DE3712786A1 - METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS - Google Patents
METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDSInfo
- Publication number
- DE3712786A1 DE3712786A1 DE19873712786 DE3712786A DE3712786A1 DE 3712786 A1 DE3712786 A1 DE 3712786A1 DE 19873712786 DE19873712786 DE 19873712786 DE 3712786 A DE3712786 A DE 3712786A DE 3712786 A1 DE3712786 A1 DE 3712786A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- dna
- methylase
- aza
- cytidine
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Nucleinsäuren mit Hilfe von 5-Aza-2′-desoxycytidin (dazaC), DNA-Methylase und anti-DNA-Methylase Antikörpern.The invention relates to methods and means for determination of nucleic acids with the help of 5-aza-2'-deoxycytidine (dazaC), DNA methylase and anti-DNA methylase antibodies.
Die Technik der DNA-Hybridisierung hat in den letzten Jahren zur Erforschung und Diagnose von genetischen und mikrobiologischen Erkrankungen breite Anwendung gefunden. Grundlage der DNA-Hybridisierung ist die Tatsache, daß zwei einzelsträngige komplementäre DNA-Moleküle unter Hybridisierungsbedingungen eine Doppelhelix bilden. In ähnlicher Weise entsteht aus einem einzelsträngigen DNA-Molekül und einem RNA-Molekül ein DNA/RNA-Hybrid.The technique of DNA hybridization has been in the past Years of research and diagnosis of genetic and microbiological diseases found wide application. The basis of DNA hybridization is the fact that two single-stranded complementary DNA molecules underneath Hybridization conditions form a double helix. In Similarly, from a single strand DNA molecule and an RNA molecule a DNA / RNA hybrid.
Zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuresequenzen werden die in der Probe enthaltenen Nucleinsäuren durch De naturierung in Einzelstränge zerlegt. Die entstandenen Einzelstränge werden anschließend auf eine inerte Ober fläche wie Nitrozellulose oder eine Nylonmembran fixiert. Die fixierten Einzelstränge werden mit einem komplemen tären Polynucleotid unterhalb der Dissoziationstemperatur in Kontakt gebracht, so daß eine Doppelstrangbildung aus den fixierten Einzelstrangsequenzen und der komplementären Polynucleotidsonde ermöglicht wird. Nach den Waschschritten wird der entstandene Doppelstrang aus Polynucleotidsonde und zu bestimmender Nucleinsäuresequenz nachgewiesen. Dazu wird die komplementäre Polynucleotidsonde in einer geeigneten Weise für die Wiederauffindung markiert. Üb licherweise erfolgt diese Markierung durch Einbau von Radioisotropen des Phosphors, Jods, Schwefels oder Wasserstoffs.For the detection of specific nucleic acid sequences the nucleic acids contained in the sample by De Naturation broken down into single strands. The resulting Single strands are then placed on an inert upper surface such as nitrocellulose or a nylon membrane fixed. The fixed single strands come with a complete tary polynucleotide below the dissociation temperature brought into contact so that a double strand formation the fixed single-strand sequences and the complementary ones Polynucleotide probe is made possible. After the washing steps the resulting double strand of polynucleotide probe and the nucleic acid sequence to be determined. To do this, the complementary polynucleotide probe is placed in one appropriately marked for retrieval. Practice This marking is done by installing Radioisotropes of phosphorus, iodine, or sulfur Hydrogen.
Ein großer Nachteil dieser Verfahren besteht in der Not wendigkeit des Umgangs mit radioaktiven Substanzen und den damit verbundenen Auflagen und Sicherheitsvorkehrungen. Es sind daher in der Vergangenheit vielfältige Versuche unternommen worden, die radioaktive Markierung von Nucleinsäuren durch nicht radioaktive Nachweissysteme zu ersetzen. So wurden Nucleotidtriphosphat-Analoge syn thetisiert, die kovalent gebundenes Biotin an einem Pyri midin- oder Purinring enthalten (EP 63 879). Da diese Nucleotidderivate Substrate für RNA- und DNA-Polymerasen sind, können biotinmarkierte Polynucleotide enzymatisch hergestellt und zur Hybridisierung verwendet werden. Der Nachweis beruht auf der seit langem bekannten Avidin- Biotin-Wechselwirkung, wobei die gebildeten Doppelstränge mit einem Affinitätsnachweissystem (z. B. Avidin-Peroxi dase) nachgewiesen werden. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß Biotin in sehr vielen biologischen Materialien vorhanden ist und sein Nachweis daher oft zu Störsignalen führt.A major disadvantage of these methods is need agility in handling radioactive substances and the associated requirements and safety precautions. There have therefore been many attempts in the past radioactive labeling of Nucleic acids from non-radioactive detection systems to replace. So nucleotide triphosphate analogs were syn thetisiert, the covalently bound biotin on a pyri contain midin or purine ring (EP 63 879). This one Nucleotide derivatives substrates for RNA and DNA polymerases biotin-labeled polynucleotides can be enzymatic produced and used for hybridization. The Detection is based on the long-known avidin Biotin interaction, the double strands formed with an affinity detection system (e.g. avidin-peroxi dase) are proven. However, this procedure has the disadvantage that biotin in many biological Materials exist and its evidence is therefore often too Leads to interference signals.
