DE3631416A1

DE3631416A1 - Genetisch modifizierte mikroorganismen fuer die herstellung von l-aminosaeuren

Info

Publication number: DE3631416A1
Application number: DE19863631416
Authority: DE
Inventors: Gerald G Lovinger; Alan W Hammond
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn
Priority date: 1985-09-19
Filing date: 1986-09-16
Publication date: 1987-05-27
Also published as: GB2180540A; AU6272286A; SE8603838L; IT8621735A0; SE8603838D0; FR2588015A1; JPS6269980A; IT1197240B; GB8622666D0; IT8621735A1; NL8602365A

Description

Die Erfindung betrifft den Gebrauch von Mikroorganismen mit deutlich erhöhter Transaminaseaktivität in der Produktion von L-Aminosäuren (nachfolgend "Aminosäuren" genannt). Insbesondere wird das Gen, welches für die Transamina seaktivität codiert, aus einem natürlichen bakteriellen Genom in Multicopy Plasmide überführt.

Mit diesen rekombinanten Plasmiden transformierte Mikroor ganismen zeigen unter geeigneten Bedingungen eine deutlich erhöhte Transaminaseaktivität. Ferner ist die Enzymaktivi tät temperaturbeständig. Als Ergebnis übertrifft die Amino säureproduktion über die Transaminierung der erfindungsge mäßen genetisch modifizierten Organismen diejenige natür licher Isolate bei weitem.

Die Transaminierung ist normalerweise definiert als Reak tion zwischen einer Aminosäure und einer Ketosäure, deren Ergebnis der Wechsel der Amino- und Ketogruppen zwischen den Ausgangsmaterialien ist. Es ist bekannt, daß Ketosäure vorstufen enzymatisch in ihre korrespondierenden Aminosäu ren umgewandelt werden können. Enzyme, welche den eigent lichen Transfer dieser Gruppen vermitteln werden als "Transaminasen" oder "Aminotransferasen" bezeichnet. Die US-Patentschrift 1 83 170 beschreibt als Beispiel dieser Art Reaktion die Transaminierung von Ketosäurevorstufen in Gegenwart eines Multienzymsystems, welches aus verschiede nen Quellen wie geernteten Bakterienzellen, getrockneten Zellen, Zellmaceraten oder Enzymlösungen erhalten wurde. Das von Kitai et al. beschriebene Multi-Enzymsystem besteht aus Dehydrogenase, Hydrogenase, Transaminase, Wasserstoff akzeptoren und einem Elektronentransportsystem.

Die Aminotransferase-Gene von E. coli wurden von Gelfand et al., J. Bacteriology, "Escherichia coli-Mutants Deficient in the Aspartate and Aromatic Amino Acid Aminotransfera ses", 130, 429-40 (1977) beschrieben, und als ilvE, tyrB und aspC bezeichnet. Es ist bekannt, daß die Gegenwart von funktionellen tyrB und aspC Genen von E. coli die Auxotro phie für Tyrosin, Phenylalanin oder Asparaginsäure aufhebt. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 84100521.8 (Ver öffentlichungsnummer 01 16 860) ist beschrieben, daß die ilvE, tyrB und aspC Aminotransferase-Gene isoliert und zur Bildung rekombinanter Mikroorganismen verwendet werden können, die in der Lage sind, diese Aminotransferase-Gen produkte zu bilden.

Erfindungsgemäß werden DNA-Rekombinationsmethoden verwen det, um einen neuen Bakterienstamm zu schaffen, der das temperaturbeständige Transaminase-Gen von Salmonella typhi murium in einer höheren Anzahl von Kopien enthält als es normalerweise in dem Bakteriengenom vorhanden ist. Dieses Gen, welches für das Enzym AT sty 2 codiert, wird in ein Multicopy Plasmid eingeführt und dieses rekombinierte Plasmid in einen geeigneten Wirt eingebaut. Die daraus resultierenden erhöhten Mengen an exprimierten Transami nase-Genprodukten im transformierten Wirt verursachen eine Überproduktion von L-Aminosäuren durch Transaminierung von exogen zugeführten Aminodonator- und Ketosäurevorstufen. Das gebildete temperaturbeständige Enzym ist deswegen wesentlich weniger anfällig gegenüber einer Inaktivierung durch erhöhte Temperaturen. Die biochemische Umwandlung der Vorstufen durch das erfindungsgemäß exprimierte Enzym, liefert verglichen mit natürlichen Varianten, eine signi fikant erhöhte Menge des Aminosäureproduktes.

Es ist in erster Linie Aufgabe der Erfindung, einen Mikroorganismen-Stamm zur Verfügung zu stellen, der mehre re Kopien eines Transaminase-Gens enthält, dessen tempe raturbeständiges Produkt die stereospezifische Umwandlung von alpha-Ketosäuren zu Aminosäuren katalysiert. Solch ein Stamm zeigt eine signifikant erhöhte Bildungsrate für Aminosäuren wobei eine wesentlich kürzere Verweildauer im Reaktionsgefäß erforderlich ist.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung einen rekombinanten Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, der durch konven tionelle Methoden immobilisiert werden kann und eine Transaminase exprimiert, die bezüglich ihrer Halblebenszeit auch nach Immobilisierung wesentlich verbesserte Charak teristika aufweist.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, die erwünschten Transaminase-Gene in eine Plasmidkonstruktion einzubrin gen, die sowohl strukturbeständig als auch bezüglich der Anzahl der Kopien beständig ist, so daß Processingprobleme, die mit Deletion oder Transpositionen der DNA-Sequenz des Gens oder dem Verlust des Plasmids einhergehen, überprüft und verringert werden können.

Zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung ist die Lokalisie rung der Transaminasegene, die für die hohe Anzahl der exprimierten Enzyme in einem High-Copy-Plasmid verantwort lich sind.

Weiterhin Gegenstand dieser Erfindung ist der Gebrauch des Spectinomycin-Resistenz-Gens des erfindungsgemäßen Plasmids.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Teils des Restriktionsmusters von pAH 27.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Teils des Restriktionsmusters von pGA 108.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines Teils des Restriktionsmusters von pGA 115.

Erfindungsgemäß wird ein Gen für eine temperaturbeständige Transaminase von Salmonella typhimurium kloniert und in einem Wirt zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren exprimiert. Das Transaminase-Gen wird zuerst isoliert und dann vorzugsweise in einen selektivierbaren Multicopy-Vec tor eingebaut. Ein geeigneter Wirt wird mit dem rekombi nierten Vector, der das Transaminase-Gen enthält, transfor miert. Die Selektion des Transaminase-Gens wird durch Komplementieren eines für die erwünschten Aminosäuren auxotrophen Wirtsmikroorganismus und anhand der Wärmebeständig keit des exprimierten Enzyms nachgewiesen. Dieses Enzym wurde als AT sty 2 bezeichnet. Ein Expressionswirt trans formiert mit dem erfindungsgemäßen S. typhimurium Transami nase-Gen oder einem Teil oder ein Extrakt des transformier ten Wirts ist in der Lage, in Gegenwart von alpha-Ketosäu revorstufen und Aminogruppendonatoren Aminosäuren zu produ zieren und akkumulieren. Katalysatoren mit der beschriebe nen Transaminaseaktivität haben signifikant verlängerte Halblebenszeiten, wenn sie für die beschriebene bioche mische Umsetzung verwendet werden.

Erfindungsgemäß schließt der Begriff "Transaminase-Gen" Genfragmente ein, die das Gen für AT sty 2 selbst, das Gen mit zusätzlicher DNA oder einen funktionellen Teil des Transminase-Gens enthalten. Das hier beschriebene AT sty 2 Transaminase-Gen ist das S. typhimurium Gen, dessen Expres sionsprodukt, die Transaminase, sich durch eine hohe Wärmebeständigkeit und durch die Fähigkeit zur schnellen Umsetzung von Ketosäurevorstufen zur korrespondierenden Aminosäure auszeichnet. Das Transaminase-Gen wird direkt aus dem Genom von S. typhimurium isoliert oder kann aus jeder anderen geeigneten Quelle genetischen Materials von S. typhimurium erhalten werden. Dieser Mikroorganismus ist erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (der ATCC Katalog, 1985, bietet 51 Stämme an). Weiterhin erhältlich sind diese Stämme auch von Laboratorien, die mit S. typhimurium arbeiten.

Das Genom oder das genetische Material wird teilweise mit Restriktionsendonukleasen verdaut und es werden Fragmente geeigneter Größe, z.B. ca. 10 bis 25 Kilobasen isoliert. Diese Fragmente werden in Vectoren überführt, die geeignet sind, die Transaminase aktiven Klone mit dem thermisch stabilen Expressionsprodukt, zu isolieren. Dort wo Lambda vectoren, wie nachfolgend beschrieben, ausgewählt werden, wird eine Sau 3A Restriktionsendonuclease verwendet, weil die Lambdavectoren Sau 3A-Restriktionsfragmente zur Bildung relativ zufälliger Bibliotheken akzeptieren.

Nach der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden E. coli Aminotransferase negative Wirtszellen zur mühelosen Überprüfung des Einbaus verwendet. Ein E. coli Stamm, welcher aspC⁻, tyrB⁻ und ilvE⁻ ist, d.h. keinerlei Transa minaseaktivität enthält, wurde verwendet. Die E. coli K-12 Linie DG 30, beschrieben von Gelfand et al., in J. Bacterio logy, "Escherichia coli Mutants Deficient in the Aspartate and Aromtic Amino Acid Aminotransferases", 130, Seiten 429-40 (1976), kann verwendet werden. Dieser Stamm ist erhältlich vom E. coli Genetic Stock Center, Yale Univer sity, New Haven, Connecticut. DG 30 ist auxotroph für Tyrosin, Phenylalanin und Asparaginsäure. Alternativ kann auch E. coli K-12 Stamm DG 44, auch erhältlich vom E. coli Stock Center, verwendet werden. DG 44 ist aspC⁻, tyrB⁻ und auxotroph für Asparaginsäure, Tyrosin und Phenylalanin.

Die Transaminase-negativen E. coli Stämme DG 30 und DG 44 transformieren in so geringen Raten, daß die Möglichkeit, Klone mit Transaminaseaktivität zu finden, sehr verringert wird. Seit der Phage Lambda für die Transduktion dieser Wirte mit viel höheren Raten verwendet werden kann, ist die Wahrscheinlichkeit, Transaminase-aktive Klone zu finden, durch die Verwendung von Lambda-Cloning-Vectoren stark erhöht.

In am meisten bevorzugter Weise wird eine Phagenkonstruk tion verwendet, die als Plasmid bei niedrigen Temperaturen und als lytischer Phage bei höheren Temperaturen existieren kann. Diese "Phasmid"-Verfahren werden bevorzugt zur effi zienten Transduktion und zur leichten Isolierung der identifizierten, Transaminase-Gen enthaltenden DNA durch konventionelle Plasmidgewinnungstechniken verwendet, obwohl dieses Verfahren nicht zwingend für die Ausführung der Erfindung erforderlich ist. Das "Phasmid"-Verfahren und die Herstellungsmethode für geeignete Lambdavectoren wird de tailliert von S. Elledge et al., J. Bacteriology, "Phasmid Vectors for Identification of Genes by Complementation of Escherichia coli Mutants," 162, Seiten 777-83 (1985) be schrieben.

Bevor die E. coli Transaminase-negativen Wirte zum Screenen der rekombinierten Phagen-Bibliothek verwendet werden, wird ein Wirtsstamm durch Transformieren mit einem Plasmid hergestellt, das ein Gen zur Exprimierung des temperatur empfindlichen Lambdarepressors enthält. In Anwesenheit dieses temperaturempfindlichen Lampbda-Repressors existiert der beschriebene Lambdaphage als Plasmid bei ungefähr 30°C und als lytischer Phage bei etwa 37°C. Ein zur Transformie rung von auxotrophen E. coli Stämmen geeignetes Plasmid ist das Plasmid pSE 103 mit dem cI 857 Gen für den tempera turempfindlichen Lambdarepressor. Die Erstellung dieses Plasmids wird von Elledge et al. in der oben zitierten Veröffentlichung beschrieben. Jedes Plasmid mit dem cI 857 Gen kann verwendet werden. Das einzige Erfordernis ist die Gegenwart des temperatursensitiven Lambdarepressors selbst.

Erfindungsgemäß ist es erforderlich, daß die exprimierten Transaminasekatalysatoren bei den verwendeten Arbeitstempe raturen keinen zu schnellen Abbau oder Inaktivierung unterliegen. Diese Temperaturbeständigkeit erhöht die Ar beits-Halblebenszeit des Biokatalysators substantiell bei Temperaturen im Bereich von 10 bis 42°C. Weiterhin wird das temperaturbeständige Enzym weniger empfindlich für Inakti vierungen bei Temperaturen sein, die typischerweise für die Immobilisierung genutzt werden und im Bereich bis zu 45 bis 50°C liegen.

Erfindungsgemäß wird ein Wärmeinaktivierungs-Aminosäurepro duktions-Test verwendet, um die rekombinierten Transaminase enthaltenden Klone zu screenen. Dieser Test erlaubt eine Differenzierung zwischen Transaminase-Genen, die hitzeemp findlich und denen die hitzebeständig sind. Sonifizierte Zellen werden mit einer alpha-Ketosäure und einem Amino gruppendonator (z.B. Asparaginsäure), sowohl nach als auch vor einem Hitzeschock bei Temperaturen von etwa 55°C 20 bis 30 Minuten lang versetzt. Die Fähigkeit zur enzymatischen Umsetzung der Vorstufen zu Aminosäuren nach dieser Behand lung wurde durch Bestimmung des Aminosäureproduktes, z.B. durch HPLC gemessen. Klone, welche diese Fähigkeit besaßen, enthalten das gewünschte AT sty 2 Gen.

Die für diesen Prozeß ausgewählte alpha-Ketosäure hängt von dem gewünschten Aminosäureprodukt ab. Zum Beispiel wird Phenylbrenztraubensäure zu L-Phenylalanin, alpha-Ketoisoca pronsäure zu L-Leucin, alpha-Ketoisovaleriansäure zu L-Va lin, alpha- Keto-β-methylvaleriansäure zu L-Isoleucin, Brenztraubensäure zu L-Alanin, Oxalessigsäure zu L-Aspara ginsäure, β-Hydroxy-alpha-ketobuttersäure zu L-Threonin, p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure zu L-Tyrosin, Indolbrenz traubensäure zu L-Tryptophan, usw. umgewandelt. Es ist zu ersehen, daß konventionelle Aminosäurevorstufen für diese Erfindung genutzt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß das AT sty 2 Enzym eine besonders hohe Aktivität bei der Umwandlung von Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin auf weist. Selbstverständlich können all diese Vorstufen sowohl in dem Hitzeinaktivierungs-Aminosäureproduktions-Test als auch bei der Produktion der gewünschten L-Aminosäure verwendet werden.

Sind temperaturbeständige Transaminase-positive Klone iso liert und geprüft worden, so wird sichergestellt, daß die Aktivität tatsächlich Ergebnis des rekombinierten Phasmids mit dem AT sty 2 Gen ist und nicht von einer chromosomalen Umlagerung herrührt. Die Klone werden bei ungefähr 42°C angezogen und bei dieser Temperatur wurde auch die Phagen bildung induziert. Der Phagentiter werden gemessen, um sicherzustellen, daß ausreichende Mengen anwesend sind. Als nächstes werden die Phasmidvectoren von denen man annimmt, daß sie das AT sty 2 Gen enthalten, in Plasmidform von den Klonen isoliert.

Diese isolierten Plasmide werden in Transaminase-negative E. coli Stämme unter Verwendung von Standard-Transforma tionstechniken eingeführt, wie sie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 250-51 (Cold Spring Harbor Laboratory 1982), beschrieben werden oder nach der Transduktionsmethode von Davis et al., "Advanced Bacterial Genetics" (Cold Spring Harbor 1980). Nur gene tisches Material mit dem funktionellen Transaminase-Gen würde den Defekt des Wirtsstammes beheben und die Auxotro phie beseitigen. Das heißt, nur transformierte Zellen mit dem exprimierten Transaminase-Gen sind in der Lage, auf Minimalnährböden ohne zusätzliche Aminosäuren zu wachsen. Es kann gefolgert werden, daß die Plasmide dieser Klone ein Transaminase-Gen enthalten und exprimieren, da die Auxotro phie des Wirtes behoben wird.

Nach der Identifizierung der Klone, die den Hybridphagen mit dem gewünschten temperaturbeständigen Transaminase-Gen enthalten, werden Phagen dieser Klone in einen Wirt mit dem chromosomalen cI 857 Gen überführt, um eine Kontaminierung mit der nativen Plasmid DNA, z.B. pSE 103 bei der Isolierung der rekombinierten Phasmid DNA zu vermeiden. Die transdu zierten Zellen werden bei Temperaturen, die ausreichen, um die Phagenbildung und Lysis zu induzieren (z.B. 37°C), inkubiert. Die Phagen mit dem gewünschten Gen werden dann isoliert. Dies bestätigt den extrachromosomalen Status der gewünschten Transaminase-Gene. Der isolierte Phage kann zur Erstellung einer Restriktionskarte oder wenn gewünscht, für ein Subcloning in einem Multicopy Vector verwendet werden.

Ist das genetische Material mit dem AT sty 2 Gen isoliert, so ist es wünschenswert, das Gen in ein Highcopy Plasmid zu überführen. Mehrere Kopien des Plasmids im transformierten Wirt gewährleisten vielfache Kopien des Transaminase-Gens. So kann die Transaminaseaktivität jeder Zelle um ein Vielfaches erhöht werden. An dieser Stelle mag es auch erwünscht sein, die Größe des rekombinierten DNA-Fragmentes durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen zu verringern.

Das DNA-Fragment mit dem Transaminase-Gen wird in einen Multicopy Vector subkloniert, der zur Transformation des gewünschten Wirtsstammes geeignet ist. Bevorzugt wird ein selektivierbares Plasmid verwendet, z.B. ein Plasmid mit Antibiotika-resistenten Genen, die eine biologische Selek tion und die Plasmidreproduktion ermöglichen. Wird E. coli als Wirtsmikroorganismus verwendet, so ist das Plasmid pBR 322 ein besonders geeigneter Vector, der Gene für Amipicillinresistenz (Ap^r) und Tetracyclinresistenz (Tc^r) typischerweise in 10 bis 20 Kopien enthält. Wo Anti biotika-Resistenz für die Erhaltung des Plasmids gewählt wird, wachsen nur Mikroorganismen in einem Medium mit dem geeigneten Antibiotikum, welche das Plasmid (mit seinem antibiotikarestenten Gen(n) und dem Transaminase-Gen) ent halten. Andere Antibiotika oder andere Methoden zur Plas midauswahl und Stabilisierung können ebenfalls verwendet werden.

Das wie oben beschrieben isolierte DNA-Fragment mit dem S. typhymurium AT sty 2 Transaminase-Gen, wird in das ausge wählte Plasmid durch konventionelle Methoden eingeführt. Dieses Fragment kann durch Verdauung mit geeigneten Restri ktionsenzymen aus dem isolierten rekombinierten Phasmid herausgetrennt werden. Das herausgetrennte DNA-Fragment wird dann in das gewählte Plasmid überführt. Partielle Restriktionsmuster der Plasmide, dargestellt in Überein stimmung mit den hier beschriebenen Methoden, werden in Fig. 1 und 2 gezeigt. Fig. 1 zeigt eine Restriktions enzymanalyse des Plasmids pAH 27, erstellt nach den Beispie len IV und V. Fig. 2 und 3 zeigen Restriktionsenzym analyen der Plasmide pGA 108 und pGA 115, jeweils erhalten nach den Beispielen VI und VII.

Nach der bevorzugten Ausführungsform, bei der Lambda SE 4 (siehe Beispiel I) oder eine ähnliche Konstruktion verwen det wird, ist das Sp^r Gen neben dem Transaminase-Gen lokalisiert und die Auswahl einer geeigneten Restriktions endonuklease muß so getroffen werden, daß das ausgeschnit tene DNA-Fragment beide Gene enthält. Ein Plasmid, welches das Sp^r Gen aufwärts von dem AT sty 2 Transaminase-Gen enthält, hat sich als sehr geeignet erwiesen und bildet die am meisten bevorzugte Konstruktion. Spectinomycin eignet sich sehr zur Plasmidselektion wegen seiner relativ gerin gen Kosten und seiner Stabilität. Zusätzlich kann die Expression des Transaminase-Gens durch einen Sp^r Genpromo tor verstärkt werden. Auf jeden Fall wird bei dieser Ausführungsform die Transaminaseexpression und Stabilität in unerwartetem Ausmaß gesteigert.

Zur Bestätigung, daß das rekombinierte Plasmid das er wünschte Transaminase-Gen enthält, kann das Plasmid reiso liert und in einem Transaminase-negativen Stamm, wie oben beschrieben, eingeführt werden. Nur die Mikroorganismen, welche das Plasmid mit dem Transaminase-Gen erhalten haben, werden auf Minimalmedium Kolonien bilden. Zusätzliche Bestätigung kann durch eine Anzucht erhalten werden, die für das Plasmid selbst selektiv ist. Enthält ein Plasmid z.B. Gene für die Spectinomycin-Resistenz, so bestätigt das Wachstum in Gegenwart dieses Antibiotikums die Anwesenheit des Plasmids.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird das Plasmid erhalten, wie in den Beispie len I bis IV beschrieben. Das heißt, das DNA-Fragment enthält sowohl das Gen für die temperaturbeständige S. typhimurium AT sty 2 wie auch das Spectinomycin-Resistenz- Gen. Der bevorzugte Plasmidvector ist pBR 322 und der bevorzugte Wirtsmikroorganismus E. coli. Das Ergebnis ist eine unerwartet hohe und beständige Transaminaseaktivität. Dies ist ungewöhnlich wegen des relativ großen DNA-Fragmen tes, von dem man erwartet, daß es eine geringe Anzahl von Kopien und niedrige Expressionsraten zur Folge hat. Weiter hin erwartet man, daß Plasmide dieser Größenordnung relativ instabil sind. Versucht man jedoch die Größe des DNA-Frag mentes und des Plasmids (Beispiel VI) zu reduzieren, so resultiert daraus eine verringerte Transaminaseaktivität (Beispiel VIII) und Stabilität.

Ist das AT sty 2 Gen einmal im gewünschten Plasmid lokalisiert, so wird das rekombinierte Plasmid in einen geeigneten Wirt eingebaut. E. coli Stämme sind besonders geeignete Wirte wegen des umfangreichen Wissens bezüglich ihrer Handhabung. Darüber hinaus resultiert aus dem Einbau des S. typhimurium Transaminase-Gens in E. coli wie oben beschrieben, eine ungewöhnlich und unerwartet hohe und stabile Expressionsrate. Auch ein Salmonella Stamm selbst kann als Wirt Verwendung finden, wenn es gewünscht ist.

Der erfindungsgemäße, neu geschaffene Mikroorganismus-Stamm enthält mehrere im Plasmid lokalisierte Kopien des tempera turbeständigen S. typhimurium AT sty 2 Gens und zeigt einen mehrfachen Anstieg bezüglich der Transaminaseaktivität verglichen mit natürlichen Isolaten. Die rekombinierten Mikroorganismen werden unter Bedingungen gehalten und vermehrt, die eine maximale Transaminaseaktivität der Zellen zulassen. Im allgemeinen werden konventionelle Bedingungen für das Wachstum gesunder Zellen geeignet sein. Das heißt, die Mikroorganismen sollen bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 8, vorzugsweise von 7 bis 8 kultiviert werden. Die Temperatur sollte ungefähr 20 bis 42°C, vorzugsweise etwa 37°C betragen.

Konventionelle Wachstumsmedien können bei der Präparation der rekombinanten Zellen dieser Erfindung verwendet werden. Das Medium sollte eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Salze und, wenn erwünscht, andere geringe organische oder anorganische Nährstoffe, die für das Wachstum des ausgewählten Wirtsorganismus notwendig sind, enthalten. Im allgemeinen sind folgende Richtlinien geeignet: Als Kohlenstoffquelle können fermentierbare Zucker verwendet werden. Als Stickstoffquelle sind Harn stoff, Proteinhydrolysate, Ammoniumsalze organischer Säuren (z.B. Ammoniumacetat oder Ammoniumoxalat) und/oder Ammo niumsalze anorganischer Säuren (z.B. Ammoniumsulfat, Ammo niumnitrat oder Ammoniumchlorid) zufriedenstellend. Anor ganische Elemente (z.B. Kaliumphosphat oder Magnesiumphos phat) und/oder Vitamine (z.B. Thiamin, Biotin) können hinzugefügt werden. Die Auswahl bestimmter Komponenten des Nährmediums hängt von dem ausgewählten Wirtsmikroorganismus ab.

Die nach Vermehrung geernteten Zellen, ein Teil oder ein Extrakt davon können zur biochemischen Umwandlung von Ketosäurevorstufen und Aminogruppendonatoren in die korre spondierende Aminosäure eingesetzt werden. Verwendbar ist jede Methode oder Verfahren, bei dem das Transaminaseenzym mit den Vorstufen und dem Aminogruppendonator in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel können ganze Zellen, sonifi zierte Zellen oder Enzymextrakte (roh oder gereinigt) Verwendung finden. Alternativ kann die biochemische Umset zung durch eine Fermentierung lebender, wachsender Kulturen mit den Vorstufen und den Aminogruppendonatoren im Wachs tumsmedium durchgeführt werden.

Nach einer bevorzugten Vorgehensweise werden die Zellen oder das Enzym zum Gebrauch in einem Batch oder kontinuier lichen Reaktor immobilisiert. Auf diese Weise wird die Verwendung der Transaminaseaktivität der Zellen oder Enzyme optimiert, während gleichzeitig die Handhabung erleichtert wird und die Erfordernisse bezüglich des Wachstums und der Wachstumsbedingungen entfallen. Die temperaturbeständige Transaminase dieser Erfindung ist ideal für Immobilisie rungsmethoden geeignet, die erhöhte Temperaturen verlangen. Auch nach Einwirkung höherer Temperaturen, die für die Immo bilisierungsstufe notwendig sind, bleibt die Transaminase aktivität substantiell erhalten. Die immobilisierten Zellen oder Enzyme können direkt mit der Lösung von Vorstufe und Aminodonator in Kontakt gebracht werden. Das molare Verhält nis von Aminogruppendonator und Ketosäurevorstufe, z.B. Asparaginsäure und Phenylbrenztraubensäure, sollte etwa 1 : 1 bis etwa 1,5 : 1 betragen.

Die Mikroorganismenstämme dieser Erfindung bieten deutliche Herstellungsvorteile bei der Umsetzung von alpha-Ketosäuren zu Aminosäuren. Die Transaminaseaktivität ist derart, daß die Umsetzungsrate zu Aminosäuren sehr groß ist. Dies läßt eine Verminderung der Verweildauer im Reaktionsgefäß zu. Das heißt, Schwierigkeiten, die mit dem Abbau der Vorstufen verbunden sind, können durch eine reduzierte Reaktionszeit verringert werden. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen stämme bilden eine Transaminase, die durch eine lange Halblebenszeit charakterisiert ist und deren Nutzungsdauer als Katalysator auf diese Weise stark erhöht ist. Das Ausmaß und die Stabilität der Transaminaseaktivität in diesen Zellen ist durch die hier beschriebenen Rekombina tionstechniken beträchtlich erhöht.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Die folgenden Abkürzungen wurden bei der Beschreibung der Erfindung verwendet:

Ap^r- Amipicillin resistent ATP- Adenosintriphosphat DNA- Desoxyribonukleinsäure DTT- Dithiothreitol EDTA- Ethylendiamiintetraessigsäure HPLC- Hochdruckflüssigkeitschromatographie IAA- Isoamylalkohol kb- Kilobase OD- optische Dichte ODU- optische Dichteeinheit P-5-P- Pyridoxal-5-Phosphat PEG- Polyethylenglykol UPM- Umdrehungen pro Minute SDS- Natriumdodecylsulfat Sp^r- Spectomycin resistent TCA- Trichloressigsäure Tc^r- Tetracyclin resistent Tc^s- Tetracyclin empfindlich TES- Tris-EDTA-natriumchlorid Tris- Tris(hydroxymethyl)-aminoethan

Die folgenden Medien, Puffer oder Vorratslösungen wurden zum Gebrauch in den Beispielen hergestellt. Es wurde jeweils demineralisiertes Wasser verwendet.

Minimalmedium

MgSO₄ · 7 H₂O 0,20 g/l Citratmonohydrat 2,00 g/l K₂HPO₄10,00 g/l NaNH₄HPO₄ · 4 H₂O 3,50 g/l Glucose 0,50% Succinat 0,25% Malat 0,25% Histidin 0,10 g/ml Arginin 0,10 g/ml Asparagin 0,10 g/ml Glutamin 0,10 g/ml Isoleucin 0,10 g/ml Leucin 0,10 g/ml Valin 0,10 g/ml Glutaminsäure 0,10 g/ml Alpha-Keto-glutarat 1,00 g/ml Thiamin-HCl 1,01 g/ml Agar edel (noble) (Difco) 1,50%

Die ersten vier Bestandteile werden gemischt und bei 121°C 15 Minuten lang zum Sterilisieren autoklaviert. Der Agar wurde separat autoklaviert. Die sterilisierten Komponenten werden gemischt, abgekühlt und dann die verbleibenden Bestandteile hinzugefügt.

Komplexmedium (Luria Brühe)

Bactotrypton (TM) (Difco)10,0 g/l Bacto-Hefe-Extrakt (TM) (Difco) 5,0 g/l NaCl10,0 g/l NaOH 1,5 ml/l

Das Medium wird zum Zwecke der Sterilisation bei 121°C 15 Minuten lang autoklaviert. Das Medium wurde in flüssiger Form oder als feste Platten verwendet, die durch Verfesti gen mit 1,5% Edel-Agar (Difco) hergestellt wurden.

Lysozympuffer

Tris-HCl (pH 8,0)30,0 mM Na₂EDTA50,0 mM NaCl50,0 mM Sucrose25,0% Lysozym 1,0 mg/ml

Das Lysozym wurde kurz vor Gebrauch hinzugefügt.

SDS Puffer

SDS (10%) 20,0 ml Na₂EDTA (500,0 mM (pH 8,0) 20,0 ml TES120,0 ml

TES Puffer

Tris-HCl (pH 7,5)0,020 M NaCl0,100 M Na₂EDTA (500,0 mM) (pH 8,0)0,005 M

Ligase Puffer

ATP 1,0 mM DTT20,0 mM Tris-HCl (pH 7,8)50,0 mM MgCl₂10,0 mM

Modifiziertes Lowry-Medium

Bactotrypton (TM (Difco)10,00 g/l Bacto-Hefe-Extrakt (TM) (Difco) 5,00 g/l NaCl 5,00 g/l KH₂PO₄ 0,50 g/l K₂HPO₄ 4,00 g/l MgSO₄ · 7 H₂O 0,25 g/l

Zur Sterilisation wurde das Medium bei 120°C 20 Minuten lang autoklaviert.

Transaminaselösung

Phenylbrenztraubensäure31,00 g/l Asparaginsäure28,90 g/l ZnSO₄ · 7 H₂O10,00 g/l Pyridoxal-5-phosphat 0,02 g/l

Nach Erstellung der wäßrigen Lösung wurde der pH-Wert auf 7,8 mit NaOH eingestellt.

Reagenz (Beispiel IV)

Pyridoxal-5-phosphat 2,5 mg Alpha-Ketoglutarat105,0 mg L-Phenylalanin245,0 mg Phenazinmethosulfat 3,0 mg Nitro-blue-tetrazolium 24,0 mg

50,0 ml Reagenz wurden mit den oben aufgeführten Substanzen hergestellt, zu denen unter Rühren 0,1 M KHPO₄ (eine Mischung von KH₂PO₄+K₂HPO₄ im Verhältnis, das ausreichend ist, den verlangten pH-Wert einzustellen) hinzugefügt wur den, um die Lösung auf pH 7,5 einzustellen.

Beispiel I Isolierung der Transaminase-Gene

Eine Salmonella typhimurium Gen-Bibliothek in der Form des Lambda SE 4 Hybridphagen wurde von G. Walker, Massachusetts Institute of Technology, zur Verfügung gestellt. Lambda SE 4 wurde durch Einfügen des Plasmid-Replikations-Promotors (origin of replication) und des Spectinomycin-Resistenz- Gens (Sp^r) des Low Copy Plasmids pDPT 427 in Lambda 1059 hergestellt. Dies wird von S. Elledge et al. in J. Bacteriology, "Plasmid Vectors for Identification of Genes by Complemantation of Escherichia coli Mutants," 162, 777-83 (1985) beschrieben. Diese Lambda-Konstruktion kann in der Gegenwart des temperaturempfindlichen Lambdarepressors als Plasmid existieren, d.h. im lysogenen Status bei niedrigen Temperaturen und im lytischen Status bei hohen Temperaturen.

Salmonella typhimurium DNA wurde teilweise mit der Sau 3A Restriktionsendonuklease verdaut und es wurden 12 bis 17 Kilobasen große Fragmente isoliert. Lambda SE 4 wurde mit der Bam HI Restriktrionsendonuklease verdaut. Die Salmo nella DNA Fragmente wurden an die linearen Lambda SE 4 Fragmente gebunden. Nach der in vitro Verpackung wurden die die 12 bis 17 kb große DNA Fragmente enthaltenden rekombinierten Phagen selektiert. Diese Verfahrensschritte wurden nach dem von Elledge et al. beschriebenen Verfahren vorgenommen. Der ausgewählte rekombinante Phage wurde nach Passage durch ein P 2 Lysogen in E. coli M 5158 eingebaut.

Der Lambda SE 4 rekombinante Phage wurde aus E. coli M 5158 mittels der Hochtemperatur-Induktionsmethode isoliert. Die Zellen wurden bei 30°C bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase (ODi 550 = 0,4) kultiviert und für 30 Minuten in ein Schüttelwasserbad bei 43°C gebracht. Danach fand eine weitere. Inkubation bei 37°C für ungefähr 2 Stunden statt. CHCl₃ wurde nach dieser Inkubation hinzugegeben. Der Phagentiter betrug 1,0 × 10⁴ bis 5,0 × 10⁸ Phagen/ml.

Vor dem Screening der Lambda-Phagen-Bibliothek wurden die E. coli K-12 Stämme DG 30 und DG 44, beide erhalten von E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, mit dem Plasmid pSE 103 (erhalten von G. Walker und beschrieben in Elledge et al.) transformiert, welcher das cI 857 Gen enthält, das den temperaturempfindlichen Lambdarepressor exprimiert. Zusätzlich trägt das pSE 103 Plasmid das Kanamycin-Resistenz-Gene (Km^r) zur Aufrechter haltung des Plamids. Wenn die transformierten E. coli Stämme (DG 30/pSE 103 und DG 44/pSE 103) mit dem oben erhalte nen rekombinanten Lambda-Phagen transduziert, so könnte Lambda in dem lysogenen Status bei niedrigen Temperaturen und im lytischen Status bei hohen Temperaturen gehalten werden. Die E. coli K-12 Stämme DG 30 und DG 44 werden von Gelfand et al., J. Bacteriology, "Escherichia coli Mutants Deficient in the Aspartate and Aromatic Amino Acid Amino transferases," 130, 429-40 (1977) beschrieben. Der DG 30 Stamm ist Lambda empfindlich und Aminotransferase negativ (z.B. aspC⁻, tyrB⁻ , ilvE⁻). Der DG 44 Stamm hat den Genotyp von DG 30 mit der Ausnahme, daß er ilvE⁺ ist, d.h. die relevanten Charakteristika sind die Lambdasensitivität und aspC⁻, tyrB⁻ und ilvE⁺. Das ilvE Gen codiert für die Verzweigtkettenaminosäuren Aminotransferase.

Die Transduktion und Komplementierung von E. coli DG 44 Zellen, die den temperaturempfindlichen Repressor enthal ten, mit der Lambda-Bibliothek wurde wie folgt durchge führt: DG 44/pSE 103 wurde bei 30°C in einer Luria-Brühe mit 50,0 µg/ml Kanamycin und 0,2% Maltose bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert (ODi 550=0,4). Die se Kultur wurde zentrifugiert und in einem 1/10 Volumen Luria-Brühe resuspendiert. 0,1 ml der Zellkultur wurden mit der rekombinanten Lambda SE 4 Phagen-Bibliothek, isoliert wie oben beschrieben, in einem Infektionsverhältnis von 0,5 transduziert. Nach Hinzufügen des Lambda-Phagen wurden die Kulturen bei 30°C 30 Minuten lang ohne Schütteln inkubiert, dann zweimal mit 1 ml einer 10,0 mM Tris und 10,0 mM MgSO₄ entsprechenden Lösung (pH 7,5) gewaschen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, in 0,1 ml der gleichen Lösung resuspendiert und auf einem Minimal-Nährboden, d.h. einem Medium, welches kein Phenylalanin, Tyrosin und keine Asparaginsäure enthielt, ausplattiert. Die Platten wurden bei 30°C so lange inkubiert bis Kolonien erschienen; dies geschah nach etwa 4 Tagen. Die einzigen Klone, die auf diesem Minimal-Medium wachsen können sind solche, die den transaminaserekombinierten Lambda-Phagen enthalten.

Beispiel II Auffinden der temperaturbeständigen Transaminaseaktivität

Die Klone aus Beispiel I wurden getestet, um diejenigen auszuwählen, die ein Gen enthielten, welches für das temperaturbeständige Transaminaseenzym, nämlich das AT sty 2 Enzym, codieren. Die Stämme, die getestet werden sollten, wurden in Luria-Brühe bei 30°C über Nacht angezo gen. Die Zellen wurden sonifiziert und je Probe in zwei Portionen unterteilt. Eine Portion (ungefähr 1 ml) wurde 23 Minuten lang in Eis als Kontrolle gehalten. Die andere (ungefähr 1,0 ml) wurde bei 55°C in einem Schüttelwasserbad 23 Minuten lang inkubiert. Zu 0,5 ml jeder Portion (d.h. der Kontrolle und der erhitzen Probe jedes Klons) wurden 4,5 ml einer Lösung aus 90,0 ml Asparaginsäure (0,1 Mol), 30,0 mg P-5-P und 1860,0 mg Phenylbrenztraubensäure, hinzu gefügt. Diese wurden bei 30°C inkubiert. Proben wurden zu Beginn und nach 60 Minuten entnommen und die Reaktion jeweils durch Zugabe von 40,0 µl TCA (50%-ige Vorratslö sung) pro 0,8 ml Probe gestoppt. Die Proben wurden auf Phenylalanin mittels HPLC untersucht. Zwei Klone, bezeich net mit DG 44-I und DG 44-IV zeigten deutlich eine tempera turbeständige Transaminaseaktivität, wobei nach Erwärmen ungefähr 75% der Transaminaseaktivität verglichen mit der Kontrollgruppe erhalten blieben.

Beispiel III Bestätigung des Hybrid-Phagens mit der Aminotransferaseaktivität

Zur Bestätigung, daß die Transaminaseexpression das Ergeb nis des das AT sty 2 enthaltenden Hybrid-Phagen und nicht einer chromosomalen Revertante ist, wurden die DG 44-I und DG 44-IV Klone aus Beispiel II getestet. Die Klone wurden auf einem komplexen Medium angezogen und die Phagenproduk tion wurde induziert. Von jedem Klon wurden Phagentiter von 2,0 × 10³-Phagen/ml gemessen. Die isolierten Phagen wurden in E. coli DG 44/pSE 103 und DG 30/pSE 103 transduziert, jedes mit dem temperaturempfindlichen Lambdarepressor. Die Zellen wurden auf einem Minimal-Medium (d.h. einem Medium ohne Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure) ausplattiert und bei 30°C inkubiert. Nach 5 Tagen waren rekomplementierte DG 44/pSE 103 Klone sichtbar und nach einer längeren Inkuba tionszeit erschienen auch die rekomplementierten DG 30/pSE 103 Klone. Ein Hitzeinaktivierungs-Phenylalanin-Produktionstest, wie in Beispiel II beschrieben, wurde durchgeführt und alle Klone zeigten die wärmebeständige Transaminaseaktivität.

Zur Gewinnung großer Mengen DNA mit dem AT sty 2 Gen wurde eine Plasmidpreparation in großem Maßstab nach der folgen den Verfahren durchgeführt. Das Komplex-Medium mit 50,0 µg/ml Spectinomycin wurde mit den transduzierten Zellen geimpft und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und das Pellet in 4,0 ml Lysozympuffer resus pendiert und in einen Sorvall SS-34-Rotorgefäß überführt. Die Lysozymzellsuspension wurde bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert und unter leichtem Rühren bis zur Klarheit wurden 16,0 ml SDS-Puffer hinzugefügt. 5 ml 5M NaCl wurden hinzu gegeben, eine Stunde bei -20°C inkubiert und dann im Sorval SS-34-Rotor bei 20 000 UpM 30 Minuten zentrifugiert. 5 ml 50%-iges PEG Typ 8000 wurden zum Überstand hinzugegeben, dieser für eine Stunde lang in Eis inkubiert, bei 10 000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde vorsichtig in 5,0 ml TES- Puffer gelöst, dann wurden 0,33 ml einer Lösung von 2,0 mg/ml RNase hinzugefügt. Dieser Ansatz bei 65°C 20 bis 30 Minuten lang inkubiert. Zu jedem Röhrchen wurden 9,3 g Cäsiumchlorid hinzugefügt und gemischt. Das endgültige Volumen wurde auf 100,0 ml pro Röhrchen mit TES-Puffer eingestellt. Nun wurden 100 µl einer Ethidiumbromidlösung (10,0 mg/ml) zu jedem Röhrchen gegeben und geschüttelt. Jede Probe wurde in ein selbstschließendes Ultrazentrifu genröhrchen gefüllt und ungefähr 48 Stunden lang bei 40 000 UpM und 4°C zentrifugiert. Die Plasmid-Bande wurde mit einer Spritze aufgenommen und das Ethidiumbromid durch Extraktion mit IAA entfernt. Die Proben wurden über Nacht in einer Pufferlösung aus 10,0 mM Tris-HCl und 10,0 mM EDTA (pH 8,0) mit verschiedenen Pufferwechseln dialysiert.

Zusätzlich wurden Phasmide aus DG 44-I und DG 44-IV Klonen mit der folgenden schnellen Plasmidisolierungsmethode iso liert. Die Zellen wurden über Nacht in 5 ml Luria-Brühe mit 50 µg/ml Kanamycin angezogen. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 10 000 UpM zentrifugiert und das Pellet in 1,4 ml Lysozym-Puffer resuspendiert, anschließend in zwei 0,7 ml Portionen (A und B) unterteilt und in Eppendorf-Mikrozen trifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, dann wurden zu jedem Eppen dorf-Mikrozentrifugenröhrchen 40 µl einer 10%-igen SDS-Lö sung hinzugefügt und durch Wenden gemischt. Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 60 µl einer 5M NaCl-Lösung gegeben und wieder durch Wenden des Röhrchen gemischt. Die Röhrchen wurden 15 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifu giert und der -Überstand (mit der Plasmid DNA) in saubere Röhrchen dekantiert. Vorsicht ist erforderlich, daß nichts von dem Präzipitat entfernt wird. Zum Überstand wurden 5,0 µl einer Lösung aus 2,0 mg/ml RNase hinzugefügt. Der Ansatz wurde 15 Minuten lang 37°C inkubiert, dann einmal mit dem gleichen Volumen Phenol : CHCl₃ (1 : 1) und einmal mit dem gleichen Volumen von CHCl₃ : IAA (24 : 1) extrahiert. Die Röhrchen wurden mit kaltem Ethanol gefüllt, geschüttelt und 1 Stunde bei -20°C inkubiert. Die Proben wurden 5 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Über stand weggegossen.

Die in den A- und B-Proben verbleibenden Präzipitate jedes Klons nach der zweiten Mikrozentrifugation wurden durch Hinzufügen von jeweils 100 µl Wasser Lösen des Pellets und Vereinigen in einem 200 µl Röhrchen kombiniert, zu dem 20 µl einer 3M Natriumacetatlösung (pH 5,5) und 0,5 ml kalter Ethanol wurden hinzugefügt wurden. Die Proben wurden 5 Minuten mikrozentrifugiert, der Uberstand weggegossen und das Pellet in 150 µl einer Pufferlösung mit 10,0 mM Tris-HCl und 10,0 mM EDTA (pH 8,0) resuspendiert. Jeweils 20 µl Proben wurden auf Agarosegel getrennt. DG 44/pSE 103, nach der gleichen Methode wie oben beschrieben hergestellt, wurden auf dem Agarosegel als Kontrolle verwendet. Dies war der Wirtsstamm, der ursprünglich mit dem Hybrid-Phagen transduziert wurde und der das Lambda-Phasmid nicht ent hielt. Die Kontrolle zeigte zwei Banden, die zur chromoso malen DNA und zum pSE 103 Plasmid gehörten. Für die DG 44-I und DG 44-IV-Proben erschien eine dritte Bande bei mehr als 50 kb, die wie erwartet mit dem großen Phasmid korrespon diert. Die Phagen DG 44-I und DG 44-IV wurden jeweils als Lambda SE 4 AH-I und Lambda SE 4 AH-IV bezeichnet.

Beispiel IV Subklonieren des Gens für die temperaturbeständige Transaminase in ein Multicopy Plasmid mit der Hind III Endonuklease

Das S. typhimurium AT sty 2 Gen, welches für die wärmebe ständige Transaminase codiert, wurde aus der Hybrid-Phagen Lambda SE 4 AH-IV Phagen-DNA unter Verwendung einer Hind III Endonuklease subkloniert. Eine komplette Verdauung des Hybrid-Phagens durch Hind III Endonukleae wurde durchge führt. Die Restriktionsenzymanalyse von Lambda SE 4 AH-I DNA ließ zwei Hind III Schnittstellen erkennen, die ungefähr 17 kb voneinander getrennt lagen und das Transaminasegen und das Spectinomycin-Resistenz-Gen (Sp^r) eingeschlossen (Fig. 1). Auch das Plasmid pBR 322 wurde mit Hind verdaut. Das 17 kb DNA-Fragment der Hybrid-Phagen DNA wurde mit der einzigen Hind III Schnittstelle von pBR 322 ver knüpft. Dabei wurde das Tetracyclin-Resistenz-Gen inakti viert, das Amipicillin-Resistenz-Gen (Ap^r) jedoch intakt gehalten. Deshalb wurde erwartet, daß transformierte Mikro organismen, die Hybrid-Plasmide enthalten, den Phenotyp Sp^rAp^rTc^s aufweisen. Der Einbau wurde durch Inkubation einer Mischung aus 1,0 µg Hind III dephosphoryliertet pBR 322 DNA, 1,0 µg Hind III geschnittenem Lambda SE 4 AH-IV DNA, 25,0 µl Ligasepuffer und einer Einheit T 4 DNA-Ligase (E.C. 6.5.1.1) bei 16°C über Nacht ausgeführt.

Nach der Inkubation wurde diese Mischung in kompetente E. coli DH 2 Zellen transformiert. Der DH 2 Stamm wurde vom E. coli Genetic Stock Center zur Verfügung gestellt. Der DH 2 Stamm wurden ausgewählt, weil er recA⁻ ist, was bedeutet, daß das Plasmid verhältnismäßig stabil ist und sich nicht mit dem Genom verbindet. Die Transformation wurde nach der folgenden Methode ausgeführt: DH 2-Zellen wurden in einer Luria-Brühe bei 37°C unter heftigem Schütteln bis zum ODi 550 = 0,5 angezogen, auf Eis gekühlt und 10 Minuten lang bei 7000 UpM in einem sterilen 50 ml Zentrifugengefäß zentrifugiert. Das Pellet wurde im gleichen Volumen einer 4°C kalten sterilen 0,1 M MgCl₂-Lösung resuspendiert. Diese Lösung wurde wie oben beschrieben zentrifugiert und das Pellet im halben Volumen einer 4°C kalten 0,1 M CaCl₂-Lö sung resuspendiert und 20 Minuten lang auf Eis gekühlt. Die Lösung wurde, wie oben beschrieben zentrifugiert und in einem 1/20 Volumen kalter 0,1 M CaCl₂-Lösung bei 4°C resus pendiert. 0,2 ml dieser kompetenten Zellen wurden in ein steriles Gefäß, das die Ligations-Reaktionsmischung ent hielt, wie oben beschrieben gegeben. Die DNA-Zellsuspension wurde auf Eis 30 Minuten lang inkubiert und dann 2 Minuten lang bei 42°C Wärme behandelt. Die Zellen wurde mit Luria-Brühe 10fach verdünnt und bei 37°C 2 Stunden lang zur Expression des Plasmids inkubiert.

Die Zellen wurden auf Luria-Brühe-Platten, die 50 µg/ml Spectinomycin enthalten, ausplattiert (0,1 ml Zellsuspen sion pro Platte) und bei 37°C 16 bis 24 Stunden inkubiert. Die Sp^r-Kolonien wurden jeweils auf getrennte Luria-Brü he-Platten plattiert, die 50 µg/ml Amipicillin, 20 µg/ml Tetracyclin oder 50 µg/ml Spectinomycin enthielten. 22 Sp^r- Klone zeigten den Ap^r Sp^r-Phenotyp. Alle bis auf einen waren Tc^s.

Eine Schnellisolierung der Plasmide der Ap^rSp^r-Klone wurde, wie in Beispiel III beschrieben, vorgenommen. Agarosegel elektrophorese des Produktes der Hind III-Restriktionsendo nuklease-Verdauung dieser DNA-Präparation zeigte, daß vier Klone die erwarteten DNA-Fragmentmuster enthielten: ein ungefähr 17 kb Fragment (Transaminase-Gen) und ein 4,3 kb Fragment (pBR 322). Alle vier Plasmide enthaltenden Klone wurden einem qualitativen Transaminasetest unterzogen. Die Zellen, die getestet werden sollten, wurden über Nacht in Komplexmedium mit 50 µg/ml Spectinomycin angezogen. Eine 25-45 µl große Menge der Zellsuspension wurde zusammen mit 450 µl des Reagenz (Beispiel IV) auf eine Titerschale mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Titerschale wurde dann etwa 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Blaufärbung zeigte die Transaminaseaktivität an.

Alle vier Klone zeigten beträchtlich erhöhte Transaminase aktivitätswerte (d.h. Farbintensität) im Vergleich zu dem Elternstamm E. coli DH 2. Der Elternstamm liefert eine Aktivität von etwa +1, wohingegen die übrigen Klone eine entsprechende Aktivität von etwa 5 zeigen. Diese vier Klone wurden als DH 2/pAH 5, DH 2/pAH 17, DH 2/pAH 18 und DH 2/pAH 27 bezeichnet. Einer dieser Klone, DH 2/pAH 27, wurde unwider ruflich bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Nummer ATCC 53248 hinterlegt.

Beispiel V Restriktionsanalye des Plasmids aus Beispiel IV

Drei der Plasmide aus Beispiel IV schienen bezüglich der Größe des eingebauten Stücks und seiner Orientierung gleich geartet zu sein. Dies wurde nachgewiesen durch doppelte Restriktionsenzymverdauung und die Tetracyclinempfindlich keit. Eins der beiden, nämlich pAH 27 wurde einer Restrik tionsanalyse durch vollständige Verdauung mit jeder der neun in Tabelle I angegebenen Restriktionsendonukleasen unterworfen. Die daraus resultierenden Fragmente wurden nach Größe durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die ersten sechs Endonukleasen der Tabelle I schneiden pAH 27 in der Weise, daß 3 bis 8 Fragmente gebildet werden. Diese Fragmente addieren sich in jedem Fall zu 21-22 kb für das Hybrid-Plasmid, was etwa der 17 kb Insertion und dem 4,3 kb pBR 322 entspricht.

Tabelle I

Beziehungen und Entfernungen zwischen den Schnittstellen wurden durch doppelte Endonukleaseverdauung bestimmt. Das daraus resultierende Restriktionsmuster ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel VI Subklonieren des Gens für die temperaturbeständige Transaminase in ein Multicopy Plasmid mit der Sau 3A Endonuklease

Das Gen für die temperaturbeständige Transaminase-Gen wurde auch aus dem Lambda SE 4 AH-IV Hybrid-Phagen mittels einer Sau 3A Restriktionsendonuklease subkloniert. Lambda SE 4 AH-IV bezeichnet Phagen erhalten aus dem DG 44-IV Klon der Beispiele II und III. Eine teilweise Verdauung des Hy brid-Phagens mit der Sau 3A Endonuklease brachte DNA-Frag mente im Größenbereich 4 bis 12 kb hervor. Das Plasmid pBR 322 wurde an der Bam HI Schnittstelle geöffnet und die Sau 3A-Fragmente des Hybrid-Phagen nach den in Beispiel IV beschriebenen Verfahren eingefügt. Der Einbau der Fragmente in die Bam HI Schnittstelle des pBR 322 inaktivierte das Tc^r Gen ließ aber das Ap^r Gen intakt. Von diesen Klonen erwartete man nicht, daß sie spectinomycinresistent seien, weil kleinere DNA-Fragmente mit dem Transaminasegen inser tiert wurden.

Nach der Verknüpfung wurde diese Mischung nach der Methode gemäß Beispiel IV in kompetente E. coli DG 30 Zellen transformiert (Aminotransferase-negativ), jedoch mit dem Unterschied, daß die Zellen bis zum ODi 550 = 0,25 angezogen wurden. Die Zellen wurden auf Luria-Brühe-Platten mit einem Gehalt an 50 µg/ml Ampicillin ausplattiert, dann auf gleiche Platten mit einem Gehalt an Ampicillin und Tetracy clin übertragen zum Test auf den Ap^rTc^s Phenotyp und auf Minimal Nährböden zum Test der Auxotrophieaufhebung aus plattiert.

Die Ap^r Tc^s Klone wurden einer schnellen Plasmidisolierung gemäß Beispiel III unterzogen. Agarosegelelektrophorese der Hind III Restriktionsendonuklease-Verdauungsprodukte der Plasmide von 13 Ap^rTc^s Klonen zeigte, daß zwei Klone (bezeichnet als pGA 115 und pGA 108) Hybrid-Plasmide mit jeweils 8,3 kb und 9,4 kb Insertionen enthielten. Diese Klone wurden dem quantitativen Test nach Beispiel IV unterzogen und zeigten erhöhte Aktivitätswerte von +2 bis +3. Um zu zeigen, daß die Transaminaseaktivität von den Hybrid-Plasmiden herrührt, wurden pGA 115 und pGA 108 nach der Methode gemäß Beispiel III isoliert und wieder in die DG 30 Wirtszellen (Aminotransferase-negativ) nach der Trans formationsmethode gemäß Beispiel IV eingeführt. Die Zellen wurden bis ODi 550 = 0,25 angezogen. Nach der Transformation durch die isolierten pGA 108 oder pGA 115 Plasmide waren die DG 30 Wirte von ihrer Auxotrophie befreit. Einer der Klone, DH 2/pGA 115, wurde unwiderruflich bei der American Type Culture Collectioln, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Nummer ATCC 53247 hinterlegt.

Beispiel VII Restriktionsanalyse der Plasmide gemäß Beispiel VI

Die pGA 108 und pGA 115 Plasmide gemäß Beispiel VI wurden zur Restriktionsanalyse einer kompletten Verdauung durch die in Tabelle II angegebenen Restriktionsendonukleasen unterwor fen. Die resultierenden Fragmente wurden nach Größe durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Fragmente addier ten sich in jedem Fall zu der ungefähren Größe des Plasmids und entsprachen etwa der 8,3 kb Insertion für pGA 115 oder einer 9,4 kb Insertion für pGA 108 und dem 4,3 kg pBR 322.

Tabelle II

Beziehungen und Entfernungen zwischen den Restriktions schnittstellen wurden durch weitere Fragmentierung mit doppelten Endonukleaseverdauungen bestimmt. Die daraus resultierenden Restriktionsmuster sind in den Fig. 2 und 3 wiedergegeben.

Beispiel IX Relative Anstiege der Transaminaseaktivität

Ein quantitativer Test wurde ausgeführt, um den relativen Anstieg der Transaminaseaktivität von E. coli DH 2 zu E. coli DH 2/pAH 27 und von E. coli DG 30 und DG 27 zu E. coli DG 30/pGA 108 und DG 30/pGA 115 zu messen. Der colorimetrische Eisenchloridtest für Phenylbrenztraubensäure (Methoden wie unten beschrieben) mißt die Fähigkeit des zellfreien Extraktes die folgende Reaktion zu katalysieren:

Zellfreie Extrakte jedes Stamms wurden durch Sonifizieren der Zellen und anschließendes einstündiges Zentrifugieren bei 15 000 UpM in einem SS-34-Rotor hergestellt. Eine Probe jedes zellfreien Extraktes wurde mit einer Substratlösung aus P-S-P, alpha-Keto-glutarat und L-Phenylalanin bei 37°C im Wasserbad inkubiert, wobei soweit erforderlich mit 0,25 M Kaliumphosphat verdünnt wurde. Die Proben wurden alle 10 Minuten geschüttelt (vortexed). Nach einer Stunde wurde eine 50 µl Probe entnommen, zu 5 ml Entwicklungslö sung hinzugefügt und geschüttelt. Nach 5 Minuten wurde die optische Dichte bei 640 nm abgelesen. Nach dieser Methode wurden die relativen Aktivitäten jedes Stammes aus Tabel le III bestimmt.

Tabelle III

Vergleichswerte der Transaminaseaktivitäten

Beispiel X Stabilität von pAH 27

Es wurde die Stabilität des Plasmids pAH 27 in Gegenwart und Abwesenheit von Spectinomycin als Selektionsmittel unter sucht. Zu 500 ml gebuchteten Erlenmeyer-Schüttelkolben wurden 100 ml Portionen eines modifizierten Lowry-Mediums mit und ohne 50 ppm Spectinomycin gegeben. Diese Kolben wurden mit 1,0 ml einer Zellsuspension beimpft, die nach folgender Methode hergestellt war: zwei Schrägagarplatten mit DH 2/pAH 27 (Beispiel IV), 48 Stunden lang bei 37°C angezogen, wurden mit 16 ml einer 0,9%-igen Salzlösung abgespült. Die Schüttelkolben wurden bei 37°C und 250 UpM inkubiert. Nach 24 Stunden wurden jeweils frische saubere Schüttelkolben durch Serienübertragung beimpft.

Die Serienübertragung wurde im Abstand von 24 Stunden wiederholt. Die Transaminaseaktivitäten der ganzen Zellen wurden alle 24 Stunden untersucht. Nach 5 Tage langer serieller Übertragung zeigte die Durchschnittsaktivität von Doppelansätzen, daß 99% der ursprünglichen spezifischen Phenylalaninproduktionsrate in Gegenwart von Specinomycin erhalten geblieben war, wohingegen in seiner Abwesenheit nur 42% vorhanden waren. Dies zeigt, daß das Plasmid pAH 27 durch Verwendung von 50 ppm Spectinomycin in dem Kultur medium in E. coli DH 2 stabil geblieben war.

Der colorimetrische Eisenchloridtest für das Natriumsalz der Phenylbrenztraubensäure

Prinzip: Phenylbrenztraubensäure (PPA) bildet einen blauen Komplex mit Eisenionen. Die Intensität der blauen Farbe ist proportional der Menge anwesender Phenylbrenztraubensäure.

Reagenzien:

1. Entwicklungslösung (DS) (1000 ml) - Die folgenden Kom ponenten werden gemischt und in einem Eisbad auf Raumtemperatur gebracht. Die Inhaltsstoffe werden in einen 1 Liter Meßkolben gegeben und mit deminerali siertem Wasser aufgefüllt. Inhaltstoffe: 0,5 g FeCl₃ × 6 Hi 2O, 20,0 ml Eisessig, 600,0 ml Dimethylsulf oxid, 200,0 ml demineralisiertes Wasser.
2. Natriumpyruvat-Standardlösung (10 g/l) - Zu 50 ml 0,1M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 34°C werden 500,0 mg Na-PPA · H₂O hinzugegeben. Es wird bis zur klaren Lösung gerührt. Die Lösung wird in einen 50,0 ml Meßkolben eingebracht und mit Tris/HCl-Puffer aufgefüllt. Die Lösung soll kühl gelagert werden. Zur Erstellung des 0,1M Tris/HCl-Puffers werden 900,0 demineralisiertes Wasser zu 12,11 g Tris gegeben, der pH-Wert wird mit HCl auf 8,0 eingestellt, die Lösung in einen Meßkolben gegeben und mit demineralisiertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Eichkurve:

Na-PPA-Standardlösung und 5/µl der Entwicklungslösung wer den in eine Photometerglasküvette gefüllt und geschüttelt. Man läßt die Probe 5 Minuten lang stehen (Startzeit mit der Zugabe der Entwicklungslösung zum ersten Gefäß). Die optische Dichte wird bei 640 nm abgelesen und die Na-PPA · H₂O Standard-Eichkurve erstellt (vertikale Achse Absorption, horizontale Achse mg Na-PPA · H₂O/ml DS.).

Claims

1. Wirts-Mikroorganismenstamm, transformiert mit einem rekombinanten Plasmid, welches ein für eine temperatur beständige Transaminase kodierendes Gen aus Salmonella typhimurium enthält.

2. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsprodukt des Gens die stereospezifische Transaminierung einer alpha-Ketosäure und eines Amino gruppendonators in die korrespondierende L-Aminosäure katalysiert.

3. Stamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die alpha-Ketosäure Phenylbrenztraubensäure und die Amino säure L-Phenylalanin sind.

4. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminase AT sty 2 ist.

5. Stamm nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Pro duktion großer Mengen der Transaminase.

6. Stamm nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine gegenüber dem nicht-transformierten Wirts-Mikroorga nismenstamm um das etwa 30fache gesteigerte Transami naseaktivität.

7. Gen-Expressionsprodukt des transformierten Stammes gemäß Anspruch 1, charakterisiert durch eine lange Halblebenszeit.

8. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Stamm von Escherichia coli oder Salmonella typhimurium ist.

9. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des DNA-Fragments bis zu 25 kb beträgt.

10. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid ein Multicopy Plasmid ist.

11. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid ein oder mehrere Gene enthält, die dem Wirt Resistenz gegenüber einem oder mehreren Antibiotika verleihen.

12. Stamm nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch Resistenz gegenüber Spectinomycin.

13. Stamm nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid ein Spectinomycin-Resistenz-Gen trägt, das oberhalb des für die temperaturbeständige Transaminase kodierenden Gens lokalisiert ist.

14. Stamm nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid von dem Plasmid pBR 322 abgeleitet ist.

15. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid durch eines der in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellten Restriktionsmuster charakteri siert ist.

16. Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er der Stamm ATCC 53247 oder ATCC 53248 ist.

17. Rekombinantes Plasmid enthaltend ein Salmonella typhi murium Transaminase-Gen, dessen Genprodukt durch ther mische Stabilität und durch die Fähigkeit charakteri siert ist, die Auxotrophie eines Wirts-Mikroorganismus für Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure aufzuhe ben.

18. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 17, dadurch ge kennzeichnet, daß das Genprodukt das Enzym AT sty 2 ist.

19. Plasmid, gekennzeichnet durch ein für die Salmonella typhimuriuma Transaminase kodierendes Gen, hergestellt durch

a) Isolieren von Fragmenten des Salmonella typhimu rium Genoms durch Verdauen mit Restriktionsendonuklease,
b) Einbringen der Fragmente in Lambda-Phagen,
c) Transformieren eines Transminase-negativen Stamms von E. coli mit einem Plasmid, welches ein den temperatursensitiven Lambda-Repressor exprimierendes Gen enthält,
d) Transduzieren des transformierten E. coli Stammes mit einem gemäß Stufe b) hergestellten Hybrid- Phagen,
e) Identifizieren der den Hybrid-Phagen mit dem Gen für die temperaturbeständige Transaminase enthal tenden Klone,
f) Isolieren eines DNA-Fragments, das das Transami nase-Gen enthält und
g) Einführen des DNA-Fragments in ein Plasmid.

20. Plasmid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsprodukt des Gens temperaturstabil ist.

21. Plasmid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsprodukt des Gens das Enzym AT sty 2 ist.

22. Plasmid nach Anpruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Multicopy Plasmid ist.

23. Wirts-Mikroorganismenstamm, gekennzeichnet durch die Fähigkeit zum Produzieren eines Salmonella typhimurium Transaminaseenzyms, hergestellt durch Transformieren eines Wirts-Mikroorganismusstammes mit dem Plasmid gemäß Anspruch 19.

24. Verfahren zur Herstellung einer temperaturbeständigen Transaminase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen transformierten Wirts-Mikroorganismenstamm kultiviert, der ein oder mehrere rekombinante Plasmide enthält, die für temperaturbeständige Salmonella typhimurium Transaminase kodierende DNA aufweisen.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminase AT sty 2 ist.

26. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen transformierten Wirts-Mikroorganismenstamm auswählt, der ein oder mehrere Plasmide enthält, die ein Gen für temperaturbeständige Salmonella typhimurium Transaminase aufweisen und
b) den Wirts-Mikroorganismus oder einen Teil oder ein Extrakt desselben mit einer alpha-Ketosäure und einem Aminogruppendonator in Kontakt bringt, um die korrespondierende L-Aminosäure zu erhalten.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsprodukt des Gens das Enzym AT sty 2 ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man ganze Zellen des ausgewählten Stammes, oder einen Teil oder einen Extrakt desselben immobilisiert.

29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe b) gebildete L-Aminosäure iso liert.

30. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als alpha-Ketosäure Phenylbrenztraubensäure und als L-Aminosäure L-Phenylalanin verwendet.