DE3634505A1 - Verfahren zum behandeln einer wasser enthaltenden probe unter einem rasterelektronenmikroskop und einrichtung hierfuer - Google Patents
Verfahren zum behandeln einer wasser enthaltenden probe unter einem rasterelektronenmikroskop und einrichtung hierfuerInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln
einer Wasser enthaltenden Probe mittels eines Mikromanipulators
unter einem Rasterelektronenmikroskop und eine
Einrichtung hierfür, und zwar betrifft die Erfindung insbesondere
ein solches Verfahren zum Behandeln einer Probe unter
einem Rasterelektronenmikroskop, in welchem eine Wasser
enthaltende Rohprobe ge- bzw. zerschnitten wird, während
sie mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird,
und brauchbare Fragmente von der Probe zu extrahieren bzw.
aus der Probe herauszuholen, und außerdem betrifft die vorliegende
Erfindung eine Einrichtung hierfür.
Nach dem Stande der Technik ist es bei den neueren Anwendungen
der Biologie wünschenswert, eine Technik zu entwickeln
bzw. zur Verfügung zu haben, die für die Verwendung in
verschiedenen Untersuchungen geeignet ist, in denen winzige
brauchbare Fragmente von einer Rohprobe extrahiert bzw. aus
einer Rohprobe entnommen werden, um sie zu züchten oder in
sonstiger Weise zu kultivieren. Beispielsweise werden
Hyphae von einer gewissen Spezies von Fungi, die an einer
Pflanze anhaften, extrahiert bzw. herausgezogen, und die
Hyphae werden einer hochgradigen Analyse unterworfen, oder
die Hyphae werden von einer gewissen Schimmel- oder Moderspezies
extrahiert, und die Hyphae werden gezüchtet oder in
sonstiger Weise kultiviert.
Da brauchbare Fragmente, die von einer Probe, wie beispielsweise
von Fungi, extrahiert worden sind, sehr winzig sind,
ist es notwendig, ein Elektronenmikroskop zu verwenden, um
die Fragmente zu beobachten. Es sei hier darauf hingewiesen,
daß im Rahmen der vorliegenden Ansprüche und Beschreibung
der Begriff "extrahieren" insbesondere die Begriffe "herausziehen,
gewinnen, herausholen, extrahieren o. dgl." umfassen
soll. Die Vorgängen, die für konventionelle Untersuchungen
dieser Art erforderlich sind, umfassen Zerschneiden, beispielsweise
einer Pflanze, die Fungi enthält, wobei das Zerschneiden
willkürlich erfolgt oder die Pflanze in dünne Abschnitte zerschnitten
wird; Beobachten der abgeschnittenen Abschnitte
mittels eines Rasterelektronenmikroskops und/oder mittels
eines Durchstrahlungselektronenmikroskops; und Untersuchen
der Abschnitte nach brauchbaren Fragmenten, die zu extrahieren
sind. Bei Anwendung einer solchen konventionellen Art
und Weise muß man jedoch warten, ob und gegebenenfalls bis
brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, zufällig in oder
an den abgeschnittenen Abschnitten entdeckt werden, die man
von der aufs Geratewohl zerschnittenen Probe erhalten hat.
Weiter ist es, selbst wenn brauchbare Fragmente entdeckt
werden, technisch schwierig, die Fragmente wirksam und effektiv
zu extrahieren. Demgemäß ist die konventionelle Beobachtung,
die zum Extrahieren von brauchbaren Fragmenten
von einer Probe erforderlich ist, sehr ineffizient bzw. wenig
leistungsfähig, und es ist fast unmöglich, viele winzige
brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, von der Probe,
wie beispielsweise von einer Pflanze, konstant zu extrahieren.
Daher kann ein Rasterelektronenmikroskop bei
ernsthaften Untersuchungen, die im Rahmen von biologischen
Anwendungen stattfinden, nicht in genügendem bzw. effektivem
Umfang für die Behandlung und Untersuchung verwendet
werden, beispielsweise für die Extraktion eines Teils der
Probe, als weitgehend nur für die Beobachtung zum Zwecke
des Findens der Fragmente. Eine entsprechende Schwierigkeit
ist beim Vorgang des Extrahierens winziger Abschnitte von
Hochmolekülen bzw. sehr großen Molekülen in dem Zustand, in
dem ein Gehalt an Wasser oder Lösungsmittel vorliegt, vorhanden.
Kurz zusammengefaßt ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
ein Probenbehandlungsverfahren zur Verfügung zu stellen,
mit dem man in der Lage ist, brauchbare Fragmente, wie
beispielsweise Hyphae, von einer Wasser enthaltenden Rohprobe,
wie beispielsweise Fungi, die an einer Pflanze anhaften,
exakt ohne Fehler zu extrahieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein
Probenbehandlungsverfahren zur Verfügung zu stellen, in dem
eine Wasser enthaltende Rohprobe, wie beispielsweise Fungi,
die an einer Pflanze anhaften, in einem Kühlzustand in ein
Rasterelektronenmikroskop gebracht wird, ohne daß bis zum
äußersten eine Änderung in der Qualität auftritt, so daß
die Probe mittels des Mikroskops mit großer Effektivität
beobachtet werden kann und brauchbare Fragmente bei Beobachtung
mittels des Mikroskops exakt von der Probe extrahiert
werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine
Einrichtung zur Verfügung zu stellen, in bzw. mit welcher
die Verfahrensschritte des Schneidens bzw. Zerschneidens
einer Wasser enthaltenden Rohprobe, des Sublimierens von
Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe
enthalten ist, und des Extrahierens von brauchbaren Fragmenten
mittels eines Manipulators als eine Reihe von Vorgängen
in einer Vakuumkammer ausführbar sind.