Weiterhin wurde in den letzten Jahren die Antigen-Anti körper-Wechselwirkung zum Nachweis von DNA-Hybridisierung eingesetzt. Zum Nachweis werden nach erfolgter Hybridi sierung klassische immunologische Methoden, wie spezi fische ggf. markierte Antikörperenzymkonjugate einge setzt. Das Antigen in dieser Antigen-Antikörper-Reaktion kann z. B. der gebildete Doppelstrang aus DNA oder DNA/RNA sein. So werden in der europäischen Patentanmeldung EP 1 35 159 monoklonale Antikörper gegen doppelsträngige native DNA eingesetzt. In der europäischen Patentanmeldung EP 1 63 220 wird eine Ribunucleinsäure als Sonde und spe zifische anti-DNA/RNA-Hybrid-Antikörper eingesetzt. In beiden Fällen erfolgt der Nachweis der zu bestimmenden Nucleinsäure nach erfolgter Hybridisierung durch Bindung der spezifischen markierten Antikörper an die entstandenen DNA-Doppelhelices oder die DNA/RNA- oder RNA/RNA-Hybride.Furthermore, the antigen anti has been used in recent years body interaction to detect DNA hybridization used. As proof, after hybridi classic immunological methods such as spec fish possibly labeled antibody enzyme conjugates puts. The antigen in this antigen-antibody reaction can e.g. B. the double strand formed from DNA or DNA / RNA be. So in the European patent application EP 1 35 159 monoclonal antibodies against double-stranded native DNA used. In the European patent application EP 1 63 220 uses a ribunucleic acid as a probe and spe specific anti-DNA / RNA hybrid antibodies used. In In both cases, the evidence to be determined is provided Nucleic acid after hybridization by binding of the specific labeled antibodies to the resulting ones DNA double helices or the DNA / RNA or RNA / RNA hybrids.
Der schwerwiegende Nachteil des Einsatzes von spezifischen Antikörpern gegen native DNA liegt darain, daß bei der Hybridisierung der Polynucleotidsonde mit der nachzu weisenden DNA unter Hybridisierungsbedingungen auch Teile der nachzuweisenden DNA Doppelhelices ausbilden und damit zu einer unspezifischen Bindung der Antikörper führen. Ein weiterer Nachteil liegt in der Beschränkung auf Ribo nucleinsäuren als Sonden, da die Verwendung von Ribo nucleinsäuren besonders enge Bedingungen an die Hybridi sierungreaktion stellt, um eine Schädigung oder Zer störung der Ribonucleinsäure durch einen zu hohen pH- Wert oder eingeschleppte Ribonuclease-Aktivität zu ver hindern.The serious disadvantage of using specific Antibodies against native DNA lie in that Hybridization of the polynucleotide probe with the post pointing DNA under hybridization conditions also parts the double helices to be detected and thus lead to non-specific binding of the antibodies. Another disadvantage is the limitation to Ribo nucleic acids as probes since the use of Ribo nucleic acids particularly tight conditions on the hybridi reaction to damage or disintegration disturbance of the ribonucleic acid due to a too high pH Value or introduced ribonuclease activity ver prevent.
Das Antigen in der immunologischen Reaktion kann auch eine Polynucleotidsonde sein, die mit einem Hapten kovalent modifiziert ist. Dabei wird z. B. das Hapten über ein Brückenglied kovalent mit der Polynucleotid sonde verbunden (EP 1 73 251). Der Nachteil dieser Methode liegt darin, daß das Hapten eine effiziente Hybridi sierung zwischen der Polynucleotidsonde und der nachzu weisenden DNA einschränkt. Weniger voluminöse Haptene, wie sie in Form von modifizierten Nucleotidtriphosphaten auch enzymatisch in die DNA eingebaut werden können, bewirken keine so große Störung der Hybridisierungs reaktion. So ist z. B. die Verwendung von Bromuracil (EP 1 02 228) und N-2-Acetylaminofluoren (EP 97 664) bekannt. Der Nachweis der Hybridisierung erfolgt dann durch spe zifische Antikörper gegen diese modifizierte Nucleo tide enthaltende DNA. Allerdings sind die verwendeten modifizierten Nucleotide meist carcinogene Substanzen, deren Handhabung notwendigerweise mit Vorsichtsmaßnahmen und evtl. Gesundheitsrisiken verbunden ist.The antigen in the immunological reaction can also be a polynucleotide probe with a hapten is covalently modified. Here, for. B. the hapten via a bridge link covalently with the polynucleotide probe connected (EP 1 73 251). The disadvantage of this method is that the hapten is an efficient hybrid sation between the polynucleotide probe and the pointing DNA. Less voluminous haptens, as they are in the form of modified nucleotide triphosphates can also be incorporated enzymatically into the DNA, do not cause so much disruption to hybridization reaction. So z. B. the use of bromouracil (EP 1 02 228) and N-2-acetylaminofluorene (EP 97 664) are known. The hybridization is then verified by spe specific antibodies against this modified nucleo tide containing DNA. However, the ones used modified nucleotides mostly carcinogenic substances, handling them necessarily with precautions and possibly health risks.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die oben ge schilderten Nachteile eliminiert.The invention was based on the object of a new agent and to provide methods that the above ge described disadvantages eliminated.