DE3686061T2 - Verfahren zur diagnose von krankheiten mit einer arthritischen komponente. - Google Patents

Verfahren zur diagnose von krankheiten mit einer arthritischen komponente.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die diagnostische Methodologie für Krankheiten mit einer arthritischen Komponente, einschließlich rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis und verwandten Zuständen.
  • Rheumatoide Arthritis ist eine weitverbreitete chronische Systemerkrankung, von der angenommen wird, daß sie eine Autoimmunkomponente aufweist, siehe z. B. Kunkel und Tan, Adv. Immunol. 4, 351-395 (1964). Ob sie Immunreaktion einleitet, aufrechterhält oder eine Folge der Krankheit ist, wird derzeit nicht verstanden. Bisher wurde angenommen, daß sowohl humorale als auch zelluläre Mechanismen in den artikulären und extraartikulären Manifestationen der Krankheit involviert sind. Osteoarthritis ist eine Gelenkserkrankung, von der angenommen wird, daß sie sich von rheumatoider Arthritis unterscheidet, wobei Knochenschaden auf Knorpeldegenerierung folgt. Es wird angenommen, daß diese Degenerierung entweder eine Knorpelprimärerkrankung oder eine Sekundärreaktion auf stressinduzierte Mikrofrakturen von subchondralem Knochen ist. Für beide Krankheiten erfolgt derzeit die Unterscheidungsdiagnose auf Basis klinischer Geschichte und radiologischer Kriterien.
  • In rheumatoider Arthritis sind Immunoglobulin (Ig)-Komplexe vorhanden, die sind klassischen antigeninduzierten immunkomplexen in ihrer Fähigkeit ähnlich sind, den klassischen Komplementweg zu aktivieren, Opsonisierungsaktivität von Makrophagen zu stimulieren, Hypersensibilität vom Soforttyp auf subkutane Injektion hervorzurufen und ähnliche Wirkungen. Diese Komplexe bestehen ausschließlich aus Immunoglobulinen, was impliziert, daß Immunoglobulin sowohl der "Antikörper" (rheumatoider Faktor) als auch das "Antigen" ist. Jedoch unterscheiden sich diese Komplexe von normalen Immunkomplexen in der geringen Affinität der Bindungsstelle (Fab-Region von rheumatoiden Faktoren) für die mutmaßliche Determinante, der Präferenz für homologe Assoziation (IgG rheumatoide Faktoren) und insbesondere durch die Tatsache, daß sich der Großteil von rheumatoiden Faktoren (IgM, IgA, IgG) an Immunoglobulin der γ-Klasse bindet. Es wurde daher argumentiert, daß in Patienten mit rheumatoider Arthritis eine Strukturänderung von Immunoglobulinen der γ-Klasse (IgG) vorliegt, die eine antigen und wahrscheinlich immunogen aktive Subpopulation hervorruft; siehe Kunkel und Tan, supra. Daß diese antigene Determinante tatsächlich existiert und auf die Cγ2- Bereiche von verändertem IgG beschränkt ist, wurde durch die Fähigkeit von rheumatoiden Faktor Fab-Gruppen, sich nur an Fc zu binden, das einen oder beide seiner Cγ2-Bereiche trägt, bewiesen. Diese und verschiedene andere Beweisführungen führten zu der Ansicht, daß die Komplexe in Patienten mit rheumatoider Arthritis Fab-Fc (IgG)-Wechselwirkungen involvieren. Es wurde auch postuliert, daß eine Vielzahl von Immunkomplexen in rheumatoidem Arthritisserum überwiegend, wenn nicht ausschließlich, aus selbst-assoziiertem, verändertem IgG besteht. D.h. jene IgG-Moleküle, die anti-IgG-Aktivität in ihrer Fab- Region enthalten, tragen auch die Strukturanomalie auf ihrer Fc- Region. Die Ansicht jedoch, daß diese anti-IgG-Aktivität die Folge eines auf eine anomale IgG-Subpopulation hervorgerufenen Autoantikörpers ist, wurde von anderen Forschern angezweifelt, die Daten vorlegten, welche nahelegten, daß die Selbst- Assoziation von IgG nicht die Folge von echten Antikörper-Antigen- Wechselwirkungen war (nicht eine Autoimmunerscheinung).
  • Bemühungen, die Moleküländerungen in der Fc-Region zu untersuchen, die zu diesen Erscheinungen führen, involvierten weitreichend die Verwendung von rheumatoiden Faktoren als die spezifischsten verfügbaren Sonden. Jedoch zeigen IgG- und IgM- rheumatoide Faktoren zwei verwirrende Eigenschaften. Zunächst reagieren sie in einem großen Ausmaß nicht nur mit IgG vom gleichen (erkrankten) Individuum, sondern auch mit IgG von normalen Individuen und sogar anderen Arten (z. B. Kaninchen, Rhesusaffe). Dies impliziert, daß die Fc-Bindungsstelle an etwas IgG von Patienten mit rheumatoider Arthritis auch an IgG existiert, das von Patienten ohne Krankheit, aber wahrscheinlich in einer latenten Form, erhalten wurde. Zweitens ist bei einigen Patienten anti-IgG-Aktivität mit einem großen Anteil (25%) des IgG- Gesamtpools assoziiert und die resultierenden Komplexe machen mehr als 50% aus. Drittens sind Wechselwirkungen rheumatoider Faktor - IgG invariabel monovalent, trotz der allgemein geltenden Ansicht, daß IgG ein strukturell symmetrisches Molekül ist und daher immer eine gleiche Zahl von Determinanten aufweisen sollte. Obwohl sterische Beschränkungen auf die Wechselwirkung zwischen rheumatoidem Faktor und Target-IgG für diese Monovalenz verantwortlich sein könnten, ist es möglich, daß Glykosylierung von IgG tatsächlich viele Moleküle strukturell asymmetrisch macht (obwohl noch tatsächlich symmetrisch in bezug auf ihre Polypeptide). Wenn letzteres wahr wäre, könnte die Antigendeterminante auf Fc Oligosaccharid auf gewisse Weise involvieren.
  • Es gibt keinen Beweis zugunsten von Aminosäureänderungen in der Fc-Region von IgG von arthritischen Patienten. Verschiedene Berichte legten jedoch nahe, daß Gesamtserum-IgG oder IgG- rheumatoider Faktor von Patienten mit Immunkomplexerkrankungen (rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes) in bezug auf seinen Kohlehydratgehalt anomal ist; siehe Pope et al., J.Immunol. 115, 365-373 (1975), Hymes et al., J.Biol.Chem. 254, 3148-3151 (1979), und Duc Dodon et al., Immunol. 42, 401- 407 (1981).
  • Aus diesen Veröffentlichungen geht nicht hervor, wie die Immunkomplexanomalie, wenn überhaupt, in diagnostischer Methodologie auf rheumatoide Arthritis genutzt werden kann. Allgemein verwendete Verfahren zur Diagnose von rheumatoider Arthritis basieren auf serologischen Reaktionen. Gemäß diesen Versuchen wird das Patientenserum mit einer Reihe von serologischen Systemen umgesetzt, die alle γ-Globulin in gewisser Form oder eine Komponente von Cohn-Fraktion II, erhalten aus Plasma oder Serum, das weitgehend γ-Globulin ist, enthalten. Wenn das Patientenserum auf die Krankheit positiv ist, bewirkt die Anwesenheit des sogenannten rheumatoiden Faktors eine Agglutinations- oder Immunopräzipitationsreaktion, die mit Kontrollproben verglichen werden kann. Derartige Reaktionen können durch verschiedene wohlbekannte definitive Versuche bestimmt werden, die beispielsweise Elektrophorese, Coombs (Antiglobulin)-Hämagglutinationsinhibierungstest, Präzipitinreaktion, Geldiffusion, Immunoelektrophorese, Nephelometrie, Radioimmunoassay und Fließzytometrie einschließen.
  • Eine typische Komponente im Agglutinationstest auf rheumatoiden Faktor involviert die Verwendung von inerten Trägerteilchen, wie beispielsweise Latexteilchen. Dieser Test wurde zuerst von Singer und Plotz, Amer.J.Med. 21, 888-892 (1956), beschrieben. Modifizierungen des Latextests sind im US-Patent 3 088 875 und zahlreichen anderen Patenten und Veröffentlichungen beschrieben. Kommerzielle Beispiele dieser Latextests auf rheumatoiden Faktor sind "Rapi-tex" von Behring Diagnostics, "RA-Test" von Hyland Diagnostics und "Rheumanosticon" von Organon Diagnostics.
  • Weitere Hintergrundinformationen über diese herkömmlichen Diagnosetests auf rheumatoide Arthritis können an Hand von Rose und Friedman, Manual of Clinical Immunology, American Society For Microbiology, Washington, D.C., 2. Auflage, 1980, erhalten werden; siehe insbesondere Horan und Schenk "Flow Cytometric Analysis of Serum Autoantibodies Applied to the Detection of Rheumatoid Factor", Kapitel 9, S. 56-59; Agnello "Method for Detection of Immune Complexes Utilizing Clq or Rheumatoid Factors", Kapitel 21, S. 178-185, und Froelich und Williams "Tests for Detection of Rheumatoid Factors", Kapitel 117, S. 871-873; siehe auch Schur "Immune-complex assays: The state of the art", New England Journal of Med. 298 (3), 161-162 (1978).
  • Trotz des wesentlichen Ausmaßes an wissenschaftlicher Forschung auf dem Gebiet ist klar, daß kein Diagnosetest auf rheumatoide Arthritis völlig verläßlich ist. Einem signifikanten Prozentsatz von klassischen Patienten mit der Krankheit fehlt der rheumatoide Faktor. Demgemäß würde ein verbessertes Verfahren für die Diagnose von rheumatoiden Krankheiten und verwandten Zuständen wesentliche Verwendung finden.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten mit einer arthritischen Komponente, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis, vorgesehen. Das Verfahren umfaßt die Bestimmung des Galaktosemangels in einer Probe von Patientenblutserum oder -plasma oder Gelenkschmiere oder einer Ig-Komponente oder eines Fragments hievon im Vergleich mit dem entsprechenden Normalwert für Galaktose.
  • Der Galaktosemangel führt zu einer Erhöhung der Anwesenheit von nicht-reduzierenden terminalen N-Acetylglucosaminresten. So wird die Erfindung vorzugsweise durchgeführt, indem (a) der Prozentsatz von Ig N-verknüpften Oligosaccharidstrukturen, die eine Außenarm-Galaktose tragen, bestimmt oder (b) der Prozentsatz von nicht-reduzierenden terminalen Außenarm-N-Acetylglucosaminresten bestimmt wird. Diese bevorzugten Tests können an gesamtem Ig, wie beispielsweise IgG, oder einem Fragment hievon durchgeführt werden. Fragmente können beispielsweise H-Kette, Fc oder Glykopeptide oder intakte Ig-Oligosaccharide oder Oligosaccharidfragmente, die von Ig stammen, sein.
  • Illustrative Beispiele zum Durchführen der obigen Bestimmung (a) sind: direkte enzymatische oder auf Lektin basierende Tests auf Galaktose, wie beispielsweise
  • (i) direkte enzymatische Tests auf Galaktose unter Verwendung von exo-β-Galaktosidasen oder Galaktoseoxidase und
  • (ii) Ricin communis-Agglutinin involvierende direkte Lektintests auf Galaktose.
  • Illustrative Beispiele zum Durchführen der obigen Bestimmung (b) sind: direkte chemische, enzymatische oder auf Lektin basierende Tests auf exponiertes N-Acetylglucosamin, wie beispielsweise
  • (i) exo-β-N-Acetylhexosaminidasen involvierende direkte enzymatische Tests auf β-N-Acetylglucosamin und
  • (ii) Weizenkeimagglutinin involvierende direkte Lektintests auf β-N-Acetylhexosamin.
  • Die Erfindung kann auch durch indirekte Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise Bestimmung von Änderungen des Molgewichts oder des hydrodynamischen Volumens. D.h. die Bestimmung kann das vollständige Sequenzieren aller komplexen Oligosaccharide von Ig oder eines seiner obigen Fragmente, Analyse der Profile der Asialo- oder der neutralen Oligosaccharidfraktion von Ig oder Änderungen im Molgewicht von Glykopeptiden von Ig und seinen Fragmenten umfassen.
  • Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß
  • 1. das Ausmaß von Außenarm-Galaktose β(1-4) auf Serum-IgG in der "Asialo"-Oligosaccharidfraktion von rheumatoider Arthritis auf 50% (p = 0,001) und in der neutralen Oligosaccharidfraktion von rheumatoider Arthritis auf 41% (p = 0,001) sinkt. Es gibt eine reziproke Zunahme im Gehalt von nicht-reduzierendem terminalen Außenarm β(1-2)-verknüpften N-Acetylglucosamin;
  • 2. das Ausmaß von Außenarm-Galaktose in der Asialo-Population von Osteoarthritis auf 66 % (p = 0,002) und in der neutralen Oligosaccharidfraktion von Osteoarthritis auf 59 % (p=0,002) sinkt. Es gibt eine reziproke Zunahme des nicht-reduzierenden terminalen β(1-2)-verknüpften Außenarm-N-Acetylglucosamins.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung bildend angesehen wird, besonders herausstreicht und eindeutig beansprucht, wird angenommen, daß die Erfindung aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen besser verständlich wird, in welchen kurz
  • Fig. 1(a) die Struktur des Antikörper (IgG)-Moleküls in schematischer Form zeigt;
  • Fig. 2 die relative Größe eines Immunoglobulinbereiches und eines voll ausgedehnten N-verknüpften komplexen Oligosaccharids zeigt;
  • Fig. 2 schematisch die Primärsequenzen der N-verknüpften Oligosaccharide assoziiert mit menschlichem IgG zeigt. Das hydrodynamische Volumen (gemessen in Glukoseeinheiten - g.u. jeder Struktur (oder ihres neutralen Derivats im Falle der ialylierten) ist angegeben. Der Schlüssel für die schematischen Symbole ist im Rechteck darunter gezeigt. Die Verbundstruktur ist auch von Rademacher et al., Biochem.Soc.Trans. 11, 132-134 (1983), gezeigt;
  • Fig. 3 repräsentative Bio-Gel P-4 (-400) Gelpermeationschromatogramme der Asialo-Oligosaccharide von Gesamtserum IgG für (a) Kontroll-, (b) rheumatoide Arthritis- und (c) osteorthritische Patienten zeigt.
  • Fig. 4 das relative Vorkommen der vier Kernstrukturen der Asialo-Oligosaccharide von Gesamtserum-IgG für Kontroll-, rheumatoide Arthritis- und Osteoarthritispatienten in zwei Studienreihen zeigt und
  • Fig. 5 repräsentative Radioelektrophoretogramme der vom IgG von Kontroll-, rheumatoiden Arthritis- und Osteoarthritispatienten freigesetzten Oligosaccharide zeigt.
  • Die folgenden detaillierten Beispiele illustrieren die Erfindung weiter, obwohl klar ist, daß die Erfindung nicht auf diese spezifischen illustrativen Beispiele beschränkt ist.
  • In diesen Beispielen werden herkömmliche Kohlehydratabkürzungen und Nomenklatur verwendet. So werden die folgenden Symbole zum Bezeichnen von Homosaccharideinheiten und ihren besten in Oligosacchariden verwendet:
  • Glukose - Glc
  • Galaktose- Gal
  • Mannose - Man
  • Fucose - Fuc
  • Glykonsäuren, Glykuronsäuren, 2-Amino-2-desoxysaccharide und deren N-Acetylderivate sind durch modifizierte Symbole angegeben. Beispielsweise:
  • N-Acetylglucosamin - GlcNAc
  • N-Acetylneuraminsäure - NeuNAc
  • Die Position und Natur von Verknüpfungen zwischen Einheiten sind durch Ziffern und die anomeren Symbole α und β gezeigt. Pfeile werden zum Angeben der Richtung der Glykosidbindung verwendet, wobei der Pfeil vom Hemiacetalkohlenstoff der Verknüpfung wegzeigt. Beispielsweise kann ein üblicher verzweigter Kern in Oligosacchariden mit N-glykosidischen Proteinverknüpfungen wie folgt dargestellt werden:
  • Aminosäuren sind ebenfalls durch ihre herkömmlichen Symbole gezeigt. Beispielsweise:
  • L-Asparagin - Asn
  • L-Serin- Ser
  • L-Threonin - Thr
  • Auch die Antikörperstruktur ist durch herkömmliche Nomenklatur bezeichnet. Die Immunoglobulin (Ig)-Moleküle bestehen aus leichten (L) und schweren (H) Ketten. Jede der fünf Klassen von Ig-Molekülen weist ähnliche Gruppen von leichten Ketten auf, aber eine antigen unterschiedliche Gruppe von schweren Ketten auf, die mit dem entsprechenden griechischen Buchstaben bezeichnet sind (γ Ketten in IgG, u in IgM, α in IgA, δ in IgD, ε in IgE). Die Aminosäuresequenz der N-terminalen Homologieeinheiten variiert zwischen Molekülen stark und ist als die variable (V) Region bekannt im Unterschied zu der konstanten (C) Region der Moleküle. Die N-terminalen Homologieeinheiten von leichten und schweren Ketten sind VL bzw. VH bezeichnet. Fragmente des durch Papaindigestion erhaltenen Antikörpermoleküls werden als die Antigenbindungsfragmente (Fab) und das kristallisierbare Fragment (Fc) bezeichnet, während bei Pepsindigestion erhaltene Fragmente, die kleine Unterschiede aufweisen, Fab' (univalentes Fragment) und F(ab')&sub2; (bivalentes Fragment) bezeichnet werden.
  • Um die Erfindung zu illustrieren, wurde das Glykosylierungsmuster von von Arthritispatienten isoliertem Gesamt-IgG im einzelnen geprüft. Dies wurde von den Erfindern in Oxford, Großbritannien, initiiert und dann in Gemeinschaftsstudien, die gleichzeitig in Oxford, Großbritannien, und Tokio, Japan, durchgeführt wurden, ausgeführt, in welchen die N-verknüpften Oligosaccharide von Gesamtserum-IgG von verschiedenen Individuen analysiert wurden. In beiden Studien wurden drei Gruppen von Individuen verglichen - normale Kontrollen, osteoarthritische und rheumatoide arthritische Individuen. Die Ergebnisse, die eine Untersuchung von mehr als 1200 primären Oligosaccharidsequenzen von 42 IgG-Proben erforderten, zeigen, daß der rheumatoide Arthritiskrankheitszustand mit einer ausgeprägten Änderung des Ausmaßes von Galaktosylierung der Oligosaccharidsequenzen, die für menschliches IgG charakteristisch sind, korreliert. Außerdem zeigt das Gesamtserum-IgG von Patienten mit Osteoarthritis die gleiche Art von Mangel bei einer Höhe intermediär zwischen dem normalen und dem rheumatoiden Zustand. Wichtig ist, daß in keiner Krankheit der Mangel zu neuen Oligosaccharidstrukturen führt, sondern eher zu einer Änderung der relativen Molverhältnisse der normal vorkommenden Strukturen.
    • Beispiel 1: Asparaginverknüpfte Oligosaccharide von IgG
  • Menschliches Serum-IgG ist ein Glykoprotein mit durchschnittlich 2,8 N-verknüpften Oligosacchariden pro Molekül; siehe Rademacher und Dwek, Prog.Immunology 5, 95-112 (1983). Diese sind nicht- regellos zwischen den beiden konservierten Glykosylierungsstellen im Fc (Asn 297) und den variablen Glykosylierungsstellen in der Fab-Region verteilt; siehe Sox und Hood, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 66, 975-982 (1970), und Spiegelberg et al., Biochemistry 9, 4217-4223 (1970). Die Paarung der Oligosaccharide im Zwischenraum zwischen den Cγ2-Bereichen involviert oft Oligosaccharide mit unterschiedlicher Primärsequenz; siehe Sutton und Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11, 130- 132 (1983). Demgemäß sind es einzelne Untergruppen von asymmetrischen IgG-Molekülen innerhalb der IgG-Population als ganzer. Die obigen Ausführungen werden durch Fig. 1(a) wie folgt illustriert:
    • Fig. 1(a)
  • Das Antikörpermolekül besteht aus zwei schweren (H) und zwei leichten (L) Ketten, die durch Disulfidbrücken (feste Linien) verknüpft sind, und ist in homologe Sequenzregionen (VH, CH1, CH2, CH3) unterteilt, wovon jede eine Disulfidbrücke innerhalb der Ketten aufweist. (Das hier gezeigte Muster der Disulfidbrücken innerhalb der Kette ist für menschliches Subklassen-IgG1 charakteristisch). In VH und VL stellen die strichlierten Segmente die hypervariablen Sequenzregionen dar, die in der dreidimensionalen Struktur miteinander die Antigenbindungsstelle bilden. Die konservierten asparaginverknüpften komplexen Biantennen-Oligosaccharidketten sind an Asn 297 in den CH2-Bereichen gebunden; siehe Sutton und Phillips, supra. Nicht-konservierte Oligosaccharidbindungsstellen sind in der Fab-Region zu finden. Ihre Häufigkeit und Anordnung hängt von der Anwesenheit von Asn-X-Ser-Stellen in den hypervariablen Regionen ab; siehe Sox und Hood, supra.
  • Die relativen Größen eines Immunoglobulinbereiches und eines voll ausgedehnten N-verknüpften komplexen Oligosaccharids sind sehr ähnlich, wie in Fig. 1(b) gezeigt; siehe auch Montreuil, Biochem.Soc.Trans. 11, 134-136 (1983). Die Stellung des konservierten Oligosaccharids am CH2-Bereich ist in Fig. 1(b) gezeigt; siehe auch Spiegelberg et al., Biochemistry 9, 4217-4223 (1970). Hinsichtlich Struktur- und Konformationsanalyse von von Immunoglobulin stammenden N-verknüpften Oligosacchariden siehe auch Rademacher et al., Biochem.Soc.Trans. 11, 132-134 (1983), und Rademacher und Dwek, Prog.Immunol. 5, 95-112 (1983).
  • Mindestens 30 verschiedene Biantennen-Oligosaccharide vom Komplextyp wurden aus menschlichem Serum-IgG isoliert. Sie sind durch Fig. 2 illustriert. Um die Molverhältnisse jeder dieser Strukturen zu vergleichen, wurde jede Gesamtserum IgG-Probe Hydrazinolyse gemäß dem Verfahren von Takasaki et al., Methods in Enzymology 83, 263-268, Academic Press, 1982, unterzogen, um die Oligosaccharidgruppen intakt freizusetzen. Dann erfolgte die Reduktion der reduzierenden terminalen N-Acetylglucosaminreste mit NaB³H&sub4;, um jede Kohlehydratkette radioaktiv zu markieren.
  • Jede markierte Oligosaccharidmischung wurde dann gründlicher Neuraminidasedigestion unterworfen, um die Verteilung der neutralen Strukturen zu analysieren. Diese "Asialo"-Oligosaccharidmischungen wurden dann Bio-Gel® P-4 (-400 Mesh) Gelpermeationschromatographie unterworfen, eine Technik, die neutrale Oligosaccharide nur auf Basis ihrer effektiven hydrodynamischen Volumina trennt, wie von Yamashita et al., Methods in Enzymology 83, 105-126, Academic Press, 1982, beschrieben. Bio-Gel P-4 ist ein im Handel erhältliches porös es Polyacrylamidkügelchenharz für Hochtrennungsgelfiltration, hergestellt durch Copolymerisation von Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid; siehe Hjertem und Mosbach, Anal.Biochem. 3, 109 (1962). Andere geeignete Gelpermeationschromatographiemedien zum Trennen von Oligosacchariden durch ihre Größen sind beispielsweise Agarosegele und Sephadex® (vernetzte Dextran)-Gele.
  • Das detaillierte Verfahren zum Durchführen der obigen Hydrazinolyse und Gelpermeationschromatographie war wie folgt: IgG vom Serum von jedem von 42 Individuen wurde durch Ausfällung bei 4ºC mit Ammoniumsulfat (33%) und DE-52 Ionenaustauschchromatographie (4ºC) in 0,01 M H&sub2;PO&sub4;, pH 7,2, isoliert. DE-52 ist eine im Handel erhältliche diäthylaminoäthylmodifizierte Ionenaustauschzellulose in mikrogranulärer Form. Jedes gereinigte IgG (5 mg) wurde gründlich gegen destilliertes Wasser (4ºC) dialysiert und über Aktivkohle bei -196ºC (< 10&supmin;&sup6; Torr) kryogenisch getrocknet. Proteinproben wurden in frisch destilliertem wasserfreien Hydrazin 8 h bei 100ºC unter einer wasserfreien Argonatmospshäre suspendiert. Das Hydrazin wurde durch wiederholte (5-mal) Schnellverdampfung aus wasserfreiem Toluol entfernt. Die Hydrazinolysate wurden durch Zusatz eines Überschusses von Essigsäure in gesättigtem NaHCO&sub3; bei 4ºC N-acetyliert. Nach Durchgang durch eine Säule von im Handel erhältlichem Dowex® Ag 50 · 12 (H&spplus;-Form)-Ionenaustauscherharz zum Entfernen von Na&spplus; wurden die Proben zur Trockene eingedampft (27ºC), in Wasser wieder gelöst und auf Whatman 3 MM-Chromatographepapier aufgebracht. Danach wurde absteigende Papierchromatographie (27ºC) unter Verwendung von n-Butanol: Äthanol:Wasser (4:1:1, V/V) (Lösungsmittel I) durchgeführt. Nach 48 h wurden die ersten 5 cm mit H&sub2;O eluiert. Die so isolierten Oligosaccharide wurden schnell zur Trockene eingedampft (27ºC) und mit einem 5-fachen Überschuß von NaB³H&sub4; (7,6 Ci mMol&supmin;¹, New England Nuclear) in 50 mM NaOH, pH 12,0, 4 h bei 30ºC reduziert. Dann wurde ein äquivalentes Volumen von 1M NaB¹H&sub4; in 50 mM NaOH, pH 12,0, zugesetzt und die Inkubation 2 h fortgesetzt. Dann wurde die Mischung mit 1 M Essigsäure angesäuert (pH 5 bis 6) und durch eine Dowex 50 · 12 (H&spplus;)-Säule geleitet, zur Trockene eingedampft (27ºC) und (5-mal) schnell aus Methanol eingedampft (27ºC). Danach wurden die Proben auf Whatman 3 MM- Papier aufgebracht und 2 Tage in Lösungsmittel I absteigender Papierchromatographie unterworfen. Radiochromatogrammabtastung wurde mit einer Berthold-Radiochromatogrammabtastvorrichtung LB280 durchgeführt. Die Radioaktivität am Ursprung wurde danach mit Wasser eluiert. Eine aliquote Menge von so isolierten reduzierten [³H]-Oligosacchariden wurde dann gründlicher Neuraminidasedigestion unterworfen (Arthobacter ureafaciens, Nakrai Chemical Co., Kyoto, Japan); radioaktiver Zucker (1 · 10&sup7; cpm) in 50 ul 0,1 M Natriumacetat pH 5,0, enthaltend 0,1 Enzymeinheit. Die Inkubation wurde 18 h bei 37ºC unter einer Toluolatmosphäre durchgeführt. Dann wurden die Proben Hochspannungs- Papierelektrophorese bei 80 V/cm in Pyridin/Essigsäure/Wasser 3:1:387 V/V, pH 5,4, unterworfen. Die gesamte Radioaktivität verblieb am Ursprung, was die vollständige Spaltung von Sialsäure bestätigte. Die Proben wurden vom Papier durch Elution mit Wasser wiedergewonnen, unter Verwendung einer Tandemsäule von Dowex AG 50 · 12 (H&spplus;) und AG 3 · 4A (OH&supmin;) in Wasser entsalzt, zur Trockene eingedampft, in 175 ul eines 20 mg ml&supmin;¹ partiellen Dextransäurehydrolysats wieder suspendiert und auf eine Bio-Gel P-4 (-400 Mesh) Gelpermeationschromatographiesäule (1,5 · 200 cm) aufgebracht. Die Säule wurde bei 55ºC gehalten und Wasser (bei 200 ul 1/min) wurde als Eluierungsmittel verwendet. Das Eluierungsmittel wurde unter Verwendung eines Berthold HPLC- Radioaktivitätsmonitors (Modell LB503) auf Radioaktivität und unter Verwendung eines Perkin Elmer Modell LC25-Refraktometers auf Brechungsindex beobachtet. Analoge Signale von den Monitoren wurden unter Verwendung von Nelson-analytischen ADC-Grenzflächen digitalisiert. Die Digitalwerte wurden gesammelt und unter Verwendung von Hewlett Packard 9836-Computern analysiert. Fig. 3 zeigt Radioaktivität (vertikale Achse) aufgetragen gegen Retentionszeit nach Entfernung von stochastischer Störgröße unter Anwendung von Fourier-Transformationstechniken. Die numerischen Überschriften oberhalb der Spur beziehen sich auf die Elutionsposition von Glukoseoligomeren in Glukoseeinheiten (g.u.), wie gleichzeitig durch den Brechungsindexmonitor nachgewiesen. Vo ist die leere Position. Probenelutionspositionen (in g.u.) wurden durch kubische Spline-Interpolation zwischen den internen Standardglukoseoligomerpositionen berechnet. Die Einschaltungen sind von trennungserhöhten Profilen, gezogen mit der unveränderten Retentionszeitachse und der um 0,5 reduzierten Radioaktivitätsachse. Trennungserhöhung wurde durch linienförmige Transformation im Fourier-Bereich erzielt.
  • Ein Vergleich der einzelnen erhaltenen Profile zeigt mehrere interessante Punkte.
  • Zunächst waren alle Asialo P-4-Chromatogramme von Kontrollindividuen (Fig. 3a) im wesentlichen identisch. D.h., obwohl jedes gegebene IgG-Molekül nur eine sehr kleine Zahl von verschiedenen Oligosaccharidstrukturen enthalten kann (d. h. 2 pro Fc und zusätzliche Fab-Zucker) ist die relative Gesamtmolverteilung jeder der ungefähr 30 Strukturen bei der Analyse von polyklonalem IgG bemerkenswert konstant. Diese große Zahl von Oligosaccharidsequenzen ist nicht das Ergebnis der Durchführung der Analyse an polyklonalem IgG, da diese gleiche "Gruppe" von Strukturen sowohl an menschlichen Myelomproteinen als auch an monoklonalen Mausantikörpern zu finden ist. Zweitens sind die Asialo P-4-Chromatogramme von Patienten mit rheumatoider Arthritis im wesentlichen von einem Patienten zum anderen gleich, unterschieden sich aber von Kontrollprofilen signifikant und diagnostisch (Fig. 3b). Drittens sind die Asialo-Oligosaccharid P-4-Chromatogramme von osteoarthritischen Patienten für alle solchen Patienten ebenfalls charakteristisch und unterscheiden sich sowohl von dem Kontroll- als auch den rheumatoiden Arthritisprofilen (Fig. 3c). Viertens, was am wichtigsten ist, können die Unterschiede zwischen den charakteristischen Kontroll- und arthritischen (osteoarthritischen und rheumatoiden) Asialo P-4- Profilen als eine Populationsverschiebung zu Oligosaccharidstrukturen mit geringerem hydrodynamischen Volumen hin rational erklärt werden. Um die Molekulargrundlage dieser Verschiebung festzustellen, wurden die Asialo-Oligosaccharide von jedem Patienten in bezug auf (1) ihre relativen Höhen von verschiedenen Kerneinheiten und (2) den Grad und die Natur ihrer Außenarm- Substitutionen analysiert.
    • Beispiel 2: Oligosaccharidkerne
  • Im allgemeinen können N-verknüpfte Olgosaccharide vom Komplextyp so klassifiziert werden, daß sie eine bis vier verschiedene Kernstrukturen aufweisen, die schematisch in Fig. 4 illustriert sind; siehe Mizuochi et al., J.Immunol. 129, 2016-2020 (1982). Für die Biantennen-Oligosaccharide von IgG können die relativen Verhältnisse dieser vier Kerne leicht durch Digerieren des Oligosaccharidpools mit einer Mischung von Streptococcus pneumoniae-&beta;-Galaktosidase und &beta;-N-Hexylhexosaminidase bestimmt werden, wie von Mizuochi et al., supra, beschrieben. Die resultierenden Digestionsprodukte sind für jeden der vier Kerne diagnostisch und unterscheiden sich im hydrodynamischen Volumen hinreichend, um auf einer P-4-Säule getrennt zu werden. Die in Fig. 4 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen klar, daß es keine systematische Korrelation zwischen Krankheitszustand und Inzidenz einer besonderen Art von Kernstruktur gibt.
  • Das detaillierte Verfahren zum Bestimmen des relativen Vorkommens der vier Kernstrukturen war wie folgt: Eine aliquote Menge (3 bis 5 · 10&sup5; cpm) der unfraktionierten Asialo-Oligosaccharide wurde mit einer Mischung von Strep.pneum. &beta;-Galaktosidase (2 Millieinheiten) und &beta;-N-Acetylhexosaminidase (4 Millieinheiten) in 25 ul 0,1 M Citratphosphat, pH 6,0, digeriert. Die Digestion wurde 18 h bei 37ºC unter einer Toluolatmosphäre durchgeführt und durch Erhitzen während 2 min auf 100ºC beendet. Nach Entsalzen [mit Dowex Ag 50 · 12 (H&spplus;), Ag3,4A (OH&supmin;) wurden die Digestionsprodukte auf einer Bio-Gel P-4 (-400 Mesh)-Säule getrennt. Enzyme wurden durch eine Modifizierung des Verfahrens von Glasgow et al., J.Biol.Chem. 252, 8615-8623 (1977), gereinigt. Strep.pneum. &beta;-Galaktosidase entfernt alle Galaktosereste aus den Asialo-Oligosacchariden von IgG, unabhängig von ihren Kernstrukturen. Strep.pneum. &beta;-N-Acetylhexosaminidase digeriert die resultierenden Oligosaccharide auf eine von der Anwesenheit des (halbierenden) GlcNAxc &beta;1&rarr;4 Restes abhängige Weise. Insbesondere wird nur ein N-Acetylglucosaminrest (GlcNAc 5 in Fig. 2) von der Agalaktosylstruktur GlcNAc &beta;1&rarr;2 Man &alpha;1&rarr;6 (GlcNAc &beta;&rarr;2 Man &alpha;1&rarr;3) (GlcNAc &beta;1&rarr;4) Man &beta;1&rarr;4 GlcNAc (&beta;1&rarr;4) (± Fuc &alpha;1&rarr;6) GlcNac freigesetzt, die in GlcNAc &beta;1&rarr;2 Man &alpha;1&rarr;6 (Man &alpha;1&rarr;3) (GlcNAc &beta;1&rarr;4) Man &beta;1&rarr;4 GlcNAc &beta;1&rarr;4) (± Fuc &alpha;1&rarr;6) GlcNAc übergeführt wird. Es werden aber zwei N-Acetylglucosaminreste aus GlcNAc &beta;1&rarr;2 Man &alpha;1&rarr;6 (GlcNAc &beta;1&rarr;2 Man &alpha;1&rarr;3) Man &beta;1&rarr;4 GlcNAc &beta;1&rarr;4 (± Fuc &alpha;1&rarr;6) GlcNAc freigesetzt, die in Man &alpha;1&rarr;6 (Man &alpha;1&rarr;3) Man &beta;1&rarr;4 GlcNAc &beta;1&rarr;4 (± Fuc &alpha; 1&rarr;6) GlcNAc übergeführt wird. Die vier Kerne haben die folgenden Strukturen:
  • A Man&alpha;1&rarr;6 (Man&alpha;1&rarr;3) (GlcNAc&beta;1&rarr;4) Man&beta;1&rarr;4GlcNac&beta;1&rarr; 4GlcNAc(+B-F)
  • B Man&alpha;1&rarr;6(Man&alpha;1&rarr;3) Man&beta;1&rarr;4GlcNAc&beta;1&rarr;4GlcNAc(-B-F);
  • C Man&alpha;1&rarr;6(Man&alpha;1&rarr;3)(GlcNAc&beta;1&rarr;4) Man&beta;1&rarr;4GlcNAc&beta;1&rarr; 4(Fuc&alpha;1&rarr;6)GlcNAc(+B+F);
  • D Man&alpha;1&rarr;6(Man&alpha;1&rarr;3) Man&beta;1&rarr;4GlcNac&beta;1&rarr;4(Fuc&alpha;1&rarr;6) GlcNAc(-B+F).
  • Der Prozentsatz jedes Kerns, wie in der Oxford-Reihe bestimmt, war: (+B-F)-Kontrolle (5,1±3,3), OA (3,5±1,0), RA (4,1±1,4); (-B-F)-Kontrolle (19,1±6,7), OA (13,5±5,1), RA (16,9±5,9); (+B+F)-Kontrolle (10,7±6,0), OA (13,0±6,5), RA (10,2±3,1); (-B+F)-Kontrolle (65,1±1 3), OA (69,7±8,0), RA (70,5±5,8). Die in der Tokio-Reihe bestimmten Werte waren: (+B-F)-Kontrolle (3,1±0,7), OA (3,7±0,8), RA (4,6±1,4); (-B-F)- Kontrolle (9,9±3,0), OA (9,7±2,4), RA (8,8±2,1); (+B+ F)-Kontrolle (15,4±0,9), OA (16,6±4,0), RA (20,9±5,7); (-B+F)- Kontrolle (71,7±2,8), OA (70,1±5,1), RA (65,7±6,7). Es gibt keine statistische Signifikanz (p> 0,O5) zur unterschiedlichen Inzidenz jedes Kerns in den drei Gruppen.
  • Im obigen ist B = halbierendes GlcNAc; F = Fucose.
    • Beispiel 3: Außenarm-Substitutionen
  • Die Außenarmstrukturen können in bezug auf die Inzidenz, die Verknüpfung und die Anordnung von Galaktose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure charakterisiert werden. Die Asialo- Oligosaccharidmischungen wurden daher zuerst Ricinus communis- Agaroseaffinitätschromatographie unterworfen, um galaktosylierte und nicht-galaktolysierte Strukturen zu trennen. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt, daß im Kontroll-IgG weniger als 75% aller Oligosaccharidketten mindestens einen Galaktoserest enthalten.
  • Ein von rheumatoiden und osteoarthritischen Patienten isoliertes IgG enthielt nur 50% (p = 0,001) bzw. 66% (p = 0,002) der in Galaktose enthaltenen Ketten.
  • Um diesen Galaktosemangel weiter zu untersuchen, wurde das Verhältnis von Digalaktosyl- zu Monogalaktosylstrukturen in jedem einzelnen Fall entweder durch Chromatographie der galaktosylierten Oligosaccharidketten auf Ricinus communis-Agarose oder enzymatisch bestimmt. Im letzteren Fall führte Digestion mit &beta;- N-Acetylhexosaminidase von Jackbaumfrüchten, gefolgt von P-4- Gelpermeationschromatographie zur Trennung von Fragmenten, die für die digalaktosylierten und monoglykosylierten Strukturen diagnostisch sind. Die durch die beiden Methoden erhaltenen Verhältnisse der Digalaktosyl- zu Monogalaktosylstrukturen stimmten überein und zeigten eine Abnahme von 28% (p< 0,02) bzw. 14% (p< 0,15) in den rheumatoiden und osteoarthritischen Asialo- Oligosaccharidmischungen.
  • Um festzustellen, ob die verminderte Zahl von galaktosehaltigen Ketten die Folge einer Abnahme an Außenarm &beta;(1-2)verknüpften N-Acetylglucosaminresten war, wurden die nichtgalaktosylierten Strukturen von jedem Individuum P-4-Chromatographie unterworfen. In allen drei Gruppen wurden ähnliche Profile gefunden, was keinen Mangel an Außenarm &beta;(1-2)-verknüpften N-Acetylglucosaminresten (GlcNAc 5 und 5') impliziert. Dies wurde danach enzymatisch bestätigt. Es kann daher keine Unterschiede zwischen Individuen, unabhängig von ihrem Krankheitszustand, in bezug auf das Ausmaß von N-Acetylglucosaminylierung geben.
  • Da die negativ geladenen N-Acetylneuraminsäurereste in einem elektrischen Feld Mobilität verleihen, wurde eine aliquote Menge des markierten Oligosaccharidpools (vor Neuraminidasedigestion) Hochspannungs-Papierelektrophorese unterworfen. Die Oligosaccharide wurden vollständig in neutrale, monosialylierte und disialylierte Strukturen getrennt (Fig. 5). Das Vorkommen derselben ist in nachstehender Tabelle 2 angegeben und die in den drei Gruppen vorhandenen Strukturen sind in Fig. 2 im einzelnen gezeigt.
  • Das detaillierte Verfahren zum Erhalten der Radioelektrophoretogramme der vom IgG verschiedener Individuen freigesetzten Oligosaccharide, wie in Fig. 5 illustriert, war wie folgt: Eine aliquote Menge (5 · 10&sup6; cpm) [³H]-Oligosaccharide wurde Hochspannungs-Papierelektrophorese (80 V/cm) in Pyridin: Essigsäure:Wasser (3:1:387 V/V), pH 5,4 (Camag HVE-Zelle 61000) unterworfen. Nach Abtasten mit einer Berthold LB28O Radiochromatogramm-Abtastvorrichtung wurden die Regionen N (neutral), A-1 (monosialyliert) und A-2 (disialyliert) eluiert und in jeder die dpm bestimmt, was die Berechnung der Verhältnisse in jeder Probe ermöglicht. Analoge Signale von der Abtastvorrichtung wurden unter Verwendung einer Nelson analytischen ADC-Grenzfläche digitalisiert und die Digitalwerte gesammelt und unter Verwendung eines Mikrocomputers analysiert. Lactose (L); (2-3)&rarr;Sialyllactose (SL); Bromphenolblau (BPB).
  • Innerhalb jeder Untersuchung korrelieren unerwarteterweise die beiden Krankheitszustände mit einer identischen Abnahme der Zahl von Ketten, die mit einem oder zwei N-Acetylneuraminsäureresten enden, trotz der nicht-identischen Änderungen im Galaktosylierungsausmaß. Das Ausmaß dieser Abnahme ist jedoch zwischen den beiden Untersuchungen unterschiedlich [36% Abnahme in Oxford (p=0,001, OA und RA) und 12% Abnahme in Tokio (p=0,002, OA, p=0,3, RA)]. Tabelle I % Oligosaccharidketten ohne Galaktose in Serum-IgG* Einzelne Patienten Kontrolle Osteoarthritis Rheumatoide Arthritis Oxford-Reihe Tokio-Reihe arithmetisches Mittel gepooltes Kontrollserum
  • * Blutproben in der Oxford-Reihe wurden von Patienten des St. John's Highfield Hospital, Droitwich, Großbritannien, und dem Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham, Großbritannien, erhalten. Die Patienten Oxf13 bis Oxf18 und Tok12 bis Tok23 entsprachen den Kriterien der American Rheumatism Association auf eindeutige oder klassische rheumatoide Arthritis. Die Oxford- Patienten waren im Alter von 50 bis 75 Jahren (durchschnittl.-RA 64 ± SD, OA 68 ± 9 SD). Die Analyse wurde mit einem Doppelblindversuch durchgeführt, wobei die klinische Geschichte nach Beendigung der Oligosaccharidanalyse erhalten wurde. In der Oxford-Reihe waren die Patienten Oxf7, 13 und 14 Rose-Waaler- Titer-positiv. Der Rose-Waaler-Test ist ein spezialisierter Antiglobulintest unter Verwendung von Schaferythrozyten, die mit einer Subagglutinationsdosis von Kaninchen-anti-Schaf-Erythrozyten-IgG sensibilisiert sind. Rheumatoider Faktor kombiniert sich mit membrangebundenem IgG unter Bildung von Agglutinatin; siehe Rose et al., Proc.Soc.Exper.Biol. & Med. 68, 1 (1948). Patienten Oxf7 und Oxf8 hatten seit langer Zeit Osteoathritis und zeigten erst sehr kurz Anzeichen einer Entzündungskomponente (6 Monate bzw. 9 Monate). Bern-1 bezieht sich auf IgG vom gepooltem Serum von mehreren tausend Individuen und war ein freundliches Geschenk von Dr. U. Nydegger des Bluttransfusionszentrums vom Schweizer Roten Kreuz, Bern, Schweiz. Nichtgalaktosylierte Oligosaccharide wurden wie folgt isoliert. Asialo-Oligosaccharide (1 · 10&sup7; cpm) vom IgG jedes Individuums wurden auf eine Ricin CA-120-Agarosesäule (Miles-Yeda Ltd., Israel, Chargen-Nr. AR26) mit den Abmessungen 6 mm · 20 cm aufgebracht. Die Säule wurde in 5 mM Natriumacetat entwickelt (pH 5,6). Nicht-galaktosylierte Strukturen eluierten im Leerraum, während digalaktosylierte und monogalaktosylierte Strukturen später und bei einmaligen Volumina eluierten. Die Zahl von Galaktosen in jedem Peak wurde entweder durch Wiederdurchleiten des Peaks auf der gleichen Ricin communis-Agarosesäule oder durch Verfolgen der Änderung des hydrodynamischen Volumens nach Digerieren mit &beta;-N-Acetylhexosaminidase von Jackbaumfrucht (14 uM Substrat, 150 Einheiten ml&supmin;¹ Enzym in 0,1 M Citratphosphat, pH 4,5) bestätigt. Das hydrodynamische Volumen von digalaktosylierten Strukturen ändert sich nicht, jenes von monogalaktosylierten nimmt um 2 g.u. und jenes von Strukturen ohne Galaktose um &ge; 4 g.u. ab. Für die Oxford-Reihe waren die Unterschiede im arithmetischen Mittel signifikant mit p=0,002 (C gegenüber OA) und p=0,001 (C gegen RA) und p=0,002 (OA gegenüber RA). Für die Tokio-Reihe war die Signifikanz p=0,05 (C gegenüber OA), p=0,0007 (C gegenüber RA) und p< 0,0008 (OA gegenüber RA). Jeglicher Unterschied im arithmetischen Mittel zwischen den beiden Reihen wurde nicht als statistisch signifikant angesehen. Die Verhältnisse von digalaktosylierten zu monogalaktosylierten Strukturen, erhalten wie oben beschrieben, waren wie folgt: C - 0,87 ± 0,10; OA - 0 75 ± 0,14; RA -0,63 ± 0,12. Die statistische Signifikanz derselben ist C gegenüber OA (p = 0,15), C gegenüber RA (p< 0,02), OA gegenüber RA (p = 0,1). Statistische Analyse wurde unter Verwendung eines nicht-parametrischen kombinierten statistischen Tests kombinierter Ordnung durchgeführt (Wilcoxon-Mann - Whitney-Test, wie von Lloyd "Handbook of Application Mathematics", 6 Statistics, Teil B, John Wiley and Sons, 1984, beschrieben). Wahrscheinlichkeiten sind für einen zweiteiligen Test mit Null-Hypothese H&sub0; : u&sub1; : u&sub2; getestet gegen eine Alternativhypothese H&sub2; = u&sub1; = u&sub2; berechnet. Tabelle 2 % Oligosaccharidketten mit endständiger &alpha;(2-6)-verknüpfter N-Acetylneuraminsäure* Neutral Monosialyliert Disialyliert Oxford-Reihe Kontrollen Osteoarthritis Rheumatoide Arthritis Tokio-Reihe
  • * Siehe obige Beschreibung von Fig. 5. Um zu bestätigen, daß alle in Position A-1 und A-2 von Fig. 5 vorhandenen Strukturen nur einen bzw. zwei Sialsäurereste enthalten, wurde eine aliquote Menge der eluierten A-1- und A-2-Oligosaccharidfraktionen auf eine QAE-A25 Sephadex®-Säule (6 mm · 10 cm) aufgebracht. Proben wurden in 2 mM Ammoniumacetat (pH 5,3) verwendet und die Säule mit einem 2 mM bis 350 mM linearen Ammoniumacetatgradienten entwickelt. Sowohl die A-1- als auch die A-2-Fraktionen von der Papierelektrophorese ergaben einzelne Elutionspeaks entsprechend den Standardelutionspositionen von monsialylierten bzw. disialylierten Oligosacchariden. QAE-A25 Sephadex ist ein vernetztes Dextranionenautauscherharz mit der funktionellen Gruppe Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-amioäthyl.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Osteoarthritis und insbesondere rheumatoide Arthritis mit bemerkenswerten Änderungen im Ausmaß von Außenarm-Galaktosylierung der komplexen N-verknüpften Oligosaccharide von Gesamtserum-IgG verbunden sind. Es wurde gefunden, daß der absolute Galaktosylierungsgrad krankheitsspezifisch ist. Die festgestellten Änderungen in der Galaktosylierung korrelieren stark mit beiden Krankheitszuständen (p=0,002 OA gegenüber C, p=0,001 RA gegenüber C) und zwischen Krankheitszuständen (p=0,002 OA gegenüber RA). Wichtigerweise wurde gefunden, daß keine neuen Primäroligosaccharidsequenzen mit IgG von jeder Arthritis assoziiert sind. Signifikanter als der Verlust von Galaktose (-33% in rheumatoider Arthritis) ist die erhöhte Exposition am nicht-reduzierenden Terminus von N-Acetylglucosamin (-100%). Wenn die Erscheinung von Oligosaccharidpaarung in Fc und die Restriktionen hievon feststehen, zeigen einfache Berechnungen, daß es eine konsequente und bemerkenswerte Zunahme der Inzidenz von Fc-Molekülen gibt, denen Galaktose zur Gänze fehlt (-300% in rheumatoider Arthritis und -60% in Osteoarthritis). So führt die hierarchische Gruppe von Änderungen, beginnend mit einem geänderten Galaktosylierungsausmaß und Fortfahren über eine Änderung in den relativen Populationen einer konstanten Gruppe von Oligosaccharidstrukturen über die Paarungserscheinung zu dramatischen Änderungen in der Inzidenz von einzelnen Fc-Subpopulationen.

Claims (1)

1. Verfahren zum Diagnostizieren von rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis als einziges Syndrom oder als Komponente von anderen rheumatischen Erkrankungen, das das Bestimmen des Mangels von Außenarm-Galaktosylierung einer IgG-Komponente oder eines Fragments hievon im Patientenblutserum oder -plasma oder der Gelenkschmiere durch Prüfen auf Inzidenz von nicht- reduzierenden terminalen Außenarm-N-Acetylglucosaminresten der IgG- Komponente oder des Fragments und Vergleichen mit entsprechenden Kontrollnormalwerten umfaßt.
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