DE3636735C2 - Biochemically active matrix and process for its production - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine biochemisch aktive Matrix, die wenigstens ein biochemisch aktives Enzym enthält, das kovalent an die Oberfläche einer Trägermatrix ge bunden ist, die von einem quervernetzten Protein gebil det wird und auf einem eine mikroporöse Membran bil denden Träger adsorbiert ist, ein Verfahren zur Her stellung einer solchen Matrix sowie die Verwendung für die extrakorporale Enzymbehandlung.The invention relates to a biochemically active matrix, which contains at least one biochemically active enzyme, that ge covalently to the surface of a support matrix is bound, which is formed by a cross-linked protein det and on a microporous membrane bil the carrier is adsorbed, a process for producing provision of such a matrix and the use for extracorporeal enzyme treatment.
Eine derartige biochemisch aktive Matrix ist aus der US-PS 4,438,183 bekannt. Bei dieser bekannten Matrix ist das die Trägermatrix bildende Protein Fibrin, welche s durch Reaktion von Fibrinogen mit Thrombin ein weiches Gel bildet. Als Trägermaterial werden Glas oder Stahl oder Kunststoffe, wie Polyolefine vor geschlagen. Sie können als Platten, Kugeln oder Röhren oder als permeable oder semipermeable Membranen einge setzt werden.Such a biochemically active matrix is from the U.S. Patent 4,438,183 known. With this well-known matrix is the protein fibrin that forms the carrier matrix, which s by reaction of fibrinogen with thrombin forms a soft gel. As a carrier material Glass or steel or plastics, such as polyolefins beaten. They can be used as plates, balls or tubes or inserted as permeable or semipermeable membranes be set.
Patienten, die an einem Ungleichgewicht eines durch En zyme abbaubaren Blutinhaltstoffes leiden, werden da durch behandelt, daß ihr Blut einer extrakorporalen En zymbehandlung unterzogen wird. Solche Enzymbehandlungen lassen sich wirksamer durchführen, wenn sie nicht am Vollblut, sondern am Blutserum erfolgen. Dazu ist es er forderlich, zunächst in einer vorgeschalteten Plasma phereseeinheit die zellulären Bestandteile vom Serum zu trennen. Nach der Enzymbehandlung werden die Blut bestandteile wieder zusammengeführt.Patients suffering from an imbalance caused by En zyme degradable blood ingredient suffer there treated by that their blood is an extracorporeal En undergoes symbology. Such enzyme treatments can be carried out more effectively if they are not on Whole blood, but done on blood serum. That's what he is for required, first in an upstream plasma pheresis unit the cellular components of the serum to separate. After the enzyme treatment, the blood components merged again.
Für die Imnobilisierung gibt es eine Reihe unterschied licher Verfahren, wobei die Biokompatibilität der Enzym trägermatrix eine wichtige Rolle spielt. Neben der Ver wendung der Asparaginase, die hier ausführlich beschrieben wird, ist die verwendete Methode auch für die Immobilisierung weiterer Enzyme geeignet, wie z. B. die Bilirubin-Oxidase zur Erniedrigung der Bilirubinkonzentration im Serum bei Lebererkrankungen, Heparinase zur Entfernung von Heparin aus Blut bzw. Serum, Carboxypeptidase G 1 zum Abbau von Methotrexat, das bei Tumorbehandlungen eingesetzt wird sowie der Phenylammonia-Lyase zum Abbau von Phenylalanin. Vorteile der Verwendung von immobilisierten Enzymen sind vor allem geringe oder fehlende immunologische Reaktionen bei längerer Anwendung oder Wiederverwendung dieser Reaktoren. (Vgl. Klein, M.D. und Lange, R., TIBTECH, July 1986, S. 179-186, Elsevier Sc. Publ., Amsterdam). There are a number of differences for immobilization Licher method, the biocompatibility of the enzyme carrier matrix plays an important role. In addition to the ver application of asparaginase, described in detail here the method used is also for immobilization other enzymes suitable such. B. the bilirubin oxidase to lower the serum bilirubin concentration Liver disease, heparinase to remove heparin from blood or serum, carboxypeptidase G 1 to break down Methotrexate, which is used in tumor treatments and the phenylammonia lyase to break down phenylalanine. Benefits of using immobilized enzymes are especially little or no immunological reactions with prolonged use or reuse Reactors. (See Klein, M.D. and Lange, R., TIBTECH, July 1986, pp. 179-186, Elsevier Sc. Publ., Amsterdam).
Enzyme können bei einer extrakorporalen Blutbehandlung eingesetzt werden. Die Behandlungsart entspricht dabei in etwa der Plasmapherese oder dem Verfahren bei der Nierendialyse.Enzymes can be used in extracorporeal blood treatment be used. The type of treatment corresponds approximately to that Plasmapheresis or the procedure in kidney dialysis.
Durch die in der US-PS 4,438,183 beschriebenen Belegung einer mikroporösen Membran mit Fibrin zum Zweck der Schaffung einer Trägermatrix für das aktive Enzym wird der Transmembranfluß auf weniger als 10% des Trans membranflusses der mikroporösen Membran erniedrigt, weil die Poren von der Trägermatrix verschlossen werden. Da durch ist eine solche biochemisch aktive Matrix nur an ihrer überströmten Oberfläche wirksam.By the assignment described in US Pat. No. 4,438,183 a microporous membrane with fibrin for the purpose of Creation of a carrier matrix for the active enzyme the transmembrane flow is reduced to less than 10% of the trans membrane flow of the microporous membrane decreased because the pores are closed by the carrier matrix. There such a biochemically active matrix is only on their flooded surface effective.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die Wirk samkeit einer biochemischen Matrix zu verbessern und in einfacher Weise Enzymbehandlungen am Serum des Blu tes auszuführen, ohne zuvor die zellulären Bestandtei le des Blutes abtrennen zu müssen.The object of the present invention was to have the effect improve the biochemical matrix and enzyme treatments on the serum of the Blu tes without performing the cellular component to have to separate le of the blood.
Gelöst wird diese Aufgabe mit einer gattungsgemäßen bio chemisch aktiven Matrix, die sich dadurch auszeichnet, daß die Trägermatrix die Oberfläche der offenen Poren durchgänge belegt und von Albumin gebildet worden ist.This task is solved with a generic bio chemically active matrix, which is characterized by that the support matrix covers the surface of the open pores passages and was formed by albumin.
Bei dieser erfindungsgemäßen biochemisch aktiven Matrix sind die Poren nicht verschlossen, so daß die für die Bildung der Matrix eingesetzte mikroporöse Membran auch noch nach der Belegung mit der Trägermatrix und der Bindung des Enzyms zur Filtration von Eiweißstoffen geeignet bleibt. In this biochemically active matrix according to the invention the pores are not closed, so that for the Formation of the matrix used microporous membrane even after the carrier matrix and the binding of the enzyme for the filtration of protein substances remains suitable.
Vorzugsweise wird als mikroporöse Membran eine solche eingesetzt, deren mittlerer Porendurchmesser 0,05 bis 5 µm beträgt. Der Porenbereich wird so ausgewählt, daß die Blutinhaltsstoffe, die enzymatisch verändert oder abgebaut werden sollen, mit dem Filtrat durch die Membran poren permeieren.Such a microporous membrane is preferred used, whose average pore diameter 0.05 to Is 5 µm. The pore area is selected so that the blood ingredients that are enzymatically altered or to be broken down with the filtrate through the membrane permeate pores.
Vorzugsweise beträgt die Molekulargewichtsausschlußgren ze 100 000 bis 3 Millionen.The molecular weight exclusion limit is preferably ze 100,000 to 3 million.
Günstige Transmembranflußwerte können vor allem dann er zielt werden, wenn das mittlere spezifische Porenvolumen 0,5 bis 0,9 cm³/g beträgt. Vorzugsweise beträgt der Trans membranfluß durch die biochemisch aktive Matrix wenig stens 80% des Transmembranflusses der mikroporösen Mem bran.Above all, favorable transmembrane flow values can then targets if the mean specific pore volume 0.5 to 0.9 cm³ / g. The trans is preferably membrane flow through the biochemically active matrix little at least 80% of the transmembrane flow of the microporous membrane bran.
Der mittlere Porendurchmesser wird mittels der Methode nach Marshall, J.C. und Meltzer, T.H., veröffentlicht in Bull. Parenteral Drug Assoc., 30, 214 (1976) bestimmt.The mean pore diameter is determined using the method after Marshall, J.C. and Meltzer, T.H. in Bull. Parenteral Drug Assoc., 30, 214 (1976).
Das spezifische Porenvolumen der mikroporösen Membran wird mittels der Quecksilber-Intrusionsmethode nach Horold, E. und Skan, E.L., Science 120 (3124), 805 (1954) bestimmt.The specific pore volume of the microporous membrane is determined using the mercury intrusion method Horold, E. and Skan, E.L., Science 120 (3124), 805 (1954) certainly.
Die Molekulargewichtsausschlußgrenze (Cutoff) wird nach Baker, R.W. und Strathmann, H., wie sie in Journal of Applied Polymer Science Vol. 14, 1197 (1970) beschrieben ist, ermittelt.The molecular weight cutoff is reduced to Baker, R.W. and Strathmann, H., as described in the Journal of Applied Polymer Science Vol. 14, 1197 (1970) is determined.
Die Messung des Transmembranflusses erfolgt an einem Modul mit ca. 125 cm² Austauschfläche mit Isopropanol nach der ASTM-Vorschrift F 317-72. The transmembrane flow is measured on a module with approx. 125 cm² exchange area with isopropanol after the ASTM regulation F 317-72.
Zur Quervernetzung von Proteinen eignen sich beispiels weise Cyanurchlorid, cyclische Anhydride mit 4 bis 9 Koh lenstoffatomen wie Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäure anhydrid oder Adipinsäureanhydrid oder aktive Dicarbonsäu reester wie Bis-Salizylsuccinate, Bis(3,5-Dibromsalizyl)- Fumarat oder Bis(N-Hydroxy-Succinimido)-Adipat.For cross-linking of proteins, for example, are suitable as cyanuric chloride, cyclic anhydrides with 4 to 9 Koh Oil atoms such as succinic anhydride, maleic acid anhydride or adipic anhydride or active dicarboxylic acid esters such as bis-salicylic succinates, bis (3,5-dibromosalicyl) - Fumarate or bis (N-hydroxy-succinimido) adipate.
Vorzugsweise werden jedoch erfindungsgemäß zur Querver netzung Dialdehyde, wie z. B. Terephthaldialdehyd ein gesetzt. Die besten Ergebnisse werden hinsichtlich der Enzymaktivität erzielt, wenn Glutardialdehyd für die Quervernetzung des Proteins eingesetzt wird.Preferably, however, according to the invention for the cross ver Network dialdehydes, such as. B. terephthalaldehyde set. The best results are in terms of Enzyme activity achieved when glutardialdehyde for the Cross-linking of the protein is used.
Erfindungsgemäß wird die biochemisch aktive Matrix her gestellt mit einem Verfahren, daß sich dadurch auszeich net, daß durch eine hydrophile und/oder hydrophilierte mikroporöse Membran nacheinander folgende Flüssigkeiten, gegebenenfalls im Kreislauf, hindurchgeleitet werden: Eine Lösung von 0,05 bis 1 Gew.-% Albumin in einem Puf fergemisch bei einem konstanten pH-Wert, Wasser, eine Lösung, die ein Vernetzungsmittel für Albumin enthält, eine Lösung des Enzyms in einem Puffergemisch bei einem konstanten pH-Wert und wiederum Wasser. According to the invention, the biochemically active matrix is produced using a method which is characterized in that the following liquids, if appropriate in a circuit, are passed through a hydrophilic and / or hydrophilized microporous membrane: a solution of 0.05 to 1% by weight % albumin in a Puf fergemisch at a constant pH value, water, a solution containing a crosslinking agent for albumin, a solution of the enzyme in a buffer mixture at a constant pH value, and water again.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wer den die Lösung des Enzyms (d) und das Wasser (e) jeweils von der entgegengesetzten Seite der mikroporösen Membran hindurchgeleitet. Die Lösung (c), die ein Vernetzungsmit tel für das Albumin enthält, ist vorzugsweise eine 1- bis 20%ige Dialdehyd-Lösung in einem Puffergemisch bei einem konstanten pH-Wert. Zweckmäßig liegt dieser pH-Wert bei 4,0. Ein bevorzugter Dialdehyd als Vernetzungsmittel für das Albumin ist Glutardialdehyd.In a preferred embodiment of the invention, the solution of the enzyme (d) and the water (e) are each passed through from the opposite side of the microporous membrane. The solution (c) containing a Vernetzungsmit tel for albumin, is preferably a 1 to 20% dialdehyde solution in a buffer mixture at a constant pH value. This p H value is expediently 4.0. A preferred dialdehyde as a crosslinking agent for the albumin is glutardialdehyde.
Die mikroporöse Membran wird vorzugsweise in Form eines Kapillarbündels eingesetzt, obwohl auch Module mit Flachmembranen geeignet erscheinen. Die Membranfläche der mikroporösen Membran beträgt von 0,01 bis 2,0 m² Die Ausschlußgrenze der bevorzugten mikroporösen Mem bran soll 100 000 bis 3 000 000 betragen.The microporous membrane is preferably in the form of a Capillary bundle used, although modules with Flat membranes appear suitable. The membrane surface the microporous membrane is from 0.01 to 2.0 m² The exclusion limit of the preferred microporous mem bran is said to be 100,000 to 3,000,000.
Die erfindungsgemäße biochemisch aktive Matrix wird vor zugsweise für die extrakorporale Enzymbehandlung von Blut eingesetzt und hat sich hier hervorragend bewährt, weil die Aktivität der Enzyme dadurch besonders wirk sam zur Geltung gebracht werden kann, daß die Matrix für die nichtzellulären Bestandteile des Blutes oder wesentliche Bestandteile des Blutes durchlässig ist. The biochemically active matrix according to the invention is proposed preferably for the extracorporeal enzyme treatment of Blood and has proven to be excellent here, because the activity of the enzymes is particularly effective sam can be brought to bear that the matrix for the non-cellular components of the blood or essential components of the blood are permeable.
An Hand von Beispielen wird die Erfindung näher er läutert.The invention is illustrated by examples purifies.
Als Träger dient ein Modul mit 100 mikroporösen Poly propylenfäden (Plasmaphan® Type PIL) mit einer Ober fläche von 125 cm². Die hydrophobe Polypropylenmembran wird mit Isopropylalkohol behandelt und der Isopropyl alkohol anschließend mit destilliertem Wasser ausge waschen.A module with 100 microporous poly serves as the carrier propylene threads (Plasmaphan® Type PIL) with a top area of 125 cm². The hydrophobic polypropylene membrane is treated with isopropyl alcohol and the isopropyl then alcohol out with distilled water to wash.
In 100 ml 50 mM Citratpuffer pH 4,0 wurden 115 mg Albumin gelöst und durch die Polypropylenhohlfäden von innen nach außen filtriert wobei diese Filtration 10 Minuten im Kreislauf fortgesetzt wurde. Nach einer Spülung mit 200 ml destilliertem Wasser wird das adsorbierte Albumin mit einer 10%igen Glutardialdehydlösung in 50 mM Citrat puffer pH 4,0 30 minutenlang behandelt.115 mg of albumin were dissolved in 100 ml of 50 mM citrate buffer pH 4.0 loosened and through the polypropylene hollow threads from the inside filtered outwards, this filtration being 10 minutes was continued in the cycle. After a rinse with The adsorbed albumin becomes 200 ml of distilled water with a 10% glutardialdehyde solution in 50 mM citrate buffer pH 4.0 treated for 30 minutes.
Als biochemisch aktives Enzym wurde L-Asparaginase (E. coli) (83 U/mg) verwendet. Dazu wurden 106 mg (8800 IU) mit 50 ml 50 mM Citratpuffer pH 4,0 gelöst und 16 Stunden bei 21°c im Kreislauf von innen nach außen durch den Modul filtriert. Anschließend wird mit 2 l destilliertem Was ser gespült. Es wurden 75 mg Albumin an die Polypropylen membran adsorbiert und darauf 2024 IU L-Asparaginase immobilisiert. Die Aktivität der immobilisierten L-Asparaginase betrug 622 IU, das entspricht 31% des immobilisierten Enzyms. L-asparaginase (E. coli) was used as a biochemically active enzyme. (83 U / mg) used. 106 mg (8800 IU) were added 50 ml of 50 mM citrate buffer pH 4.0 dissolved and 16 hours at 21 ° c in the circuit from the inside out through the module filtered. Then with 2 l of distilled water rinsed. There were 75 mg of albumin on the polypropylene adsorbed membrane and then 2024 IU L-asparaginase immobilized. The activity of the immobilized L-Asparaginase was 622 IU, which corresponds to 31% of the immobilized enzyme.
Der Transmembranfluß des Ausgangsträgermaterials betrug 7,80 ± 0,50 ml/min·bar·cm² gemessen mit Isopropanol. Nach der Belegung des Trägers mit Albumin betrug der Transmembranfluß 7,05 ± 0,45 ml/min·bar·cm² gemessen mit Isopropanol. Die erfindungsgemäße biochemisch aktive Matrix wies bei einer entsprechenden Messung mit Iso propanol einen Transmembranfluß von 7,10 ± 0,45 ml/min·bar·cm² auf.The transmembrane flow of the starting support material was 7.80 ± 0.50 ml / min · bar · cm² measured with isopropanol. After the support was coated with albumin, the Transmembrane flow 7.05 ± 0.45 ml / min · bar · cm² measured with Isopropanol. The biochemically active according to the invention Matrix showed a corresponding measurement with Iso propanol has a transmembrane flow of 7.10 ± 0.45 ml / min · bar · cm² on.
Es wurde ein entsprechender Modul wie im Beispiel 1 vor behandelt und dann anstelle der Albuminlösung mit einer Lösung von 150 mg Fibrinogen in 50 ml Phosphatpuffer bei pH 7,35 10 Minuten im Kreislauf durch den Modul von in nen nach außen filtriert. Anschließend wurde mit 100 ml destilliertem Wasser nachgewaschen. Das adsorbierte Fibrinogen wurde mit 10%iger Glutardialdehydlösung in Phosphatpuffer pH 7,35 30 minutenlang behandelt. Danach wurde wieder mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Entsprechend dem Beispiel 1 wurde eine Lösung von L-Asparaginase im Kreislauf von innen nach außen durch den Modul filtriert. Danach mit 2 l destilliertem Wasser flachgewaschen. Es wurden 80 mg Fibrinogen an den Träger adsorbiert und 4335 IU L-Asparaginase immobilisiert. Die wiedergefundene Aktivität betrug 992 IU, das ent spricht 23% des immobilisierten Enzyms. Der mit Iso propanol gemessene Transmembranfluß betrug 0,16 ± 0,02 ml/min·bar·cm². There was a corresponding module and treated as in Example 1 before then in place of the albumin solution with a solution of 150 mg of fibrinogen into 50 ml of phosphate buffer at pH 7.35 for 10 minutes in circulation through the module from NEN filtered out. It was then washed with 100 ml of distilled water. The adsorbed fibrinogen was treated for several minutes with 10% glutaraldehyde in phosphate buffer p H 7.35 30th Then it was washed again with distilled water. According to Example 1, a solution of L-asparaginase was circulated through the module from the inside out. Then washed flat with 2 liters of distilled water. 80 mg of fibrinogen were adsorbed onto the support and 4335 IU L-asparaginase were immobilized. The recovered activity was 992 IU, which corresponds to 23% of the immobilized enzyme. The transmembrane flow measured with isopropanol was 0.16 ± 0.02 ml / min · bar · cm².
Es wurde ein weiterer Modul, wie vorstehend im Ver gleichsbeispiel bereits beschrieben, behandelt, jedoch wurde zu der Lösung von 150 mg Fibrinogen in 150 ml Phosphatpuffer pH 7,35 3 IU Thrombin gegeben. Im übrigen wurde der Modul in gleicher Weise behandelt wie bereits beschrieben. Dabei wurde jedoch festge stellt, daß bereits nach ca. 30 Sekunden eine Filtration der Fibrin-Thrombin-Lösung durch die Membran nicht mehr möglich war, da die Membran durch das entstandene Fibrin blockiert wurde. Eine Fixierung von L-Asparaginase im Porensystem der Polypropylenmembran ist deshalb gar nicht möglich. Mit Isopropanol wurde noch ein Transmembranfluß von 0,06 ± 0,01 ml/min·bar·cm² gemessen.It was a further module, as above, for example in the same Ver already described, treated, but was added to the solution of 150 mg of fibrinogen in 150 ml of phosphate buffer p H, optionally 7.35 3 IU thrombin. Otherwise, the module was treated in the same way as already described. However, it was found that after just 30 seconds, filtration of the fibrin-thrombin solution through the membrane was no longer possible, since the membrane was blocked by the fibrin formed. It is therefore not possible to fix L-asparaginase in the pore system of the polypropylene membrane. A transmembrane flow of 0.06 ± 0.01 ml / min · bar · cm² was measured with isopropanol.
Claims (14)
- a) eine Lösung von 0,05 bis 1 Gew.-% Albumin in einem Puffergemisch bei einem konstanten pH-Wert,
- b) Wasser,
- c) eine Lösung die ein Vernetzungsmittel für das Albumin enthält,
- d) eine Lösung des Enzyms in einem Puffergemisch bei ei nem konstanten pH-Wert,
- e) Wasser.
- a) a solution of 0.05 to 1 wt .-% albumin in a buffer mixture at a constant pH value,
- b) water,
- c) a solution containing a crosslinking agent for the albumin,
- d) a solution of the enzyme in a buffer mixture at ei nem constant pH value,
- e) water.
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