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Nucleinsäuren mit Hilfe von DNA-Methylase, anti-DNA-Methylase Anti körpern und 5-Aza-2′-desoxycytidin oder 5-Aza-cytidin.According to the invention, this object is achieved by a Methods and means for the determination of nucleic acids with the help of DNA methylase, anti-DNA methylase anti bodies and 5-aza-2'-deoxycytidine or 5-aza-cytidine.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäuren in einer Probe durch Überführung der zu bestimmenden Nucleinsäuresequenzen in Einzelstränge und Umsetzung der Einzelstränge mit einer komplementären Polynucleotidsonde, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in der Polynucleotidsonde Cytidin durch 5-Aza-2′-desoxy cytidin oder 5-Aza-cytidin ersetzt ist und diese Sonde durch Bindung von gegebenenfalls markierter DNA-Methylase und Nachweise der Methylase über spezifische, gegebenen falls markierte anti-Methylase-Antikörper oder über den Marker erfolgt. The invention relates to a method for determination of nucleic acids in a sample by transferring the Nucleic acid sequences to be determined in single strands and implementation of the single strands with a complementary Polynucleotide probe, which is characterized in that in the polynucleotide probe cytidine by 5-aza-2'-deoxy cytidine or 5-aza-cytidine is replaced and this probe by binding any labeled DNA methylase and detection of methylase via specific, given if labeled anti-methylase antibody or via the Marker is done.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Bestimmung von Nucleinsäuren, das eine anstelle von Cytidin 5-Aza-2′-desoxicitidin oder 5-Aza-cytidin ent haltende Polynucleotidsonde, eine gegebenenfalls markierte Methylase und gegebenenfalls markierte anti-Methylase- Antikörper enthält. Die Polynucleotidsonde kann doppel ständig, einzelständig oder als Komplex mit der gege benenfalls markierten Methylase vorliegen.Another object of the invention is a means for Determination of nucleic acids, one instead of Cytidine 5-aza-2'-deoxicitidine or 5-aza-cytidine ent holding polynucleotide probe, optionally labeled Methylase and optionally labeled anti-methylase Contains antibodies. The polynucleotide probe can be double permanent, individual or as a complex with the counterpart also labeled methylase.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Nachweis einer zu bestimmenden Nucleinsäurespecies dadurch gelingt, daß die hohe Bindungsaffinität der DNA-Methylase aus Säugetierzellen zum 5-Aza-cytidin ausgenutzt wird. Dazu wird in einer Polynucleotidsonde das d-Cytidin durch 5-Aza-2′-desoxycytidin ersetzt. Der Nachweis erfolgt durch Inkubation der entstandenen DNA-Hybride mit eu karyontischer DNA-Methyltransferase (=DNA-Methylase), wobei stabile dazaC-Methyltransferase-Komplexe gebildet werden. Diese Komplexe können dann durch spezifische Antikörper gegen DNA-Methyltransferase nach bekannten immunologischen Verfahren nachgewiesen werden.Surprisingly, it was found that the detection of a nucleic acid species to be determined that the high binding affinity of DNA methylase Mammalian cells for 5-aza-cytidine is used. To is the d-cytidine in a polynucleotide probe 5-aza-2'-deoxycytidine replaced. Evidence is provided by incubating the resulting DNA hybrids with eu caryotic DNA methyltransferase (= DNA methylase), forming stable dazaC-methyltransferase complexes will. These complexes can then be identified by specific Antibodies against DNA methyltransferase according to known immunological procedures can be demonstrated.
Eukaryontische DNA-Methylase wird nach bekannten Verfahren aus z. B. menschlicher Placenta isoliert (Biochim. Biophys. Acta, 740, 323 (1983)). Das gereinigte Enzym ist ein 190-KD-Polypeptid, welches eine "Erhaltungs-" und eine "de novo" Methylase-Aktivität besitzt. Aufgrund dieser Aktivitäten bindet die DNA-Methylase sowohl an einzel strängige als auch an doppelsträngige Nucleinsäuren. Die Bindung an mit dazaC modifizierter DNA ist aber wesent lich stabiler, so daß sie unter destabilisierenden Be dingungen, z. B. hohen Salzkonzentrationen, nicht disso ziert. Dadurch ist es überraschenderweise möglich, Be dingungen zu finden, die die unspezifische Bindung an Nucleinsäuren vollständig unterdrücken und nur die Bindung der Methylase andie dazaC-haltige DNA erlauben. Da die Komplexe aus Methylase und dazaC-haltiger DNA auch den rigiden Hybridisierungsbedingungen standhalten, eignen sich DNA-Methylase und dazaC hervorragend zum Nachweis von Hybridisierungsreaktionen.Eukaryotic DNA methylase is made by known methods from z. B. human placenta isolated (Biochim. Biophys. Acta, 740, 323 (1983)). The purified enzyme is a 190 KD polypeptide, which is a "maintenance" and a "de novo" has methylase activity. Based on these DNA methylase binds to both individual activities stranded as well as double-stranded nucleic acids. The Binding to DNA modified with dazaC is essential Lich more stable, so that under destabilizing loading conditions, e.g. B. high salt concentrations, not disso graces. This makes it surprisingly possible to be to find conditions that reflect the non-specific binding Completely suppress nucleic acids and only binding allow the methylase and the DNA containing DNA. Since the Complexes of methylase and DNA containing dazaC also the withstand rigid hybridization conditions DNA methylase and dazaC are excellent for detection of hybridization reactions.
