DE3586697T2

DE3586697T2 - Aktive thymopentin-analoga.

Info

Publication number: DE3586697T2
Application number: DE8585304559T
Authority: DE
Inventors: Tapan Audhya; Gideon Goldstein; George Heavner; Daniel Kroon
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1985-06-26
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2005-06-27
Also published as: USRE34165E; JPH0689029B2; EP0166612A3; NO167924B; DE3586697D1; NO852567L; US4629723A; IL75637A0; CA1269499A; AU4421585A; ATE81135T1; FI92325B; JPS6118799A; DK289285A; NZ212461A; EP0166612A2; FI92325C; IL75637A; FI852522A0; DK171238B1

Description

Diese Erfindung betrifft generell neue, immunodulatorische Peptide, und insbesondere betrifft sie Analoga des Peptides Thymopentin, welche eine stark erhöhte Wirksamkeit haben.
In den (der EP-A-0 018 182 äquivalenten) US-PS'en US-A-4 190 646 und US-A-4 261 886 sind verschiedene Pentapeptide beschrieben, welche eine ähnliche Wirkung wie das als Thymopoietin bekannte langkettige Polypeptid haben, welches in der US-A-4 002 740 und in der US-A-4 077 949 beschrieben ist. Das Thymopoietin stimuliert selektiv die Differenzierung van T-Zellen. Das in der US-A-4 190 646 beschriebene Pentapeptid, welches die Sequenz H-ARG-LYS-ASP- VAL-TYR-OH aufweist, ist als das Thymopoietinpentapeptid oder "Thymopentin" bekannt. Die biologische Wirkung von bestimmten dieser Peptide ist in einem Aufsatz von M.E.Weksler et al., J. Exp. Med. 148: 996 - 1006 (1978) beschrieben. In den (der EP-A-0 025 897 äquivalenten) US-A-4 361 673 und US-A-4 420 424 sind ebenfalls verschiedene Peptide beschrieben, von welchen behauptet wird, daß sie eine ähnliche Wirkung wie das Thymopoietin aufweisen. Ein aus Rindermilz isoliertes und mit "Splenin" bezeichnetes Peptid von ähnlicher Struktur ist in den Publikationen von Audhya et al., Biochemistry, 20, 6195 - 6200, (1981) und Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 81, 2847 - 2849, (Mai 1984), beschrieben. Dieses Material stimuliert die Induktion von sowohl T-Zellen als auch von B-Zellen. Andere Pentapeptide, wie z.B. ARG-LYS-GLU-VAL-TRG sind in der (der EP-A-0 164 654 äquivalenten) US-A-4 658 016 beschrieben.
In der EP-A-0 146 266 sind gewisse enzymresistente immunmodulatorische Peptide beschrieben.
Von dem Thymopentin ist gezeigt worden, daß es eine modulatorische Wirkung auf das Immunsystem von Tieren und Menschen ausübt und somit nützlich für die Behandlung von Krankheiten ist, welche mit Defekten der Immunfunktion zusammenhängen, und zwar gleichgültig, ob sich solche Defekte als eine mangelhafte oder eine übermäßige Immunfunktion manifestieren. Siehe z.B. Audhya, T. und Goldstein, G., Int. J. Pept. Protein Res., 22, 568 - 572 (1983); Aiuti et al., Lancet 1:551 - 555 (1983); und Levinsky et al., in "Primary Immun-deficiency Diseases", Wedgewood, Rosen, und Paul, Hsg. 19, 273 - 276 (1983). Bezüglich einer Erörterung von anderem Grundlagenmaterial und der für die vorliegende Erfindung relevanten biologischen Vorgänge sei auf diese Aufsätze und auf die obgenannten Patentschriften und den obgenannten Aufsatz verwiesen.
Durch die vorliegende Erfindung werden Peptide und Peptidzusammensetzungen zur Verfügung gestellt, welche überraschenderweise wirksamer als Thymopentin oder Splenin sind und welche somit signifikante Vorteile bei der Behandlung von Immundefekten darbieten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Peptide mit der folgenden Formel:
R-V-W-X-Y-Z-R¹ (I)
oder ein pharmazeutisch annehmbares Säure- oder Basenadditionssalz hievon, worin:
R für H, Niederalkyl, Formyl oder Niederalkanoyl steht;
V für ARG oder D-ARG steht;
W für PRO, Dehydro-PRO oder AIB steht, worin AIB α-Aminoisobutyryl bedeutet;
X für ASP, D-ASP, GLU oder D-GLU steht;
Y für VAL, LYS, LEU, ILE, GLU, ALA, GLN, D-VAL, D-LYS, D-LEU, D-ILE, D-GLU, D-ALA oder D-GLN steht;
Z für PHE, HIS, TRP, D-PHE, D-HIS oder D-TRP steht;
R¹ für OH oder NR²R³ steht; und
R² und R³ jeweils unabhängig voneinander unter Wasserstoff oder Niederalkyl ausgewählt sind.
Es ist überraschenderweise gefunden worden, daß die gegenständlichen Peptide eine thymopentinartige oder spleninartige Aktivität mit einer Wirksamkeit aufweisen, die etwa das zehnfache jener von Thymopentin oder Splenin selbst ausmacht.
Die gegenständlichen Peptide, in welchen W für PRO, Dehydro-PRO oder AIB steht, besitzen auch eine überraschende Widerstandsfähigkeit gegenüber einem Abbau drrch Enzyme, wie dies in der obgenannten europäischen Patentanmeldung beschrieben ist.
Wie oben bereits angegeben worden ist, betrifft diese Erfindung neue Peptide mit thymopoietinartiger Aktivität, diese Peptide enthaltende, therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Anwendung.
In ihrem breitesten Umfang schafft die vorliegende Erfindung Peptide mit der folgenden Formel:
R-V-W-X-Y-Z-R¹ (I)
oder ein pharmazeutisch amehmbares Säure- oder Basenadditionssalz hievon,
worin R, V, W, X, Y, Z und R¹ wie oben definiert sind. Bevorzugte Peptide der vorliegenden Erfindung sind jene der Formel (I), worin Z für PHE, D-PHE, HIS oder D-HIS steht, und insbesondere jene, worin W auch für PRO steht. In höherem Maße bevorzugte Peptide sind jene der Formel I, worin R Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet, V für ARG steht, X für ASP steht und Z für PHE oder HIS steht, und im spezielleren jene, worin W auch für PRO steht. In noch höherem Maße bevorzugte Peptide sind H-ARG-LYS-ASP-VAL-PHE-OH, H-ARG-PRO-ASP-VAL- PHE-OH, H-ARG-PRO-ASP-VAL-HIS-OH, α-Acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-NH&sub2; und Niedrigalkanoyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH.
Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen umfaßt der Ausdruck "Niedrigalkyl" verzweigt- und geradkettige, gesättigte Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Pentyl und Hexyl, während der Ausdruck "Niedrigalkanoyl"
Niedrigalkyl-O -
bedeutet.
Als Säuren, welche befänigt sind, mit diesen Peptiden Salze zu bilden, können anorganische Säuren, wie z.B. Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Perchlor-, Salpeter-, Thiocyan-, Schwefel-. und Phosphorsäure, sowie organische Säuren, wie z.B. Ameisen-, Essig-, Propion-, Glykol-, Milch-, Brenztrauben-, Oxal-, Malon-, Succin-, Malein-, Fumar-, Anthranil-, Zimt-, Naphthalinsulfon- und Sulfanilsäure, angeführt werden.
Als Basen, welche befähigt sind, mit diesen Peptiden Salze zu bilden, können anorganische Basen, wie z.B. Natrium-, Ammonium- und Kaliumhydroxid, sowie organische Basen, wie z.B. Mono-, Di- und Trialkyl- und -arylamine (z.B. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin und Dimethylamin) und gegebenenfalls substituierte Ethanolamine (z.B. Ethaholamin und Diethanolamin), angeführt werden.
In den vorliegenden Unterlagen werden die Aminosäurenkomponenten der Peptide und gewisse, für deren Herstellung verwendete Materialien der Einfachheit halber durch Abkürzungen identifiziert. Diese Abkürzungen sind die folgenden: Aminosäure Abkürzung: L-Alanin D-Alanin L-Arginin D-Arginin L-Asparginsäure D-Asparginsäure L-Glutaminsäure D-Glutaminsäure L-Glutamin D-Glutamin L-Histidin D-Histidin L-Isoleucin D-Isoleucin L-Leucin D-Leucin L-Lysin D-Lysin α-Aminoisobutyryl L-Phenylalanin D-Phenylalanin L-Prolin L-Tryptophan D-Tryptophan L-Valin D-Valin
Die Peptide dieser Erfindung können generell nach bekannten Techniken hergestellt werden. Die Peptide können zweckmäßig nach der Festphasensynthesetechnik hergestellt werden, die erstmals von Merrifield in JACS, 85, 2149 - 2154 (1963) beschrieben worden ist. Solche Verfahren sind auch in gewissen der oben angeführten, zum Stande der Technik gehörenden Patentschriften beschrieben. Andere Techniken finden sich z.B. in dem Buch "Peptide Synthesis" von M. Bodanszky et al., 2.Auflage, 1976, John Wiley & Sons, sowie in anderen, dem Fachmann bekannten Nachschlagewerken. In solchen Synthesen brauchbare, geeignete Schutzgruppen und deren Abkürzungen finden sich in dem obigen Text, sowie in J.F.W.McOmie, "Protective Groups in 0rganic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973. Die üblichen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Schutzgruppen sind t-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyl (BZL), t-Amyloxycarbonyl (AOC), Tosyl (TOS), o-Bromphenylmethoxycarbonyl (BrZ), 2-6-Dichlorbenzyl (BZLCl&sub2;), und Phenylmethoxycarbonyl (Z oder CBZ).
Es hat sich erwiesen, daß die Peptide dieser Erfindung, worin X für ASP oder D-ASP steht, eine ähnliche biologische Wirkung wie das Thymopoietin, dessen Wirkung in den oben angeführten US-PS'en und Publikationen beschrieben ist, zeigen. Diese biologische Wirkung wird durch einen Test nachgewiesen, bei welchem die Induktion der Produktion von zyklischem GMP (Guanosin-Monophosphat) in einer Human-T-Zellinie im Vergleich zu Thymopoietin gemessen wird. Die Induktion der Erzeugung von c-GMP durch ein Testpeptid in diesem Test zeigt die Fähigkeit des Testpeptides an, sich an die Thymopoietin-Rezeptorstelle auf der Zelle zu binden und eine thymopoietinartige, biologische Aktivität zu induzieren. Wie aus den nachstehend angeführten Ergebnissen ersehen werden kann, sind die gegenständlichen Peptide bis zu etwa zehnmal wirksamer als Thymopentin, wodurch sie einen signifikanten Vorteil darbieten. Wegen der Kosten der Herstellung von Peptiden und wegen des raschen Abbaues von Peptiden, der oft in lebenden Systemen beobachtet wird, legt man großen Wert auf Peptide, wie die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen, welche eine erhöhte Wirksamkeit aufweisen.
Die biologische Wirksamkeit der gegenständlichen Peptide, worin X für ASP oder D-ASP steht, zeigt sich ebenfalls durch das Binden dieser Peptide an den Zellmembranrezeptor für die aktive Stelle des Thymopoietins.
Die Peptide dieser Erfindung, worin X für GLU oder D-GLU steht, zeigen eine ähnliche biologische Aktivität wie Splenin und bewirken die Differenzierung von sowohl Thy-1-Zellen in Thy-1&spplus;-T-Zellen als auch von Lyb-2-Zellen in Lyb-2&spplus;-B-Zellen, wie sich dies in dem Assay von Scheid et al., J. Exp.Med. 147: 1727 - 1743 (1978), zeigt.
Bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, war es völlig unerwartet, daß man Peptide mit derart erhöhter Wirksamkeit im Vergleich zu Thymopentin dadurch würde herstellen können, daß man die Aminosäure Tyrosin in der 5-Stellung durch Phenylalanin, Histidin oder Tryptophan ersetzt. In den oben angeführten Literaturstellen wird generell auf die Notwendigkeit eines Tyrosinaminosäurerestes oder eines tyrosinartigen Aminosäurerestes in der Stellung 5 verwiesen. In den zum Stande der Technik gehörenden Publikationen fand sich ganz gewiß kein Hinweis darauf, daß man durch die Verwendung der gegenständlichen Peptide eine derart stark erhöhte Wirksamkeit erzielen könnte.
Wegen der immunmodulatorischen Eigenschaften der gegenständlichen Peptide sind dieselben therapeutisch nützlich bei der Behandlung von Menschen und Tieren, da sie die Fähigkeit haben, die Differenzierung von lymphopoetischen Stammzellen in den hämopoetischen Geweben zu thymusabhängigen Zellen (T-Zellen), welche befähigt sind, an der Immunantwort des Körpers teilzunehmen, zu induzieren. Demzufolge werden die gegenständlichen Peptide als eine vielfache therapeutische Anwendbarkeit aufweisend angesehen.
Erstens finden diese Verbindungen Verwendung in verschiedenen Bereichen der Thymusfunktion und der Immunität, weil sie die Fähigkeit aufweisen, gewisse der angegebenen Funktionen des Thymus auszuüben. Eine soloche Verwendung liegt in der Behandlung des Di-George-Syndroms, eines Zustandes mit kongenitalem Fehlen des Thymus. Die Verabreichung von einem der gegenständlichen Peptide an einen an dem Di-Geroge-Syndrom leidenden Patienten trägt dazu bei, diesen Mangel zu überwinden. Fachleute auf immunologischem Gebiet können leicht den geeigneten Verabreichungsweg bestimmen (vorzugsweise wählt man die parenterale Verabreichung), und sie können die wirksame Menge von einem der gegenständlichen Peptide für die Behandlung des Di-George-Syndroms bestimmen. Da die gegenständlichen Peptide wirksamer als Thymopentin sind, sind sie therapeutisch nützlicher als zum Stande der Technik gehörende Peptide.
Außerdem werden die gegenständlichen Peptide als nützlich zum Unterstützen der kollektiven Immunität des Körpers angesehen und zwar dadurch, daß sie die therapeutische Stiuulation der zellulären Immunität erhöhen bzw. dieselbe unterstützen und dadurch von Nutzen bei der Behandlung von Krankheiten sind, die mit einer chronischen Infektion einhergehen, wie z.B. von Pilz- oder Mykoplasmainfektionen, Tuberkulose, Lepra, akuten und chronischen viralen Infektionen und dergleichen mehr.
Die gegenständlichen Verbindungen werden generell als nützlich in jedem Bereich angesehen, in welchen die zelluläre Immunität eine Rolle spielt, und als ganz besonders nützlich dort, wo Immundefekte vorliegen, wie z.B. bei dem oben erwähnten Di-George-Syndrom. So können die gegenständlichen Peptide dort, wo es auf Grund eines Ungleichgewichtes zwischen T-Zellen und B-Zellen zu einer übermäßigen Antikörperproduktion kommt, diesen Zustand dadurch korrigieren, daß sie die Produktion von T-Zellen stimulieren. Es ist daher zu erwarten, daß die gegenständlichen Verbindungen bei gewissen Autoimmunkrankheiten von therapeutischem Nutzen sein werden, bei welchen schädigende Antikörper erzeugt werden, wie z.B. bei systemischem Lupus erythematodes und bei rheumatoider Arthritis.
Die gegenständlichen Peptide, worin X für GLU oder D-GLU steht, sind auch nützlich zum Induzieren der Differenzierung von Vorläufer-B-Zellen zu reifen B-Zellen, welche zur Produktion von Antikörpern befähigt sind. Diese Peptide sind daher nützlich bei der Behandlung solcher Zustände, wie z.B. der mit dem X-Chromosom zusammenhängenden Hypogammaglobulinämie des Kindesalters, wo ein Defekt in einem solchen Differenzierungsmechanismus vorliegt.
In ihrer breitesten Anwendung sind die gegenständlichen Verbindungen nützlich zum Regeln des Immunsystems eines Human-Subjektes oder eines tierischen Subjektes, welches eine solche Regelung benötigt. Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen bedeutet der Ausdruck "Regeln", daß die gegenständlichen Verbindungen eine Rückkehr des Immunsystems von einem abnormen, krankhaften Zustand zu einem normalen, ausgeglichenen Zustand bewirken. Obgleich diese Regelung sehr wohl eine umfassende Anwendung beim Korrigieren von Immundefekten (wie z.B. des Di-George-Syndroms) finden kann, ist sie auch zum Korrigieren von Zuständen mit übermäßiger immunologischer Aktivität (z.B. bei Autoimmunkrankheiten) anwendbar. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf Verfahren zum Regeln des Immunsystems eines eine solche Regelung benötigenden Individuums, welche Verfahren das Verabreichen einer im immunregulatorischen Sinne wirksamen Menge von einer der gegenständlichen Verbindungen an dieses Individuum umfassen; und die vorliegende Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zusammensetzungen für die Ausführung dieser Verfahren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln von Zuständen, welche das Ergebnis eines relativen oder absoluten T-Zellen- oder B-Zellen-Mangels in einem Human-Subjekt oder einem tierischen Subjekt, das einen solchen Zustand aufweist, sind, und welches Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptides der Formel (I) an das betreffende Subjekt umfaßt. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für die Behandlung von Zuständen, welche das Ergebnis eines relativen oder absoluten Mangels in bzw. an dem Thymus in einem Subjekt sind, und welches Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptides der Formel (I) an das betreffende Subjekt umfaßt. Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, welche zum Behandeln von Zuständen wirksam ist, welche das Ergebnis von Mangelzuständen hinsichtlich der T-Zellen oder hinsichtlich der B-Zellen sind, oder welche das Ergebnis eines Mangels in bzw. an dem Thymus selbst sind. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Induzieren lymphopoetischer Stammzellen in einem Subjekt im Sinne einer Entwicklung der Kennmerkmale von thymusabhängigen Lymphozyten, welches Verfahren das Verabreichen einer wirksamen, induzierenden Menge eines Peptides der Formel (I) an das betreffende Subjekt umfaßt. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Induzieren von Vorläufer-B-Zellen in einem Subjekt im Sinne der Entwicklung der Kennmerkmale von reifen B-Zellen, welches Verfahren das Verabreichen einer wirksamen, induzierenden Menge eines Peptides der Formel (I) an das betreffende Subjekt umfaßt. Durch die Erfindung werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zum Ausführen dieser Verfahren zur Verfügung gestellt.
Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid der Formel I oder ein Basen- oder Säureadditionssaiz hievon als Wirkstoff in innigem Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger nach den herkömmlichen pharmazeutischen Vermischungstechniken vereinigt. Dieser Träger kann in einer umfassenden Vielfalt von Formen vorliegen, und zwar in Abhängigkeit von der für die Verabreichung, z.B. eine sublinguale, rektale, nasale, orale oder parenterale, gewünschten Form des Präparates. Zur Herstellung der Zusammensetzungen in oraler Dosierungsform können irgendwelche der üblichen, pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie z.b. Wasser, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel und Färbemittel, für den Fall oraler, flüssiger Präparate (z.B. Suspensionen, Elixiere und Lösungen), oder solche Träger, wie z.B. Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel und Sprengmittel für den Fall oraler fester Präparate (z.B. von Pulvern, Kapseln und Tabletten). Es können auch Formen mit geregelter Freisetzung verwendet werden. Wegen ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Einheitsdosierungsform dar, in welchem Fall selbstverständlich feste pharmazeutische Träger verwendet werden. Gewünschtenfalls können die Tabletten nach Standardtechniken mit einem Zuckerüberzug oder mit einem darmlöslichen Überzug versehen werden.
Für parenterale Produkte wird der Träger gewöhnlich steriles Wasser umfassen, obgleich auch andere Bestandteile darin enthalten sein können, um (z.B.) die Löslichkeit zu verbessern oder zum Zwecke des Konservierens. Es können auch injizierbare Suspensionen hergestellt werden, in welchem Falle geeignete flüssige Träger oder Suspendiermittel verwendet werden können.
Die gegenständlichen Peptide sind im allgemeinen wirksam, wenn sie parenteral in Mengen von mehr als etwa 1 ug/kg Körpergewicht verabreicht werden. Für die Behandlung des Di-George-Syndroms können die Peptide parenteral, in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht, verabreicht werden. Generell kann der gleiche Bereich von Dosierungsmengen zur Behandlung von anderen der oben angeführten Kranheiten oder Zustände angewendet werden, bei welchen ein Immundefekt zu behandeln ist. Größere Mengen (z.B. etwa 10 bis 1.000 mg/kg Körpergewicht) sind zum Unterdrücken einer übermäßigen Immunaktivität nützlich.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, ohne daß die Absicht bestünde, die Erfindung spezifisch darauf zu beschränken. In den Beispielen und in der gesamten übrigen Beschreibung beziehen sich die Teile, sofern nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.

BEISPIEL I:

Nα-Acetyl-arginyl-prolyl-aspartyl-valyl-phenylalanin:

Das in der Überschrift angegebene Peptid wurde nach dem Festphasenverfahren synthetisiert, wobei von dem BOC-PHE-Merrifield-Harz (12,03 g, 0,51 mÄquiv./g) ausgegangen wurde. Das Harz wurde nacheinander mit drei Äquivalenten von BOC-VAL, BOC-β-BZL-ASP und BOC-PRO gekuppelt. Das Kupplungsmittel war - während der gesamten Synthese - 1:1 DCC:HOBT in 4:1 CH&sub2;Cl&sub2;:DMF.
Etwa ein Drittel dieses Tetrapeptidrarzes wurde aufgehoben. Der Rest wurde - unter Anwendung der gleichen Kupplungsbedingungen wie oben - mit Ng-TOS-Nα-AOC-ARG gekuppelt.
Etwa die Hälfte des Pentapeptidharzes wurde aufgehoben. Der Rest wurde mit TFA behandelt und mit DIEA neutralisiert. Dann wurde dieses Produkt mit Ac&sub2;O (3 ml) und DMAP (0,3 g) in CH&sub2;Cl&sub2; (40 ml) während 60 min behandelt. Das Harz wurde gewaschen, getrocknet und in HF (40 ml):Anisol (10 ml) bei 0º während 60 min abgespalten. Die restlichen Feststoffe wurden mit 10%iger HOAc extrahiert und lyophilisiert, wobei 1,36 g Rohpeptid erhalten wurden.
Das Rohpeptid wurde auf einer Sephadex-DEAE-Säule 2,6 x 90 cm (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke) mit 0,05M NH&sub4;HCO&sub3;, vom pH 5 (3,5 Liter), bei 100 ml/h Fließgeschwindigkeit, und bei 13 ml-Fraktionen, und mit einem 206 nm-Detektor gereinigt. Die Fraktionen 170 bis 205 wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei die im Titel angeführte Verbindung, 830 mg, erhalten wurde.
TLC (Dünnschichtchromatographie):: Silikagel, 250 um Lösungsmittel: 1:1 Trifluorethanol:NH&sub4;OH
Aminosäurenanalyse:
Arg, 1,02; Pro, 0,98; Asp, 0,97; Val, 1,02; Phe, 1,01. Peptidgehalt: 65,3 %

BEISPIEL II:

Nα-Formyl-arginyl-prolyl-aspartyl-valyl-phenylalanin:

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde nach dem Festphasenverfahren hergestellt,wobei von dem (Ng-TOS-Nα-AOC)-ARG-PRO-(β-BZL )-ASP-VAL-PHE- Harzester des Beispiels I (etwa 2 mMol) ausgegangen wurde. Nach dem Entfernen der Schutzgruppen mit 1:1 TFA/CH&sub2;Cl&sub2; und dem Neutralisieren mit DIEA wurde das Harz mit p-Nitrophenylformiat (1,0 g) und HOBR (0,9 g) in 5:1 CH&sub2;Cl&sub2;:DMF (30 ml) während 16 h behandelt. Das Harz wurde gewaschen und erneut mit p-Nitrophenylformiat (1,0 g) und DMAP (0,2 g) in CH&sub2;Cl&sub2; während 1 h behandelt.
Das Formylpeptidharz wurde in HF (60 ml) und Anisol (10 ml) bei 0º während 1 h abgespalten. Die restlichen Feststoffe wurden mit 0,2%iger NH&sub4;OH-Lösung behandelt, und der Extrakt wurde lyophilisiert, wobei 1,00 g eines farblosen Feststoffes erhalten wurden.
Das Peptid wurde auf einer Sephadex-DEAE-Säule (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke), 2,6 x 90 cm, mit 0,1M NH&sub4;HCO&sub3; vom pH 7,5, bei 100 ml/h Fließgeschwindigkeit und bei 13 ml Fraktionen, und mit einer 206 nm-Detektor gereinigt. Die Fraktionen 105 bis 130 wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei die im Titel angeführte Verbindung, 675 mg, als ein farbloser Feststoff erhalten wurde.
TLC: Silikagel, 250 um Lösungsmittel: Aminosäurenanalyse: Peptidgehalt: 78,5 %.

BEISPIEL III:

Arginyl-prolyl-aspartyl-valyl-phenylalanin:

Das in der Überschrift angegebene Peptid wurde nach dem Festphasenverfahren hergestellt,wobei von dem BOC-PHE-Merrifield-Harz (8,06 g, 0,5/mÄquiv./g) ausgegangen wurde. Das Harz wurde nacheinander mit drei Äquivalenten von BOC-VAL (einmal mit DCC/4-Pyrollidinopyridin, nochmals gekuppelt mit DCC/HOBT), BOC-β-BZL-ASP (DCC/HOBT), BOC-PRO(DCC/HOBT) und Ng-TOS-Nα-AOC-ARG (DCC/HOBT) gekuppelt. Das Lösungsmittel war durchgehend 4:1 CH&sub2;Cl&sub2;:DMF.
Etwa die Hälfte dieses Harzes wurde getrocknet und in HF (40 ml) :Anisol (10 ml):Mercaptoethanol (1 ml) bei 0º während 60 min abgespalten. Die restlichen Feststoffe wurden mit 10 %iger HOAc extrahiert und lyophilisiert, wobei 1,34 g Rohpeptid erhalten wurden.
Das Rohpeptid wurde auf einer Sephadex-CM-25-Säule, 2,6 x 90 cm (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke) bei Gradientenelution von 0,05M NH&sub4;OAc vom pH 5 (2,1 Liter) bis 0,3M NH&sub4;OAc vom pH 5 (2,1 Liter), 100 ml/h Fließgeschwindigkeit, und bei 13 ml-Fraktionen und mit einem 206 nm Detektor, gereinigt. Die Fraktionen 61 bis 100 wurden gesammelt und lyophilisiert. Der Feststoff wurde auf einer Sephadex-G-10-Säule chromatographiert (wobei mit 1%iger HOAc eluiert wurde) (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke), gesammelt und lyophilisiert, wobei die im Titel angegebene Verbindung, 780 mg, erhalten wurde.
TLC: Silikagel G, 250 um Lösungsmittel: 1:1 Trifluorethanol:NH&sub4;OH Aminosäurenanalyse: Peptidgehalt: 61 %.
Die obigen Beispiele sind angeführt worden, um die gegenständliche Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht, um deren Schutzumfang einzuschränken, welcher Schutzumfang nur in den angeschlossenen Patentansprüchen angeführt ist.

BEISPIEL IV:

Acetyl-arginyl-α-aminoisobutyryl-aspartyl-valyl-phenylalaninamid, solvatiert:

A. TFA Asp(OBzl)-Val-Phe-NH-MBHA-Harz:

p-Methylbenzhydrylamin-Harz (70 g; 0,3 mMol/g Harz) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; während einer Stunde aufquellen gelassen. Dem Harz wurden über DCC-vermitteltes Kuppeln Boc-Phe, Boc-Val und Boc-Asp(OBzl)-OH einverleibt. Nach dem Entfernen der N-terminalen BOC-Gruppe wurde das Peptid-Harz getrocknet und für die Synthese anderer Peptide verwendet.

B. Ac-Arg-Aib-Asp-Val-Phe-NH&sub2;:

TFA Asp(OBzl)-Val-Phe-NH-MBHA-Harz (6 g) wurde nacheinander mit Boc-Aib und Aoc-Arg(Tos)-OH unter Anwendung eines DCC/HOBt-Kuppelns gekuppelt. Nach dem Entfernen der AOC-Gruppe des Arg wurde das Peptid-Harz mit Ac&sub2;O/Pyridin (1:1) acetyliert. Dann wurde das Peptid-Harz (5 g) mit HF/Anisol (9:1; 50 ml) bei 0ºC während einer Stunde gespalten. Das Peptid wurde mit 5%iger HOAc/H&sub2;O (3 x 50 ml) exträhiert und lyophilisiert, wobei 570 mg eines Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde auf einer Sephadex-DEAE-Säule (80 cm x 2,5 cm) (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke) chromatographiert, die mit ungepuffertem 0,05 M (NH&sub4;)HCO&sub3; ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Fließgeschwindigkeit betrug 85 ml/h, und es wurden Fraktionen von 10 ml gesammelt. Das Peptid wurde zwischen den Röhrchen 35 und 48 eluiert, und diese Fraktion wurde dann lyophilisiert, wobei 450 mg des Produktes erhalten wurden.
Dünnschichtchromatographie (Silikagel F&sub6;&sub0;; 200 um)
RfI 0,45 (NH&sub4;OH/Isopropanol = 37:84)
RfII 0,25 (n-BuOH/HOAc/H&sub2;O = 3:1:1)
Aminosäurenanalyse:
Arg, 1,01; Aib, 1,03; Asp, 1,03; Val, 0,99; Phe, 1,00.
Peptidgehalt: 88,3 %

BEISPIEL V:

Acetyl-arginyl-prolyl-aspartyl-valyl-phenylalanin-amid; solvatiert.

Ac-Arg(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Val-Phe-NH-MBHA-Harz wurde nach dem Festphasenpeptidsyntheseverfähren (SPPS) synthetisiert, wobei von 10 g des p-Methylbenzhydrylamin-Harzes (substituiert mit 0,3 mMol NH&sub2;/g Harz) ausgegangen wurde. Die Aminosäurenderivate und das DCC wurden in dreifachem Überschuß bei den folgenden Kupplungsvorgängen angewendet: Aoc-Arg(Tos)-OH, Boc-Pro, Boc-Asp(OBzl)- OH, Boc-Val und Boc-Phe. Dann wurde das Peptid-Harz (4 g) mit HF/Anisol (9:1; 40 ml) während einer Stunde bei 0ºC gespalten. Nach dem Entfernen von HF/Anisol wurde das Gemisch filtriert und mit Ether (3 x 30 ml) gewaschen. Das Peptid wurde mit 5%iger H0Ac/H&sub2;O (3 x 50 ml) extrahiert und lyophilisiert, wobei 315 mg des Produktes erhalten wurden. Dann wurde das Rohpeptid auf einer Sephadex-DEAE-Säule (2,5 cm x 80 cm) (Sephadex ist eine eingetragene Handelsmarke), die mit (ungepuffertem) 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3; ins Gleichgewicht gebracht worden war, gereinigt. Die Fließgeschwindigkeit betrug 85 ml/h, und es wurden Fraktionen von 12 ml/Röhrchen gesammelt. Das gewünschte Peptid wurde zwischen den Röhrchen 30 und 40 eluiert. Diese Fraktion wurde lyophilisiert, wobei 300 mg des Materials erhalten wurden.
Dünschichtchromatographie (Silikagel F&sub6;&sub0;; 200 um)
RfI 0,55 (NH&sub4;OH/Isopropanol = 37,84)
RfII 0,3 (n-BuOH/HOAc/H&sub2;O = 3:1:1)
Aminosäurenanalyse:
Arg, 1,00; Pro, 0,99; Asp, 0,99; Val, 1,00; Phe, 1,00.
Peptidgehalt: 57,5 %

BEISPIEL VI:

Test auf zyklisches GMP:

Dieser Test mißt die Fähigkeit des Testpeptides, sich an den Zellmembranrezeptor der intakten CEM-Zelle zu binden und selektiv die Produktion von zyklischem GMP zu stimulieren, wie dies auch das Thymopoietin selbst tut.
Die CEM-Zellinie wurde von der American Type Culture Collection erhalten, und sie wurde in RPMI-1640-Medium, das mit 10 % von durch Wärme inaktiviertem Fetalrinderserum, 10 % von durch Wärme inaktiviertem Pferdeserum, 2 mM L-Glutamin und 50 ug/ml von Gentamycin ergänzt worden war, bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre, welche 5 % CO&sub2; enthielt, auf eine Enddichte von 3 - 4 x 10&sup6; Zellen/ml kultiviert. Bei dieser Konzentration befanden sich die Zellen in der frühen,stationären Phase der Wachstumskurve, und sie wurden auf Grund der Ausschließungsprüfung mit Trypanblau als zu mehr als 90 % lebensfähig beurteilt. Die Zellen wurden während vier Tagen gezüchtet und dann geerntet. Nach dem Ernten wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen, und sie wurden erneut im RPMI-1640-Medium in einer Konzentration von 3,12 x 10&sup7; Zellen/ml suspendiert. Nachdem die Zellen bei 37ºC während 30 min ins Gleichgewicht kommen gelassen worden waren, wurden verschiedene Konzentrationen der Testpeptide in einem Volumen von 25 ul des Mediums auf 1 ml der Zellen zugesetzt, wobei die Anfangskonzentration der zugesetzten Testverbindung so ausgewählt wurde, daß sich in dem Medium die gewünschte Endkonzentration des Testpeptides ergeben würde. Das Testpeptid wurde sofort mit der Zellsuspension vermischt. Die Inkubation wurde in einem Schüttelwasserbad bei 37ºC während 4 - 5 min fortschreiten gelassen, und sie wurde dann durch Zugabe von eiskalter Trichloressigsäure (10%ig; 1 ml) beendet.
Dann wurden die in der TCA befindlichen Zellen homogenisiert und beschallt, um das zyklische Nukleotid freizusetzen. Die so entstandene Suspension wurde bei 3000 g während 20 min bei 4ºC zentrifugiert, und das so entstandene Präzipitat wurde in 0,1 N NaOH aufgelöst und während weiterer 30 min beschallt, wonach der Proteingehalt nach dem Verfahren von Cadman et al, Anal. Biochem., 96, 21 - 23 (1979), bestimmt wurde. Die TCA wurde dann aus der überstehenden Fraktion durch viermaliges Extrahieren mit je 5 ml von mit Wasser gesättigtem Diethylether entfernt. Nach der letzten Extraktion wurden die restlichen Spuren des Ethers aus der überstehenden Fraktion durch Erhitzen derselben während 10 min in einem Wasserbad von 50ºC entfernt. Nach dem Lyophilisieren der extrahierten, überstehenden Fraktion wurde dieselbe in 50 mM Acetatpuffer vom pH 6,2 rekonstituiert, und zwar für den Radioimmunoassay auf das zyklische Nukleotid unter Verwendung des Assay-Kits NEX-133, New England Nuclear, Boston, MA 02113.
Es wurde ein herkömmlicher kompetitiver Radioimmunoassay gegen das radioaktiv markierte, zyklische GMP durchgeführt, um die Menge des zyklischen GMP festzustellen, die von jeder Konzentration des Testpeptides induziert worden war. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 und in der nachstehenden Tabelle angeführt, in welcher repräsentative, gegenständliche Peptide im Vergleich mit Thymopentin (als "TP-5" bezeichnet) und mit einem "Nonsense"-Peptid H-ASP-ARG-TYR- LYS-VAL-OH geprüft worden sind. Diese Ergebnisse zeigen die überlegene Wirksamkeit der gegenständlichen Peptide im Vergleich mit Thymopentin, und sie zeigen auch die Spezifität des Tests auf Peptide, welche eine Thymopentinartige Aktivität aufweisen. TABELLE 1: Konzentration des erzeugten c-GMP (pMol/ml) Peptid Konzentration des Peptides (ug/ml)
Andere repräsentative Verbindungen, welche bei diesem Test überlegene Ergebnisse zeigten, waren: N-α-Acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-NH&sub2;; N-α-Acetyl-ARG-AIB- ASP-VAL-PHE-NH&sub2;; und N-α-Acetyl-ARG-3,4-dehydro-PRO-ASP-VAL-TYR-NH&sub2;.

BEISPIEL XVI:

Rezeptor-Assay:

Dieser Test mißt die Fähigkeit des Testpeptides, mit markiertem Thymopoietin um das Binden an das isolierte Thymopoietin-Zelloberflächen-Rezeptorprotein aus CEM-Zellen zu konkurrieren.

Materialien:

Die CEM-Zellinien wurden von der American Type Culture Collection erhalten. 3-Nitro-2-pyridinsulfonylchlorid und 2-Pyridinthiol-1-oxid wurden von Dr. Rei Matsueda, Sanyo Laboratories, Tokyo, zur Verfügung gestellt. RPMl-1640, Fetalrinderserum und L-Glutamin wurden von Gibco bezogen, Gentamycin wurde von Schering bezogen und an Lectin gekuppelte Agaroseperlen wurden von Vector Laboratories bezogen. Sephadex wurde von Pharmacia Fine Chemicals bezogen und Human-IgG wurde von Miles Laboratories bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden aus üblichen Handelsquellen bezogen, und sie wiesen Reagenzien-Qualität auf. Kaninchen-Anti-Thymopoietin-Antikörper und Ubiquitin wurden nach bekannten Techniken hergestellt. Alle anderen Chemikalien wurden aus üblichen Handelsquellen bezogen, und sie wiesen Reagenzien-Qualität auf. Kaninchen-Anti-Thymopoietin-Antikörper und Ubiquitin wurden nach bekannten Techniken hergestellt.
Die verwendeten Abkürzungen sind:
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung:
TCA Trichloressigsäure;
SDS Natriumdodecylsulfat;
Con A Concavalin A;
TP Thymopoietin;
PEG Polyethylenglykol;
BSA Rindersermmalbumin;
I.P. intraperitoneal;
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid;
FTS "facteur thymique serique" (Thymusserumfaktor)
CRF Corticotropin-Releasing Factor (Corticotropin- Freisetzungsfaktor)
ACTH Adrenocorticotropes Hormon;
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethan-sulfonsäure.

Herstellung von Membran-Glykoprotein:

Die CEM-Human-Lymphoid-Zellinie wurde in RPMI-1640-Medium, das mit 10 % von durch Wärme inaktiviertem Fetalrinderserum, 2 mM L-Glutamin und 50 ug/ml von Gentamycin ergänzt worden war, bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre, welche 5% CO&sub2; enthielt, auf eine Enddichte von 3 - 4 x 10&sup6; Zellen/ml kultiviert. Bei dieser Konzentration befanden sich die Zellen in der frühen, stationären Phase der Wachstumskurve, und sie wurden auf Grund der Ausschließungsprüfung mit Trypanblau als zu mehr als 90 % lebensfähig beurteilt.
Die Membran-Glykoproteine wurden nach einer Modifikation der Technik von Hedo et al, Biochem.20, 3385 - 3393 (1981), hergestellt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, und sie wurden in 40%iger Saccharose,50 mM Hepes, 1 % EDTA, 0,1 % O-Phenanthrolin, und 1 mM PMSF (in Methanol), vom pH 7,8 suspendiert und in einem Glashomogenisator bei Zimmertemperatur homogenisiert. Die Gesamtsuspension wurde dann mit einem Zellzertrümmerungsbeschallungsgerät mit einer Schalltrichterschale als zusätzlicher Ausrustung ("sonicator with a cup horn attachment") (Modell W-225R) bei 35ºC während 10 min einer Beschallung unterworfen. Die Suspension wurde bei 600 x g während 10 min und bei 4ºC in einer Sorval-GLC-3-Zentrifuge zentrifugiert, und der Überstand wurde bei 20.000 x g in einer Sorval-5B-Zentrifuge bei 4ºC während 3 min erneut zentrifugiert. Die aus diesem Pellet erhaltene Rohmembranfraktion wurde in 50 mM Hepes, 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM PMSF vom pH 7,8, auf eine Proteinendkonzentration von 5 mg/ml, suspendiert. Das Löslichmachen des Proteins wurde durch Rühren der Suspension während 2 h bei 25ºC in Gegenwart von 1%igem Triton-X-100 (Endkonzentration) und von 0,1%igem Brij-96 (Polyoxyethylen 10, Oleylether) (Endkonzentration) bewirkt. Die Suspension wurde bei 200.000 x g während 2 h bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde bei -70ºC gelagert. Die Konzentration an löslichem Protein wurde nach der Technik von Cadman et al., unter Verwendung von BSA als Standard, und von Puffer als Kontrolle, gemessen.
Für die Reinigung des Rezeptorproteins wurde Weizenkeim-Agglutinin oder Ricinus-communis-Agglutinin-I verwendet. Alle Lectinperlen wurden bei 4ºC mit ihren entsprechenden Monosaccharid-Inhibitoren (300 mM) gelagert.
Für jeden Reinigungsvorgang wurden 2 ml von Lectin-Agarose in eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm gepackt und bei Zimmertemperatur mit 25 ml von 0,15 Mol NaCl, 50 mM Hepes, 0,1 %igem Triton-X-1 und 0,01 %igem SDS vom pH 7,8 gewaschen.
Die Säulen wurden mit 200 ml von 0,15 Mol NaCl, 50 mM Hepes und 0,1%igem Triton-X-100, vom pH 7,8, gewaschen, und anschließend daran wurde ein abschließender Waschvorgang mit diesem Puffer, welcher 10 mM MgSO&sub4; enthielt, vorgenommen. Zu allen Puffersystemen wurde PMSF (1 mM) zugegeben. Die löslichgemachten Membranproteine ( 10 mg) wurden fünfmal durch einzelne Säulen laufen gelassen (rezykliert). Die Säulen wurden dann mit 100 ml von 0,15M NaCl, 50 mM Hepes, 10 mM MgSO&sub4; und 0,1%igem Triton X-100, vom pH 7,8, bei 4ºC, gewaschen. Zum Eluieren der einzelnen Säften wurden Monosaccharid-Inhibitoren, bei einer Konzentration von 400 mM in 3 ml Waschpuffer, nämlich N-Acetylglucosamin für Weizenkeim-Agglutinin, und β-Methyl-D-Galactosid für Ricinus-communis-Agglutinin-I, verwendet. Die Monosaccharide wurden auf die Säule aufgebracht, welche während 30 bis 40 min angehalten wurde, um es der Säule zu ermöglichen, ins Gleichgewicht zu kommen, wonach weiter eluiert wurde. Das Protein-Eluat wurde gegen 5m ml von 50 mM Hepes, 10 mM MgSO&sub4; und 0, 1%iges Triton-X-100, vom pH 7,8, bei 4ºC, dialysiert.

Herstellung von radioaktiv markiertem Thymopoietin:

Thymopoietin wurde in 0,2M Natriumcarbonat-Bicarbonat-Puffer, vom pH 9,8, aufgelöst, um reaktive Aminogruppen zu erhalten. Zu der Thymopoietin-Lösung wurde Nitro-2-pyridinsulfonylchlorid in Dioxan (10:1 Mole) zugesetzt, und es wurde während 5 h bei 20ºC gerührt. Nach Zugabe von Wasser wurde das unlösliche Material zentrifugiert. Das geschützte Peptid wurde unter Anwendung von Sephadex-G-25-Chromatographle gereinigt,wonache ein Verdauen mit einem nachträglich Prolin-abspaltenden Enzym vorgenommen wurde, um das blockierte (geschützte), am NH&sub2;-Terminus befindliche Prolin zu entfernen. Methyl-3,5-di [¹²&sup5;I]-iodhhdroxybenzimidat (1,48 x 10¹&sup4; Bq/mM) (4000 Ci/mM) wurde in einer Konzentration von 2,035 x 1 Bq/ml (5,5 mCi/ml) in Methanol erhalten und wurde zur Trockene eingedampft. Der iodierte Imidoester (1,4 nM) wurde mit geschütztem Thymopoietin (5 ug; 0,9 mM) nach der Methode von Wood und Mitarbeitern in Anal. Biochem., 69, 339 - 349 (1975), mit den folgenden Modifikationen umgesetzt. Die Umsetzung wurde in 500 ul von 0,16 M Boratpuffer, vom pH 9,1, während 24 h bei 4ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 500 ul von 2 M Citrat-Phosphat-Puffer, vom pH 5,5, bei 4ºC, abgebrochen. Die Probe wurde auf einer Biogel-P-10-Säule ("Biogel" ist eine registrierte Handelsmarke) in Natriumpyrophosphat, vom pH 7,5 (15 Tropfen/Fraktion), bei 4ºC chromatographiert, um das freie Iod abzutrennen.
Das iodierte Peptid wurde in Wasser aufgelöst und mit 2-Pyridinthiol-1-oxid (10:1 Mole) während 5 h bei Zimmertemperatur behandelt, um die Schutzgruppen zu entfernen. Das von den Schutzgruppen befreite,markierte Peptid wurde auf einer Biogel-P-10-Säule gereinigt. Es wurden drei radioaktive Peaks (Spitzenfraktionen) erhalten, von denen die ersten zwei mit Kahinchen-Anti-Thymopoietin-Antikörper immunaktiv waren. Die erste Spitzenfraktion wurde dann auf eine 1 x 60 cm-Säule von DEAE-Sephadex A-25 aufgebracht, die mit 50 mM Tris-Puffer vom pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Iodierungsgemisch wurde mit diesem Puffer unter Verwendung eines linearen Gradienten von zunehmender Ionenstärke, von der Konzentration, mit der die Säule ins Gleichgewicht gebracht worden war, bis zu 1,0 M, eluiert. Die Radioaktivität jeder Fraktion wurde unter Verwendung eines LKB-1280-Gamma-Spektrometers bestimmt.
Die Fraktionen mit Spitzenwerten für die Radioaktivität aus jedem Reinigungsschema wurden auf ihr Bindungsvermögen mit überschüssigem Anti-Thymopoietin-Antikörper analysiert. Die Fraktionen aus dem Peak II (näniich die Fraktionen 35 bis 45) aus der DEAE-Sephadex A-25-Säule zeigten das höchste spezifische Bindungsvermögen und wurden in dem anschließenden Radiorezeptor-Assay verwendet.
Das iodierte Thymopoietin behielt seine biologische Aktivität bei, wobei diese biologische Aktivität auf Grund der Wirkung des iodierten Thymopoietins in einem Neuromuskeltest (Goldstein, Nature, 247, 11-14 (1974)) bestimmt wurde; und das iodierte Tbymopoietin behielt auch seine Wirkung auf die Synthese von zyklischem GMP durch CEM-Zellen bei.

Bindungstest:

Der Testpuffer wurde hergestellt, indem man 12 g Hepes, 1,2 g MgSO&sub4; und 1,2 g BSA zu 1000 ml von Glas-destilliertem Wasser hinzugügte. Unter Verwendung von 1N NaOH wurde ein pH-Wert von 7,65 erhalten. Die Vorrats-Standardlösung wurde unter Verwendung von Testpuffer hergestellt, und sie wurde während einer Woche verwendet. Der Test wurde in 12 x 75 mm-Glasteströhrchen durch Zugabe von 100 µm von der Standardlösung, 25 ul des Rezeptorproteins (150 - 200 ug/ml), 25 ul von ¹²&sup5;I-TP (80.000 "cpm" = Zählimpulse je min) und 20 ul von 1%igem Triton- X-100 durchgeführt, und das Volumen wurde mit Testpuffer auf 200 ul aufgefüllt. Nach einem 18-stundigen Inkubieren bei 4ºC wurden 200 ul von Human-IgG (1,5 mg/ml) (als Träger) und 200 ul von 35%igem PEG-8000 in PBS, vom pH 7,56, zugesetzt, und es wurde vermischt und während 30 min auf Eis inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und der Rückstand wurde mit 10%igem PEG in PBS, vom pH 7,3, gewaschen und in einem LKB-Gammazähler ausgezähit.
Die Radioaktivität in dem Niederschlag in Gegenwart von 1 mg/ml von nicht-radioaktivem Thymopoietin wurde als ein nicht-spezifisches Binden repräsentierend angesehen. TCA wurde zu dem Überstand zugegeben (bis zu einer Endkonzentration von 5 %), und die damit ausfällbare Radioaktivität wurde gemessen. Diese war jederzeit größer als 95 %, was eine nur minimale Freisetzung von freiem ¹²&sup5;I aus dem Tracer anzeigt.

Konkurrenz-Versuche:

Gemäß der obigen Verfahrensweise für den Bindungstest wurden 2,3 x 10&supmin;¹&sup0; M von ¹²&sup5;I-TP mit 4 ug von Bindungsprotein und von Testpeptid zusammen mit der gleichen Konzentration des Thymopoietin-37-45-Nonapeptides (H-VAL-GLU-LEU-TYR- LEU-GLN-SER-LEU-TNR-OH) inkubiert. Die Inkubation wurde während 12 h fortgesetzt, wonach das freie und gebundene ¹²&sup5;I-TP wie oben bestimmt wurde. Das Nonapeptid wird verwendet, um eine benachbarte Rezeptorstelle auf dem Rezeptorprotein zu blockieren. Ist diese benachbarte Rezeptorstelle nicht blockiert, dann kann sich etwas markiertes TP durch diese Stelle an das Rezeptorprotein selbst dann binden, wenn die Thymopentin-Rezeptorstelle durch das Testpeptid blockiert ist. Ein solches Binden steht in keiner Beziehung zu der Aktivität des Testpeptides und würde (falls es nicht durch das TP-37-45-Nonapeptid blockiert wäre) ungenaue Ergebnisse liefern. Die folgenden repräsentativen Verbindungen der Erfindung bewirkten eine Verdrängung, welche wenigstens 50 % von jener Verdrängung ausmachte, die durch die Eigenverdrängung des Thymopoietins bei gleichwertigen Konzenrationen verursacht wird.
N-α-Acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE- OH;
N-α-Formyl-ARG-PR0-ASP-VAL-PHE-OH; und
N-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH.
Zum Vergleich sei angeführt, daß andere Peptide, wie z.B. Insulin, Glucagon, Wachstumshormon, Somatostatin, β-Endorphin, FTS, ACTH, CRF und Ubiquitin, keine nachweisbare Verdrängung bewirken.
Die vorstehenden Beispiele sind vorgelegt worden, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen; sie sollen deren Umfang jedoch nicht einschränken; welcher Umfang in den angeschlossenen Patentansprüchen dargelegt ist.

Claims

1. Ein Peptid mit der Formel:

R-V-W-X-Y-Z-R¹

oder ein pharmazeutisch annehmbares Säure- oder Basenadditionssalz hievon, worin:

R für H, Niederalkyl, Formyl oder Niederalkanoyl steht;

V für ARG oder D-ARG steht;

W für PRO, Dehydro-PRO oder AIB steht, worin AIB α-Aminoisobutyryl bedeutet;

X für ASP, D-ASP, GLU oder D-GLU steht;

Y für VAL, LYS, LEU, ILE, GLU, ALA, GLN, D-VAL, D-LYS, D-LEU, D-ILE, D-GLU, D-ALA oder 1-GLN steht;

Z für PHE, HIS, TRP, D-PHE, D-HIS oder D-TRP steht;

R¹ für OH oder NR²R³ steht; und

R² und R³ jeweils unabhängig voneinander unter Wasserstoff oder Niederalkyl ausgewählt sind.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin Z für PHE, HIS, D-PHE oder D-HIS steht.

3. Peptid nach Anspruch 1, worin

R Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet,

V für ARG steht,

X für ASP steht und

Z für PHE oder HIS steht.

4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin W für PRO steht.

5. Ein Peptid mit der Formel:

α-Acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH;

α-Formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH;

α-(Niederalkanoyl)-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH;

H-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH;

H-ARG-PRO-ASP-VAL-HIS-OH;

Acetyl-ARG-α-AIB-ASP-VAL-PHE-NH&sub2;; oder

Acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-NH&sub2;; oder

ein pharmazeutisch annehmbares Säure- oder Basenadditionssalz hievon.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einer wirksamen T-Zellen-induzierende Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

7. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Behandlung eines aus einem relativen oder absoluten T-Zellen- oder B-Zellen-Mangel resultierenden Zustandes in einem Subjekt, das einen solchen Zustand zeigt.

8. Ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 6 zum Induzieren von lymphopoetischen Stammzellen eines Subjektes zur Entwicklung der Eigenschaften von Tnymus-derivierten Lymphocyten oder zum Induzieren von Vorläufer B-Zellen eines Subjektes zur Entwicklung der Eigenschaften von reifen B-Zellen.

9. Anwendung von Peptid-Synthesemethoden zur Ausbildung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aus dessen konstituierenden Aminosäureresten.

10. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 6, umfassend das Vermischen einer wirksamen, T-Zellen- oder B-Zellen-induzierenden Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.