Das Verfahren und die Einrichtung nach der Erfindung sind
insbesondere in den Patentansprüchen angegeben, wenngleich
die Erfindung nicht auf die Gegenstände dieser Patentansprüche
beschränkt ist, sondern vielmehr alles, was den
vorliegenden Unterlagen insgesamt zu entnehmen ist, sofern
es nicht ausdrücklich als zum Stand der Technik gehörend
bezeichnet ist, zur Erfindung gehört.
Die Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren
der Zeichnung anhand einiger, besonders bevorzugter
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der
Einrichtung nach der Erfindung näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 eine Reihe von Vorgängen, die mittels einer Ausführungsform
des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
ausgeführt werden;
Fig. 2 eine in der Draufsicht gezeigte Schnittansicht,
die eine Ausführungsform einer Einrichtung gemäß
der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, in welcher
Vakuumkammern, die je bei einem Vorgang verwendet
werden, um eine Arbeitskammer eines Rasterelektronenmikroskops
herum angeordnet sind;
Fig. 3A eine Ansicht auf einen Halter einer Probe bzw. für
eine Probe;
Fig. 3B eine Längsschnittansicht des Halters der Fig. 3A;
Fig. 4 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in
der eine gefrorene Probe ge- bzw. zerschnitten und
in der Probe enthaltendes Wasser sublimiert wird;
Fig. 5 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in
der eine Probe unter einem optischen Mikroskop behandelt
wird;
Fig. 6 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in
der leitfähiges Material durch Beschichtung auf
eine Probe aufgebracht wird;
Fig. 7 eine Längsschnittansicht, welche die Arbeitskammer
und einen kühlenden Objektträger des Rasterelektronenmikroskops
zeigt;
Fig. 8 eine Längsschnittansicht eines Mikromanipulators,
der zum Behandeln einer Probe unter dem
Rasterelektronenmikroskop verwendet wird; und
Fig. 9A, 9B, 9C, 9D und 9E vergrößerte Aufsichten auf
jeweilige verschiedene Arten von Nadeln für den
Mikromanipulator.
Es seien nun die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
beschrieben:
Zunächst sei der Aufbau einer Einrichtung zum Behandeln einer
Wasser enthaltenden Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop
beschrieben.
Es sei zunächst auf Fig. 2 Bezug genommen, in der ein
Rasterelektronenmikroskop gezeigt ist, das eine Arbeitskammer
D 1 und einen kühlenden Objektträger D 2 hat, der im Zentrum
der Kammer D 1 angeordnet ist. Das Mikroskop ist mit einem
Sekundärelektronendetektor D 3 versehen. Um die Arbeitskammer
D 1 herum sind mehrere Vakuumkammern angeordnet, nämlich
eine Vakuumkammer B 1 zum Schneiden bzw. Zerschneiden einer
gefrorenen Probe, eine Vakuumkammer C 1 zum Sublimieren von
Wasser, das in einer Probe enthalten ist, eine Vakuumkammer
E 1 zum Behandeln einer Probe unter einem optischen Mikroskop,
eine Vakuumkammer F 1 zum Aufbringen von leitfähigem
Material auf eine Probe durch Beschichten und eine Arbeitskammer
D 4, deren Benutzung mit einem Mikromanipulator erfolgt.
Die Vakuumkammern B 1 und C 1 sind in der gleichen
Vakuumkammer bzw. werden von einander gemeinsamen Vakuumkammern
umfaßt.
Die Fig. 3A und 3B zeigen einen Halter 1 für eine Probe.
der Halter 1 ist mit einer Nut, Rille, Ausnehmung o. dgl.
oder einem Loch 1 a versehen, worin eine Probe plaziert wird,
sowie mit einer Nadel 1 b, welche die Probe hält, und mit
einem Behälter 1 c, in welchem brauchbare Fragmente, die von
der Probe extrahiert worden sind, untergebracht werden bzw.
enthalten sind. Wenn die Probe eine Fungi enthaltende Suspension
ist, wird die Suspension mittels ihrer Oberflächenspannung
auf bzw. in der Ausnehmung 1 a gehalten. Wenn die
Probe ein Teil einer Pflanze ist, wird die Probe mittels
der Nadel 1 b gehalten. Der Halter 1 ist an seinem Boden mit
einem Einspann- bzw. Einsteckvorsprung 1 d versehen. Der Vorsprung
1 d des Halters 1 wird mittels eines Halteteils 2 gehalten,
das in Fig. 3B durch strichpunktierte Linien angedeutet
ist, und die auf dem Halter 1 plazierte Probe wird
in einem Gefrierprozeß A (siehe Fig. 1) schnell gefroren.
Ein aktuelles bzw. bevorzugtes Verfahren des Schnellgefrierprozesses A
besteht darin, daß der Halter 1 schnell in
flüssigen Stickstoff eingetaucht wird. Der die schnellgefrorene
Probe haltende Halter wird in die in Fig. 2 gezeigten
Vakuumkammern B 1 bis F 1 gebracht, so daß die Probe
verschiedenen Prozessen (die hier auch als Vorgänge oder
Arbeitsgänge bezeichnet sind) in den Vakuumkammern unterworfen
wird.