Monoclonale Antikörper gegen eukaryontische DNA-Methylase werden nach bekannten Verfahren z. B. durch Immunisierung von Mäusen mit gereinigter Methylase und Konstruktion der Hybridomzellklone hergestellt (Eur. J. Cell. Biol. 34, 330 (1984)).Monoclonal antibodies against eukaryotic DNA methylase are z. B. by immunization of mice with purified methylase and construction of the hybridoma cell clones (Eur. J. Cell. Biol. 34, 330 (1984)).
Die Herstellung einer dazaC- oder azaC-haltigen Poly nucleotidprobe kann nach bekannten enzymatischen Methoden erfolgen, z. B. durch den Einbau von dAzaCTP mittels Poly merase I (nick translation; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1184 (1975)). Dazu muß allerdings das 5′-dazaC in das entsprechende Triphosphat überführt werden. Hierzu wird zu 5′-dazaC ein 1,5 molarer Überschuß POCl3 bei 0°C ge geben und 1 Std. unter Rühren bei 18°C umgesetzt. An schließend wird ein 2facher Überschuß Triethylammonium pyrophosphat bei 0°C zugegeben und 1 Std. bei 18°C um gesetzt. Die Aufreinigung des gebildeten 5′-dazaCTP er folgt über Cellulose-Dünnschichtchromatographie oder mittels HPLC.A dazaC- or azaC-containing poly nucleotide sample can be prepared by known enzymatic methods, e.g. B. by the incorporation of dAzaCTP by means of polymerase I (nick translation; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1184 (1975)). To do this, however, the 5′-dazaC must be converted into the corresponding triphosphate. For this purpose, a 5 molar excess of POCl 3 is added to 5′-dazaC at 0 ° C. and reacted for 1 hour at 18 ° C. with stirring. Then a 2-fold excess of triethylammonium pyrophosphate is added at 0 ° C. and reacted at 18 ° C. for 1 hour. The purification of the 5'-dazaCTP formed follows via cellulose thin layer chromatography or by means of HPLC.
Eine durch enzymatischen Einbau mit 5′-dzaCTP markierte DNA-Sonde kann in einzelsträngiger oder in doppelsträn giger Form in einen Hybridisierungsassay eingesetzt werden. 5-Aza-2′-desoxycytidin hydrolisiert unter be stimmten Bedingungen unter Ringöffnung zu Desoxyribo fluranosyl-3-guanylharnstoff. Diese Hydrolyse erfolgt in doppelsträngiger DNA langsamer als in einzelsträngiger DNA. Dieser Effekt kann dazu ausgenutzt werden, auf eine Abtrennung der nicht hybridisierten Polynucleotidsonde nach erfolgter Hybridisierung zu verzichten.A labeled with 5′-dzaCTP by enzymatic incorporation DNA probe can be single-stranded or double-stranded form used in a hybridization assay will. 5-aza-2'-deoxycytidine hydrolyzed under be agreed conditions under ring opening to deoxyribo fluranosyl-3-guanyl urea. This hydrolysis takes place slower in double-stranded DNA than in single-stranded DNA. This effect can be used on a Separation of the non-hybridized polynucleotide probe to waive after hybridization.
Der eigentliche Hybridisierungsschritt zwischen der er findungsgemäß derivatisierten Nucleinsäure und der komplementären Nucleinsäure in der zu analysierenden Probe erfolgt nach bekannten Methoden. Bevorzugt ist die Hybridisierung auf einer festen Phase. Hierzu wird nach Aufspaltung der Nucleinsäure in Einzelstränge die nachzuweisende Nucleinsäure auf eine Festphase fixiert. Üblicherweise werden Nitrozellulose oder eine Nylonmembran eingesetzt. Anschließend wird die immobilisierte Nuclein säure mit der dazaC enthaltenen Polynucleotidprobe unter Hybridisierungsbedingungen zusammengebracht.The actual hybridization step between the he derivatized nucleic acid according to the invention and the complementary nucleic acid in the to be analyzed Trial is carried out according to known methods. Is preferred hybridization on a solid phase. This will after splitting the nucleic acid into single strands Fixed nucleic acid to be detected on a solid phase. Usually nitrocellulose or a nylon membrane used. Then the immobilized nuclein acid with the polynucleotide sample contained below Hybridization conditions brought together.
Der Nachweis der Hybridisierung kann dann nach den üb lichen Wasch- und Blockierschritten durch Zugabe und Inkubation mit DNA-Methylase erfolgen. Aufgrund der sehr hohen Bindungskonstante zwischen dazaC-haltiger DNA und der DNA-Methylase entsteht ein sehr stabiler Komplex aus nachzuweisender DNA, Polynucleotidsonde und der DNA-Methylase. Nach Entfernung der nicht gebundenen DNA-Methylase und der nicht hybridisierten Polynucleotid probe kann die erfolgte Hybridisierung z. B. durch den Nachweis der gebundenen DNA-Methylase mit monoclonalen Maus-anti-DNA-Methylase-Antikörpern und einem mit β-Galactosidase konjugiertem zweiten anti-Maus-IgG nach gewiesen werden. The hybridization can then be detected after the usual washing and blocking steps by addition and incubation with DNA methylase. Due to the very high binding constant between DNA containing dazaC and DNA methylase, a very stable complex of DNA to be detected, polynucleotide probe and DNA methylase is formed. After removal of the unbound DNA methylase and the non-hybridized polynucleotide probe, the hybridization can, for. B. by detection of the bound DNA methylase with monoclonal mouse anti-DNA methylase antibodies and a conjugated with β- galactosidase conjugated second anti-mouse IgG.
