, teilweise aber auch nur p24, gp41 und die Fusion aus beiden. Falls nur drei Antigene verwendet wurden, erfolgte die Auftrennung in Gelen mit 12 cm Laufstrecke.

Abb. 13 und Abb. 14 zeigen jeweils als Beispiel die Reaktivität einiger dieser fraglichen Seren. In Tab. 1 und Tab. 2 sind die Ergebnisse der getesteten Seren zusammengefaßt und mit den Befunden der herkömmlichen Testung verglichen. Dabei ergibt sich eindeutig eine erhebliche Verbesserung der anti-gp41-Sensitivität, was in sehr vielen Fällen eine sichere Zuordnung als HIV-1-positiv zuläßt. Es war kein Serum zu finden, bei dem im herkömmlichen Western Blot eine (auch nur fragliche) anti-gp41-Reaktivität auftrat, die in dem neuen Test nicht zu reproduzieren war. Das Gegenteil war häufiger der Fall: In vielen Fällen konnte durch den neuen Ansatz eine anti-gp41- Reaktion nachgewiesen werden, die im herkömmlichen Test nicht gefunden worden war.

Daß trotzdem einige der Seren weiter unklar bleiben, liegt wohl an der anti-p24-Reaktion, die für sich alleine, wenn sie nicht sehr stark auftritt, entweder das Indiz für eine beginnende Serokonversion und frische Infektion spricht, oder aber bei nur schwacher Reaktion für Unspezifität gehalten werden muß. Dies ist umso wahrscheinlicher, wenn man miteinbezieht, daß dieses rekombinante p24 in sehr großer Menge exprimiert wird und damit auch bei nur sehr schwacher unspezifischer Bindung ein Signal hervorruft.

Bei sehr starker Reaktion und fehlenden anti-gp41-Titer ist ein solches Serum auf jeden Fall stark verdächtig; es handelt sich dann entweder um einen Serokonvertierer oder um eine andere retrovirale Infektion, eventuell HIV 2, da die gag-Proteine sehr stark konserviert sind.

Tabelle 1

Zusammenfassung der getesteten, zum Teil fraglichen Seren und Vergleich mit den Ergebnissen der herkömmlichen Bestätigungstests

Die erste Spalte gibt die Nummer, die Zweite die Benennung des Serums an. Spalten 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der herkömmlichen Western Blots (Vir. Blot), Spalte 3 die Reaktion mit gag und pol, Spalte 4 die mit gp41 oder gp120/160. In Spalte 5 ist die Reaktivität des Serums mit dem rekombinanten p24, in Spalte 6 die mit dem rekombinanten gp41 aufgelistet (Rek. Blot). Spalte 7 gibt die Diagnose aufgrund der Ergebnisse des rekombinanten Blots, und in Spalte 8 gegenübergestellt der Befund aufgrund des herkömmlichen Bestätigungs-Western Blots.

Tabelle 2

Diagnose-Ergebnis im Vergleich mit Viralem Western Blot

Bei den Tab. 1 zusammengefaßten Seren handelt es sich zum Teil um ausgesuchte seltene Seren, die in einem Western Blot zum Teil fraglich oder negativ blieben, obwohl andere Daten für eine Infektion sprachen (Finalstadium von AIDS).

Von den 16 nach dem vir. Blot sicher positiven konnten alle mit dem rek. Blot erkannt werden (1. Spalte). Von den 16 getesteten negativen Seren wurden dagegen 3 als positiv erkannt, da noch eine gp41-Reaktion stattgefunden hatte. Es handelt sich dabei um die Seren MB1519, G8099 und G1220. Von den nach der herkömmlichen Testung fraglichen Seren (18) blieben schließlich drei weiterhin fraglich, wobei ein Serum HIV-2-positiv war. Von den restlichen wurden 8 als negativ eingeordnet, obwohl, wie schon angesprochen zum Teil eine schwache p24-Reaktion auftrat, und immerhin 7 Seren waren durch die höhere Sensitivität als positiv einzuordnen (MB1503, MB1510, G9222, G10 431, G11 287, G7078 und G7187).

Beispiel 8 Verwendung des Testprinzips für andere rekombinant produzierte Antigene

Generell läßt sich das hier vorgestellte Prinzip auch für andere Diagnostik-Verfahren, bei denen Antikörper bestimmt werden, einsetzen. Voraussetzung dabei ist, daß die jeweiligen Antigene in Bakterien als unfusionierte Proteine gentechnologisch produziert werden können. Analog zu dem vorgestellten HIV-1-Bestätigungstest werden auch hier mehrere rekombinant produzierte Antigene nebeneinander durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und können dann im Test eingesetzt werden. Der Vorteil hier ist wiederum, daß keinerlei Aufreinigung nötig ist, was den Test extrem billig hält und gleichzeitig eine Kontrolle von bakteriellen, unspezifischen Reaktionen erlaubt. Als ein Beispiel soll hier die Verwendung von Lysaten mit rekombinant produzierten Epstien-Barr-Virus(EBV)-Proteinen gezeigt werden. Bei Abb. 15 handelt es sich um eine Anzahl von Western Blots, mit denen vier verschiedene Seren auf den anti-EBV-Titer getestet wurden (EBV-negativ, frische Infektion-infektöse Mononukleose, EBV-positiv und NPC Nr. 359-Serum eines Patienten mit Nasopharynx-Carcinom). Zusätzlich ist in diesem Beispiel noch die Möglichkeit gezeigt, zwiscchen IgG, IgA und IgM zu unterscheiden, was bei der EBV-Serologie von Wichtigkeit ist, speziell bei der Frühdiagnose von NPC, wo charakteristischerweise der IgA-Titer gegen spezielle EBV-Antigene ansteigt. Die Bedeutung der einzelnen Antigene für die Diagnose, die Klonierung der entsprechenden DNA-Sequenzen sowie die gentechnologische Produktion ist ausführlich in den beiden Patentanträgen, Chin. Pat.: 8 61 00 441 (Method for the differential in vitro diagnosis of EBV-related diseases) und EP 8 51 10 565.0 (DNA sequences of the EBV genome, recombinant DNA molecules, process for producing EBV-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions of said antigens), dargestellt.

Wie bei den Blotstreifen mit den HIV-1-Antigenen lassen sich auch hier problemlos spezifische Reaktionen identifizieren.

Claims (12)

1. DNA-Sequenzen, charakterisiert dadurch, daß sie kodierende Bereiche von HIV 1 oder HIV 2 beinhalten.

2. Expressionsplasmide mit HIV-1- und HIV-2-Sequenzen entsprechend Anspruch 1, die eine Produktion von diagnostisch relevanten HIV-1-Antigenen in E. coli-Zellen als Nicht- Fusionsproteine erlauben.

3. Testansätze, die die Vorteile rekombinanter DNA-Technologie mit denen des beispielsweise in der HIV-1-Diagnostik bisher zur Bestätigung benutzten Western Blots verbinden und zur raschen Einführung sicherer serologischer Untersuchungen auf virale und mikrobiologische Erreger eignet.

4. Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinanten Plasmid pUC9HPvBg10 in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines p24-analogen Antigens bewirkt.

5. Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinanten Plasmid pUC18RRstop in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines gp41-analogen Antigens bewirkt.

6. Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinanten pUC18Xmnstop in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines p17-analogen Antigens bewirkt.

7. Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinanten Plasmid pUC19EBg sowie in dem Plasmid pMFpol in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines pol-analogen Antigens bewirkt.

8. Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinanten Plasmid pUC19RRPvBg in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines Antigens bewirkt, welches gleichzeitig Epitope von gp41 sowie von p24 trägt.

9. Ein Testansatz, bei dem rekombinant produzierte HIV-1- oder HIV-2-Antigene entsprechend Anspruch 2 oder die in den Ansprüchen 3 bis 8 genannten Antigene bzw. die für deren Expression zuständigen Plasmide verwendet werden, indem Bakterienlysate dieser Klone durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden und auf Nitrozellulose oder andere Protein-bindende Träger transferriert werden. Nach Inkubation des Nitrozellulose-Streifens mit Patientenserum werden gebundene Antikörper durch einen zweiten, Peroxidase-konjugierten, anti-human Antikörper und Peroxidase-Reaktion oder einem analogen System (z. B. Phosphatase-Färbung) nachgewiesen.

10. Ein Testansatz analog zu Anspruch 9, im Unterschied zu diesem jedoch nur mit drei Antigenen bzw. deren Expressionsplasmide (pUC9PvBg10, pUC18RRstop, pUC19RRPvBg).

11. Die Methode der Interpretation der Ergebnisse, bei der es völlig irrelevant ist, daß ungereinigte bakterielle Lysate verwendet werden und daß unspezifische Reaktionen mit bakteriellen Proteinen auftreten; sowie die im Vergleich mit dem herkömmlichen Bestätigungs-Test entscheidend verbesserte Kontrollmöglichkeit durch die Verwendung von mehreren Spuren mit Antigen, bei der die Nachbarspur jeweils als negative Kontrolle verwendet wird.

12. Die erheblich verbesserte Sensitivität für die bei einer Diagnose besonders wichtigen Antikörper gegen gp41, die es erlaubt nur noch ein zusätzliches Antigen (p24) zu verwenden; sowie die im Vergleich mit herkömmlichen Bestätigungstests um Größenordnungen kostengünstigere Herstellung.