Es sei nun ein aktueller bzw. bevorzugter Aufbau der Vakuumkammern
B 1 bis F 1 beschrieben.
Die Fig. 4 zeigt den Aufbau der Vakuumkammern B 1 und C 1.
Beide Kammern sind in einer gemeinsamen Vakuumkammer 10 angeordnet
bzw. bilden eine gemeinsame Vakuumkammer 10. Die Vakuumkammer 10
wird auf einem Hochvakuum von etwa 10-10 bis
10-11 Torr gehalten. Die Vakuumkammer 10 steht mit der Arbeitskammer D 1
des Rasterelektronenmikroskops durch ein
Absperrventil 11 in Verbindung, das in Fig. 4 rechts angeordnet
ist. Eine Vorabsaugkammer 12 bzw. eine Schleusenkammer 12
ist auf der linken Seite der Vakuumkammer 10 angeordnet
und von der Vakuumkammer 10 mittels eines Absperrventils 13
getrennt. Die Vorabsaugkammer 12 wird auf einem
Niedervakuum von etwa 10-2 Torr gehalten.
Die Kammer 12 ist mittels eines Deckels 14 verschlossen,
und ein Stab 15, der zum Bewegen einer Probe verwendet wird,
ist durch den Deckel 14 in die Kammer 12 eingeführt. Der
Halter 1 wird auf einem Tisch 15 a gehalten, der lösbar mit
einem Ende des Stabs 15 verbunden ist.
Die Vakuumkammer B 1 umfaßt einen Kühlblock 16, eine
Schneideinrichtung 17, welche die gefrorene Probe roh bzw. grob
zerschneidet, und eine Kühlkammer 18, welche die Schneideinrichtung 17
kühlt. Der Kühlblock 16 ist mit flüssigem
Stickstoff N2 gefüllt. Der Tisch 15 a wird auf dem Kühlblock 16
plaziert. Die Schneideinrichtung 17 kann eine sich um eine
horizontale Achse oder eine sich um eine vertikale Achse
drehende Schneideinrichtung bzw. ein sich um eine horizontale
Achse oder ein sich um eine vertikale Achse drehendes
Messer sein, und sie ist dazu geeignet, eine gefrorene Probe X 1
auf dem Halter 1 manuell zu schneiden bzw. zerschneiden.
Die Kühlkammer 18, die, wie bereits erwähnt, mit flüssigem
Stickstoff N2 gefüllt ist, und die Schneideinrichtung
17 werden auf einer niedrigen Temperatur gehalten. Ein optisches
Mikroskop 19 von niedriger Vergrößerung ist oberhalb
des Halters 1 angeordnet. Die ge- bzw. zerschnittene
gefrorene Probe X 1 kann mittels des optischen Mikroskops
beobachtet werden.
Die Vakuumkammer C 1 umfaßt ein Heizteil 21, das auf dem
Kühlblock 16 angeordnet ist, und eine Kühlkammer 22 zur
Sublimation, die oberhalb des Heizteils 21 und gegenüber
demselben angeordnet ist. Das Heizteil 21 enthält in seinem
Inneren einen Heizer 23 und kann den Halter 1 allmählich
erhitzen. Die Kühlkammer 22 ist mit flüssigem Stickstoff N2
gefüllt. Die Kühlkammer 22 weist eine äußere untere Oberfläche
auf, die eine Sublimationsoberfläche 22 a bildet, welche
mit Gold plattiert ist. Der Tisch 15 a wird auf dem
Heizteil 21 plaziert, und die gefrorene Probe X 1, die auf
dem Tisch 15 a angeordnet ist, befindet gegenüber der
Sublimationsoberfläche 22 a, wobei ein kleiner Spalt zwischen der
Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a ausgebildet ist.
Die Probe X 1 wird mittels des Heizers 23 allmählich erhitzt,
so daß in der gefrorenen Probe X 1 enthaltenes Wasser, das
von der geschnittenen Oberfläche derselben herkommt, sublimiert
bzw. niedergeschlagen wird.
Es ist wünschenswert, daß der Sublimationsvorgang bzw. der
Vorgang des Niederschlagens von Wasser ausgeführt wird, während
der Tisch 15 a, bezogen auf die Ansicht der Fig. 4,
allmählich nach rechts bewegt wird. Um den Abstand zwischen
der gefrorenen Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a
feineinzustellen, kann das Heizteil 21 fein bzw. leicht
nach aufwärts und abwärts bewegt werden. Wenn der Fall vorliegt,
daß eine Probe bearbeitet wird, die keinen Sublimationsvorgang
erfordert, kann die Vakuumkammer C 1 in einem
Aufbau ausgebildet werden, in welchem das Heizteil 21 entfernt
werden kann.