Die Verwendung von dazaC-Methylase bietet darüber hinaus eine Reihe weiterer Möglichkeiten, DNA- Hybridisierung einfach nachzuweisen. So besteht die Möglichkeit, gentechnologisch oder chemisch hergestellte DNA-Methylase-Enzym-Konjugate oder mit einem Marker ge koppelte DNA-Methylase zum Nachweis der gebildeten Hybride zu verwenden, wobei alle in bekannten Bindungstesten ver wendeten Marker (Label) eingesetzt werden können. Dieses erspart die Inkubation mit dem anti-Methylase-Antikörper.The use of dazaC methylase provides also a number of other ways to DNA Easy to demonstrate hybridization. So there is Possibility of genetically engineered or chemically produced DNA-methylase-enzyme conjugates or with a marker coupled DNA methylase to detect the hybrids formed to use, all ver in known binding tests used marker (label) can be used. This saves incubation with the anti-methylase antibody.
In einer anderen Ausführungsform wird die dazaC enthaltene Polynucleotidsonde vor der Hybridisierung mit DNA-Methylase inkubiert und die gebildeten DNA-Methylase-Polynucleotid sonden-Komplexe werden zur Hydridisierung eingesetzt. Der Nachweis der Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nuclein säure erfolgt auch hier nach Durchführung der Hybridisierung und der üblichen Waschritte durch Bindung von anti-DNA- Methylase-Antikörpern an die Methylase nach bekannten Ver fahren. Dieser Schritt kann entfallen, wenn direkt ein Komplex aus Polynucleotidsonde und mit einem Marker oder mit einem Enzym gekoppelter DNA-Methylase verwendet wird.In another embodiment, the dazaC is included Polynucleotide probe before hybridization with DNA methylase incubated and the DNA methylase polynucleotide formed probe complexes are used for hydriding. The Detection of hybridization with the nuclein to be detected Acid also occurs here after the hybridization has been carried out and the usual washing steps by binding anti-DNA Methylase antibodies to the methylase according to known ver drive. This step can be omitted if directly Complex of polynucleotide probe and with a marker or DNA methylase coupled with an enzyme is used.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, die dazaC-haltige Polynucleotidsonde nach Hybridisierung mit der nachzu weisenden DNA mit anti-dazaC-Antikörpern direkt zu inku bieren. Der Nachweis der Hybridisierung erfolgt dann nach bekannten immunologischen Verfahren mittels eines zweiten mit einem Marker versehenen Antikörpers oder direkt, falls der anti-dazaC-Antikörper mit einem Marker oder Enzym ge koppelt ist. Furthermore, there is the possibility of the DAC containing Polynucleotide probe after hybridization with the post directing DNA with anti-dazaC antibodies directly beers. The hybridization is then verified known immunological methods using a second with a labeled antibody or directly if the anti-dazaC antibody with a marker or enzyme is coupled.
Da die DNA-Methylase auch an natürliche DNA bindet, kann leicht ein konvalenter Komplex aus DNA-Methylase oder mit einem Marker oder Enzym gekoppelter Methylase und natür licher einzelsträngiger bzw. doppelsträngiger DNA durch Bestrahlen im nahen UV-Bereich oder durch andere bekannte chemische Vernetzungsreaktionen zwischen Protein und Nucleinsäuren gebildet werden. Dieser Komplex kann dann direkt zur Hybridisierung eingesetzt und in der üblichen Weise nachgewiesen werden.Since DNA methylase also binds to natural DNA, it can easily a convex complex of DNA methylase or with a marker or enzyme coupled methylase and natural single-stranded or double-stranded DNA Irradiate in the near UV range or by other known ones chemical crosslinking reactions between protein and Nucleic acids are formed. This complex can then used directly for hybridization and in the usual Way to be demonstrated.
Die Modifikation der Nucleinsäure durch den Einbau des dazaCTP beeinflußt die Hybridisierungsreaktion nicht, darüber hinaus werden die in der Hybridisierungsreaktion gebildeten DNA/DNA-Hybride durch die anschließende Bindung der DNA-Methylase verstärkt. Eine weitere Sensitivitäts steigerung wird dadurch möglich, daß auf de DNA-Methy lase mehrere Epitope die spezifischen Antikörper binden können, so daß eine zusätzliche Amplifikation entsteht.The modification of the nucleic acid by the incorporation of the dazaCTP does not affect the hybridization reaction, in addition, those in the hybridization reaction formed DNA / DNA hybrids by the subsequent binding of DNA methylase enhanced. Another sensitivity increase is made possible by the fact that the DNA-Methy read several epitopes that bind specific antibodies can, so that an additional amplification arises.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auf ein fache Weise Analysenergebnisse erzielen, die den bekannten Verfahren zur Nucleinsäurebestimmung mindestens ebenbürtig sind. Aufgrund der sehr hohen Bindungskonstante von DNA- Methylase an dazaC-haltige DNA sind Nachweise auch in sehr geringen Konzentrationsbereichen möglich, ohne daß es zu einer störenden unspezifischen Bindung von DNA-Methylase an nicht dazaC-haltige DNA kommt.With the method according to the invention, one can to achieve analytical results that Methods for nucleic acid determination at least equal are. Due to the very high binding constant of DNA Methylase on DNA containing dazaC are also very evident low concentration ranges possible without it an interfering non-specific binding of DNA methylase DNA that does not contain CA comes.
