Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die
nützlich in der Behandlung und Diagnose von Autoimmunkrankheiten sind, und
insbesondere solche Verfahren und Zusammensetzungen, die durch Gentechnik
erzeugt werden.
Stand der Technik
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In normalen Menschen und Tieren wird ein Individuum auf Exposition an eine
Fremdsubstanz mit der Herstellung von spezifischen Antikörpern oder mit der
Entwicklung zellvermittelter Immunität gegen die Fremdsubstanz antworten.
Individuen sind im allgemeinen tolerant gegenüber Substanzen, die
normalerweise einen Teil ihrer selbst bilden, und werden daher als selbst-tolerant
beschrieben. Die Entwicklung einer immunologischen Antwort gegenüber dem
Selbst wird als Autoimmunität bezeichnet und ist das Ergebnis eines gewissen
Zusammenbruchs der Selbst-Toleranz.
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Verschiedene Theorien sind vorgeschlagen worden, um die Entwicklung von
Autoimmunität zu erklären. Zum Beispiel denkt man, daß Viren eine wichtige
Rolle in der Pathogenese von Autoimmunität spielen, wie in mehreren
Tiermodellen gezeigt wurde. Von der Expression viraler Antigene auf der
Oberfläche der Wirtszellen denkt man, daß sie Autoantikörper gegen
Zellmembranantigene ebenso wie gegen die viralen Antigene hervorruft. Es ist ebenfalls
vorgeschlagen worden, daß Autoimmunität eine Störung ist, welche durch
abnorme immunologische Regulation, insbesondere eine Veränderung in der T-
Zell-Aktivität, verursacht wird. Eine Verringerung der Suppressor-T-Zell-Aktivität
oder eine Steigerung der Helfer-T-Zell-Aktivität würde zu einer überschüssigen
Produktion geringer Spiegel an Autoantikörpern führen. Diese Theorie findet
Unterstützung durch das Vorkommen von Autoantikörpern in manchen normalen
Personen ohne Anzeichen von Autoimmunkrankheit, und in verschiedenen
Tiermodellen. Auch eine Genregulation scheint in wenigstens einigen
Autoimmunkrankheiten vorzuliegen, da man bei gewissen Mausstämmen gezeigt
hat, daß sie eine dem systemischen Lupus erythematosus (SLE) ähnliche
Autoimmunkrankheit aufweisen. Eine hohe Korrelation von SLE wird auch in
eineugen Zwilligen angetroffen. Darüber hinaus ist eine Assoziation von
Autoimmunkrankheit mit im HLA-D-Lokus gelegenen Genen bei adulter
rheumatoider Arthritis und bei Multipler Sklerose bemerkt worden.
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Systemischer Lupus erythematosus (SLE) ist eine ernste Autoimmunkrankheit,
welche das Collagen der Bindegewebe des menschlichen Körpers betrifft. Zumal
SLE eines oder mehrere einer großen Anzahl verschiedener Gewebe oder
Organe des Körpers, wie Blutgefäße, Herz, Nieren, Haut, seröse Membranen
usw., betreffen kann, ist die klinische Diagnose von SLE oft schwierig, da die
Symptome einer Anzahl von anderen Krankheiten gleichen können, wie
rheumatoide Arthritis, Hautkrebs, Serumkrankheit, rheumatisches Fieber,
multiples Myelom und Siögren-Syndrom.
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Es ist wichtig, in der Lage zu sein, SLE von anderen Krankheiten zu
unterschieden, wegen der hohen Wahrscheinlichkeit von Nieren-,
Zentralnervensystem- und Gefäßschäden aufgrund der Krankheit. Zum Beispiel liegt
sehr häufig Lupus nephritis bei der Krankheit vor und ist eines der schwersten
Merkmale von SLE. Nephritis ist eine häufige Todesursache bei SLE-Patienten,
und es wäre äußerst vorteilhaft, in der Lage zu sein, SLE früh genug
nachzuweisen, um ernsthaften Nierenschaden zu verhindern oder abzumildern.
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Es wurde gezeigt, daß Seren aus Patienten mit Bindegewebsstörungen
Antikörper gegen viele nukleäre Bestandteile enthalten. Zum Beispiel wurde
festgestellt, daß im Kreislauf befindliche Antikörper, die mit nativer DNA
(Desoxyribonukleinsäure) reagieren, hochspezifisch für Patienten sind, welche
unter systemischem Lupus erythematosus leiden. Das Erscheinen und die
Verschlimmerung der Nephritis, welche SLE begleitet, scheint mit der Bildung und
Ablagerung von Antikörper/DNA- und anderen Immunkomplexen in den Nieren
und insbesondere den Nierenglomeruli in Zusammenhang zu stehen. Obwohl die
genauen Gründe für die Herstellung dieser Antikörper und die Gründe für ihre
besondere Spezifität für SLE bislang unbekannt sind, sind der Nachweis und die
Messung dieser Autoantikörper zunehmend wichtig bei der klinischen Diagnose
und Evaluierung dieser Krankheit geworden.
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Vor kurzem ist ein genaues Verfahren zur Messung verschiedener kleiner
Mengen von Anti-DNA-Antikörper unter Verwendung von ¹&sup4;C-markierter DNA
entwickelt worden; siehe T. Pincus et al., "Measurement of Serum DNA-Binding
Activity In Systemic Lupus Erythematosus", New England Journal of Medicine,
281 701-705 (1969). Dieses Verfahren scheint der definitivste Test für SLE zu
sein, der zur Zeit verfügbar ist. Es wurde berichtet, daß er in 75 Prozent der
untersuchten SLE-Patienten positiv war, wohingegen andere führende Tests bei
nur etwa 25-64 Prozent der SLE-Fälle positiv waren. Darüber hinaus hat dieser
Anti-DNA-Antikörper-Test eine größere Spezifität für SLE als andere angewandte
Diagnosetests, wie Immunodiffusion, Komplement-Fixierung und Präzipitation,
aufgewiesen.
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Allerdings ist dieser Test ein Test auf Antikörper, welche mit DNA reagieren,
obwohl DNA nicht das authentische Antigen sein muß. Weiterhin ist dieses
Verfahren nicht auf Autoimmunkrankheiten anwendbar, bei denen das Antigen ein
Protein ist. Proteinantigene sind mit den meisten Formen von SLE als auch
anderen Typen von Autoimmunkrankheiten assoziiert. Solche Proteinantigene
sind in diagnostischen und Behandlungsverfahren als ein Resultat der Fähigkeit,
spezifisch mit Autoantikörpern zu reagieren, welche mit einer Autoimmunkrankheit
assoziiert sind, nützlich. Allerdings sind die Isolation und Reinigung dieser
Antigene bislang aufgrund der Knappheit und Instabilität das antigenen Materials
und aufgrund der Komplexität der Separationstechniken nicht fruchtbar gewesen.
Folglich wird ein Verfahren zur Herstellung von Proteinantigenen, welche mit
einem Autoantikörper, der mit einer Autoimmunkrankheit in einem Wirt assoziiert
ist, reagieren können, immer noch benötigt.
Beschreibung der Erfindung
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Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines
Proteinantigens zur Verfügung zu stellen, das mit einem Autoantikörper reagieren kann,
der mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert ist.
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Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das fähig zur
Herstellung derartiger Antigene in großen Mengen und ohne das Erfordernis der
Spende bzw. Abnahme großer Materialmengen aus einem Wirt ist.
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Diese und andere Ziele der Erfindung wurden, wie hier nachstehend leichter
offenbar werden wird, durch Bereitstellen eines Verfahrens zur Herstellung eines
Proteinantigens, das mit einem Autoantikörper reagieren kann, der mit einer
Autoimmunkrankheit in einem Wirt assoziiert ist, erreicht, welches das Einführen
genetischer Information aus einer kreuzreaktiven Donor-Genbibliothek in mehrere
Empfängerzellen, wodurch transformierte Zellen erzeugt werden; das Auswählen
einer Zelle, welche das Antigen exprimiert, durch Nachweis einer
Bindungsreaktion zwischen dem aus dem Wirt erhaltenen Autoantikörper und
einem Proteinantigen, das durch eine Erzeugerzelle aus den transformierten
Zellen exprimiert wird, welche ein für das Proteinantigen codierendes Gen enthält;
Kultivieren der Zelle, welche das Antigen exprimiert, in einem Kulturmedium; und
Isolieren des Proteinantigens aus dem Kulturmedium umfaßt.