Die Fig. 5 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer E 1, die dazu
verwendet wird, den Vorgang des Behandelns einer Probe unter
dem optischen Mikroskop auszuführen. Die Vakuumkammer
E 1 dient dazu, die in der Vakuumkammer C 1 der Sublimation
unterworfenen Probe mit niedriger Vergrößerung zu beobachten
und die Probe in kleinere Abschnitte zu zerschneiden,
wenn das notwendig ist. Die Vakuumkammer E 1 umfaßt eine
Vakuumkammer 30 und eine Vorabsaugkammer 31 bzw. eine
Schleusenkammer 31. Die Vakuumkammer 30 ist von der Arbeitskammer D 1
des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 32
getrennt, und sie ist auch von der Vorabsaugkammer 31
mittels eines Absperrventils 33 getrennt. Die
Vorabsaugkammer 31 ist mittels eines Deckels 34 geschlossen,
durch den ein Stab 35 zum Bewegen der Probe in die Kammer
31 eingeführt ist. Der Tisch 15 a, auf dem die Probe 1 gehalten
wird, kann an das ihm zugewandte Ende des Stabs 35
angekoppelt bzw. mit diesem Ende verbunden werden. In der
Kammer 30 ist ein Kühlblock 36 angeordnet, der mit flüssigem
Stickstoff N2 gefüllt ist und auf einer niedrigen Temperatur
gehalten wird. Der Kühlblock 36 ist mit einem Heizer 37
versehen, so daß die Temperatur des Kühlblocks 36
mittels des Heizers 37 einstellbar ist. Auf dem Kühlblock 36
ist ein Aufwärts- und abwärts-Block 38 bzw. ein aufwärts
und abwärts bewegbarer Block 38 angeordnet, und der von dem
Stab 35 abgenommene Tisch 15 a wird auf dem Block 38 plaziert.
Ein optisches Mikroskop 39 vom Projektionstyp bzw.
vom Auflichttyp ist oberhalb der Vakuumkammer 30 angeordnet,
und die Objektivlinse 41 bzw. das Objektiv 41 des Mirkoskops
39 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt und befindet sich
gegenüber dem Halter 1 in der Kammer 30. Die Objektivlinse
41 bzw. das Objektiv 41 hat einen großen Arbeitsabstand und
kann in einer Entfernung von dem Halter 1 gehalten werden,
die etwa 10 mm beträgt. Die Brennweite des Objektivs 41 bzw.
der Objektabstand wird durch Aufwärts- und Abwärtsbewegung
des Block 38 eingestellt.
Ein manueller Manipulator 42 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt.
Eine Nadel 42 a ist an einem Ende des Manipulators 42
mittels eines Wärmeisolationsmaterial 42 b angebracht.
Die Nadel 42 a kann die gefrorene Probe X 1 auf dem Halter 1
feiner bzw. winziger schneiden bzw. zerschneiden. Vorzugsweise
ist eine Mehrzahl von Manipulatoren 42 vorgesehen,
von denen je einer ein Messer, eine Nadel, eine Pinzette
u. dgl. jeweils hat. Der Behandlungsvorgang der Probe durch
den Manipulator 42 wird auf einen Schirm 39 a des Mikroskops
39 projiziert.
Die Fig. 6 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer F 1, die dazu
verwendet wird, den Vorgang des Aufbringens von leitfähigem
Material auf eine Probe durch Beschichtung auszuführen. Die
Vakuumkammer F 1 umfaßt eine Vakuumkammer 50, die von der
Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops mittels eines
Absperrventils 51 abgetrennt bzw. abtrennbar ist, und
eine Vorabsaugkammer 52 bzw. eine Schleusenkammer 52, die
von der Vakuumkammer 50 mittels eines Absperrventils 53 abtrennbar
ist. Die Vorabsaugkammer 52 ist mit einem Deckel
54 versehen, durch den ein Stab 55 zum Bewegen der Probe in
die Kammer 52 eingeführt ist, und der Tisch 15 a wird an einem
Ende des Stabs 55 angebracht. In der Vakuumkammer 50
ist ein Kühlblock 56 vorgesehen. Der Kühlblock 56 ist mit
flüssigem Stickstoff N2 gefüllt und mit einem Heizer 57 versehen,
so daß die Temperatur des Kühlblocks 56 mittels des
Heizers 57 eingestellt werden kann (es versteht sich von
selbst, daß der Kühlblock der vorliegenden Ausführungsform
aus einem eigentlichen massiven Blocks besteht, in den Heizer 57
eingeführt ist, und eine darunterliegende Kammer, in
die flüssiger Stickstoff eingefüllt ist). Der den Halter 1
haltende Tisch 15 a wird mittels des Stabs 55 in bzw. auf den
Kühlblock 56 bewegt.
Eine Stabaustauschkammer 60 ist oberhalb der Vakuumkammer 50
angeordnet und von der Vakuumkammer 50 mittels eines
Absperrventils 61 abtrennbar. In der Stabaustauschkammer 60
sind ein Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 und eine Elektrode 63
vorgesehen, welche eine Spannung an den Kohlenstoff- bzw.
Kohlestab 62 angelegt bzw. diesem zuführt. Der Vorgang des
Aufbringens von leitfähigem Material auf die Probe X 1 durch
Beschichten kann in der Kammer F 1 dadurch ausgeführt werden,
daß man den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 erhitzt.
Die Fig. 7 zeigt die Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops.
Der kühlende Objektträger D 2, der im Zentrum
der Arbeitskammer D 1 angeordnet ist, wird mit flüssigem
Stickstoff N2 gekühlt. Obwohl das in der Figur nicht gezeigt
ist, kann der auf dem kühlenden Objektträger D 2 angeordnete
Tisch 15 a von außen her so eingestellt werden, daß
eine bzw. die Drehrichtung und ein bzw. der Winkel desselben
verändert werden kann. Der kühlende Objektträger D 2 ist
dem Kanal 71 des Rasterelektronenstrahls gegenüber angeordnet.