1 µg Plasmid-DNA (pBCam 3225) wird in einem Volumen von 50 µl unter Standardbedingungen (je 50 µM dATP, dGTP, dTTP, 1 µM dCTP, 5 mM MnCl2, 50 µg/ml BSA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) mit 500 µM dazuCTP und 2 pg DNAse I und 500 U DNA Polymerase I bei 15°C inkubiert. Nach einer Stunde wird die Reaktion durch Zugabe von 100 µl 12,5 mM EDTA, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) abgebrochen. Um die mit azaC modifizierte DNA von den nicht umgesetzten Nucleotidtri phosphaten abzutrennen, wird der Ansatz über eine Sephadex G-50 Säule chromatographiert. Die DNA läuft im Ausschluß volumen und wird in 400 µl 10 mM Tris-Puffer, pH 7,6, eluiert.1 µg of plasmid DNA (pBCam 3225) in a volume of 50 µl under standard conditions (50 µM dATP, dGTP, dTTP, 1 µM dCTP, 5 mM MnCl 2 , 50 µg / ml BSA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) with 500 µM CTP and 2 pg DNAse I and 500 U DNA polymerase I at 15 ° C. After one hour, the reaction is stopped by adding 100 μl of 12.5 mM EDTA, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS). In order to separate the azaC-modified DNA from the unreacted nucleotide tri-phosphates, the mixture is chromatographed on a Sephadex G-50 column. The DNA runs in volume and is eluted in 400 ul 10 mM Tris buffer, pH 7.6.
5 pmol einzelsträngiger M13camp5-DNA werden mit 5 pmol eines synthetisierten Oligonucleotids (60 N), welches komplementär zur in M13camp5 klonierten Campylobacter- DNA ist, hybridisiert. Der entstandene Primer-Tenplate- Komplex wird mit 100 U DNA Polymerase I (Klenow-Enzym) und je 200 µM dGTP, dATP, dTTP, 5 µM dCTP, 750 µM dazaCTP in 50 µl 5 mM MnCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 50 µg/ml BSA bei 15° inkubiert. Nach 45 Min. wird die Reaktion gestoppt und der Ansatz auf einem 8% denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Einzelsträngige dazaC- haltige DNA, die größer als 150 N ist, wird eluiert und zur Hybridisierung eingesetzt. 5 pmol of single-stranded M13camp5 DNA are hybridized with 5 pmol of a synthesized oligonucleotide (60 N), which is complementary to Campylobacter DNA cloned in M13camp5. The resulting primer-tenplate complex is mixed with 100 U DNA polymerase I (Klenow enzyme) and 200 µM dGTP, dATP, dTTP, 5 µM dCTP, 750 µM dazaCTP in 50 µl 5 mM MnCl 2 , 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 50 µg / ml BSA incubated at 15 °. After 45 minutes, the reaction is stopped and the mixture is separated on an 8% denaturing polyacrylamide gel. Single-stranded DNA containing DNA larger than 150 N is eluted and used for hybridization.
Auf eine Nylonmembran werden mittels einer dot-blot Apparatur verschiedene Mengen denaturierte Campylo bacter-DNA aufgetragen (10 ng-1 pg). Nach Prehybri disierung des Filters für 1 Std. bei 60° in 6xSSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat), 5 x Denhardt (Rinder serumalbumin/Polyrinylpyrrolidon/Ficol), 0,5% SDS und 20 µg/ml denatuirerte Heringssperma-DNA erfolgt durch Zugabe der aus Beispiel 1 nick translatierten dazaC-haltigen DNA-Sonde in einer Konzentration von 300 ng/ml die eigentliche Hybridisierung für 3 Std. bei 60°C. Anschließend wird das Filter nach bekannten Verfahren mit abnehmenden SSC-Konzentrationen bis zur gewünschten Stringenz gewaschen.A dot blot is applied to a nylon membrane Apparatus various amounts of denatured Campylo bacter DNA applied (10 ng-1 pg). After Prehybri filtering for 1 hour at 60 ° in 6xSSC (Sodium chloride / sodium citrate), 5 x Denhardt (cattle serum albumin / polyrinylpyrrolidone / ficol), 0.5% SDS and 20 µg / ml denatured herring sperm DNA by adding the nick translated from Example 1 DNA probe containing dazaC in a concentration of 300 ng / ml the actual hybridization for 3 hours at 60 ° C. Then the filter according to known Procedure with decreasing SSC concentrations up to desired stringency.
Zum Nachweis des in der Hybridisierungsreaktion gebildeten Hybrids aus nachzuweisender DNA und der dazaC-haltigen DNA-Sonde werden die Hybride mit DNA- Methylase inkubiert. Dazu wird die Nylonmembran unter Schütteln mit 1 µg/ml DNA-Methylase in 20 mM Tris- Puffer, pH 7,5 5 mM EDTA, 0,5 mM Dithioerythiol, 2% Glycerin, 1% BSA, 10 µM S-Adenosyl-Methionin bei 37°C 15 Min. inkubiert. Nicht gebundene DNA- Methylase wird durch je 5minütiges Waschen des Filters mit 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,4 M NaCl und anschließend mit 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl bei Raumtemperatur ent fernt. To detect the in the hybridization reaction hybrid formed from DNA to be detected and the the DNA probe containing dazaC, the hybrids are Incubated methylase. For this, the nylon membrane is under Shake with 1 µg / ml DNA methylase in 20 mM Tris Buffer, pH 7.5 5 mM EDTA, 0.5 mM dithioerythiol, 2% glycerin, 1% BSA, 10 µM S-adenosyl methionine incubated at 37 ° C for 15 min. Unbound DNA Methylase is washed by washing the Filters with 20 mM Tris buffer, pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.4 M NaCl and then with 20 mM Tris buffer, pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl at room temperature distant.