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Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, rekombinante DNA-Moleküle, die nützlich
bei der Ausübung des Verfahrens der Erfindung sind, als auch Verfahren zur
Verwendung der Proteinantigene, die nun erstmalig in großen Mengen verfügbar
sind, für die Diagnose und Behandlung von Autoimmunkrankheiten zur Verfügung
zu stellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Ein vollständigere Einschätzung der Erfindung und vieler der begleitenden
Vorteile davon wird ohne weiteres unter Bezug auf die nachstehende ausführliche
Beschreibung erhalten werden, wobei diese im Zusammenhang mit den
begleitenden Zeichnungen zu betrachten ist, wobei:
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die FIGUR 1(a) eine Reihe von Photographien von Kulturmedien ist, welche die
Isolierung und Identifizierung von La-cDNA-Klonen durch immunologisches
Screening von rekombinanten λgt11-Phagenplaques mit Lupus-Seren der La-
Spezifität zeigen;
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die FIGUR 1(b) eine Reihe von Photographien ist, welche das immunologische
Screenen von λgt11-La-Klonen mit Lupus-Seren von verschiedenen Spezifitäten
zeigen;
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die FIGUR 2 eine Reihe von Photographien ist, die einen "Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay" (ELISA) unter Verwendung des an Nitrozellulose
gebundenen exprimierten La-Antigens, welches mit Seren aus 18 Patienten mit
Autoimmunkrankheiten und 2 normalen Seren reagieren gelassen wurde, zeigen;
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die FIGUR 3 eine Restriktionskarte der 1,5 kb großen La-Protein-cDNA zeigt;
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die FIGUR 4 eine photographische Wiedergabe einer Reihe von Acrylamid-
Gelelektrophoresen ist, wobei die in vitro-Translation von hybridselektierter HeLa-
Zellen-mRNA, unter Verwendung von cDNA für das La-Protein gezeigt wird;
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die FIGUR 5 eine photographische Wiedergabe einer teilweisen Peptidkartierung
des La-Proteins ist, welche in vivo radioaktiv markiertes HeLa-Zellen-La-Protein
zeigt.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung enstand teilweise mit der Feststellung, daß mehrere
cDNA-Klone, erhalten aus einer humanen Leber-Expressionsbibliothek, durch
Autoantikörper erkannt wurden, die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten
assoziiert sind. Vor der vorliegenden Erfindung war es nicht bekannt, daß mit
Autoimmunantikörpern reaktive Peptide auf diese Weise hergestellt werden
können. Wenn ein Arzt oder Forschungstreibender ein Antigen aus einem
bestimmten Patienten oder einem anderen betroffenen Individuum wollte, war es
darüber hinaus notwendig, das Antigen aus dieser Quelle zu isolieren. Derartige
Antigene waren im allgemeinen nicht frei in Lösung und waren in jedem Fall in nur
winzigen Mengen verfügbar, was diese Identifikation, Analyse und Anwendung
praktisch unmöglich machte, zumal die Herstellung großer Mengen an Antigen
große Mengen an Material aus dem betroffenen Menschen oder Tier, zum
Schaden dieses Individuums, erforderte.
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Da die Quelle, welche die ursprüngliche Boten-DNA lieferte, aus der die CDNA-
Klone im Laboratorium der Erfinder hergestellt wurden, nicht die gleiche war, wie
die Quelle der Autoantikörper, wurde festgestellt, daß Proteinantigene, welche mit
Autoantikörpern, die mit einer Autoimmunkrankheit zusammenhängen, reagieren
können, welche früher nicht in großen Mengen erhältlich waren, hergestellt
werden könnten, wobei nicht mehr als eine Serumprobe aus einem Wirt mit einer
Autoimmunkrankheit erforderlich ist, und zwar indem das Serum oder daraus
abgeleitete Antikörper mit einer cDNA-Bibliothek aus einer unterschiedlichen
Quelle reagieren gelassen wird/werden. Folglich macht die vorliegende Erfindung
zum ersten Mal einen effektiven Weg zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten
in einem Wirt auf eine für diesen Wirt spezifische Weise verfügbar.
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Mit "Wirt" ist jeglicher Mensch oder jegliches Tier gemeint, welcher/welches an
einer Autoimmunkrankheit leidet. Obwohl die Erfindung zuerst an einem
menschlichen Wirt aufgezeigt wurde und es erwartet wird, daß menschliche Wirte
ein Gebiet von Interesse bleiben werden, kann die vorliegende Erfindung auch im
Gebiet der Verterinärmedizin angewandt werden; beispielsweise bei Pferden,
Rindern, Schafen und Geflügel (z. B. Hühner, Enten und Truthähne), Primaten,
Hunden, Katzen, Schweinen, Ziegen (insbesondere zur Behandlung von Ziegen-
Arthritis) und beim Nerz (insbesondere zur Behandlung der Aleuten-Nerz-
Krankheit).
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Ein bei der Ausübung der Erfindung verwendetes Reagenz ist Antiserum (oder ein
gereinigter Antikörper) aus dem Wirtsserum. Eine Serum- oder Plasmaprobe wird
aus einem Wirt, typischerweise durch Venen-Punktierung, erhalten, und rote
Blutzellen und Gerinnsel werden entfernt. Antikörper werden dann mittels
jedweder geeigneten Technik von anderen Proteinen getrennt. Die antigene
Reaktivität des Wirtes wird durch Immunopräzipitation von radioaktiv markierten
Wirtszellextrakten oder durch Immunoblotting von unmarkierten Wirtszellextrakten
ermittelt. In beiden Fällen werden die reaktiven Antigene durch
Molekulargewichts-Fraktionierung (Acrylamidgelelektrophorese) und durch
Bindung von Immunkomplexen an Protein A aus Staphylococcus aureus, wie
beschrieben in Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (1979),
und Francoeur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6772-6776 (1982),
charakterisiert, obwohl viele andere Verfahren zur Ausführung dieser Reaktionen
gleicherweise geeignet sind.
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Ein anderes für die Ausübung der vorliegenden Erfindung notwendiges Reagenz
ist eine Genbibliothek von einer Donorspezies, die ausreichend mit dem Wirt
verwandt ist, so daß ein kreuzreaktives Proteinantigen hergestellt wird. Wie in
dieser Beschreibung verwendet, bedeutet "Genbibliothek" eine Sammlung von
Vektoren mit operational darin inserierten oder daran angefügten DNA-
Fragmenten aus einer Zelle oder Zellen der Donorspezies. Da Wirt und Donor,
wie in dieser Beschreibung beschrieben, eukaryontische Organismen sind,
werden komplementär-DNA(cDNA)-Bibliotheken besonders - obwohl nicht
notwendigerweise - bevorzugt, zumal antigene Determinanten auf Proteinen
vorhanden sein können, welche von DNA-Segmenten hergestellt werden, die
sowohl Introns als auch funktionelle Gensegmente enthalten, wenn diese DNA-
Segmente als Peptide in einzelligen Empfänger-Organismen exprimiert werden.
Allerdings wird es sehr wohl erkannt, daß aus Boten-DNA hergestellte cDNA,
welche somit keine Introns besitzt, die normalerweise in eukaryontischen Zellen
vorhanden sind, eine höhere Erfolgsrate bei der Expression von Proteinen
aufweist, wenn sie in prokaryontische Empfängerzellen eingeführt worden ist, und
folglich wird die Verwendung einer cDNA-Bibliothek bevorzugt.
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Vom Fachmann wird es, mit Unterstützung der in dieser Beschreibung
dargestellten Offenbarung, erkannt werden, daß die Donorspezies nicht die
gleiche wie die Wirtsspezies sein muß. Es ist aber erforderlich, daß die
Donorspezies in der Lage zur Expression eines Proteins mit einer antigenen
Stelle (Determinante) ist, die kreuzreaktiv mit dem Autoantikörper des Wirts ist.
Die Auswahl einer Donorspezies kann ohne weiteres durch radioaktives
Markieren von kultivierten Zellen aus einer vorgeschlagenen Donorspezies (zum
Beispiel mit ³&sup5;S-Methionin), Herstellen eines Rohzellextraktes aus den
kultivierten Zellen und Immunopräzipitieren des Zellextraktes mit aus dem Wirt
erhaltenem Autoantikörper zusammen mit Protein A aus Stadhvlococcus aureus
bewerkstelligt werden. Wenn Radioaktivität gefällt wird, ist ein Antigen in dem
Donorzellextrakt vorhanden, das mit dem aus dem Wirt erhaltenen Autoantikörper
reagieren kann, und die Genbibliothek aus diesem Donor kann in dem Verfahren
der Erfindung verwendet werden. Alternativ dazu kann die Donorspezies oder ein
spezifisches Gewebe aus dem Donor extrahiert werden, und die extrahierten
Proteine können in einer Matrix fraktioniert werden. Die aufgetrennten Proteine
werden durch Überführen auf eine Membran immobilisiert und mit dem
Autoantikörper aus dem Wirt zur Reaktion gebracht. Wenn Protein A aus
Staphylococcus aureus an den Filter bindet, kann eine entsprechende
Genbibliothek von dem Donorgewebe in dem Verfahren der Erfindung verwendet
werden. Um den Prozentsatz von Erzeugerzellen (Zellen, die ein geeignetes
Proteinantigen herstellen) in einer gegebenen Transformation zu steigern, wird es
nichtsdestoweniger bevorzugt, daß der Donor und der Wirt aus derselben
Gattung, vorzugsweise in derselben Art, sind, obwohl die Verwendung eines
Säugerdonors mit einem Säugerwirt ebenfalls geeignet ist.
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Mit "kreuzreaktiv" ist in dieser Anmeldung gemeint, daß ein Autoantikörper des
Wirtes mit einem von dem Donor hergestellten Proteinantigen reagiert. Dieses
Donor-Proteinantigen muß nicht identisch sein mit dem im Wirt vorhandenen
normalen Proteinantigen, welches die antigene Determinante für den
Autoantikörper, der mit der Autoimmunkrankheit des Wirtes assoziiert ist,
bereitstellt. Die Kreuzreaktivität ist durch das Vermögen des in Frage stehenden
Antigens, mit dem Autoantikörper zu reagieren, definiert. Wenn die
Proteinantigene identisch sind, wird natürlich Kreuzreaktivität vorliegen. Es ist
aber auch möglich, daß das kreuzreaktive Antigen insgesamt oder teilweise eine
von derjenigen des Wirts-Antigens unterschiedliche biochemische
Zusammensetzung umfaßt.
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Innerhalb der rheumatischen Krankheiten, und insbesondere in Hinsicht auf
systemischen Lupus erythematosus, gibt es unterschiedliche Klassen von klinisch
definierten Autoantikörpern, die als hauptsächlich und nebensächlich bezeichnet
werden können. Die hauptsächliche Klasse besteht aus vier herkömmlichen
antigenen Protein-Spezifitäten, die als La, Ro, Sm und RNP bekannt sind. Obwohl
die meisten humanen Wirte Mischungen dieser Spezifitäten enthalten, können
unter Verwendung der obenstehend beschriebenen Verfahren der
Immunopräzipitation und des Immunoblottings viele Wirte identifiziert werden, die
eine einzigartige Einzel-Klasse von reaktivem La-, Ro-, Sm. oder RNP-
Autoantikörper aufweisen. Deshalb können bei der Praxis dieser Technik
Autoantikörper aus ausgewählten Wirten mit einer einzelnen antigenen Spezifität
verwendet werden, um genetische Rekombinanten aus Donor-Bibliotheken zu
erhalten, welche normalerweise mit jedem Wirt derselben herkömmlichen
Spezifität oder Klasse reaktiv sind. Bei SLE zeigen mehr als die Hälfte aller
Patienten Autoantikörper, die mit einer von diesen vier hauptsächlichen
Spezifitäten oder Klassen reagieren können. Die Verfahren, wie hierin
beschrieben, werden dem erfahrenen Fachmann ermöglichen, gereinigte
Antigene jeder Klasse als allgemeine diagnostische oder therapeutische
Reagenzien für andere Individuen, die Autoantikörper derselben Spezifität oder
Klasse enthalten, herzustellen.