Der Sekundärelektronendetektor D 3 ist der Arbeitskammer D 1
zugewandt. Die Vakuumkammern B 1, C 1, E 1 und F 1sind
radial um den kühlenden Objektträger D 2 herum angeordnet,
wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Stäbe 15, 35 und 55, die in
den Vakuumkammern B 1 bzw. E 1 bzw. F 1 vorgesehen sind,
können über den kühlenden Objektträger D 2 verlängert bzw.
geschoben werden.
Die Fig. 8 zeigt einen bevorzugten Aufbau des Mikromanipulators
D 4. Der Mikromanipulator D 4 weist eine Mikromanipulatoraustauschkammer
80 auf, die von der Arbeitskammer D 1 des
Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 81
abtrennbar ist (wie die gesamte vorstehende Beschreibung in
Verbindung mit den Figuren der Zeichnung erkennen läßt, ist
unter einem Absperrventil insbesondere ein solches Absperrventil
zu verstehen, durch welches hindurch Gegenstände bewegt
werden können, das also gleichzeitig als Manipulations-
oder Einführungs- oder Ausführungstor zwischen den beiden
Kammern dienen kann, die mittels dieses Absperrventils voneinander
abtrennbar sind). Eine Vorabsaugeinrichtung, die
nicht dargestellt ist, ist benachbart der Austauschkammer
80 vorgesehen. Die Austauschkammer 80 ist mit einem Mikromanipulator 82
versehen. Der Mikromanipulator 82 wird mittels
eines Antriebsmechanismus 82 so angetrieben, daß der
Mikromanipulator 82 in der x-Richtung und der y-Richtung
nach vorwärts und rückwärts bewegt werden kann, wie in Fig. 8
angedeutet ist. Der Antriebsmechanismus 83 weist einen
Impulsmotor als Kraftquelle auf und kann den Mikromanipulator 82
so steuern, daß dieser über sehr kurze Strecken
entsprechend Operationsbefehlen bewegt wird, die von einem
Mikrorechner zugeführt werden.
Eine Nadel 85 ist an einem Ende des Mikromanipulators 82
mittels eines Wärmeisolationsmaterials 84 befestigt. Die
Fig. 9A bis 9E zeigen Nadeln von verschiedenen Formen.
Die in diesen Figuren gezeigten Nadeln 85 können, wenn notwendig,
an dem Mikromanipulator 82 befestigt werden. Die
Nadeln sind aus Wolfram ausgebildet, das mit Gold plattiert
ist. Die in Fig. 9A gezeigte Nadel hat eine Plattenform,
wobei an einem Ende derselben ein Pinhole ausgebildet ist,
das einen Durchmesser von etwa 1 bis 2 µm hat. Die Nadel
der Fig. 9B ist eine Mikropinzette. Die Nadel der Fig. 9C ist
an einem Ende derselben mit einer ovalen Ausnehmung ausgebildet,
wobei diese Ausnehmung in der vorliegenden Ausführungsform,
wie die Fig. 9C zeigt, durch einen seitlichen
Durchgang mit einer Seitenkante verbunden ist, so daß das
freie Ende der Nadel 85 insgesamt hakenförmig ist. Die Nadel
der Fig. 9D ist ein Mikrobohrer, an dessen einem Ende
feine Teilchen aus Diamant haften. Die Nadel der Fig. 9E
ist eine Mikronadel, die an ihrem einen Ende scharf bzw.
sehr spitz ausgebildet ist.
Es sei nun eine bevorzugte Ausführungsform des hier vorgeschlagenen
Verfahrens zur Behandlung einer Wasser enthaltenden
Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop unter
Verwendung der obigen Einrichtung beschrieben.
Sämtliche Prozesse des Verfahrens umfassen, wie in Fig. 1
dargestellt ist, folgende Vorgänge: einen Prozeß A des
schnellen Gefrierens einer rohen Probe X 1, die Wasser enthält;
einen Prozeß B des Schneidens bzw. Zerschneidens der
gefrorenen Probe unter Vakuum; einen Prozeß C des Sublimierens
von Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen
Probe enthalten ist, von deren Schnittoberfläche; einen
Prozeß E des groben Schneidens bzw. Zerschneidens der Probe
nach der Sublimation, und zwar mittels des Manipulators unter
dem optischen Mikroskop; einen Prozeß F des Aufbringens
von leitfähigem Material auf die grob ge- bzw. zerschnittene
Probe durch Beschichten; und einen Prozeß G des Behandelns
der Probe mittels des Mikromanipulators unter dem
Rasterelektronenmikroskop, um brauchbare Fragmente, wie
beispielsweise Hyphae, von der Probe zu extrahieren.
Es sei nun jeder dieser vorstehend erwähnten Prozesse in näheren
Einzelheiten beschrieben:
Zunächst wird eine rohe Probe, die Wasser enthält, auf dem
Halter 1 gehaltert, wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt
ist. Wenn die Probe eine Suspension ist, die Fungi enthält,
wird die Suspension durch Oberflächenspannung auf bzw. in
der Ausnehmung 1 a gehalten. Weiterhin wird die Probe, wenn
sie ein Teil einer Pflanze ist, mittels der Haltenadel 1 b
gehalten.
In dem Schnellgefrierprozeß A wird der Halter 1 schnell in
flüssigen Stickstoff eingetaucht, und das in der Probe X 1 auf
dem Halter 1 enthaltene Wasser wird schnell auf eine niedrige
Temperatur von -210°C gefroren.
Die Prozesse B und C werden in den in Fig. 4 gezeigten
Vakuumkammern B 1 und C 1 ausgeführt. Der Halter 1, der die
schnellgefrorene Probe X 1 hält, wird auf dem Tisch 15 a plaziert
und wird mittels des ausgefahrenen (d. h. in die
Vakuumkammer hinein ausgefahrenen) Stabs 15 auf dem Kühlblock 16
der Vakuumkammer 10 durch Ausfahren des Stabs 15 bewegt
bzw. verschoben (sowie gegebenenfalls durch seitliches Verschwenken
und/oder Hin- und Herbewegen und/oder Aufwärts-
und Abwärtsverschwenken und/oder Drehen und/oder sonstiges
Bewegen des Stabs 15). In der Vakuumkammer B 1 wird die gekühlte
Schneideinrichtung 17 unter Vakuum und bei einer
niedrigen Temperatur betrieben, und die gefrorene Probe X 1
auf dem Halter 1 wird mittels der Schneideinrichtung 17
aufs Geratewohl grob geschnitten bzw. zerschnitten. Der
Schneidvorgang wird durch Drehen der Schneideinrichtung 17
bzw. des Schneidwerkzeugs 17 um eine horizontale Achse oder
eine vertikale Achse kontinuierlich ausgeführt. Die mittels
der Schneideinrichtung 17 bzw. mittels des Schneidwerkzeugs
17 ge- bzw. zerschnittene Probe X 1 wird sofort durch das
optische Mikroskop 19 beobachtet. Die Beobachtung mittels
des optischen Mikroskops 19 kann während des Schneidens bzw.
Zerschneiden der gefrorenen Probe X 1 ausgeführt werden, so
daß brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, in der
gefrorenen Probe X 1 in der Schnittoberfläche gelassen werden.
Unbrauchbare Fragmente der gefrorenen Probe X 1 werden
bei dem Schneidprozeß entfernt.
Dann wird der Tisch 15 a über das Heizteil 21 der Vakuumkammer
C 1 bewegt bzw. verschoben, und der Heizer 23 wird allmählich
erhitzt, während die Schnittoberfläche der gefrorenen
Probe X 1 gegenüber der Sublimationsoberfläche 22 a liegt,
wobei ein kleiner Spalt zwischen der Schnittoberfläche der
Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a vorhanden ist;
auf diese Weise wird in der Probe X 1 enthaltenes Wasser
sublimiert bzw. an der Oberfläche 22 a niedergeschlagen. Um
den Sublimationszustand der Probe X 1 zu beobachten, kann
der Tisch 15 a wieder unter das optische Mikroskop 19 zur
Beobachtung der Probe bewegt bzw. verschoben werden. Um die
Beobachtung zu fördern, kann das optische Mikroskop 19 zwischen
den Vakuumkammern b 1 und C 1 angeordnet sein.
Der Prozeß E des Behandelns der Probe unter dem optischen
Mikroskop wird, wenn notwendig, ausgeführt. Um mit dem Prozeß
E fortzufahren, wird der Tisch 15 a in der Vakuumkammer C 1
mittels des Stabs 15 in die Arbeitskammer D 1 des
Rasterelektronenmikroskops bewegt und einmal auf dem kühlende Objektträger
D 2 in der Arbeitskammer D 1 plaziert. Der Stab 35,
der in der Vakuumkammer E 1 der Fig. 5 vorgesehen ist, wird
dann ausgefahren (d. h. in die Kammer hinein ausgefahren),
um an dem Tisch 15 a angebracht zu werden, der auf dem kühlenden
Objektträger D 2 in der Arbeitskammer D 1 plaziert ist,
und der Tisch 15 a wird auf den Aufwärts-und-abwärts-Block 38
in der Vakuumkammer E 1 bewegt. Während die gefrorene
Probe X 1 auf dem Tisch 15 a, der auf dem aufwärts und abwärts
bewegbaren Block 38 angeordnet ist, mittels des
Auflichtmikroskops 39 beobachtet wird, wird die gefrorene Probe X 1
weiter mittels des Manipulators 42 ge- bzw. zerschnitten,
so daß Teile, die brauchbare Fragmente in der Probe enthalten,
dagelassen (d. h. nicht entfernt) werden und
unbrauchbare Teile entfernt werden.
Der Prozeß F des Aufbringens von leitfähigem Material auf
die Probe durch Beschichten wird nur dann ausgeführt, wenn
es notwendig ist, die in dem Prozeß E grob ge- bzw. zerschnittene
Probe mit leitfähigem Material zu beschichten.
In dem Prozeß F wird, nachdem die Probe in der Vakuumkammer
E 1 der Fig. 5 behandelt worden ist, der Tisch 15 a mittels
des Stabs 35 auf den kühlenden Objektträger D 2 in der
Arbeitskammer D 1 zurückgebracht. Dann wird der Tisch 15 a mittels
des Stabs 55 in der Vakuumkammer F 1, die in Fig. 6
gezeigt ist, zu dem Kühlblock 56 bewegt bzw. gebracht. Die
Absperrventile 51 und 53 in der Vakuumkammer F 1 werden
geschlossen, und das Absperrventil 61 wird unter Vakuum geöffnet.
Eine entsprechende Spannung wird an den Kohlestab
62 angelegt, und Kohlenstoffteilchen, die von dem Kohlestab
62 emittiert werden, werden als Beschichtung auf der gefrorenen
Probe X 1 niedergeschlagen bzw. aufgebracht. Nach
Vollendung des Prozesses F wird der Tisch 15 a mittels des
Stabs 55 auf den kühlenden Objektträger D 2 in der Arbeitskammer
zurückgebracht.
Dann wird der Prozeß D des Behandelns der Probe unter dem
Rasterelektronenmikroskop ausgeführt. In dem Prozeß D wird
eine angemessene Nadel aus den in den Fig. 9A bis 9E gezeigten
Nadeln an dem Ende des Mikromanipulators 82 der Fig. 8
befestigt. Die Austauschkammer 80 wird vorher evakuiert,
und dann wird das Absperrventil 81 geöffnet. Der
Mikromanipulator 82 wird mittels eines Impulsmotors in Übereinstimmung
mit Befehlen eines Mikrocomputers angetrieben,
um die Nadel 81 auf die gefrorene Probe X 1 zu bewegen. Während
die Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet
wird, werden brauchbare Fragmente, wie beispielsweise
Hyphae, mittels der Nadel 85 von der Probe X 1 extrahiert.
Die Extraktion wird durch Austauschen der Nadel 85 von verschiedenen
Arten, wie in Fig. 9A bis 9E gezeigt, durchgeführt
bzw. es können für die Extraktion durch Austausch
der Nadel verschiedenste Nadeln der in den Fig. 9A bis
9E gezeigten Art für die Extraktion verwendet werden.
Beispielsweise wird die Oberfläche der Probe mittels der Nadel
der Fig. 9D rasiert, geschabt, abgeschält oder abgeschabt.
Die Nadel der Fig. 9A oder 9C extrahiert oder schneidet
Hyphae von der Probe. Die Mikropinzette der Fig. 9B extrahiert
Hyphae o. dgl. Die auf diese Weise von der Probe
extrahierten brauchbaren Fragmente werden mittels der Mikronadel
der Fig. 9E durchstochen, von der Probe X 1 getrennt
und in den Behälter 1 c des Halters 1 eingebracht.
Nach Vollendung der obigen Prozesse wird der Halter 1 aus
der Arbeitskammer D 1 herausgenommen, und die brauchbaren
Fragmente in dem Behälter 1 c des Halters werden für Studien,
Untersuchungen und/oder zur Zucht, zum Kultivieren
o. dgl. verwendet.
Weiter kann, wie Fig. 1 zeigt, die Behandlungseinrichtung
eine trockene Probe Xo behandeln. In diesem Fall wird die
trockene Probe Xo zu dem Prozeß E gebracht, um die Probe
mittels des Manipulators unter dem optischen Mikroskop grob
zu schneiden bzw. zu zerschneiden. Nach dem Prozeß F des
Beschichtens der Probe mit leitfähigem Material wird die
Probe zu dem Prozeß D gebracht.
Wie oben beschrieben, können mit dem Verfahren zur Behandlung
von Proben unter dem Rasterelektronenmikroskop gemäß
der vorliegenden Erfindung winzige brauchbare Fragmente,
wie beispielsweise Hyphae, in der Form von fast rohen bzw.
frischen Fragmenten extrahiert werden, da die rohe bzw.
frische Probe, welche Wasser enthält und welche sehr schnell
eingefroren worden ist, unter Vakuum ge- bzw. zerschnitten
werden kann und da nach einer Sublimation brauchbare Fragmente
von der Probe extrahiert werden können, während die
Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet
wird. Demgemäß können die brauchbaren Fragmente für verschiedenste
Studien bzw. Untersuchungen, wie beispielsweise
für Züchtung oder Kultivierung oder eine Analyse hohen Grades
bzw. Hochgradanalyse, verwendet werden.
Weiter kann der Vorgang des Extrahierens der brauchbaren
Fragmente von der rohen bzw. frischen Probe exakt mittels
einer Reihe von Prozessen unter Verwendung der Probenbehandlungseinrichtung
nach der Erfindung, in der ein
Rasterelektronenmikroskop verwendet wird, durchgeführt werden.
Claims (5)
1. Verfahren zum Behandeln einer Probe unter einem
Rasterelektronenmikroskop, dadurch gekennzeichnet,
daß es die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
schnelles Gefrieren einer rohen Probe (X 1), die Wasser enthält;
weitgehendes und willkürliches bzw. aufs Geratewohl erfolgendes Schneiden bzw. Zerschneiden der gefrorenen Probe (X 1) unter Vakuum;
ein allmähliches Erwärmen bzw. Erhitzen der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe (X 1) unter Vakuum, so daß Wasser, welches in der Probe (X 1) enthalten ist, sublimiert wird;
Aufbringen eines leitfähigen Materials auf die Probe (X 1) durch Beschichten nach der Sublimation; und
Herausnehmen brauchbarer Fragmente der Probe (X 1) mittel eines Mikromanipulators (82), während man die beschichtete Probe (X 1) durch das Rasterelektronenmikroskop beobachtet.
schnelles Gefrieren einer rohen Probe (X 1), die Wasser enthält;
weitgehendes und willkürliches bzw. aufs Geratewohl erfolgendes Schneiden bzw. Zerschneiden der gefrorenen Probe (X 1) unter Vakuum;
ein allmähliches Erwärmen bzw. Erhitzen der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe (X 1) unter Vakuum, so daß Wasser, welches in der Probe (X 1) enthalten ist, sublimiert wird;
Aufbringen eines leitfähigen Materials auf die Probe (X 1) durch Beschichten nach der Sublimation; und
Herausnehmen brauchbarer Fragmente der Probe (X 1) mittel eines Mikromanipulators (82), während man die beschichtete Probe (X 1) durch das Rasterelektronenmikroskop beobachtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Verfahrensschritt des weitgehenden
und willkürlichen bzw. aufs Geratewohl erfolgenden
Schneidens bzw. Zerschneidens der gefrorenen Probe (X 1) unter
Vakuum unter einem optischen Mikroskop (39) ausgeführt
wird.
3. Einrichtung zum Behandeln einer Probe unter einem
Rasterelektronenmikroskop, dadurch gekennzeichnet,
daß sie folgendes umfaßt:
eine erste Vakuumkammer (B 1) die einen Teil (16) aufweist, in bzw. auf dem eine schnell gefrorene Probe (X 1) plaziert wird, und eine Schneideeinrichtung (17) bzw. ein Schneidwerkzeug (17) zum weitgehenden und willkürlichen bzw. auf Geratewohl erfolgenden Schneiden bzw. Zerschneiden der Probe (X 1);
eine zweite Vakuumkammer (C 1), die einen Teil aufweist, in bzw. auf dem die weitgehend und willkürlich bzw. aufs Geratewohl geschnittene bzw. zerschnittene Probe (X 1) plaziert wird, und ein Heizteil (21) zum allmählichen Erwärmen bzw. Erhitzen der Probe (X 1) zur Sublimierung von Wasser, das in der Probe (X 1) enthalten ist;
eine dritte Vakuumkammer (F 1) zum Beschichten der Probe (X 1) mit leitfähigem Material nach der Sublimation;
wobei die erste, zweite und dritte Vakuumkammer (B 1, C 1, F 1) benachbart einer Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind;
einen kühlenden Objektträger (D 2), auf dem die Probe (X 1) nach der Sublimation plaziert wird; und
einen sich bis zu dem kühlenden Objektträger (D 2) erstreckenden Mikromanipulator (82) zum Herausnehmen von brauchbaren Fragmenten aus der Probe (X 1) unter dem Rasterelektronenmikroskop;
wobei der kühlende Objektträger (D 2) und der Mikromanipulator (82) in der Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind.
eine erste Vakuumkammer (B 1) die einen Teil (16) aufweist, in bzw. auf dem eine schnell gefrorene Probe (X 1) plaziert wird, und eine Schneideeinrichtung (17) bzw. ein Schneidwerkzeug (17) zum weitgehenden und willkürlichen bzw. auf Geratewohl erfolgenden Schneiden bzw. Zerschneiden der Probe (X 1);
eine zweite Vakuumkammer (C 1), die einen Teil aufweist, in bzw. auf dem die weitgehend und willkürlich bzw. aufs Geratewohl geschnittene bzw. zerschnittene Probe (X 1) plaziert wird, und ein Heizteil (21) zum allmählichen Erwärmen bzw. Erhitzen der Probe (X 1) zur Sublimierung von Wasser, das in der Probe (X 1) enthalten ist;
eine dritte Vakuumkammer (F 1) zum Beschichten der Probe (X 1) mit leitfähigem Material nach der Sublimation;
wobei die erste, zweite und dritte Vakuumkammer (B 1, C 1, F 1) benachbart einer Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind;
einen kühlenden Objektträger (D 2), auf dem die Probe (X 1) nach der Sublimation plaziert wird; und
einen sich bis zu dem kühlenden Objektträger (D 2) erstreckenden Mikromanipulator (82) zum Herausnehmen von brauchbaren Fragmenten aus der Probe (X 1) unter dem Rasterelektronenmikroskop;
wobei der kühlende Objektträger (D 2) und der Mikromanipulator (82) in der Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind.
4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die erste, zweite und dritte Vakuumkammer
(B 1, C 1, F 1) radial um die Arbeitskammer (D 1) des
Rasterelektronenmikroskops herum angeordnet sind, und daß jede
der Vakuumkammern (B 1, C 1, F 1) von der Arbeitskammer (D 1)
durch ein Absperr- bzw. Torventil (11, 32, 51) abtrennbar
ist.
5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein optisches Mikroskop
(19) umfaßt, das benachbart der ersten Vakuumkammer (B 1)
angeordnet ist.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60226096A JPS6285840A (ja) | 1985-10-11 | 1985-10-11 | 走査型電子顕微鏡を用いた試料処理方法および装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3634505A1 true DE3634505A1 (de) | 1987-04-16 |
DE3634505C2 DE3634505C2 (de) | 1992-01-23 |
Family
ID=16839758
Family Applications (1)
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DE19863634505 Granted DE3634505A1 (de) | 1985-10-11 | 1986-10-09 | Verfahren zum behandeln einer wasser enthaltenden probe unter einem rasterelektronenmikroskop und einrichtung hierfuer |
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JP (1) | JPS6285840A (de) |
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- 1985-10-11 JP JP60226096A patent/JPS6285840A/ja active Pending
-
1986
- 1986-10-08 US US06/916,618 patent/US4749868A/en not_active Expired - Fee Related
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