Nach Waschen der Membran aus b) mit 1 x PBS (Natrium phosphat), pH 7,5 und 0,1% Tween 20 wird mit dem Maus- anti-DNA-Methylase-Antikörper (1 µg/ml) 30 Min. bei Raumtemperatur in 1 x PBS, 0,1% BSA inkubiert. An schließend wird der β-Galactosidase-anti-Maus-IgG- Antikörper zugesetzt und ebenfalls 30 Min. bei Raum temperatur inkubiert. Die nicht gebundenen Antikörper werden durch 5maliges Waschen mit 1 x PBS entfernt. Anschließend wird mit der Enzymsubtratlösung (0,5 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Galactosidase, 1 mM MgCl2, 3 mM Kaliumferricyanid, 3 mM Ferrocyanid in PBS, pH 7,5) mindestens 1 Std. bei Raumtemperatur inku biert. Auf diese Weise lassen sich problemlos 50 pg Campylobacter-DNA nachweisen.After washing the membrane from b) with 1 × PBS (sodium phosphate), pH 7.5 and 0.1% Tween 20, the mouse anti-DNA methylase antibody (1 μg / ml) was used for 30 minutes at room temperature incubated in 1 x PBS, 0.1% BSA. Then the β- galactosidase anti-mouse IgG antibody is added and also incubated for 30 minutes at room temperature. The unbound antibodies are removed by washing 5 times with 1 × PBS. Then with the enzyme substrate solution (0.5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactosidase, 1 mM MgCl 2 , 3 mM potassium ferricyanide, 3 mM ferrocyanide in PBS, pH 7.5) for at least 1 hour. incubated at room temperature. In this way, 50 pg Campylobacter DNA can be detected without any problems.
Die in Beispiel 2 hergestellte einzelsträngige dazaC- haltige DNA-Sonde wird mit DNA-Methylase (10 µg/ml), wie in Beispiel 3b beschrieben, inkubiert. Zur teilweisen Ab trennung ungebundener Methylase wird der Ansatz über eine Sephadex G-200 Säule chromatographiert. Der erhaltene DNA- Sonde-Methylase-Komplex ist äußerst stabil und kann zum Nachweis von Campylobacter-DNA, wie in Beispiel 3a be schrieben, eingesetzt werden. Die Hybridisierungstempera tur liegt dabei 35°C unter der erwarteten Dissoziations temperatur des nicht mit DNA-Methylase gelabelten Sonde- DNA-Hybrids. Der Nachweis der erfolgten Hybridisierung erfolgt wie in Beispiel 3c beschrieben.The single-stranded Zac- containing DNA probe with DNA methylase (10 ug / ml), such as described in Example 3b, incubated. For partial Ab separation of unbound methylase, the approach is via a Chromatographed Sephadex G-200 column. The DNA obtained Probe methylase complex is extremely stable and can be used for Detection of Campylobacter DNA as in Example 3a wrote, used. The hybridization tempera The temperature is 35 ° C below the expected dissociation temperature of the probe not labeled with DNA methylase DNA hybrids. Evidence of hybridization takes place as described in Example 3c.
Zum Nachweis des in Beispiel 3 gebildeten Hybrids aus nachzuweisender DNA und der dazaC-haltigen DNA-Sonde wird mit einem DNA-Methylase-Peroxidase-Konjugat inkubiert. Die Inkubation erfolgt analog der Inkubation mit DNA- Methylase, wie in Beispiel 3b beschrieben.To detect the hybrid formed in Example 3 DNA to be detected and the DNA probe containing dazaC incubated with a DNA-methylase-peroxidase conjugate. The incubation is carried out analogously to the incubation with DNA Methylase as described in Example 3b.
Nach Bindung und Abtrennung des nicht gebundenen DNA- Methylase-Enzym-Konjugats erfolgt der direkte Nachweis der Hybridisierung durch Zugabe der Peroxidasesubstrat lösung aus 0,025% Wasserstoffperoxid und 400 µg/ml Aminoethylcarbazol in 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5, und Inkubation bei Raumtemperatur, bis eine deutliche Farbreaktion auftritt.After binding and separating the unbound DNA Methylase-enzyme conjugate is used for direct detection hybridization by adding the peroxidase substrate solution of 0.025% hydrogen peroxide and 400 µg / ml Aminoethyl carbazole in 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.5, and incubation at room temperature until one clear color reaction occurs.
Die Herstellung des Konjugates aus DNA-Methylase und Meerrettich-Peroxidase erfolgt nach bekannten Verfahren mit dem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz N-Succin- imidyl-3-(2-pyridyldiothio)-propionat.The preparation of the conjugate from DNA methylase and Horseradish peroxidase takes place according to known methods with the heterobifunctional coupling reagent N-succin imidyl 3- (2-pyridyldiothio) propionate.