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Der Ausdruck "genetische Information" betrifft im allgemeinen DNA, die für das
gesamte oder einen Teil des Proteinantigens codiert. Jedoch umfaßt dieser
Ausdruck auch RNA bei Verwendung mit einem RNA-Virus oder einem anderen
auf RNA basierenden Vektor.
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Eine Zelle, die für das Proteinantigen codierende genetische Information
empfangen hat, und welche das Proteinantigen exprimiert, ob intrazellulär
zurückgehalten oder in das Kulturmedium abgegeben, wird als "Erzeugerzelle"
bezeichnet.
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Der Begriff "Vektor" ist gut verstanden und ist synonym mit dem häufig
verwendeten Begriff "Klonierungsvehikel". Ein Vektor ist nicht-chromosomale
doppeisträngige DNA, welche ein intaktes Replikon umfaßt, so daß der Vektor
repliziert wird, wenn er innerhalb eines einzelligen Organismus, zum Beispiel
durch ein Transformationsverfahren, eingebracht wurde.
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Ein Material ist "gereinigt", wenn es keine anderen Bestandteile enthält, welche
die gesuchte Reaktivität oder Eigenschaft stören würden und welche in dem
Material, wie es natürlich gebildet wird, vorhanden sein würden. Weiter bevorzugt
enthält gereinigtes Material mindestens 95 Gew.-%, noch stärker bevorzugt 99 %,
und am stärksten bevorzugt 99,8 %, eines einzigen Materials. Wasser wird beim
Messen der Reinheit nicht mitgezählt.
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Die Fortschritte in der Biochemie während der letzten Jahre haben zur
Konstruktion von "rekombinanten" Vektoren geführt, in denen, zum Beispiel,
Plasmide dazu gebracht werden, exogene DNA zu enthalten. In besonderen
Fällen kann der rekombinante Vektor heterologe DNA beinhalten, womit DNA
gemeint ist, welche für eine Polypeptid codiert, das gewöhnlicherweise von dem
für Transformation durch den rekombinanten Vektor empfänglichen Organismus
nicht hergestellt wird. Die Herstellung rekombinanter DNA-Vektoren im Verfahren
der Erzeugung einer Genbibliothek ist gut verstanden und muß nicht ausführlich
beschrieben werden. Jedoch ist zur Bezugnahme eine kurze Beschreibung dieses
Verfahrens hier eingeschloßen.
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Zum Beispiel kann ein Plasmidvektor gespalten werden, um lineare DNA mit
ligierbaren Enden bereitzustellen. Diese Enden werden an exogene DNA mit
komplementären gleichartigen ligierbaren Enden gebunden, um ein biologisch
funktionelles rekombinantes DNA-Molekül mit einem intakten Replikon und einer
gewünschten pHänotypischen Eigenschaft bereitzustellen. Eine Vielfalt von
Techniken ist für die DNA-Rekombination verfügbar, wobei
aneinandergrenzende Enden von separaten DNA-Fragmenten maßgeschneidert werden, um
die Ligation zu vereinfachen. Ligation bezieht sich auf die Bildung von
Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten Nukleotiden, am häufigsten
durch die Wirkung des Enzyms T&sub4;-DNA-Ligase. Somit können glatte Enden direkt
ligiert werden. Alternativerweise können Fragmente mit Einzelsträngen an ihren
aneinander-grenzenden Enden, die an komplementäre Einzeistränge über
Wasserstoffbrücken gebunden werden, ligiert werden. Derartige Einzelstränge,
bezeichnet als kohäsive Enden, können durch das Anfügen von Nukleotiden an
glatte Enden unter Verwendung von terminaler Transferase gebildet werden.
Jedoch werden am häufigsten Restriktionsendonukleasen verwendet, um
kohäsive Enden zu erzeugen. Diese Enzyme spalten Phosphodiesterbindungen in
und um einzigartige Sequenzen von Nukleotiden von etwa 4-6 Basenpaaren
Länge. Viele Restriktionsendonukleasen und ihre Erkennungsstellen sind
bekannt, wobei die sogenannte Eco RI-Endonuklease die am weitesten bekannte
ist. Typischerweise wird ein Plasmid oder ein anderes Klonierungsvehikel
gespalten, wobei Enden übrigbleiben, die jeweils die Hälfte der
Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle umfassen, und ein mit derselben
Restriktionsendonuklease erhaltenes Spaltungsprodukt von exogener DNA mit
komplementären Enden in den gespaltenen Vektor eingefügt wird. Viele
Variationen dieser Techniken sind dem Fachmann bekannt und können bei der
Ausübung der vorliegenden Erfindung angewandt werden.
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Die bei der Herstellung der Genbibliothek der vorliegenden Erfindung verwendete
exogene, d.h. Donor-, DNA wird aus geeigneten Zellen eines wie obenstehend
beschrieben identifizierten Donors erhalten. Wenn eine cDNA-Donor-
Genbibliothek erzeugt wird, wird es bevorzugt, Zellen zu verwenden, die aus
einem Organ des mDNA-Donors erhalten wurden, welches dasselbe ist, wie das
Organ, das von der Autoimmunkrankheit in dem Wirt angegriffen wird. Wenn zum
Beispiel eine Autoimmunkrankheit die Leber eines Wirtes angreift, werden
Leberzellen aus dem Donor bevorzugt, da Zellen anderer Organe mit höherer
Wahrscheinlichkeit Peptide exprimieren, die nicht mit dem Autoantikörper
reagieren können, gegen welchen ein Schutz gewünscht wird. Wenn cDNA-
Fragmente hergestellt werden, wird Boten-DNA mittels einer beliebigen der
verschiedenen Techniken, die für diesen Zweck vorhanden sind, aus den
Donorzellen erhalten.
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Zum Beispiel kann das folgende Verfahren verwendet werden, um Boten-RNA
aus jeglicher Säugergewebe- oder Zellkultur, die in Einzelzellen zerteilt werden
kann, zu isolieren. Eine ausführlichere Beschreibung dieser Technik ist
angegeben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982, Seiten 191-199, was
hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Zellen werden aus dem
Kulturmedium abgetrennt und in Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen.
Die Zellen werden dann zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und in
einem Lysepuffer, enthaltend etwa 1000 Units/ml RNasin oder 10 mN Vanadyl-
Ribonucleosid-Komplexe, resuspendiert. Nach Mischen, Aufbewahren und
Zentrifugation auf einem Gradienten wird die cytoplasmatische Schicht gewonnen
und zu einem Puffer mit einem Denaturierungsmittel gegeben. Dann wird eine
Proteinase zugegeben, um Protein zu zerstören. Die Proteine werden durch
einmaliges Extrahieren mit Phenol/Chloroform entfernt. Die wäßrige Phase wird
gewonnen und aufbewahrt, nachdem Ethanol zugegeben worden ist. Die
aufbewahrte Lösung wird danach zentrifugiert, um ein Pellet, das Nukleinsäuren
enthält, zu erhalten. Die Nukleinsäuren werden erneut in einem kleinen Volumen
an Puffer, enthaltend RNasin oder Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe, gelöst. Eine
DNase wird zugesetzt, um DNA zu zerstören. Nach Inkubation wird das
resultierende Material einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert. Eine Lösung von
Natriumacetat wird zugegeben, und die Nukleinsäuren werden mit Ethanol gefällt.
Gefällte RNA wird in wäßrigem Ethanol bei -70ºC aufbewahrt. Als Alternativen
können das Guanidinium/Heißes Phenol-Verfahren und das Guanidinium/-
Caesiumchlorid-Verfahren angewandt werden. Beide von diesen Techniken sind
in der Druckschrift von Maniatis et al., die obenstehend zitiert wurde,
beschrieben. Falls gewünscht, kann polyadenylierte RNA von
nicht-polyadenylierten RNAs getrennt werden. Das Verfahren der Wahl ist die
Chromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose, welche im Laboratorium hergestellt
oder im Handel erhalten werden kann. Eine ausführliche Technik zur Selektion
polyadenylierter RNA ist in der obenstehend zitierten Druckschrift von Maniatis et
al., dargestellt.
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Von der isolierten mRNA wird dann komplementäre DNA durch das Enzym
reverse Transkriptase hergestellt. Die resultierende einzelsträngige DNA wird
unter Verwendung von DNA-Polymerase zu doppeisträngiger DNA umgewandelt.
Wenn cDNA auf diese Weise von der gesamten mRNA erzeugt wird, welche in
einer Zelle vorhanden ist, und in ein Klonierungsvehikel inseriert wird, wird die
resultierende Sammlung von cDNA als eine "Donor-Genbibliothek" bezeichnet, da
sie DNA-Sequenzen enthält, welche für die Genprodukte des Donors codieren,
die zu der Zeit exprimiert wurden, als die ursprüngliche mRNA abgesammelt
wurde.
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Es sollte bemerkt werden, daß die Herstellung einer Donor-Genbibliothek an sich
gut bekannt ist, und daß diese Erörterung der Herstellung einer Donor-Bibliothek
nur die Natur der biochemischen Reaktionen betonen soll, welche bei der
Ausübung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Die Erfindung hängt
nicht von der Existenz einer besonderen Genbibliothek ab, sondern kann jegliche
Genbibliothek verwenden, ob sie spezifisch für den Zweck dieser Erfindung oder
für jeglichen anderen Zweck zusammengestellt wurde, welche die in dieser
Beschreibung dargestellten Anforderungen erfüllt.
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Der bei der Herstellung der Wirts-Genbibliothek verwendete Vektor kann
jedweder Vektor sein, der in einem einzelligen Organismus repliziert. Zum
Beispiel sind viele für die Verwendung bei der Ausübung dieser Erfindung
geeignete Plasmide in neueren U.S.-Patenten beschrieben worden, wie den U.S.-
Patenten 4 273 875; 4 304 863; 4 419 450; 4 403 036; 4 363 877; 4 356 270;
4 349 629 und 4 332 901. Andere zur Verwendung bei der Ausführung dieser
Erfindung geeignete Vektoren schließen pAJ 655 (Wirtsbakterien: E.coli FERM-
BP 136), pAJ 611 (Wirtsbakterien: E.coli FERM-BP 138), pAJ 440
(Wirtsbakterien: Bacillus subtilis ATCC 391391), pAJ 1844 (Wirtsbakterien: E.coli
FERM-BP 137) und pAJ 3148 (Wirtsbakterien: Corynebacterium glutamicum
ATCC 39137) ein. Besonders bevorzugt ist der Phagenvektor λgt11, der aus
öffentlich erhältlichen Phagen gemäß dem Verfahren hergestellt werden kann,
das in Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194-1198 (1983)
beschrieben ist. Kurz gesagt, kann dieser bevorzugte Phagenvektor wie folgend
hergestellt werden:
λgt7-lac5
und λ540 (ΔB imm21 nin5) werden mit Hind III gespalten, und die
Fragmente werden vereinigt und danach mit T&sub4;-DNA-Ligase ligiert. Die
gewünschte Phagenrekombinante erzeugt trübe (imm21), blaue (lac5) Plaques,
wenn die DNA in E. coli BNN93 transfiziert wird und die Zellen auf Medium mit
dem chromogenen Indikator 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal)
ausplattiert werden. Das λgt7-lac5-λ540-Hybrid wird danach mit λgt4 (c1857
S100 nin5) gekreuzt, und bei 42ºC herangezogene Rekombinanten werden
hinsichtlich der Bildung von klaren (c1857) blauen Plaques auf X-Gal-Platten
begutachtet. Das Vorhandensein der Amber-Mutation S100 wird durch
Untersuchen der relativen Plattierungswirksamkeit bei Wirten bestätigt, welche
den Amber-Suppressor supF (BNN45 bzw. BNN93) enthalten oder entbehren.
Schließlich wird der lac5 c1857 S100-Phage hinsichtlich EcoRI-Spaltungsstellen
kartiert. Der Phage λgt11 enthält eine einzige EcoRI-Spaltungsstelle.
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Sobald eine Donor-Genbibliothek verfügbar ist, entweder gemäß den
obenstehend beschriebenen Verfahren oder durch ein beliebiges anderes
Verfahren, werden Empfängerzellen mit der Genbibliothek transformiert, um eine
Reihe von transformierten Zellen zu erzeugen, welche die verschiedenen Donor-
DNA- (oder cDNA-) Fragmente enthalten. Die Einführung der rekombinanten DNA
in Empfängerzellen kann durch die Behandlung der empfangenden einzelligen
Mikroorganismen mit Calciumchlorid, um die Permeabilität der Zellmembranen für
DNA zu erhöhen, bewirkt werden, wie es in Mandel et al., J. Mol. Biol., 53, 159
(1970) berichtet ist. Andere Verfahren zum Transformieren von Empfängerzellen
schließen das Inkorporieren der rekombinanten DNA bei einer Wachstumsstufe
ein, wenn Zellen fähig zur Einverleibung von DNA werden (das sogenannte
kompetente Zell-Stadium), wie berichtet in Young et al., Gene 1, 153 (1977).
Plasmide können auch in DNA-Empfänger inkorporiert werden, indem
Protoplasten oder Sphäroplasten der DNA-Empfänger gebildet werden (was
insbesondere bei Hefe angewandt wird), wie beschrieben in Chang et al., Mol. Ec.
Gen. Genet., 168, 111 (1979). Jedwedes andere Verfahren zum Transformieren
von Empfängerzellen kann in der Praxis dieses Aspekts der Erfindung angewandt
werden.
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Autoimmunantigene können aus Empfängerzellen unter Verwendung einer
beliebigen aus einer Vielzahl bekannter Techniken erhalten werden. Zum Beispiel
können Zellen, welche Peptidantigene auf eine solche Weise exprimieren, daß
die Antigene durch die Zellmembran in den umgebenden Raum transportiert
werden, in einem Kulturmedium herangezüchtet werden, und das gewünschte
Antigen kann direkt aus dem Medium erhalten werden. Wenn das gewünschte
Antigen innerhalb der Zellmembran zurückgehalten wird, können die Zellen lysiert
werden, um das Antigen in den Zellüberstand freizusetzen, der dann gereinigt
werden kann, um das gewünschte Antigen zu erhalten. Wenn das herzustellende
Antigen einen nachteiligen Effekt auf die das Antigen exprimierende Zelle hat,
ermöglicht das Unterstellen des Gens für das Antigen unter die Regulierung eines
Induktors die Expression des Gens nur zur Zeit des Absammeins. Zum Beispiel
kann ein λ-Phage auf Zellen herangezogen werden, die pNC9 enthalten, ein
pBR322-Derivat, das lac IQ enthält. In den Zellen wird ausreichend lac-Repressor
hergestellt, um die Expression des Hybridproteins während des lytischen Phagen-
Wachstums zu unterdrücken. Die Expression des Hybrids kann in infizierten
Zellen mit IPTG induziert werden, und das so hergestellte Antigen wird beim
Lysieren der Zellen aus den Zellen freigesetzt.
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Wenn der λgt11-Phage in einem der bevorzugten Aspekte der Erfindung
verwendet wird, wird das folgende Verfahren für das Screening mit Antikörpern,
um das Vorhandensein von Autoimmunantigenen festzustellen, bevorzugt. Ein
empfohlener Wirt ist E. coli Y1090, der wie folgt beschaffen ist: ΔlacU169 proA&spplus;
ΔIon araD139 strA supF [trpc22::Tn10] (pMC9). Das Wirtsbakterium wird infiziert
und in Weichagar plattiert, wonach die Platte etwa 5 Stunden lang bei etwa 42ºC
inkubiert wird. Für eine gleichmäßige Verteilung von Phagen werden ungefähr
10&sup4; Phagen pro kleiner Platte und 10&sup5; Phagen pro großer Platte empfohlen. Auf
die Platte wird ein trockenes Nitrozellulose-Filterblatt gelegt, welches zuvor in 10
mM IPTG getränkt worden war. Die Platte wird bei etwa 37ºC inkubiert. Das Filter
wird dann entfernt und in Tris-gepufferter Salzlösung, pH-Wert 8,1, bei
Raumtemperatur etwa 5-10 Minuten lang gewaschen. Der Filter wird danach in
TBS mit etwa 20 % fötalem Kälberserum (oder 3 % BSA oder Ovalbumin)
inkubiert. Die Inkubation findet etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur statt.
Das Filter wird danach in TBS + 20 % fötalem Kälberserum plus Antikörper
(ungefähr 1:1-Verdünnung von Serum oder IgG; wenn IgG verwendet wird, ist IgG
anfänglich bei 10 mg/ml vorhanden) inkubiert. Die Inkubation findet etwa eine
Stunde lang bei Raumtemperatur statt. Das Filter wird dann gewaschen, um
nichtgebundenen Antikörper zu entfernen, und in TBS mit ¹²&sup5;I-Protein A (etwa 10&sup6;
cpm/Filter) etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Radioaktivität
wird an Stellen vorhanden sein, wo eine Antikörperbindung die Gegenwart von
exprimiertem Antigen anzeigt.
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Obwohl diese Technik eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt,
sind dem Fachmann andere Verfahren zum Screenen mit Antikörpersonden
bekannt und können leicht anstatt dieser Technik angewandt werden.
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Das Wort "Transformante" wird in dieser Anmeldung in seiner breitesten
Bedeutung verwendet, um jegliche Empfängerzelle einzubeziehen, welche darin
eingefügt exogene genetische Information aufweist. Zusätzlich zu der
eingeschränkteren Bedeutung von Transformante (eine Zelle, welche ein Plasmid
aufgenommen hat), bezieht sich Transformante in dieser Anmeldung auf Zellen,
die exogene DNA in ihr Chromosom (oder Chromosomen) eingefügt aufweisen,
als auch auf Zellen, die irgendeinen rekombinanten Vektor, wie obenstehend
beschrieben, enthalten.
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Die mehreren Empfängerzellen, welche unter Verwendung einer
Donor-Genbibliothek transformiert werden, werden als Expressionsbibliotheken bezeichnet,
da die Transformanten Genprodukte von den rekombinanten DNA-Vektoren,
welche wahllos in die individuellen einzelligen Organismen eingeführt worden
sind, exprimieren werden. Typischerweise werden die Transformanten kloniert,
um eine Reihe von Zellinien zu erzeugen, die von individuellen ursprünglichen
Transformanten abstammen. Eine Probe wird aus jeder Zellinie gewählt und wird
(nach Lysieren, falls gewünscht) an den mit der Immunkrankheit in dem Wirt
assoziierten Autoantikörper exponiert, der wie obenstehend beschrieben
hergestellt wurde. Bindungswechselwirkungen zwischen dem Autoantikörper und
dem von der, das richtige Gen enthaltenden, Transformante exprimierten Antigen
können durch ein beliebiges der verschiedenen für dieses Vorgehen verfügbaren
Verfahren nachgewiesen werden. Zum Beispiel können Proteine aus Kolonien
von Transformanten auf Nitrozellulose-Filterpapier adsorbiert werden, das auf die
Kolonien aufgelegt wurde, gefolgt von Zusetzen des Autoantikörpers, Waschen
zur Entfernung nicht-reagierten Antikörpers und Nachweisen von
Proteingebundenem Antikörper mit radioaktiv markiertem Protein A. Auf diese Weise
identifizierte Zellkolonien können in großer Menge herangezüchtet werden, um
die gewünschte Menge des für das Proteinantigen codierenden Gens zur
Verfügung zu stellen. An diesem Punkt sind mehrere Variationen möglich. Den
Zellen mit dem Gen für das Proteinantigen kann gestattet werden, das Antigen zu
exprimieren, und das Antigen kann unter Anwendung bekannter Techniken aus
dem Kulturmedium gewonnen werden. Alternativ dazu kann das Donor-cDNA-
Fragment aus dem ersten Vektor (z. B. durch Ausschneiden mit der gleichen
Endonuklease, die ursprünglich verwendet wurde, um das Plasmid zu spalten und
die DNA einzufügen) herausgeschnitten, in einen neuen Klonierungsvektor
eingefügt, und verwendet werden, um eine Empfängerzelle für die Herstellung der
cDNA oder des Proteinantigens in großem Maßstab zu transformieren. Alternativ
dazu ist es auch möglich, sobald relativ große Mengen des Proteinantigens oder
der cDNA, welche selbiges herstellt, verfügbar sind, die Sequenz der molekularen
Spezies zu bestimmen. Sobald diese Sequenz bekannt ist, ist es möglich, das
Peptidantigen unter Verwendung eines automatischen Peptid-Synthesizers oder
einer anderen geeigneten Vorrichtung zur Synthese zu synthetisieren. Sowohl
Laboratonumstechniken der Synthese, typischerweise Festphasensynthese, als
auch automatische Peptidsynthesizer sind im Fachgebiet gut bekannt; siehe zum
Beispiel Seite 34 der November/Dezember 1984-Ausgabe von Genetic
Engineering News, welche eine kommerzielle Werbung für eine derartige
Vorrichtung enthält. Da eine gegebene DNA-Sequenz für ein einzelnes Peptid
codieren wird, kann die in dem klonierten DNA-Segment vorhandene genetische
Information ohne weiteres in einer nicht-biologischen Synthese eines Peptides
verwendet werden. Da hydrophobe Regionen eines Peptides im allgemeinen auf
der Innenseite des Peptides sind, und hydrophile Regionen im allgemeinen auf
der Außenseite sind, ist es möglich, mit vernünftiger Gewißheit diejenigen
Abschnitte des Peptides vorherzusagen, welche auf den nach außen gerichteten
Oberflächen sein werden und deshalb zur Verfügung stehen werden, um als
antigene Determinanten zu wirken. Die Hydrophilitäts-Analyse unter Anwendung
des Verfahrens von Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828,
(1981), kann verwendet werden, um Regionen von Peptiden mit hoher
Hydrophilität zu identifizieren. Antigene Determinanten besitzen oft eine Sequenz
von 3-10 Aminosäuren mit höheren als durchschnittlichen Hydrophilitätswerten.
Unter Verwendung der genetischen Information hergestellte künstliche Peptide
enthalten bevorzugt die gesamte hydrophile Region, wie obenstehend
beschrieben. Weiter bevorzugt besitzen künstliche Peptide eine Sequenz, welche
ausreichend identisch zu der von dem klonierten DNA-Segment codierten
Sequenz ist, um antigene Determinanten für die Reaktion mit dem Autoantikörper
verfügbar zu machen. Eine identische Sequenz wird am stärksten bevorzugt, aber
es wird vom Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteres erkannt werden, daß
kleinere Modifikationen in der Proteinstruktur vorgenommen werden können, ohne
die antigene Determinante zu beeinträchtigen. Zum Beispiel sind die Substitution
von nahe verwandten Aminosäuren (Leucin für Isoleucin) und die Herstellung von
Peptiden mit substituierten (z. B. Cystein) oder fehlenden endständigen
Aminosäuren (vorzugsweise nicht mehr als 10 Prozent des
Aminosäuregesamtgehaltes) beide möglich.
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Andere typische Modifikationen beinhalten das Hinzufügen verschiedener
Aminosäuren, um die Kopplung des Antigens an verschiedene Oberflächen zu
ermöglichen.
Zum Beispiel ermöglicht das Hinzufügen oder die Substitution eines
Cysteins die Anknüpfung der Sulfhydrylgruppe an eine funktionalisierte
Oberfläche, und die Hinzufügung oder Substitution von hydrophoben
Aminosäuren gestattet die Anknüpfung durch hydrophobe Bindung an
Kunststoffoberflächen. Beide diese Verfahren können zum Beispiel in ELISA-Assays und
anderen Standard-Immunoassays angewandt werden. Modifikationen, die
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung fallen, können leicht durch ihr
Vermögen, mit dem Autoimmunantikörper zu reagieren, ermittelt werden.
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Jedes dieser oder anderer äquivalenter Verfahren ist geeignet zum Gewinnen
eines Antigens, das mit dem Autoantikörper reagieren kann, der mit der
Autoimmunkrankheit des Wirtes assoziiert ist, aus welchem ursprünglich Serum
erhalten wurde.
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Zusätzlich zu den obenstehenden allgemeinen Verfahren, welche zur Herstellung
rekombinanter DNA-Moleküle und transformierter einzelliger Organismen gemäß
den Praktiken dieser Erfindung angewandt werden können, können andere
bekannte Techniken und Abwandlungen davon bei der Durchführung der Praxis
der Erfindung eingesetzt werden. Insbesondere haben Techniken, welche sich auf
Gentechnik beziehen, kürzlich ein Wachstum und eine Entwicklung in
explosionsartiger Weise erfahren. Viele jüngere U.S.-Patente offenbaren Plasmide,
gentechnisch veränderte Mikroorganismen und Verfahren zur Ausführung der
Gentechnik, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung angewandt werden
können. Zum Beispiel offenbart das U.S.-Patent 4273 875 ein Plasmid und ein
Verfahren zur Isolierung desselben. Das U.S.-Patent 4 304 863 offenbart ein
Verfahren zur Herstellung von Bakterien durch Gentechnik, wobei ein
Hybridplasmid konstruiert und verwendet wird, um einen bakteriellen Wirt zu
transformieren. Das U.S.-Patent 4419 450 offenbart ein bei der Arbeit mit
rekombinanter DNA als Klonierungsvehikel verwendbares Plasmid. Das U.S.-
Patent 4 362 867 offenbart rekombinante cDNA-Konstruktionsverfahren und
dadurch hergestellte Hybridnukleotide, die nützlich bei Klonierungsverfahren sind.
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Das U.S.-Patent 4 403 036 offenbart genetische Reagenzien zur Herstellung von
Plasmiden mit mehrfachen Kopien von DNA-Segmenten. Das U.S.-Patent
4 363 877 offenbart rekombinante DNA-Transfervektoren. Das U.S.-Patent
4 356 270 offenbart ein rekombinantes DNA-Klonierungsvehikel und ist eine
besonders nützliche Beschreibung für diejenigen mit begrenzter Erfahrung auf
dem Gebiet der Gentechnik, da es viele der in der Gentechnik verwendeten
Begriffe und die dabei verwendeten Grundverfahren definiert. Das U.S.-Patent
4 336 336 offenbart ein fusioniertes Gen und ein Verfahren zur Herstellung
desselben. Das U.S.-Patent 4 349 629 offenbart Plasmidvektoren und die
Herstellung und Verwendung davon. Das U.S.-Patent 4 332 901 offenbart einen
Klonierungsvektor, der bei rekombinanter DNA verwendbar ist.
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Alle von diesen Patenten, als auch alle in dieser Offenbarung zitierten anderen
Patente und anderen Veröffentlichungen weisen auf das Niveau der Fertigkeiten
des Fachmanns auf dem Gebiet hin, auf das sich diese Erfindung bezieht, und
sind alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
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Obwohl manche dieser Patente sich auf die Herstellung eines besonderen
Genprodukts richten, das sich nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden
Erfindung befindet, können die darin beschriebenen Verfahren vom Fachmann
auf dem Gebiet der Gentechnik leicht auf die Ausübung der Erfindung, die in
dieser Beschreibung beschrieben wird, modifiziert werden. Zum Beispiel kann die
Herstellung von fusionierten Proteinen eine erhöhte Protein- und antigenische
Stabilität vorsehen, was bei der Ausübung der beschriebenen Erfindung nützlich
ist. Mit Autoantikörpern reaktive Antigene sind normale Wirtsbestandteile und
sind gegenüber einem Abbau besonders empfindlich. Für die langfristige
Aufbewahrung bei diagnostischen und für die Exposition mit großen Volumina bei
therapeutischen Aspekten dieser Erfindung ist eine erhöhte Stabilität erwünscht.
Darüber hinaus kann für eine Vielzahl von unterschiedlichen antigenen
Materialien, die in einer üblichen diagnostischen oder therapeutischen
Vorrichtung eingesetzt werden sollen, ein üblicher Fusionsprotein-Rest (z. B. β-
Galactosidase) die Flexibilität des Verfahrens erhöhen.
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Obwohl das Verfahren der Erfindung bei der Behandlung jedweder
Autoimmunkrankheit angewandt werden kann, wird es besonders zur Verwendung bei SLE
und assoziierten Autoimmunkrankheiten, wie Sklerodermie, Sicca-Syndrom,
gemischte Bindegewebskrankheit (MCTD) und dem Sjögren-Syndrom bevorzugt.
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Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierte und hergestellte
Antigene finden viele Anwendungen, zum Beispiel bei der Identifzierung und
Behandlung von Autoimmunstörungen. In vielen Autoimmunstörungen werden die
Symptome durch Entfernen von Autoantikörpern aus dem betroffenen Menschen
oder Tier abgemildert. Eine selektive Entfernung wird gewünscht, so daß der
betroffene Wirt noch in der Lage zum Aufzeigen normaler Immunantworten gegen
exogene Antigene sein kann. Wie in Terman et al., Clinical Immunology and
Immunopathology, 8, 90-96, (1977), erörtert, ist die Entfernung von DNA-
Antikörpern in vivo durch extrakorporalen Kreislauf des Blutes über auf Aktivkohle
immobilisierte DNA bewirkt worden. Diese Technik kann einfach für die
Anwendung bei Autoimmunkrankheiten, die Proteinantigene beinhalten, angepaßt
werden, indem die auf Aktivkohle immobilisierte DNA durch geeignete
Proteinantigene ersetzt wird, welche wie hierin beschrieben hergestellt und auf
einem geeigneten Substrat immobilisiert worden sind. Ein anderes Beispiel eines
Verfahrens und einer Vorrichtung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten ist
in dem U.S.-Patent 4 362 155 dargestellt. Dieses Patent offenbart die Entfernung
von Interferon und/oder Autoantikörpern aus Blut. Das Verfahren und die
Vorrichtung können leicht an die Verwendung der in der vorliegenden Erfindung
offenbarten Antigene anstelle der in dem Patent offenbarten allgemeinen
Adsorptionsmittel angepaßt werden.
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Die gereinigten Antigene, die mit Patienten-Autoantikörpern reaktiv sind, können
an Feststoff-Matrizen angeknüpft und verwendet werden, um die reaktiven
Autoantikörper aus dem Plasma von betroffenen Wirten zu depletieren,
einzufangen oder anderweitig zu entfernen. Verfahren zur Anknüpfung von
Peptiden an Oberflächen sind gut bekannt und können für die Verwendung mit
dieser Erfindung leicht angepaßt werden. Zum Beispiel kann eine endständige
Aminosäure eines Peptidantigens mit einer reaktiven Carbonyl-, Carboxylat-,
Hydroxyl- oder Aminogruppe eines festen Polymers (oder einer
Verknüpfungsgruppe, die an das Polymer angeheftet ist) reagieren. Die
Aufbeschichtung von unmodifiziertem Peptid auf Kunststoff- oder Glasoberflächen
kann ebenfalls angewandt werden, um eine immunologisch reaktive Oberfläche
zur Verfügung zu stellen.
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Patienten mit Autoimmunkrankheiten, wie Myasthenia gravis und systemischem
Lupus, als auch diejenigen mit gewissen Formen von Krebs sind erfolgreich mit
substraktiven Therapien behandelt worden, in denen alle Antikörper aus dem Blut
des Patienten depletiert werden. Diese Verfahren litten unter der Nicht-
Verfügbarkeit chemischer reiner, reaktiver Antigene. Das hierin beschriebene
Verfahren stellt zum ersten Mal große Mengen antigener Proteine zur Verfügung,
die verwendet werden können, um das Wirtsplasma von spezifischen
Autoantikörpern zu depletieren. Somit können in der Praxis die nützlichen
Antikörper in den Wirt zurückgeführt werden, wodurch die Verwendung von
kostspieligen und potentiell zu Schwierigkeiten führenden Ersatzfluiden (z. B.
Albumin) vermieden wird.
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Zum Beispiel können Patienten mit SLE oder Sjögren-Syndrom, welche
Autoantikörper erzeugen, die mit dem La-Protein reagieren, eine Krise der
Zellzerstörung und Entzündung erfahren. Ein solcher Patient kann durch Kreislauf
oder Perkolation seines Serums durch eine Apheresevorrichtung behandelt
werden, in der genetisch hergestelltes La-Protein bei hohen Konzentrationen
eingebracht worden ist. Die Vorrichtung kann so ausgelegt sein, daß jeder
potentielle La-Autoantikörper an ein immoblilisiertes La-Antigen angelagert wird.
Das Antigen kann an die feste Matrix mittels eines Proteinanteils angeknüpft sein,
der genetisch fusioniert und exprimiert worden ist (z. B. β-Galactosidase oder ein
stark matrixbindendes Protein, wie Avidin). Die Anknüpfung mittels eines
fusionierten Stiels, Armes oder losen Endes wird die nachstehenden Vorteile
aufweisen: (1) Zulassen einer üblichen chemischen Anknüpfungsquelle, so daß
verschiedene Antigene auf identische Weise an eine gängige Matrix konjugiert
werden können, (2) Ermöglichen der maximalen Freiheit an Mobilität des
Antigens, eine Qualität, die bekanntermaßen die Antikörperlantigen-Reaktivität
verbessert, und (3) Vorsehen einer erhöhten Stabilität des Antigens. Die
resultierende Subtraktion von La-Autoantikörpern aus dem Blut des Patienten
wird das Vermögen zur Bildung von Immunkomplexen verhindern oder verändern,
und die Ablagerung von Komplexen in entzündeten Geweben eines Patienten
kann vermindert werden. Der anfängliche Schritt in diesem Verfahren erfordert die
Subtraktion von zuvor gebildeten La-Immunkomplexen unter Anwendung einer
Rohplasmapherese oder Immunoglobulin-Depletion mit Staph.-Protein A, gefolgt
von einer spezifischen Depletion der neu hergestellten La-Autoantikörper, bevor
sie Antigene im Wirt treffen können, mit denen sie reagieren könnten. Somit
könnte das Blut des Patienten danach frei von das La-Antigen enthaltenden
Immunkomplexen bleiben.
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Gemäß der Erfindung hergestellte Proteinantigene könnten auch durch direkte
Injektion des Antigens in den betroffenen Wirt angewandt werden, um die Bildung
von Immunkomplexen zu stören. Immunkomplexe, die sich als Ergebnis von
Autoimmunität bilden, hängen von dem Vorhandensein von kritischen
Konzentrationen der Reaktanten (Antigen und Antikörper) ab, und das Verhältnis der
Reaktanten zueinander bestimmt, ob eine Bindung auftreten wird. Man geht
davon aus, daß dieses Verhältnis während Perioden der Krise in dem Autoimmun-
Krankheitszustand optimal ist. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung
können homogene reine Antigene in das Blut des Wirtes injiziert werden und
somit das Antigenlantikörper-Verhältnis verändern. Das resultierende Versagen,
neue Immunkomplexe zu bilden, wird dem retikuloendothelialen System und den
Phagozyten erlauben, zuvor gebildete Immunkomplexe erfolgreich zu entfernen,
wodurch das Vermögen der Immunkomplexe, sich in Zielgeweben abzulagern, wo
sie mit der Autoimmunpathologie assoziert sind, vermindert wird.
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Zum Beispiel kann gereinigtes La-Antigen intravenös in einen Patienten injiziert
werden, der La-Autoantikörper während einer lebensbedrohlichen
Autoimmunkrise herstellt, in der sich Immunkomplexe mit La-Antigen schneller bilden, als sie
geklärt bzw. entfernt und zerstört werden können. In einem durchschnittlichen
menschlichen Wirt von 68 kg Gewicht mit 4,8 Litern Gesamtblut gibt es etwa 5 x
10&sup4; mM IgG. Bei typischen Patienten mit im Kreislauf befindlichen La-
Autoantikörpern repräsentiert dies ein ungefähres Äquivalent von 10¹&sup5; Molekülen
an La-Antikörper insgesamt. Somit würde eine Injektion einer molaren Äquivalenz
von La-Antigen (etwa 1,6 Nanomol) die Bildung von Immunkomplexen verhindern,
welche in bestmöglicher Weise während Bedingungen von hohen
Antikörper/niedrigen Antigen-Verhältnissen resultieren. Die derzeitige Hypothese
von Autoimmunität, welche auf der Bildung von pathogenen Immunkomplexen an
der Stelle der Ablagerung eher als im freien Kreislauf basiert, behauptet, daß die
Gegenwart eines Hochaffinitäts-Antigens im Kreislauf die Ablagerungsrate von
Immunkomplexen in Zielgeweben vermindern sollte. Um die Menge von im
Kreislauf befindlichen Autoantikörpern richtig zu bestimmen, können die in der
vorliegenden Erfindung beschriebenen quantitativen diagnostischen Verfahren
angewandt werden, und die Menge an injiziertem gereinigten Antigen kann
entsprechend eingestellt werden, wenn der Spiegel an Autoantikörpern steigt
oder fällt.
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Nun, da die Erfindung im allgemeinen beschrieben worden ist, wird diese unter
Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele besser verstanden werden,
welche hierin lediglich aus Zwecken der Veranschaulichung eingeschlossen sind
und mit denen nicht beabsichtigt wird, die Erfindung oder irgendeine
Ausführungsform davon einzuschränken, es sei denn, es ist anderweitig
angegeben.
Beispiel
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Isolierung und Analyse von cDNA-Klonen, die das humane Lupus-La-Antigen
exprimieren.
Einleitung
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Die vorliegende Erfindung ist auf eine Ausübung reduziert und veranschaulicht
worden durch die Identifizierung von aus menschlicher Leber hergestellten
rekombinanten cDNA-Klonen, welche das La-Protein exprimieren, das mit
systemischem Lupus erythematosus und Sjögren-Syndrom assoziiert ist. Vor der
vorliegenden Erfindung gab es kein bekanntes Verfahren, das die Identifizierung
des spezifischen antigenen Materials ermöglicht hätte, und lediglich eine
ungefähre Zuordnung von antigenen Spezifitäten gegen Standard-Prototyp-
Antiseren war möglich (1). Es wurde festgestellt, daß das Säugerzell-La-Protein
mit Vorläuferformen von RNA-Polymerase III-Transkripten assoziiert war,
einschließlich tRNA, 4,5 S RNA, 5 S RNA und 7-2 RNA (3, 4, 5, 6). Es wurde
auch gezeigt, daß einige kleine virale Transkripte, wie VAI-RNA von Adenovirus
(7, 8), EBER-RNAs von Epstein-Barr-Virus (9) und die Leader-RNAs des
vesikulären Stomatitis-Virus (2, 10) und Rabies-Virus (11) mit dem La-Protein
komplexiert sind. Durch Immunopräzipitation von Ribonukleoproteinkomplexen
unter Verwendung von La-Antikörpern wurde gezeigt, daß die Stelle der La-
Protein-Bindung an mehrere dieser RNA-Spezies nahe dem 3'-Ende liegt (4, 8,
12). Die Gegenwart von Uridylatresten an den 3'-Enden dieser RNAS kann für die
Bindung erforderlich sein. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß das Hinzufügen
von 3'-terminalen Extra-Uridylatresten die Bindung von La-Protein an VAI-RNA
(13) und an Transfer-RNA (14) erhöht. Da das La-Protein vorzugsweise an
nichtprozessierte Transkripte bindet, haben Steitz und Mitarbeiter (4, 5)
vorgeschlagen, daß das La-Protein ein Transkriptionsfaktor für RNA-
Polymerase III ist. Trotz der Ungewißheit hinsichtlich seiner exakten Funktion im
RNA-Metabolismus, ist es klar, daß das La-Protein biologisch bedeutsam bei der
Regulation von Genexpression ist, weil es sich mit einer Vielzahl von zellulären
und viralen RNAs, von denen viele bekannte Funktionen besitzen, assoziiert.
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Um die biochemischen Funktionen des La-Proteins weiter zu charakterisieren,
wurden Anstrengungen unternommen, es aus Säugerzellen zu reinigen (14). Die
Ausbeuten aus diesen Reinigungsverfahren sind niedriger als 7 % gewesen, und
das La-Protein zeigte, offenbar aufgrund von Wechselwirkungen mit
RNA-Komponenten, eine biochemische Heterogenität. Um große Mengen an hochgereinigtem
La-Protein herzustellen, leiteten die Erfinder rekombinante cDNA-Klone her,
welche für das La-Protein codieren. La-cDNA-Kolonien aus
λgt11-Expressionsbibliotheken (15) wurden unter Verwendung von Seren aus ausgewählten Lupus-
Patienten als Antikörpersonden identifiziert.
MATERIALIEN UND METHODEN
Enzyme
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Enzyme wurden von Bethesda Research Laboratories und New England Biolabs
erworben. Kaninchen-Retikulozytenlysat-System für die in vitro-Translation
stammte von New England Nuclear.
Antiseren
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Lupus-Antiseren wurden von dem "Duke University Medical Center Fluorescent
Antinuclear Antibody"-Laboratorium erhalten. Seren, die mit einzelnen
spezifischen Antigenen stark reaktiv waren, wurden identifiziert und durch
Venenpuktierung in größeren Mengen erhalten.
Zellen und Immunopräzipitation
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HeLa-Zellen wurden 5 Stunden lang in Methionin-freiem Medium mit [³&sup5;S]-
Methionin (New England Nuclear) bei 0,2-0,5 mCi/ml für Antikörper-Fällungen
markiert. Proteinextrakte wurden hergestellt und Immunopräzipitationen wurden
durchgeführt, wie beschrieben (8), wobei Pansorbin (Calbiochem) als eine Quelle
von Protein A verwendet wurde. Immunopräzipitierte Proteine wurden durch
15%ige SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) (16), gefolgt von
Fluorographie, analysiert.
Bakterienstämme und λgt11-Expressionsbibliotheken
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Die E. coli-Stämme Y1088 und Y1090 wurden von D. Stafford (University of North
Carolina at Chapel Hill) erhalten. Mit λgt11 konstruierte humane Leber-cDNA-
Bibliotheken wurden von D. Stafford und P. Modrich (Duke University Medical
Center) und R.A. Lazzarini (National Institutes of Health) zur Verfügung gestellt.
Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpersonden
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Wie von Young und Davis (15) beschrieben, wurden rekombinante λgt11-Phagen
auf E. coli Y1090 bei 10&sup5; pfu bzw. plaquebildenden Einheiten pro 576 cm²-Platte
(NUCU Inter Med) ausplattiert. Die Expression von
β-Galactosidase-Fusionsproteinen wurde durch Überschichten mit Nitrozellulosefiltern (Schleicher und
Schuell) induziert, welche mit 10 mM Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG)
(Boehringer Mannheim Biochemicals) gesättigt waren. Seren aus Lupus-Patienten
wurden gescreent durch Immunopräzipitation von [³&sup5;S]-Methionin- und [³H]-
Aminosäure-markierten HeLa-Zellextrakten, zur Bestätigung der einzigartigen
Spezifität der Autoantikörper, oder durch Immunoblotting unter Anwendung der
Technik von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 4350-4354, (1979). Es
wurde, vor der Verwendung im Screening von Expressionsbibliotheken,
festgestellt, daß die La-Seren frei von Ro-, Sm-, RNP- und anderen Lupus-
Autoantikörpern waren. Nach Transfer der induzierten Proteine auf Nitrozellulose
wurden die Filter mit fötalem Kälberserum geblockt, mit 1:100-Verdünnungen von
Lupus-Antiseren gescreent und mit [¹²&sup5;I-]-markiertem Protein A (ICN
Radiochemicals)sondiert.
Hybridselektion bei der in vitro-Translation
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Die EcoRI-DNA-Inserts, erneut kloniert in pBR322, wurden auf
Nitrozellulosefiltern immobilisiert und für die Hybridselektion verwendet. Zytoplasmatische
Gesamt-HeLa-Zellen-RNA wurde in den Hybridselektionen verwendet, wie von
Maniatis et al. (17) beschrieben. Hybridselektierte mRNAs wurden in vitro unter
Verwendung von Kaninchen-Retikulozytenlysaten in Gegenwart von [³&sup5;S]-
Methionin translatiert, und die Produkte wurden durch 15%ige SDS/PAGE
analysiert. Durch Autoradiographie identifizierte Gelstücke, welche das La-Protein
enthielten, wurden in Probenvertiefungen eines zweiten Geis überführt.
Variierende Mengen von S. aureus V8-Protease (Sigma) wurden jeder Vertiefung
zugegeben, und ein Verdau wurde im Sammelgel gemäß dem Verfahren von
Cleveland et al. (18) stattfinden gelassen. Die durch limitierte Proteolyse
erzeugten Peptide wurden im gleichen Gel fraktioniert und mittels Fluorographie
identifiziert.
DNA-Sequenzierung
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Aus λgt11-La-Klonen isolierte EcoRI-Inserts wurden unter Verwendung von
Restriktionsenzymen fragmentiert und in M13-mp18- und M13-mp19-Vektoren
subkloniert. Eine Didesoxy-DNA-Sequenzierung (19) wurde unter Verwendung
von [³&sup5;S]-dATP (Amersham) und Puffergradientengelen (20) durchgeführt.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
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In 10 mM IPTG getränkte Nitrozellubeblätter wurden durch Induktion von
konfluenten Phagenpaques, enthaltend die klonal gereinigte Vollängen-La-cDNA, mit
La-Antigen beschichtet. Für empfindlichere Assays wurde das teilweise gereinigte
β-Galactosidase-La-Fusionsprotein verwendet, um Nitrozelluloseblätter zu
beschichten. Antigen-beschichtete Nitrozelluloseblätter wurden mit einer BSA-
enthaltenden Blockierungslösung (Kirkegaard and Perry Laboratories) behandelt,
und Verdünnungen von menschlichen Seren wurden eine Stunde lang mit dem
Antigen in Kontakt gebracht. Die Seren wurden entfernt und die Filter wurden
gründlich mit Puffer gewaschen, der 0,02 M Imidazol-gepufferte Salzlösung und
0,02 % Tween 20 (Kirkegaard and Perry Laboratories) enthielt. Die
Nitrozelluloseblätter wurden jeweils 10 Minuten lang in dem Tween 20-Puffer und zweimal in
Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die mit Antikörper
umgesetzten Blätter wurden mit Lactoperoxidase-konjugiertem Protein A bei einer
Konzentration von 1 ug/ml 30 Minuten lang inkubiert. Nach drei Waschzyklen
wurden die Filter mit 4-Chlor-1-naphthol in dem Peroxidase-Substratsystem
(Kirkegaard and Perry Laboratories) 10 Minuten lang reagieren gelassen.
ERGEBNISSE
Isolierung und Identifizierung von La-cDNA-Klonen
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Das anfängliche Plaque-Screenen von 500 000 Rekombinanten identifizierte
zwanzig vermeintliche La-Klone. Nach mehreren Reinigungs und Rescreening-
Runden mit verschiedenen La-spezifischen Autoantikörpern wurden drei positive
La-Klone isoliert und bestätigt. Die FIGUR 1(a) zeigt eine Reihe von
Photographien von Kulturmedien, welche die Isolierung und Identifizierung von
La-cDNA-Klonen durch das immunologische Screeningverfahren veranschaulicht.
Rekombinante Phagen wurden anfänglich bei einer Dichte von etwa 200 pfu/cm²
auf 576 cm²-Platten ausplattiert. Ein Agarpfropf von 0,5 cm Durchmesser an der
Position jedes der Signale wurde entnommen und "getitert", bevor ein
Wiederausplattieren bei einer Dichte von etwa 20 pfu/cm² auf Platten von 9 cm
Durchmesser und ein erneutes Screenen erfolgten. Das
Wiederausplattierungs- und Rescreening-Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, bis jeder
Phagenplaque klonal gereinigte Rekombinanten enthielt, was bestimmt wurde,
wenn jeder Plaque auf der Platte mit La-Antiseren aus mehreren
unterschiedlichen Patienten reaktiv war.
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Als zwei der La-Klone als "λgt11"-Plaques exprimiert und hinsichtlich der
Reaktivität mit einer Auswahl von Seren aus Patienten mit SLE, welche keine
Laspezifischen Autoantikörper enthielten (wie geassayt durch Immunopräzipitation
von RNA und Protein, Zellfluoreszenz (ANA) und Gegen-Immunoelektrophorese
(CIE)), als auch mit normalen menschlichen Seren analysiert wurden, wurden die
Daten von FIGUR 1b erhalten. Die verwendeten Seren zeigten La-, Sm- und
RNP-Spezifitäten auf. Es ist klar, daß Klone, die La-Antigen exprimierten, nur mit
Seren aus SLE-Patienten der La-Spezifität reagieren konnten.
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Diese klonal exprimierten La-Antigene wurden durch einen Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) weiter identifiziert. Die Ergebnisse eines typischen
Dot-ELISA mit einem der La-Antigenklone sind in der FIGUR 2 gezeigt. Seren aus
18 SLE-Patienten wurden hinsichtlich Reaktivität mit dem exprimierten La-Antigen
analysiert. Seren aus drei SLE-La-Patienten zeigten eine deutlich positive
Antwort, während Patienten mit anderen Lupus-Spezifitäten (Sm, Ro, RNP, Ga,
To und unklassifizierte Reaktivitäten) und Normalfälle nur einen niedrigen
Hintergrund an Reaktivität aufwiesen. Filter wurden, wie in Material und Methoden
beschrieben, präpariert und verarbeitet und durch Lactoperoxidase-verknüpftes
S. aureus-Protein A analysiert. (1-2) La, (3) La/Ro, (4) Ro, (5) Sm, (6) RNP, (7)
SM/RNP, (8) Sm/RNP, (9) unbekannter SLE, (10) To, (11) RNP, (12) RNP +
unbekannt, (13) Sm/RNP, (14) RNP, (15) unbekannter SLE, (16) Sm/RNP, (17)
unbekannter SLE (La), (18) unbekannter SLE, (19) normal, (20) normal. In einigen
Fällen wurde bei Seren von unbekannter Spezifität mittels ANA und CIE durch
den ELISA festgestellt, daß sie für La-Protein schwach positiv waren. Die
anschließende Analyse durch RNA- und Protein-Fällungen bestätigte die
Gegenwart von La-Antikörpern in diesen Proben (Daten nicht gezeigt).
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Daten aus DNA-DNA-Hybridisierung (nicht gezeigt) und Restriktionsenzym-
Analyse zeigten, daß überlappende La-Klone isoliert worden waren, von denen
alle den carboxyterminalen Abschnitt der codierenden Sequenz enthielten. Die
erwartete Länge der codierenden Sequenz für das 50 000 Dalton große humane
La-Protein beläuft sich auf etwa 1,5 kb. Der größte der cDNA-Klone enthielt ein
Insert von etwa 1,5 kb und schien die beinahe für die Vollänge codierende
Sequenz zu repräsentieren. Eine teilweise Restriktionskarte ist in der FIGUR 3
gezeigt.
Proteinidentität mittels Hybridselektion und in vitro-Translation
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Um die Identität der cDNA-Klone zu bestätigen, wurden die Techniken der
Hybridselektion und in vitro-Translation angewandt. DNA-Inserts aus den λgt11-
La-Klonen, subkloniert in pBR322, wurden für die Hybridselektion von mRNA aus
cytoplasmatischer Gesamt-HeLa-RNA verwendet. Die selektierte, an Filter
gebundene mRNA wurde eluiert und unter Verwendung von Kaninchen-
Retikulozytenlysaten in vitro translatiert. Die FIGUR 4 zeigt eine Fluorographie
der in vitro synthetisierten [³&sup5;S]-Methionin-markierten Produkte, fraktioniert auf
15%igen SDS/Acrylamid-Gelen.
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Die verschiedenen Gele sind in der FIGUR 4 wie folgend gezeigt:
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(a) Bahn 1: in vivo [³&sup5;S]-markierte HeLa-Zell-Proteine, immunopräzipitiert mit
Lupus-Seren der La- und Ro-Spezifitäten. Bahn 2: in vitro-translatierte
Produkte von HeLa-mRNA, hybridselektiert mit La-cDNA-Insert. Bahn 3: in
vitro-translatierte Produkte von HeLa-mRNA, hybridselektiert mit La-cDNA-
Plasmid. Bahnen 4 und 5: in vitro-translatierte Produkte von HeLa-mRNA,
hybridselektiert mit dem Plasmid pBR322. Bahn 6: in vitro-translatierte
Produkte unter Verwendung von 10 ug Träger-tRNA.
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(b) Bahn 1: in vivo [³&sup5;S]-markierte HeLa-Zell-Proteine, immunopräzipitiert mit
Lupus-Seren der La-Spezifität. Bahn 2: dasselbe wie Bahn 3 in (a). Bahn 3:
transiatiertes Material aus Bahn 2, das mit Anti-La-Serum immunopräzipitiert
wurde. Bahn 4: dasselbe wie Bahn 4 in (a). Bahn 5: dasselbe wie Bahn 6 in
(a). Bahn 6: in vitro-translatierte Produkte unter Verwendung von 0,1 ug
Gesamt-HeLa-Zell-RNA.
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Ein einzelnes Protein von etwa 50 000 Dalton war die einzige Proteinspezies, die
für die La-cDNA-selektierte mRNA einzigartig war (FIGUR 4a, Bahnen 2 und 3;
FIGUR 4b, Bahn 2). Dieses Protein co-migrierte mit dem in vivo-markierten La-
Protein, welches durch Anti-La-Serum immunopräzipitiert worden war (FIGUR 4a
und b, Bahn 1). Es wurde festgestellt, daß die in vitro-synthetisierte Spezies mit
demselben Antiserum reaktiv war (FIGUR 4b, Bahn 3). Um weiterhin zu zeigen,
daß das in vitro-translatierte Protein tatsächlich das authentische zelluläre La-
Protein war, wurden eine Hybridselektion und Translation und Fraktionierung der
Produkte auf präparativen Gelen durchgeführt. Die präparativen Gele wurden
autoradiographiert und die Gelstücke, die sowohl in vitro als auch in vivo
markiertes La-Protein enthielten, wurden in Probenvertiefungen eines zweiten
Geis überführt. Unter Anwendung des Verfahrens von Cleveland et al. (17)
wurden die Proben einer limitierten Proteolyse mit S. aureus V8-Protease
unterzogen, und die erzeugten Peptide wurden analysiert. Die Fig. 5 zeigt eine
Fluorographie der Peptidkartierung des in vitro und in vivo synthetisierten La-
Proteins. In vivo [³&sup5;S]-markiertes HeLa-Zell-La-Protein und die co-migrierende
Proteinbande die in vitro mit Kaninchen-Retikulozytenlysaten unter Verwendung
von La-cDNA-hybridselektierter mRNA synthetisiert worden war, wurden über das
Gel gereinigt, mit variierenden Mengen von S. aureus V8-Protease verdaut und
auf einem 15%igen SDS/Acrylamidgel analysiert. Die Proben wurden 30 Minuten
lang im Sammelgel inkubiert, wobei die Bahnen 1-4 für 0, 10, 100 bzw. 1000 ng
an Protease stehen. Diese Daten zeigen, daß das in vitro transiatierte Produkt
dasselbe partielle proteolytische Profil aufweist, wie das in vivo markierte La-
Protein. Deshalb codieren und exprimieren die cDNA-Klone das humane La-
Protein.
Kartierung einer antigenen Stelle des La-Proteins
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Weil λgt11 cDNA-Inserts im korrekten Leserahmen exprimiert, wie durch
Antigenität definiert, war es möglich, die Aminosäuresequenz aus der DNA-
Sequenz zu bestimmen, welche unmittelbar nach der 5'-EcoRI-Spaltungsstelle
beginnt. Das kleinste isolierte cDNA-Insert war 390 Nukleotide lang, welche 366
Basen, die für die carboxyterminalen 122 Aminosäuren von La-Protein codierten,
zusätzlich zu 24 Nukleotiden von nicht-codierender Information einschlossen. Von
der codierenden Sequenz eines anderen cDNA-Inserts wurde festgestellt, daß sie
nur die carboxyterminalen 55 Aminosäuren einschließt. Da beide cDNA-lnserts
als β-Galactosidase-Fusionsproteine in dem λgt11-Vektor exprimiert wurden, liegt
mindestens eine antigene Stelle, die mit La-Antiseren reaktiv ist, in dieser 55
Aminosäuren großen Region (terminale 12 %) des Proteins. Die Nukleotid- und
Aminosäuresequenzen sind wie folgt:
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Ein Terminationscodon im Leserahmen war beginnend an Position 166
vorhanden.
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Diese Sequenz weist einen hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren auf. Eine
Hydrophilizitäts-Analyse unter Anwendung des Verfahrens von Hopp und Woods
(21) identifizierte ein Dekapeptid von Aminosäure 40 bis 49 mit einem Wert von
+1,61. Die durchschnittliche Hydrophilizität des 55 Aminosäuren großen
antigenen Abschnitts wurde als +0,3 berechnet. Basierend auf diesem Verfahren
hat diese Dekapeptid-Region eine hohe Wahrscheinlichkeit, auf der Oberfläche
des Proteins exponiert zu sein, und kann mit einer antigenen Determinante für La-
Protein überlappen. Folglich repräsentiert diese Dekapeptidsequenz, glu-asp-lys-
thr-lys-ile-arg-arg-ser-pro zum ersten Mal eine einzelne antigene Determinante,
welche mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert ist.
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Das wie obenstehend beschriebene Verfahren ist ebenfalls auf die Herstellung
von Klonen angewandt worden, welche Antigene exprimieren, die mit natürlichen
Ro-, L-42-, Scl- und U&sub2;bp-Antigenen kreuzreaktiv sind.
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Es wurde eine Hinterlegung bei der "American Type Culture Collection", 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., vorgenommen, um diesen
bevorzugten Aspekt der Erfindung beispielhaft zu verdeutlichen. Die Hinterlegung
wird identifiziert als E. coli HB1010-Lab und durch ihre Hinterlegungsnummer
ATCC 39984. Dieser Stamm umfaßt ein pBR322-Plasmid mit einem darin
inserierten La-Antigen-Gen, welches in E. coli HB101 transformiert worden ist.
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