Claims (6)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873712786 DE3712786A1 (en) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS |
| EP88105441A EP0286958A3 (en) | 1987-04-15 | 1988-04-06 | Process and means for the determination of nucleic acids |
| JP63091897A JPS63282659A (en) | 1987-04-15 | 1988-04-15 | Method of measuring nucleic acid and measuring agent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873712786 DE3712786A1 (en) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3712786A1 true DE3712786A1 (en) | 1988-11-03 |
Family
ID=6325680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19873712786 Withdrawn DE3712786A1 (en) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0286958A3 (en) |
| JP (1) | JPS63282659A (en) |
| DE (1) | DE3712786A1 (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6905669B2 (en) | 2001-04-24 | 2005-06-14 | Supergen, Inc. | Compositions and methods for reestablishing gene transcription through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase |
| US6982253B2 (en) | 2002-06-05 | 2006-01-03 | Supergen, Inc. | Liquid formulation of decitabine and use of the same |
| US20050123944A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-06-09 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and compositions related to the use of sequence-specific endonucleases for analyzing nucleic acids under non-cleaving conditions |
| US7250416B2 (en) | 2005-03-11 | 2007-07-31 | Supergen, Inc. | Azacytosine analogs and derivatives |
| US7700567B2 (en) | 2005-09-29 | 2010-04-20 | Supergen, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| KR102004559B1 (en) | 2011-08-30 | 2019-07-26 | 아스텍스 파마수티컬스, 인크. | Decitabine derivative formulations |
| JP6768722B2 (en) | 2015-07-02 | 2020-10-14 | 大塚製薬株式会社 | Lyophilized pharmaceutical composition |
| BR112020002280A2 (en) | 2017-08-03 | 2020-07-28 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | pharmacological compound and purification methods |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2518755B1 (en) * | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | PROBE CONTAINING MODIFIED NUCLEIC ACID RECOGNIZABLE BY SPECIFIC ANTIBODIES AND USE OF THE SAME TO DETECT AND CHARACTERIZE A HOMOLOGATED DNA SEQUENCE |
| US4529700A (en) * | 1982-08-20 | 1985-07-16 | University Of Miami | Hybridoma cells secreting a monoclonal antibody specific for 5-bromo and 5-iodoeoxyuridine and reagents for measuring cellular proliferation |
| US4585736A (en) * | 1983-10-18 | 1986-04-29 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine |
| JPH0723393B2 (en) * | 1985-05-15 | 1995-03-15 | アモコ・コーポレーション | Cytidine congener |
-
1987
- 1987-04-15 DE DE19873712786 patent/DE3712786A1/en not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-06 EP EP88105441A patent/EP0286958A3/en not_active Withdrawn
- 1988-04-15 JP JP63091897A patent/JPS63282659A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0286958A2 (en) | 1988-10-19 |
| JPS63282659A (en) | 1988-11-18 |
| EP0286958A3 (en) | 1989-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0324474B1 (en) | Method for the detection of nucleic acids | |
| LeBowitz et al. | Initiation of DNA replication on single-stranded DNA templates catalyzed by purified replication proteins of bacteriophage lambda and Escherichia coli. | |
| Weinberg et al. | Reconstitution of simian virus 40 DNA replication with purified proteins. | |
| DE69730926T2 (en) | Modified thermostable DNA polymerase | |
| McMacken et al. | A multienzyme system for priming the replication of phiX174 viral DNA. | |
| US4987065A (en) | In vivo labelling of polynucleotide sequences | |
| Helfman et al. | Branch point selection in alternative splicing of tropomyosin pre-mRNAs | |
| DE3446635C2 (en) | Synthesis of amino derivatives of oligonucleotides | |
| Romano et al. | Requirements for synthesis of ribonucleic acid primers during lagging strand synthesis by the DNA polymerase and gene 4 protein of bacteriophage T7. | |
| Eisenberg et al. | The mechanism of replication of øX174 DNA: XII. Non-random location of gaps in nascent øX174 RF II DNA | |
| DE4344742A1 (en) | Method for the immobilization of nucleic acids | |
| DD301731A9 (en) | T7 DNA POLYMERASE | |
| DD284053A5 (en) | A PROCESS FOR THE REINFORCEMENT OF NUCLEOTIDE SEQUENCES | |
| DE4406524A1 (en) | 3 'RNA tag with terminal transferase | |
| DE3929030A1 (en) | METHOD FOR PROPELLING NUCLEIC ACIDS | |
| KR100559098B1 (en) | Method for synthesizing dna | |
| EP0122614B1 (en) | Kit for terminally chemically labeling dna | |
| DE3712786A1 (en) | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS | |
| DE3910151A1 (en) | 5'-Bromo-2'-deoxyuridine-labelled DNA or RNA probes | |
| DE4336266A1 (en) | Stabilized liquid mixtures for labeling nucleic acids | |
| JP2607058B2 (en) | Method for labeling polynucleotides in vivo | |
| Sutton et al. | Trypanosome trans‐splicing utilizes 2′‐5′ branches and a corresponding debranching activity. | |
| Lessor et al. | Synthesis and biochemical evaluation of 2'-deoxy-lin-benzoadenosine phosphates | |
| US4401759A (en) | Detection and isolation of glucagon mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide | |
| DE4001154A1 (en) | New nucleic acids contg. detectable immobilising gps. - formed as amplification prod. in new nucleic acid assay, useful for clinical diagnosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |