DE3531148A1 - Immunogenic polypeptide sequence of the hepatitis B virus - Google Patents
Immunogenic polypeptide sequence of the hepatitis B virusInfo
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Abstract
Description
Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-VirusHepatitis B virus immunogenic polypeptide sequence
In der europäischen Patentanmeldung 0 020 251 wird ein Verfahren beschrieben, das Genom der DNA des Hepatitis B-Virus oder Fragmente dieses Genoms mittels Transfer-Vektoren in geeignete Wirtsorganismen einzuführen, so daß diese transformierten Mikroorganismen befähigt sind, Polypeptide zu produzieren, die von dem Genom des Hepatitis B-Virus beziehungsweise dessen Fragmenten kodiert werden. Nach diesem Verfahren wird beispielsweise ein Protein aus 226 Aminosäuren mit antigenen Eigenschaften (S-Protein) erhalten, welches zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Hepatitis B-Virus-Erkrankungen verwendet werden kann.In the European patent application 0 020 251 a method is described, the genome of the DNA of the hepatitis B virus or fragments of this genome using transfer vectors to introduce into suitable host organisms so that these transformed microorganisms are able to produce polypeptides derived from the genome of the hepatitis B virus or its fragments are encoded. According to this procedure, for example get a protein of 226 amino acids with antigenic properties (S-protein), which is used to manufacture a vaccine against hepatitis B virus diseases can be.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß Hepatitis B-Viren in ihrer Hülle eine stark immunogene Polypeptidsequenz von 108 oder 119 Aminosäuren enthalten, die durch einen bestimmten Genomausschnitt des Hepatitis Virus, nämlich der Prä-S(1)-Nucleotidsequenz, kodiert wird. Polypeptide, die mindestens eine Aminosäuresequenz enthalten, die dieser Prä-S(1)-Nucleotidsequenz entspricht (Prä-S(1)-Aminosäuresequenz) einschließlich der äquivalenten Varianten dieser Prä-S (1) -Aminosäuresequenz, sind zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Hepatitis B-Virusinfektionen geeignet.It has now surprisingly been found that hepatitis B viruses in their Shell contain a highly immunogenic polypeptide sequence of 108 or 119 amino acids, by a certain genome segment of the hepatitis virus, namely the pre-S (1) -nucleotide sequence, is encoded. Polypeptides that contain at least one amino acid sequence that corresponds to this pre-S (1) nucleotide sequence (pre-S (1) amino acid sequence) inclusive of the equivalent variants of this pre-S (1) amino acid sequence are for the preparation a vaccine against hepatitis B virus infections.
Solche Peptide können beispielsweise auf gentechnologischem Wege hergestellt werden.Such peptides can be produced by genetic engineering, for example will.
Im Gegensatz zu dem bekannten S-Protein aus der europäischen Patentanmeldung 0 020 251 läßt sich das erfindungsgemäße Prä-S(1)-Protein ohne wesentliche Antigenitätsverluste in Bakterien herstellen oder beispielsweise auch aus dem Hepatitis B-Virus beziehungsweise dessen Hüllproteinen gewinnen.In contrast to the known S-protein from the European patent application 0 020 251 can do that Pre-S (1) protein according to the invention without produce substantial losses of antigenicity in bacteria or, for example, also from the hepatitis B virus or its envelope proteins.
Es hat sich gezeigt, daß in Abhängigkeit vom Gesundheitszustand, Geschlecht und Alter ein Teil der mit dem bekannten 5-Protein geimpften Personen keine meßbaren Antikörper bildet, während bei anderen Personen der Antikörper wieder rasch verschwindet.It has been shown that depending on the state of health, gender and age of some of the people vaccinated with the known 5 protein was not measurable Antibodies forms, while in other people the antibody quickly disappears.
Geimpfte Personen ohne Antikörper sind erfahrungsgemäß jedoch nicht geschützt.Experience shows, however, that people are not vaccinated without antibodies protected.
Klinische Beobachtungen an Hepatitis B-Rekonvaleszenten zeigen andererseits, daß Antikörper gegen das S-Protein erst lange nach dem Verschwinden der Hepatitis B-Virus-Partikel im Serum erscheinen und viele der Rekonvaleszenten bilden trotz Ausheilung überhaupt keine Antikörper.On the other hand, clinical observations on hepatitis B convalescents show that that antibodies against the S protein did not appear until long after the hepatitis had disappeared B virus particles appear in the serum and many of the convalescents form in spite of it Healing no antibodies at all.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines verbesserten Impf stoffes gegen Hepatitis B-Virus-Erkrankungen, dessen Wirkstoff vorzugsweise ein Polypeptid mit relativ niedrigem Molekulargewicht ist und wobei dieser Wirkstoff insbesondere in ausreichender und reiner Form hergestellt werden kann. Darüberhinaus ist eine Aufgabe der Erfindung die Gewinnung einer viel kleineren DNA-Sequenz (Prä-S(1)-Nucleotidsequenz) als die virale DNA selbst, welche eine Nucleotidsequenz enthält, die in der Lage ist, für eine solche kleinere Peptidsequenz mit immunogenen Eigenschaften zu kodieren (Prä-S (1) -Aminosäuresequenz). Diese Peptidsequenz kann, wenn sie in einen lebenden Wirtsorganismus eingebracht wird, die Erzeugung von Antikörpern durch diesen induzieren, welche fähig sind, den nämlichen Wirt letzt- lich vor einer Infektion mit dem Virus der Virushepatitis B zu schützen.The object of the invention is therefore to provide an improved Vaccine against hepatitis B virus diseases, its active ingredient preferably is a relatively low molecular weight polypeptide and wherein this active ingredient in particular can be produced in sufficient and pure form. Furthermore an object of the invention is to obtain a much smaller DNA sequence (pre-S (1) nucleotide sequence) than the viral DNA itself, which contains a nucleotide sequence capable of is to code for such a smaller peptide sequence with immunogenic properties (Pre-S (1) amino acid sequence). This peptide sequence can, when in a living Host organism is introduced, induce the generation of antibodies by this, who are able to last the same host before infection with the virus of viral hepatitis B to protect.
Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche definierten Gegenstände.The invention relates to the subject matter defined by the claims.
Die Abkürzungen für die Aminosäuren in den Ansprüchen sowie der Beschreibung sind die international üblichen Standardabkürzungen (siehe zum Beispiel Europa-Anmeldung 0 020 251, Seite 4).The abbreviations for the amino acids in the claims and the description are the international standard abbreviations (see, for example, European registration 0 020 251, page 4).
Die überraschenden und nicht naheliegenden Vorteile der Erfindung liegen zum Beispiel in folgendem: 1. Das erfindungsgemäße Prä-S(1)-Polypeptid induziert als Hepatitis B-Impfstoff Antikörper, die vorwiegend gegen das Hepatitis B-Virus und nur in geringem Maße gegen Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Partikel gerichtet sind. In Hepatitis B-Virushaltigen Proben befindet sich normalerweise ein rund tausendfacher Überschuß von nicht infektiösem Hepatitis Oberflächenantigen. Herkömmliche Hepatitis B-Impfstoffe induzieren Antikörper, die bei Vorliegen von nicht infekt iö sen Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikeln mit verbraucht werden. Ein schützender anti-Prä-s(1)Antikörper kann dagegen in viel geringeren Mengen vorliegen als ein Antikörper, der aufgrund eines S-Protein-haltigen Impfstoffes gebildet wird, um die gleichen Hepatitis B-Virusmengen aus infektiösem Material abzubinden.The surprising and non-obvious advantages of the invention lie, for example, in the following: 1. The pre-S (1) polypeptide according to the invention is induced as a hepatitis B vaccine antibodies that are predominantly against the hepatitis B virus and directed only to a small extent against hepatitis B surface antigen particles are. Samples containing the hepatitis B virus usually contain around a thousand fold Excess of non-infectious hepatitis surface antigen. Conventional hepatitis B vaccines induce antibodies, which in the presence of non-infectious hepatitis B surface antigen particles are also consumed. A protective anti-pre-s (1) antibody on the other hand, can be present in much smaller amounts than an antibody that is due to A vaccine containing S-protein is made to treat the same amounts of hepatitis B virus to tie off from infectious material.
2. Die Eigenschaften der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz deuten darauf hin, daß sie das Hepatitis B-Virus-Antigen bildet, gegen das bei einer ausheilenden Hepatitis B-Virus-Infektion zuerst Antikörper gebildet werden. Dies bedeutet eine verbesserte Immunogenität.2. The properties of the pre-S (1) amino acid sequence suggest this point out that it forms the hepatitis B virus antigen against which in a healer Hepatitis B virus infection first antibodies are formed. This means improved immunogenicity.
3. Antikörper gegen Peptide mit der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz sind für den selektiven Nachweis von Hepatitis B-Viruspartikeln geeignet und als Immunadsorbens auch zur Entfernung von Hepatitis B-Viruspartikeln aus biologischen Flüssigkeiten.3. Are antibodies to peptides with the pre-S (1) amino acid sequence suitable for the selective detection of hepatitis B virus particles and as an immune adsorbent also for removing hepatitis B virus particles from biological fluids.
Antikörper gegen Peptide mit der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz sind weiterhin in der Diagnostik und der Verlaufsbeurteilung von Hepatitis B-Infektionen nützlich, da sie bevorzugt mit Hepatitis B-Viruspartikeln und weniger mit den 20 nm Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikeln reagieren. Antibodies to peptides with the pre-S (1) amino acid sequence are furthermore in the diagnosis and assessment of the course of hepatitis B infections useful as it prefers with hepatitis B virus particles and less with the 20 nm hepatitis B surface antigen particles react.
Prä-S (1) -halige Antigene sind nützliche Reagenzien, um humorale und celluläre Immunreaktionen gegen diese Antigene zu testen. Pre-S (1) -containing antigens are useful reagents to detect humoral and test cellular immune responses against these antigens.
Diese Immunreaktionen können zum Beispiel auch von großer Bedeutung für die Ausheilung einer Hepatitis B sein. These immune responses, for example, can also be of great importance for the healing of hepatitis B.
Antikörper gegen Prä-S(1) Protein sind gegebenenfalls auch für die Elimination von Hepatitis B-Viren aus biologischem Material geeignet. Antibodies against pre-S (1) protein may also be used for the Elimination of hepatitis B viruses from biological material suitable.
Darüberhinaus sind Prä-S(1)-haltige Mittel gegebenenfalls auch für die Behandlung bereits bestehender Hepatitis B-Virus-Infektionen nützlich. In addition, agents containing pre-S (1) may also be used for useful in treating pre-existing hepatitis B virus infections.
Peptide, die Untereinheiten der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz enthalten, oder ausschließlich aus solchen Untereinheiten bestehen, und beispielsweise aus dem Prä-S (1)-Protein (Protein, welches die Prä-S (1) -Aminosäuresequenz enthält) gemäß Anspruch 8, worin X=OH ist oder eine andere der angegebenen Bedeutungen besitzt, durch Spaltung entstehen, sind ebenfalls in gleicher Weise gegen Hepatitis B immunogen wirksam und daher Teil der Erfindung. Solche Peptide, die ausschließlich Untereinheiten der Pr8-S(1)-Aminosäuresequenz darstellen, sind beispielsweise die folgenden Oligopeptide: H-PheProAspHisGlnLeuAspProAla-OH; H-AsnAsnProAspTrpAsp PheAsnPro-OH; H-ThrAsnArgGlnSerGlyArgProThr-OH; H-AlaAsnArgGlnSerGlyArgProThr-OH; H-ProProProAlaSerThr AsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrPro-OH oder H-ProProProAlaSer AlaAsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrPro-OH.Peptides containing subunits of the pre-S (1) amino acid sequence, or consist exclusively of such subunits, and for example from the pre-S (1) protein (protein which contains the pre-S (1) amino acid sequence) according to claim 8, wherein X = OH or has another of the meanings given, arising from cleavage are also in the same Way against Hepatitis B has an immunogenic effect and is therefore part of the invention. Such peptides that exclusively represent subunits of the Pr8-S (1) amino acid sequence are, for example the following oligopeptides: H-PheProAspHisGlnLeuAspProAla-OH; H-AsnAsnProAspTrpAsp PheAsnPro-OH; H-ThrAsnArgGlnSerGlyArgProThr-OH; H-AlaAsnArgGlnSerGlyArgProThr-OH; H-ProProProAlaSerThr AsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrPro-OH or H-ProProProAlaSer AlaAsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrPro-OH.
Die hier in Frage kommenden Untereinheiten der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz müssen mindestens aus 6 Aminosäuren bestehen.The subunits of the pre-S (1) amino acid sequence that come into question here must consist of at least 6 amino acids.
Größere Peptide, die die vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen enthalten, sind ebenfalls immunogen gegen Hepatitis B wirksam.Larger peptides containing the amino acid sequences given above are also immunogenic against hepatitis B.
Das Hepatitis B-Virus (HBV) enthält ein Oberflächenprotein mit 39 000 Dalton scheinbarem Molgewicht (P39) und ein Glykoprotein mit 42 000 Dalton (GP42). GP42 und P39 haben dieselbe Proteinsequenz, GP42 enthält aber zusätzlich eine N-glykosidisch gebundene Kohlenhydratseitenkette. P39/GP42 ist co-terminal mit dem bekannten viralen Oberflächenprotein GP33 (STIBBE & GERLICH, Virol. 123, 436-442, 1982, und J.Virol. 46, 626-628, 1983). Co-terminal heißt, daß die gesamte Aminosäuresequenz von GP33 im carboxy-terminalen Teil von P39/GP42 enthalten ist. Zusätzlich enthält P39/42 am aminoterminalen Teil eine Sequenz von 108 oder 119 Aminosäuren, die erfindungsgemäß als Prä-S(1)-Sequenz (Prä-S(1)-Aminosäuresequenz) bezeichnet wird.The hepatitis B virus (HBV) contains a surface protein with 39 000 Dalton apparent molecular weight (P39) and a glycoprotein with 42,000 Dalton (GP42). GP42 and P39 have the same protein sequence, but GP42 also contains an N-glycosidic linked carbohydrate side chain. P39 / GP42 is co-terminal with the known viral Surface protein GP33 (STIBBE & GERLICH, Virol. 123, 436-442, 1982, and J. Virol. 46, 626-628, 1983). Co-terminal means that the entire amino acid sequence of GP33 is contained in the carboxy-terminal part of P39 / GP42. Additionally contains P39 / 42 at the amino-terminal part a sequence of 108 or 119 amino acids, which according to the invention referred to as pre-S (1) sequence (pre-S (1) amino acid sequence).
Die Struktur von entsprechenden Prä-S(1)-Polypeptiden ergibt sich aus den bekannten DNA-Sequenzen verschiedener Hepatitis-Virus B-Isolate. Zwischen den Hepatitis B-Virus-Subtypen gibt es gerade in der Prä-S(1)-Sequenz zahlreiche Aminosäureaustausche. Die genetische Grundstruktur, die die Prä-S(1)-Sequenz als amino-terminalen Teilabschnitt der großen Oberflächenproteine P39/GP42 definiert, ist jedoch bei allen bekannten Isolaten von Hepatitis B- Virus gleich. Die verschiedenen Oberflächenproteine werden alle von einer kontinuierlichen Sequenz von Basentripletts (= Codons) codiert, die mit einem ersten Startcodon beginnt und mit einem Stopcodon endet. Das Startcodon besteht aus dem Triplett ATG, das für den Beginn der Proteinbiosynthese nötig ist und zugleich die Aminosäure Methionin als Aminoende des Proteins codiert. Die Biosynthese des Proteins bricht mit einem der Stopcodons, TAA, TGA, TAG ab.The structure of the corresponding pre-S (1) polypeptides results from the known DNA sequences of various hepatitis virus B isolates. Between the hepatitis B virus subtypes are numerous, especially in the pre-S (1) sequence Amino acid exchanges. The basic genetic structure identified by the pre-S (1) sequence as amino-terminal section of the large surface proteins P39 / GP42 defined, is, however, in all known isolates of hepatitis B- virus same. The various surface proteins are all produced by a continuous Sequence of base triplets (= codons) encoded, which begins with a first start codon and ends with a stop codon. The start codon consists of the triplet ATG, the for the beginning of protein synthesis is necessary and at the same time the amino acid methionine encoded as the amino terminus of the protein. The biosynthesis of the protein breaks down with you the stop codons, TAA, TGA, TAG.
Im Normalfall beginnt die Proteinbiosynthese mit dem ersten ATG-Codon einer codierenden Sequenz. Dies ist auch für das P39/GP42 des Hepatitis B-Virus der Fall, so daß ein Protein von 389 oder 400 Aminosäuren entsteht.Normally, protein synthesis begins with the first ATG codon a coding sequence. This is also the case for the P39 / GP42 of the hepatitis B virus the case, resulting in a protein of 389 or 400 amino acids.
Als Besonderheit des Hepatitis B-Virus werden jedoch auch zwei spätere Startcodons als fakultative Startpunkte der Proteinbiosynthese von infizierten Zellen verwendet. Ein ATG-Triplett, das 108 bis 119 Tripletts nach dem ersten Startcodon (je nach Subtyp) liegt, dient als Aminoende des GP33/36. Die Sequenz zwischen diesem zweiten und dem ersten Startcodon wird als Prä-S(1)-Sequenz definiert. Noch weitere 55 Tripletts später befindet sich ein drittes Startcodon, das das Aminoende des Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Hauptproteins P24/GP27 (auch als Gen S bezeichnet) festlegt. Die Sequenz von 55 Codons zwischen dem zweiten und dritten Startcodon wird als Prä-S(2)-Sequenz definiert. Die Lage der Prä-S(1)- und Prä-S(2)-Nucleotidsequenzen in der ringförmigen Hepatitis B-DNA sowie die Schnittstellen für die Prä-S(1)-Nucleotidsequenz wird in Fig. 1 gezeigt.As a special feature of the hepatitis B virus, however, two later Start codons as optional starting points for protein synthesis in infected cells used. An ATG triplet containing 108 to 119 triplets after the first start codon (depending on the subtype) serves as the amino end of the GP33 / 36. The sequence between this The second and first start codons are defined as the pre-S (1) sequence. Even more 55 triplets later there is a third start codon, which is the amino end of the Hepatitis B virus major surface protein P24 / GP27 (also known as gene S) specifies. The sequence of 55 codons between the second and third start codons is defined as a pre-S (2) sequence. The location of the pre-S (1) and pre-S (2) nucleotide sequences in the circular hepatitis B DNA and the interfaces for the pre-S (1) nucleotide sequence is shown in FIG.
Die EcoRI-Schnittstelle wird in üblicher Weise als Anfang, das heißt mit 0 bezeichnet.The EcoRI cleavage site is used in the usual way as the beginning, that is denoted by 0.
Die Prä-S (1)-Sequenz bezeichnet eine Aminosäuresequenz von 108 oder 119 Aminosäuren sowie die entsprechende für die Codierung dieser Aminosäuresequenz verantwortliche Nucleotidsequenz der Hepatitis B-Virus-DNA. Die Prä-S(1)-Nucleotidsequenz ist die Folge von 108 oder 119 Codons, die maximal 400 oder 389 Codons vor dem Stopcodon des offenen Ableserahmen beginnt, der das HBsAg codiert und 281 Codons vor dem Stopcodon desselben offenen Ableserahmens endet. Diese Prä-S (1) -Nucleotidsequenz codiert die entsprechende Prä-S (1) -Aminosäuresequenz.The pre-S (1) sequence designates an amino acid sequence of 108 or 119 amino acids as well as the corresponding for the coding of this Amino acid sequence responsible nucleotide sequence of the hepatitis B virus DNA. the Pre-S (1) nucleotide sequence is the sequence of 108 or 119 codons, the maximum of 400 or 389 codons before the stop codon of the open reading frame that contains the HBsAg encoded and ends 281 codons before the stop codon of the same open reading frame. This pre-S (1) nucleotide sequence encodes the corresponding pre-S (1) amino acid sequence.
Die Prä-S(2)-Nucleotidsequenz besteht aus 55 Codons und schließt sich unmittelbar an die Prä-S(1)-Nucleotidsequenz an; sie beginnt mit dem Startcodon, der 281 Codons vor dem Stopcodon des offenen Ableserahmens für das HBsAg liegt (Codon ATG das Methionin codiert) und endet nach 55 weiteren Codons desselben Ableserahmens. Die entsprechende Prä-S(2)-Aminosäuresequenz ist beispielsweise die folgende: MetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnAlaLeuGlnAsp ProArgValArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsn ProAlaProAsnIleAlaSerHisIleSerSerIleSerAlaArgThrGlyAspPro ValThrAsn.The pre-S (2) nucleotide sequence consists of 55 codons and closes immediately after the pre-S (1) nucleotide sequence; it begins with the start codon, of the 281 codons in front of the stop codon of the open reading frame for the HBsAg (codon ATG which codes for methionine) and ends after 55 further codons in the same reading frame. The corresponding pre-S (2) amino acid sequence is, for example, the following: MetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnAlaLeuGlnAsp ProArgValArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsn ProAlaProAsnIleAlaSerHisIleSerSerIleSerAlaArgThrGlyAspPro ValThrAsn.
Unter HBsAg codierenden offenen Ableserahmen (siehe Anspruch 1) wird hierbei der Teil der Hepatitis B-Virus-DNA verstanden, welcher beispielsweise in Viral Hepatitis 1981, International Symposium, The Franklin Institute Press, Philadelphia 1982 auf Seite 82 erwähnt ist und aus den zwei Bezirken "Region Pre 5" und "Gen 5" besteht. Diese Region Pre S besteht aus der erfindungsgemäßen Prä-S(1)-Sequenz und der sich hieran anschließenden Prä-S(2)-Sequenz, wobei sich das Gen S (Gen für = Protein P24/GP27) unmittelbar an die Prä-S(2)-Sequenz anschließt (siehe auch Viral Hepatitis, Laboratory and Clinical Science, F. und J.Under HBsAg coding open reading frame (see claim 1) is understood here the part of the hepatitis B virus DNA which, for example, in Viral Hepatitis 1981, International Symposium, The Franklin Institute Press, Philadelphia 1982 is mentioned on page 82 and consists of the two districts "Region Pre 5" and "Gen 5 ". This region Pre S consists of the pre-S (1) sequence according to the invention and the subsequent pre-S (2) sequence, where the gene S (gene for = Protein P24 / GP27) immediately follows the pre-S (2) sequence (see also Viral Hepatitis, Laboratory and Clinical Science, F. and J.
Deinhardt Editors Marcel Dekker, New York, Basel 1983, Seite 71). Die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz ist also die Folge von 108 oder 119 Codons der Hepatitis B-Virus-DNA, die mit dem ersten Startcodon des HBsAg codierenden Ableserahmens beginnt und 281 Codons vor dessen Stopcodon endet.Deinhardt Editors Marcel Dekker, New York, Basel 1983, page 71). The pre-S (1) amino acid sequence is thus the sequence of 108 or 119 codons of hepatitis B virus DNA which begins with the first start codon of the reading frame coding for HBsAg and 281 codons before its stop codon ends.
Unter Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) im Rahmen dieser Erfindung wird folgendes verstanden: HBsAg ist die Antigeneigenschaft der 20 nm Hepatitis B-Oberflächenpartikel, die im wesentlichen aus den Proteinen P24 beziehungsweise GP27 bestehen. Diese Proteine P24 beziehungsweise GP27 sind zum Beispiel in Peterson et al, Proc.Nat.Among hepatitis B surface antigen (HBsAg) within the scope of this invention the following is understood: HBsAg is the antigenic property of 20 nm hepatitis B-surface particles, consisting essentially of the proteins P24 respectively GP27 pass. These proteins P24 and GP27, respectively, are in Peterson, for example et al, Proc. Nat.
Acad.Sci., USA, Band 74 (1977), Seiten 1530-34 beschrieben.Acad. Sci., USA, Vol. 74 (1977), pp. 1530-34.
Das Protein P24 wird beispielsweise von den Nucleotiden 161 bis 841 gemäß Fig. 4 auf Seite 71 des oben zitierten Buches Viral Hepatitis, Laboratory and Clinical Science beschrieben. Der offene Ableserahmen, der dieses HBsAg codiert, beginnt gemäß der zuvor erwähnten Fig. 1, jedoch viel früher und zwar mit dem Nucleotid 2859.The P24 protein is, for example, from nucleotides 161 to 841 according to FIG. 4 on page 71 of the above-cited book Viral Hepatitis, Laboratory and Clinical Science. The open reading frame that encodes this HBsAg, begins according to the aforementioned FIG. 1, but much earlier, namely with the nucleotide 2859.
Die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz beziehungsweise Peptide, die diese Prä-S(1)-Aminosäuresequenz enthalten, sind auch dadurch charakterisiert, daß sie spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper MA18/7 reagieren und diesen binden.The pre-S (1) amino acid sequence or peptides that these Pre-S (1) amino acid sequence containing are also characterized in that they specifically react with the monoclonal antibody MA18 / 7 and bind it.
Erfindungsgemäße Polypeptide, die im wesentlichen aus der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz bestehen, können außer dieser Prä-S(1)-Sequenz noch bis zu 12 weitere natürliche Aminosäuren enthalten, wobei sich diese zusätzlichen 1 - 12 Aminosäuren vorzugsweise am Carboxy-terminalen Ende der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz befinden. Insbesondere kommen hier die Aminosäuren beziehungsweise die Aminosäuresequenzen in Frage, die in Anspruch 8 für X angegeben sind. Größere Polypeptide, welche die erfindungsgemäße Prä-S(1)-Aminosäuresequenz enthalten, können beispielsweise an ihrem Carboxyterminalen Ende noch 12 - 1000 und an ihrem Amino-terminalen Ende noch 1 - 1000, vorzugsweise 1 - 500, insbesondere 1 - 250 weitere natürliche Aminosäuren enthalten. Insbesondere können solche größeren Polypeptide an ihrem Carboxy-terminalen Ende die ganze Prä-S(2)-Aminosäuresequenz enthalten oder auch diese Prä-S(2)-Aminosäuresequenz plus Aminosäuren beziehungsweise Peptidteile, die von dem sich an den Prä-S(2)-Teil anschließenden Gen S stammen.Polypeptides according to the invention consisting essentially of the pre-S (1) amino acid sequence exist, in addition to this pre-S (1) sequence, up to 12 other natural ones can exist Contain amino acids, these additional 1 - 12 amino acids being preferred at the carboxy-terminal end of the pre-S (1) amino acid sequence. In particular the amino acids or the amino acid sequences come into question here, the in claim 8 for X are given. Larger polypeptides which the invention Pre-S (1) amino acid sequence may contain, for example, at their carboxy terminal Another 12-1000 at the end and 1-1000 at their amino-terminal end, preferably Contain 1 - 500, in particular 1 - 250 other natural amino acids. In particular Such larger polypeptides can have the entire pre-S (2) amino acid sequence at their carboxy-terminal end contain or also this pre-S (2) amino acid sequence plus amino acids or peptide parts that adjoin the pre-S (2) part Gen S originate.
Die DNA-Fragmente für die Synthese des Prä-S(1)-Polypeptids werden durch Schnitte der Hepatitis B-Virus-DNA mit beispielsweise folgenden Re str iktionsenzymen erzeugt: Mit BstEII und nachfolgender Behandlung mit Exonucleasen, zum Beispiel Bal31 (alle Subtypen), AluI (ad Subtypen) oder BglII (ay Subtypen) oder deren Isoschizomeren als Schnitt vor der Pr§-S(1)-Sequenz; die Prä-S(1)-Sequenz beginnt insbesondere dort, wo nach diesem Schnitt erstmalig die Aminosäure Methionin kommt, das heißt sie wird beispielsweise in der Hepatitis B-DNA durch das erste Methion-Codon (ATG) nach der Schnittstelle mit den Enzymen BstEII + Bal3i markiert. Zusätzliche ATG-Tripletts innerhalb der Prä-S(1)-Sequenz sind von Subtyp zu Subtyp nicht konserviert und haben keine Funktion als Startcodon, sondern codieren lediglich Methionin innerhalb der Prä-S(1)-Sequenz. Der zweite Schnitt erfolgt beispielsweise mit EcoRI als Schnitt nach der Prä-S(1)-Sequenz; das Ende der Prä-S(1)-Sequenz ist also beispielsweise dort, wo vor diesem EcoRI-Schnitt das erste Codon für die Aminosäure Alanin steht. Als Schnitt nach der Prä-S(1)-Sequenz und vor Gen S sind darüberhinaus noch zahlreiche weitere Enzyme je nach Subtyp geeignet, wie zum Beispiel XhoI (bei Subtyp ay), BamHI (bei Subtyp adw2).The DNA fragments for the synthesis of the pre-S (1) polypeptide are used by sections of the hepatitis B virus DNA with, for example, the following restriction enzymes generated: With BstEII and subsequent treatment with exonucleases, for example Bal31 (all subtypes), AluI (ad subtypes) or BglII (ay subtypes) or their isoschizomers as a cut before the Pr§-S (1) sequence; the pre-S (1) sequence begins in particular where the amino acid methionine appears for the first time after this cut, that is it is represented, for example, in the hepatitis B DNA by the first methione codon (ATG) marked after the cleavage with the enzymes BstEII + Bal3i. Additional ATG triplets within the pre-S (1) sequence are and have not been conserved from subtype to subtype no function as a start codon, but only encode methionine within the Pre-S (1) sequence. The second cut is made, for example, with EcoRI as the cut after the pre-S (1) sequence; so the end of the pre-S (1) sequence is for example where the first codon for the amino acid alanine is in front of this EcoRI cut. There are also numerous cuts after the pre-S (1) sequence and before gene S other enzymes suitable depending on the subtype, such as XhoI (for subtype ay), BamHI (with subtype adw2).
Bei den Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz Prä-S(1)-X hat X insbesondere folgende Bedeutungen: 1. Met-Gln-Trp oder Met-His-Trp als Rest der Prä-S(2)-Sequenz bis zur EcoRI-Schnittstelle.In the case of the polypeptides with the amino acid sequence pre-S (1) -X, X has in particular the following meanings: 1. Met-Gln-Trp or Met-His-Trp as a remainder of the pre-S (2) sequence up to the EcoRI interface.
2. Met-Gln-Trp-Y oder Met-His-Trp-Y, wobei Y ein für die Erfindung nicht wesentlicher Anteil von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 30, insbesondere 1 bis 12 natürlichen Aminosäuren ist, die durch den Vector zufällig codiert werden bis ein Stopcodon in der DNA-Sequenz auftritt; beispielsweise ist Y LeuProArgAlaPheArg-OH.2. Met-Gln-Trp-Y or Met-His-Trp-Y, where Y is a for the invention non-essential proportion of 1 to 50, preferably 1 to 30, in particular 1 to 12 natural amino acids that are randomly encoded by the Vector up a stop codon appears in the DNA sequence; for example, Y is LeuProArgAlaPheArg-OH.
3. Wird die Prä-S(1)-Sequenz beispielsweise in die PvuII-Stelle des Plamids pGL101 (beziehungsweise pBR322) eingesetzt, kann X außerdem zum Beispiel folgende Bedeutungen haben: CysLeuAlaArgPheGlyAspAspGlyGlu AsnLeu-OH, (12 Aminosäuren) AlaSerArgValSerValMet ThrValLysThrSerAspThrCysSerSerArgArgArgSerLeuLeu ValCysLysArgMetProGlyAlaArgLysProValArgAlaArgGln ArgValLeuAlaGlyValGlyAlaGlnPro-OH.3. For example, if the pre-S (1) sequence is in the PvuII site of the Plamids pGL101 (or pBR322) used, X can also for example have the following meanings: CysLeuAlaArgPheGlyAspAspGlyGlu AsnLeu-OH, (12 amino acids) AlaSerArgValSerValMet ThrValLysThrSerAspThrCysSerSerArgArgArgSerLeuLeu ValCysLysArgMetProGlyAlaArgLysProValArgAlaArgGln ArgValLeuAlaGlyValGlyAlaGlnPro-OH.
4. Statt mit EcoRI kann die HBV-DNA auch mit einem Enzym geschnitten werden, dessen Erkennungssequenz näher am Stopcodon des offenen Ableserahmens für HBsAg liegt. Das erhaltene Polypeptid enthält als Sequenz X dann größere Teile der Prä-S(2)-Sequenz oder die gesamte Prä-S(2) und noch aminoterminale Teile des Gen S. Als Beispiel kann für den Subtyp adw2 ein Schnitt mit BamHI genannt werden, für die Subtypen mit ay XhoI, wobei das exprimierte Protein dann außer der Prä-S(1)-Sequenz auch noch größere aminoterminale Anteile der Prä-S(2)-Sequenz enthält. Ein Schnitt mit beispielsweise XbaI würde zu einem Protein führen, das die gesamte Prä-i(2)-Sequenz und aminoterminale Bereiche des Gen S enthält.4. Instead of using EcoRI, the HBV DNA can also be cut with an enzyme whose recognition sequence is closer to the stop codon of the open reading frame for HBsAg is located. The polypeptide obtained then contains, as sequence X, larger parts of the Pre-S (2) sequence or the entire pre-S (2) plus amino-terminal parts of the gene S. As an example, a cut with BamHI can be cited for the subtype adw2, for the subtypes with ay XhoI, the expressed protein then except for the pre-S (1) sequence also contains even larger amino-terminal portions of the pre-S (2) sequence. One cut with, for example, XbaI would result in a protein that contains the entire pre-i (2) sequence and amino-terminal regions of the S gene.
Weiterhin sind ganz allgemein auch Proteine mit höherem Molekulargewicht als beispielsweise die Polypeptide, die im wesentlichen aus der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz bestehen, immunogen gegen Hepatitis B wirksam, sofern sie nur an irgendeiner Stelle die Prä-S(1)-Sequenz oder Fragmente dieser Sequenz eingebaut enthalten.Furthermore, proteins with a higher molecular weight are also quite generally than, for example, the polypeptides consisting essentially of the pre-S (1) amino acid sequence exist, immunogenic against hepatitis B, provided they only contain the pre-S (1) sequence at any point or contain fragments of this sequence incorporated.
Die Herstellung von derartigen höher molekularen Proteinen mit der Prä-S(1)-Sequenz oder Fragmenten der Prä-S(1)-Sequenz kann zum Beispiel nach folgender Methode erfolgen: Die Prä-S(1)-Nucleotidsequenz kann so mit einem beliebigen anderen Gen durch DNA-Ligation in Phase zusammengefügt werden, daß die Proteinsynthese kontinuierlich von der Prä-S(1)-Sequenz auf das andere Gen übergeht. Das zweite Gen kann ein beispielsweise bekanntes bakterielles Enzym codieren, zum Beispiel beta-Galaktosidase oder ein Protein, das selbst als Impfstoff interessant ist, zum Beispiel Diphterie- oder Tetanustoxin. Das Fusionsprodukt ist wegen seiner Größe im allgemeinen immunogener und wegen seiner teilweise bakteriellen Herkunft in der Bakterienzelle eventuell stabiler.The production of such higher molecular weight proteins with the Pre-S (1) sequence or fragments of the pre-S (1) sequence can for example be according to the following Method done: The pre-S (1) -nucleotide sequence can be done so with any other Gene are joined together by DNA ligation in phase that protein synthesis is continuous passes from the pre-S (1) sequence to the other gene. The second gene can be an example encode a known bacterial enzyme, for example beta-galactosidase or a Protein that is itself of interest as a vaccine, for example diphtheria or Tetanus toxin. The fusion product is generally more immunogenic because of its size and possibly because of its partly bacterial origin in the bacterial cell more stable.
Es ist auch möglich, die Prä-S(1)-Sequenz innerhalb eines bakteriellen Strukturgens einzusetzen. Es sind Vector-Plasmide vom pUR- oder pUC-Typ verfügbar, die Restriktionsschnittstellen innerhalb einer codierenden Sequenz für ein Fragment der beta-Galactosidase enthalten (Gene 19 (1982), 259).It is also possible to use the pre-S (1) sequence within a bacterial Use structural gens. There are vector plasmids of the pUR or pUC type available, the restriction sites within a coding sequence for a fragment contain the beta-galactosidase (Gene 19 (1982), 259).
In diese oder ähnliche Plasmide können jegliche Fragmente der HBV-DNA, speziell auch solche mit wesentlichen Teilen der Prä-S(1)-Sequenz eingesetzt werden. Wenn durch geeignete Behandlung der HBV DNA-Fragmente, beispielsweise Verkürzung mit Bal31 oder Verlängerung um einige Basen mit dem Enzym terminale Nucleotidtransferase, in einem Teil der rekombinierten DNA ein phasenrichtiger Einbau erzielt wird, können Klone mit einer solchen DNA, ein Fusionsprotein mit Prä-S(1)-Sequenzanteilen exprimieren.Any fragments of HBV-DNA, especially those with essential parts of the pre-S (1) sequence can also be used. If by appropriate treatment of the HBV DNA fragments, for example shortening with Bal31 or extension by a few bases with the enzyme terminal nucleotide transferase, a phase-correct incorporation is achieved in a part of the recombined DNA, can Clones with such a DNA express a fusion protein with parts of the pre-S (1) sequence.
Hierbei ist es nicht nötig, daß das HBV-DNA-Fragment noch das Startcodon der Prä-S(1)-Sequenz enthält.It is not necessary here that the HBV DNA fragment still contains the start codon of the pre-S (1) sequence.
Die eingesetzten HBV-DNA-Fragmente können sehr große Bereiche umfassen, zum Beispiel auch noch Anteile der Prä-S(2)-Region und des Gens S oder auch nur kleine Ausschnitte der Prä-S(1)-Region. Sehr kleine Ausschnitte mit zum Beispiel nur 27 Nucleotiden können für diesen Zweck bevorzugt durch chemische Nucleotidsynthese hergestellt werden. Zum Zweck der größeren Stabilität und leichteren Isolierbarkeit werden auch solche kleinen Genfragmente mit größeren Genen fusioniert.The HBV DNA fragments used can cover very large areas, For example, parts of the pre-S (2) region and the S gene, or even just small sections of the pre-S (1) region. Very small cutouts with, for example only 27 nucleotides can preferably be used for this purpose by chemical nucleotide synthesis getting produced. For the purpose of greater stability and easier insulation such small gene fragments are also fused with larger genes.
In den Fig. 2, 3, 4 und 5 sind beispielhaft Prä-S(1)-Nucleotidsequenzen von verschiedenen Hepatitis B-Virus-DNA Isolaten verschiedenen Subtyps (zum Beispiel Subtyp ayw, adw2, adr) einschließlich wesentlicher flankierender Bereiche sowie die diesen Prä-S(1)-Nucleotidsequenzen entsprechenden Prä-S(1)-Aminosäuresequenzen dargestellt.2, 3, 4 and 5 are exemplary pre-S (1) nucleotide sequences of different hepatitis B virus DNA isolates of different subtypes (for example Subtype ayw, adw2, adr) including essential flanking areas as well the pre-S (1) amino acid sequences corresponding to these pre-S (1) nucleotide sequences shown.
Fig. 2 und Fig. 3 betreffen zwei verschiedene Isolate des Subtyps adw2 der Hepatitis B-DNA, Fig. 4 den Subtyp adr und Fig. 5 den Subtyp ayw. Hierbei wurde die EcoRI Restriktionsschnittstelle als Nullpunkt der DNA-Sequenz angenommen. Die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz von Fig. 2 entspricht dem Peptid der Formel I (X=OH). Die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz von Fig. 3 entspricht dem Peptid der Formel II, die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz von Fig. 4 entspricht dem Peptid der Formel III und die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz von Fig. 5 entspricht dem Peptid der Formel IV (X jeweils = OH).Figures 2 and 3 relate to two different isolates of the subtype adw2 of the hepatitis B DNA, FIG. 4 the subtype adr and FIG. 5 the subtype ayw. Here the EcoRI restriction site was assumed to be the zero point of the DNA sequence. The pre-S (1) amino acid sequence of FIG. 2 corresponds to the peptide of the formula I (X = OH). The pre-S (1) amino acid sequence of Fig. 3 corresponds to the peptide of formula II, the Pre-S (1) amino acid sequence of Fig. 4 corresponds to the peptide of formula III and the Pre-S (1) amino acid sequence of Figure 5 corresponds to the peptide of Formula IV (X each = OH).
Die Erfindung betrifft daher auch die Nucleinsäurefragmente, die aus der DNA des Hepatitis B-Virus herausgeschnitten werden können, welche den Teil des Gens enthalten, der in der Lage ist, für die ersten 119 beziehungsweise 108 Aminosäuren des Proteins mit Mol-Gewicht 39 000 Dalton zu kodieren. Dieses Protein wird zum Beispiel gemäß Beispiel II erhalten.The invention therefore also relates to the nucleic acid fragments from The DNA of the hepatitis B virus can be cut out, which is the part of the Contain gene that is able to for the first 119 and 108 amino acids of the protein with a molecular weight of 39,000 Daltons. This protein is used to Example obtained according to Example II.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung demnach ein Nucleinsäure-Fragment mit etwa 324 bis 357 Nucleotiden, das insbesondere dadurch gekennzeichnet ist, daß es in der Lage ist, für eine immunogene Peptidsequenz zu kodieren, welche ihrerseits in der Lage ist, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die gegen das Hepatitis B-Virus aktiv sind, wobei diese Peptidsequenz im wesentlichen die in den Figuren 2, 3, 4 und 5 dargestellte Struktur aufweist, oder für irgendeine Peptidsequenz mit äquivalenten immunogenen Eigenschaften.In this regard, the invention accordingly relates to a nucleic acid fragment having about 324 to 357 nucleotides, which is particularly characterized in that it is able to code for an immunogenic peptide sequence, which in turn is able to induce in vivo the production of antibodies directed against the hepatitis B virus are active, this peptide sequence essentially the has the structure shown in Figures 2, 3, 4 and 5, or for any Peptide sequence with equivalent immunogenic properties.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor im Hinblick auf die Expression der genannten Nucleotidsequenz in einem Mikroorganismus oder in eukaryotischen Zellen mit der Maßgabe, daß bei der genetischen Verknüpfung die Ablesephase des Prä-S(1)-Gens beibehalten wurde.The invention also relates to a vector with regard to the Expression of said nucleotide sequence in a microorganism or in eukaryotic Cells with the proviso that in the genetic linkage the reading phase of the Pre-S (1) gene was retained.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen weisen im Verhältnis zueinander eine Veränderlichkeit auf, die bei ihrer Expression zur Entstehung von Determinanten führt, die je nach dem Subtyp des Hepatitis B-Virus variieren (Subtypen adw2, adr, ayw und sonstige Varianten).The nucleotide sequences used according to the invention have the ratio to each other a mutability which, when expressed, leads to the emergence of Determinants that vary depending on the subtype of the hepatitis B virus (subtypes adw2, adr, ayw and other variants).
Bei der Peptidsequenz gemäß den Figuren 2, 3, 4 und 5 ist die erste Aminosäure der vorstehend erläuterten Sequenz: Methionin, N-terminal und die Aminosäure des entgegengesetzten Endes Alanin, C-terminal.In the case of the peptide sequence according to FIGS. 2, 3, 4 and 5, the first is Amino acid of the sequence explained above: methionine, N-terminal and the amino acid of the opposite end alanine, C-terminal.
Die Erfindung betrifft daher insbesondere auch die in den Figuren 2, 3, 4 und 5 wiedergegebene Nucleotidsequenz, die für eine solche Peptidsequenz kodiert, wie sie zum Beispiel in Anspruch 6 wiedergegeben ist, oder für irgendeine analoge Peptidsequenz, die mit äquivalenten immunogenen Eigenschaften versehen ist.The invention therefore also relates in particular to that in the figures 2, 3, 4 and 5 reproduced nucleotide sequence, which for such a peptide sequence encoded, for example, as reproduced in claim 6, or for any analogous peptide sequence which is provided with equivalent immunogenic properties.
Es versteht sich von selbst, daß mit dem vorstehend erwähnten Begriff "äquivalente Peptidsequenz" jede Peptidsequenz gemeint ist, in der bestimmte Teile nicht streng identisch mit den entsprechenden Teilen der in den Figuren 2, 3, 4 und 5 wiedergegebenen Peptidsequenz sein können, wobei diese Variationen auf lokale Mutationen zurückzuführen sein können, welche den allgemeinen immunogenen Charakter des Proteins nicht beeinflussen, oder auf Modifikationen der Struktur, die zu den unterschiedlichen Serotypen führen, unter denen die Proteine der in Frage stehenden Art in Erscheinung zu treten vermögen.It goes without saying that with the above-mentioned term "Equivalent peptide sequence" means any peptide sequence in which certain parts not strictly identical to the corresponding parts of the FIGS. 2, 3, 4 and 5 may be the peptide sequence shown, these variations being limited to local Mutations can be attributed to the general immunogenic character of the protein does not affect, or on modifications of the structure leading to the different serotypes, among which the proteins of the one in question Kind to appear.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch folgende Peptidsequenzen, die Untereinheiten der Prä-S(1)-Aminos&uresequenz darstellen: Peptid A: PheProAspHisGlnLeuAspProAla Peptid B: AsnAsnProAspTrpAspPheAsnPro Peptid Ca: ThrAsnArgGlnSerGlyArgProThr Peptid Cb: AlaAsnArgGlnSerGlyArgProThr Peptid Cc: ProProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrpro Peptid Cd: ProProproAlaSerAlaAsnArgGlnSerGlyArgGlnproThrpro In den vorstehend aufgeführten Peptiden (dies gilt auch für alle übrigen in dieser Anmeldung genannten Peptide beziehungsweise Peptidfragmente) ist jeweils die erste linksstehende Aminosäure Amino-terminal (zum Beispiel bei Peptid A Phe) und die letzte rechts stehende Aminosäure Carboxy-terminal (zum Beispiel bei Peptid A Ala).In particular, the invention also relates to the following peptide sequences, represent the subunits of the pre-S (1) amino acid sequence: Peptide A: PheProAspHisGlnLeuAspProAla Peptide B: AsnAsnProAspTrpAspPheAsnPro Peptide Ca: ThrAsnArgGlnSerGlyArgProThr peptide Cb: AlaAsnArgGlnSerGlyArgProThr peptide Cc: ProProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyArgGlnProThrpro Peptide Cd: ProProproAlaSerAlaAsnArgGlnSerGlyArgGlnproThrpro In those listed above Peptides (this also applies to all other peptides mentioned in this application or peptide fragments) is in each case the first amino acid on the left Amino-terminal (e.g. Phe for peptide A) and the last amino acid on the right Carboxy-terminal (for example with peptide A Ala).
Die Herstellung von kleineren Peptidfragmenten aus der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz kann nach den üblichen Verfahren zur Herstellung synthetischer Peptide erfolgen.The preparation of smaller peptide fragments from the pre-S (1) amino acid sequence can be carried out according to the usual methods for the production of synthetic peptides.
Beispielsweise kann man das Peptid Cc beziehungsweise Cd ausgehend von der Carboxy-terminalen Aminosäure nach dem Verfahren c) des Verfahrensanspruchs herstellen.For example, one can start with the peptide Cc or Cd of the carboxy-terminal amino acid according to process c) of process claim produce.
Die Erfindung betrifft auch die Produkte, die sich aus der Anheftung der erfindungsgemäßen Polypeptide (zum Beispiel gemäß Anspruch 8) sowie von den vorstehend angegebenen Untereinheiten solcher Polypeptide (zum Beispiel Oligopeptide des Anspruchs 7 beziehungsweise Fragmente von Polypeptiden gemäß Anspruch 8) an ein größeres Trägermolekül, insbesondere vom Polypeptid- oder Proteintyp, ergeben, ferner Mittel, welche solche Peptide in Form von Verknüpfungsprodukten enthalten, insbesondere zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, sowie insbesondere Impfstoffe gegen die Hepatitis B. Die pharmazeutischen Träger sind in an sich üblicher Weise der ausgewählten Verabreichungsart angepasst, die insbesondere oral, parenteral, rektal oder durch Aufsprühen auf die Schleimhäute, insbesondere der Nase, erfolgen kann.The invention also relates to the products resulting from attachment of the polypeptides according to the invention (for example according to claim 8) and of the subunits of such polypeptides indicated above (for example oligopeptides of claim 7 or fragments of polypeptides according to claim 8) result in a larger carrier molecule, in particular of the polypeptide or protein type, also agents which contain such peptides in the form of linkage products, in particular together with a pharmaceutically acceptable carrier, and in particular Vaccines against hepatitis B. The pharmaceutical carriers are in themselves more common Way of the selected type of administration adapted, in particular oral, parenteral, rectally or by spraying on the mucous membranes, especially the nose can.
Die Polypeptide gemäß Anspruch 7 oder 8 sowie Fragmente dieser Polypeptide können zum Beispiel auch nach den üblichen Verfahren der Peptidsynthese hergestellt werden.The polypeptides according to claim 7 or 8 and fragments of these polypeptides can, for example, also be prepared by the usual methods of peptide synthesis will.
Die Erfindung betrifft ferner noch die DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, beispielsweise für die Herstellung von Fragmenten der Polypeptide gemäß Anspruch 8 zu kodieren.The invention also relates to the DNA sequences that are capable of are, for example for the production of fragments of the polypeptides according to claim 8 to encode.
Es handelt sich: - Für das Peptid I insbesondere um die Polynucleotidsequenz der Formel TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT; - Für das Peptid II insbesondere um die Polynucleotidsequenz der Formel AAC AAT CCA GAT TGG GAC TTC AAC CCC; - Für die Peptide IIIc und IIId um die Polynucleotidsequenz der Formel CCT CCT CCT GCC TCC G*CC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC oder um Ausschnitte von mindestens 6 Tripletts * oder A oder in jedem dieser Fälle um das zu den drei jeweiligen vorstehenden Polynucleotiden komplementäre Polynucleotid, oder auch um irgendein Polynucleotid in dem jedes der Tripletts durch irgendein analoges Triplett ersetzt sein kann, das in der Lage ist, für den Einbau der gleichen Aminosäure zu kodieren: Die Nucleinsäure der Erfindung kann ferner auch nur einen der zwei wechselseitig komplementären Stränge der entsprechenden DNA-Sequenz gemäß Fig. 1 enthalten.These are: - For peptide I in particular the polynucleotide sequence of the formula TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT; - For the peptide II in particular around the polynucleotide sequence of the formula AAC AAT CCA GAT TGG GAC TTC AAC CCC; - For the Peptides IIIc and IIId around the polynucleotide sequence of the formula CCT CCT CCT GCC TCC G * CC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC or around sections of at least 6 triplets * or A or in each of these cases about the three polynucleotide complementary to each of the above polynucleotides, or else around any polynucleotide in each of the triplets by any analog triplet that is able to incorporate the same amino acid as well Code: The nucleic acid of the invention can also only one of the two reciprocally contain complementary strands of the corresponding DNA sequence according to FIG.
Die Erfindung betrifft natürlich auch die äquivalenten, einsträngigen oder doppelsträngigen Prä-S(1)-Nucleotid-Sequenzen, darunter insbesondere den codierenden Strang, die entsprechende doppelsträngige DNA oder die entsprechenden Boten-RNAs, insbesondere diejenige, die durch die entsprechenden Komplementärketten der Nucleotide wiedergegeben wird.The invention of course also relates to the equivalent, single-stranded ones or double-stranded pre-S (1) nucleotide sequences, including in particular the coding Strand, the corresponding double-stranded DNA or the corresponding messenger RNAs, especially those that are represented by the corresponding complementary chains of the nucleotides is reproduced.
Ebenfalls gehören zur Erfindung die Prä-S(1)-Nucleotidketten, die sich von den vorstehenden durch bestimmte Tripletts oder kurze Triplettsequenzen unterscheiden, mit der Maßgabe, daß diese Nucleotidsequenzen befähigt bleiben, für ein Polypeptid zu kodieren, das die immunogenen Eigenschaften der Prä-S(1)-Polypeptide zum Beispiel gemäß Anspruch 8 bewahrt. Allgemein handelt es sich um Prä-S(1)-Nucleotidketten, die gegebenenfalls nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA zur Erzeugung der entsprechenden einsträngigen Nucleinsäuren die Fähigkeit behalten, sich auf mindestens etwa 90 % ihrer Länge mit einem entsprechenden komplementären DNA-Strang zu hybridisieren.The invention also includes the pre-S (1) nucleotide chains, the differ from the above by certain triplets or short triplet sequences differ, with the proviso that these nucleotide sequences remain capable for to encode a polypeptide exhibiting the immunogenic properties of the pre-S (1) polypeptides for example according to claim 8 preserved. In general, these are pre-S (1) nucleotide chains, optionally after denaturing the double-stranded DNA to generate the corresponding single-stranded nucleic acids retain the ability to relate to at least hybridize about 90% of their length with a corresponding complementary DNA strand.
Die erfindungsgemäße Prä-S(1)-DNA ist für den Einbau in einen Vektor bestimmt, der ihre Expression in einem Bakterium und in eukaryotischen Zellen (zum Beispiel Hefezellen) ermöglicht, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung eines Proteins oder eines Peptids, das in der Lage ist, in einem lebenden Wirtsorganismus die Herstellung von Antikörpern zu induzieren, die gegen das Virus der Virushepatitis B aktiv sind. Das aus der Übersetzung der Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung hervorgehende Protein oder Peptid kann als Impfstoff oder als Hilfsmittel zur Diagnose verwendet werden.The pre-S (1) DNA according to the invention is for incorporation into a vector determined of their expression in one Bacterium and in eukaryotic Cells (for example yeast cells), especially with regard to production a protein or a peptide capable of acting in a living host organism induce the production of antibodies against the virus of viral hepatitis B are active. That which emerges from the translation of the nucleotide sequence according to the invention Protein or peptide can be used as a vaccine or as an aid to diagnosis will.
Weitere Kennzeichen der Erfindung werden sich noch aus der Beschreibung ergeben, die sich auf die Herstellung, die Identifizierung und Gewinnung der Prä-S(1)-DNA-Fragmente sowie der Prä-S(1)-Peptide gemäß der Erfindung bezieht. Natürlich wird auf die Zeichnungen Bezug genommen, deren Figuren bereits in den vorangehenden Ausführungen in Betracht gezogen wurden.Further characteristics of the invention will emerge from the description which relate to the production, identification and recovery of the pre-S (1) DNA fragments as well as the pre-S (1) peptides according to the invention. Of course, on the drawings Reference is made, the figures of which have already been considered in the preceding explanations were drawn.
Die Erfindung betrifft auch besondere Vektoren, die die Expression der vorstehend beschriebenen Prä-S(1)-Nucleotidsequenzen ermöglichen, insbesondere in Form eines Hybridproteins, in welchem ein Proteinfragment, das die immunologischen Eigenschaften der Polypeptide gemäß den Ansprüchen oder von Fragmenten hiervon aufweist, an ein Trägermolekül gebunden ist, wobei dem Ganzen immunogene oder immunoreaktive Eigenschaften verliehen werden, die es dazu befähigen, die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die im Wirtsorganismus, in den dieses Protein vorher eingebracht wurde, eine Schutzwirkung gegen die virale Infektion ausüben.The invention also relates to particular vectors that enable expression of the pre-S (1) nucleotide sequences described above, in particular in the form of a hybrid protein in which a protein fragment representing the immunological Has properties of the polypeptides according to the claims or fragments thereof, is bound to a carrier molecule, the whole being immunogenic or immunoreactive Properties are bestowed that enable it to produce antibodies to induce that in the host organism into which this protein was previously introduced exert a protective effect against the viral infection.
Insbesondere betrifft die Erfindung den Vector Plasmid pDR540 (Hersteller Pharmacia PL Biochemicals). Dieser Vector enthält als wesentliches Strukturmerkmal den "tac"-Promoter (Gene 20 (1982), 231), der eine hochwirksame Signal sequenz für die Auslösung der Proteinsynthese darstellt. Hinter dem tac-Promoter enthält pDR540 eine BamHI Schnittstelle. Für die Zwecke der Erfindung wurden die Einzelstrangenden der Schnittstelle mit einer Einzelstrang spezifischen Nuclease entfernt.In particular, the invention relates to the vector plasmid pDR540 (manufacturer Pharmacia PL Biochemicals). This vector contains as an essential structural feature the "tac" promoter (Gene 20: 231 (1982)), which is a highly effective signal represents sequence for triggering protein synthesis. Behind the tac promoter pDR540 contains a BamHI site. For the purposes of the invention, the Single strand ends of the interface with a single strand specific nuclease removed.
Mischt man das so modifizierte Plasmid mit einem DNA-Fragment, beispielsweise dem Prä-S(1)-Fragment, und setzt das Enzym DNA-Ligase zu, entsteht rekombinierte DNA, die immer dann zur Produktion von Proteinen führen kann, wenn ein Startcodon aus dem eingesetzten DNA-Fragment in der Nähe des tac-Promoters liegt.If you mix the modified plasmid with a DNA fragment, for example the pre-S (1) fragment, and if the enzyme DNA ligase is added, recombined is formed DNA, which can lead to the production of proteins whenever there is a start codon from the inserted DNA fragment is in the vicinity of the tac promoter.
Zu dem Verfahren a): Als Restriktionsnuclease, die die Nucleotidsequenz GAATTC spaltet, kommt in Frage EcoRI.Regarding method a): As a restriction nuclease which contains the nucleotide sequence GAATTC splits, EcoRI comes into question.
Die Behandlung mit diesem Enzym erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 34 und 400 C, vorzugsweise 360 und 380 C bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0, vorzugsweise 7,4 und 7,6; Zeit: 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden.The treatment with this enzyme takes place in an aqueous medium at temperatures between 34 and 400 C, preferably 360 and 380 C at pH values between 7.0 and 8.0, preferably 7.4 and 7.6; Time: 15 minutes to 16 hours, preferably 1 to 2 hours.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer, wie: 100 mM Tris-HCl; NaCl 50 mM; MgCl2 10 mM.The required pH is set, for example by buffers such as: 100 mM Tris-HCl; NaCl 50mM; MgCl2 10mM.
Beendigung der Enzymreaktionen beispielsweise durch Zusatz von: 250 mM Natrium-EDTA auf eine Endkonzentration von 25 mM.Termination of the enzyme reactions, for example, by adding: 250 mM sodium EDTA to a final concentration of 25 mM.
Die Inaktivierung dieses Enzyms erfolgt zum Beispiel durch Erhitzen auf 60 bis 80, vorzugsweise 64 bis 66" C, während 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 10 bis 15 Minuten.This enzyme is inactivated, for example, by heating to 60 to 80, preferably 64 to 66 "C, for 5 to 30 minutes, preferably 10 to 15 minutes.
Als Restriktionsnucleasen, die die Nucleotidsequenz AGCT spalten, kommen zum Beispiel in Frage: AluI oder Isoschizomere hiervon, wie Oxyl.As restriction nucleases that cleave the nucleotide sequence AGCT, come for example: AluI or isoschizomers thereof, such as Oxyl.
Die Behandlung mit AluI erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 35 und 400 C, vorzugsweise 36 und 380 C bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0, vorzugsweise 7,5 und 7,7; Zeit: 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden.The treatment with AluI takes place in an aqueous medium at temperatures between 35 and 400 C, preferably 36 and 380 C at pH values between 7.0 and 8.0, preferably 7.5 and 7.7; Time: 15 minutes to 16 hours, preferably 1 to 2 hours.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer, wie: 6 mM Tris-HCl; 50 mM NaCl; 6 mM MgCl2; 10 mM Dithiothreitol.The required pH is set, for example by buffers such as: 6 mM Tris-HCl; 50 mM NaCl; 6 mM MgCl2; 10 mM dithiothreitol.
Beendigung der Enzymreaktionen beispielsweise durch Zusatz von: 250 mM NaEDTA auf 10 mM Endkonzentration.Termination of the enzyme reactions, for example, by adding: 250 mM NaEDTA to 10 mM final concentration.
Die Inaktivierung dieses Enzyms erfolgt zum Beispiel durch Erhitzen auf 60 bis 80, vorzugsweise 64 bis 660 C, während 5 bis 30, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten.This enzyme is inactivated, for example, by heating to 60 to 80, preferably 64 to 660 C, while 5 to 30, preferably 5 to 10 Minutes.
Als Restriktionsendonucleasen, die die Nucleotidsequenz AGATCT spalten, kommt zum Beispiel in Frage: BGl II.As restriction endonucleases that cleave the nucleotide sequence AGATCT, for example: BGl II.
Die Behandlung mit diesem Enzym erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 34 und 400 C, vorzugsweise 36 und 380 C bei pH-Werten zwischen 9,0 und 10,0, vorzugsweise 9,4 und 9,6; Zeit: 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden.The treatment with this enzyme takes place in an aqueous medium at temperatures between 34 and 400 C, preferably 36 and 380 C at pH values between 9.0 and 10.0, preferably 9.4 and 9.6; Time: 15 minutes to 16 hours, preferably 1 up to 2 hours.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer, wie: 20 mM Glycin-NaOH; 10 mM MgCl2; 7 mM beta-Mercaptoethanol.The required pH is set, for example by buffers such as: 20 mM glycine-NaOH; 10mM MgCl2; 7 mM beta-mercaptoethanol.
Beendigung der Enzymreaktionen beispielsweise durch Zusatz von: 250 mM NaEDTA auf 20 mM Endkonzentration.Termination of the enzyme reactions, for example, by adding: 250 mM NaEDTA to 20 mM final concentration.
Die Inaktivierung dieses Enzyms erfolgt zum Beispiel durch Erhitzen auf 60 bis 80, vorzugsweise 64 bis 660 C, während 5 bis 30, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten.This enzyme is inactivated, for example, by heating to 60 to 80, preferably 64 to 660 C, while 5 to 30, preferably 5 to 10 Minutes.
Als Restriktionsnucleasen, die die Nucleotidsequenz GGTNACC spalten (N kann ein beliebiges Nucleotid A, G, T oder C sein), kommen zum Beispiel in Frage: BstEII oder Isoschizomere dieses Enzyms: AspAI, BstPI, EcaI.As restriction nucleases that cleave the nucleotide sequence GGTNACC (N can be any nucleotide A, G, T or C), for example: BstEII or isoschizomers of this enzyme: AspAI, BstPI, EcaI.
Die Behandlung mit BstEII erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 55 und 65, vorzugsweise 58 und 60° C bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0, vor- zugsweise 7,5 und 7,7; Zeit: 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden.The treatment with BstEII takes place in an aqueous medium at temperatures between 55 and 65, preferably 58 and 60 ° C at pH values between 7.0 and 8.0, before- preferably 7.5 and 7.7; Time: 15 minutes to 16 hours, preferably 1 to 2 hours.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer,. wie: 100 mM Tris-HCl; 50 mM KCl; 5 mM MgC12.The required pH is set, for example by buffer ,. such as: 100mM Tris-HCl; 50 mM KCl; 5mM MgCl2.
Beendigung der Enzymreaktionen beispielsweise durch Zusatz von: 250 mM NaEDTA auf 10 mM Endkonzentration.Termination of the enzyme reactions, for example, by adding: 250 mM NaEDTA to 10 mM final concentration.
Das Restriktionsenzym EcoRI und dessen Isoschizomere spalten hinter dem Start der Prä-S(2)-Sequenz, das heißt hinter dem Start des Nucleotidteils der Hepatitis B-DNA der die bekannten Oberflächenproteine mit den Mol-Gewichten 33 000 beziehungsweise 36 000 Dalton kodiert. Die anderen vorstehend erwähnten drei Typen von Restriktionsenzymen (BstEII, Alul, BGl II und deren Isoschizomere) spalten vor dem Startpunkt der Prä-S(1)-Sequenz.The restriction enzyme EcoRI and its isoschizomers cleave behind the start of the pre-S (2) sequence, i.e. after the start of the nucleotide part of the Hepatitis B-DNA of the known surface proteins with the molar weights 33,000 or 36,000 daltons are coded. The other three types mentioned above restriction enzymes (BstEII, Alul, BGl II and their isoschizomers) cleave before the starting point of the pre-S (1) sequence.
Die Behandlung der Hepatitis B-DNA mit den beiden Enzymtypen EcoRI einerseits und BstEII, Alul oder BGl II andererseits kann gleichzeitig erfolgen oder nacheinander, wobei die Reihenfolge beliebig ist. Beispielsweise kann man zuerst mit BstEII oder einem Isoschizomeren hiervon oder zuerst mit AluI beziehungsweise BGl II behandeln und anschließend mit dem Enzymtyp EcoRI, oder umgekehrt.Treatment of hepatitis B DNA with the two types of enzymes EcoRI on the one hand and BstEII, Alul or BGl II on the other hand can take place at the same time or one after the other, in any order. For example, you can first with BstEII or an isoschizomer thereof or first with AluI respectively Treat BGI II and then with the enzyme type EcoRI, or vice versa.
Falls bei der Spaltung mit den genannten Restriktionsenzymen DNA-Fragmente entstehen mit überstehenden 5'-Einzelstrangenden (5'-sticky-ends), wie dies zum Beispiel insbesondere bei Verwendung EcoRI und von BstEII und den entsprechenden Isoschizomeren der Fall ist, empfiehlt es sich, diese heraushängenden Enden mit einzelstrangspezifischen Nucleasen zu entfernen, das heißt in stumpfe Enden (blunt-ends) umzuwandeln.If the cleavage with the restriction enzymes mentioned is DNA fragments arise with protruding 5'-single strand ends (5'-sticky ends), like this for Example especially when using EcoRI and BstEII and the corresponding Isoschizomer is the case, it is best to use these protruding ends remove single-strand-specific nucleases, i.e. into blunt ends to convert.
Als einzelstrangspezifische Nucleasen für diese Umwandlung kommen zum Beispiel in Frage: Mung-Bean-Nuclease, Nuclease P1, Nuclease S1, Nuclease aus Neurospora crassa.Come as single strand specific nucleases for this conversion for example in question: Mung Bean Nuclease, Nuclease P1, Nuclease S1, Nuclease off Neurospora crassa.
Die Behandlung mit Mung-Bean-Nuclease erfolgt zum Beispiel in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 20 und 45, vorzugsweise 36 und 380 C bei pH-Werten zwischen 4 und 5, vorzugsweise 4,4 und 4,5; Zeit: 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 5 bis 15 Minuten.The treatment with mung bean nuclease takes place, for example, in aqueous Medium at temperatures between 20 and 45, preferably 36 and 380 C at pH values between 4 and 5, preferably 4.4 and 4.5; Time: 5 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer, wie 60 mM Natriumacetat-Essigsäure; 100 mM NaCl; 2 mM ZnCl; 10 % Glycerin.The required pH is set, for example by buffers such as 60 mM sodium acetate-acetic acid; 100 mM NaCl; 2 mM ZnCl; 10% glycerin.
Beendigung der Enzymreaktion beispielsweise durch Zusatz von: 250 mM NaEDTA auf 10 mM Endkonzentration.Termination of the enzyme reaction, for example, by adding: 250 mM NaEDTA to 10 mM final concentration.
Die Entfernung dieser Enzyme erfolgt zum Beispiel durch Ausschütteln mit Phenol und Chloroform wie beschrieben in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Seite 458, Verfasser T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1982).These enzymes are removed, for example, by shaking them out with phenol and chloroform as described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Page 458, authors T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1982).
Die Entfernung von überstehenden Einzelstrangenden kann auch durch Behandlung mit einer doppelstrangspezifischen Exonuclease, wie Bal31, erfolgen, wobei nun nicht nur der überstehende Einzelstrang, sondern das ganze Fragment an dem Ende, wo das Startcodon für die Prä-S(1)-Sequenz liegt, weiter verkürzt wird, wodurch eine günstigere Distanz zwischen dem Startcodon der Prä-S(1)-Sequenz und der Shine-Delgarno-Sequenz erreicht wird, die möglichst 3 bis 12 Basenpaare betragen soll.The removal of protruding single strand ends can also be done by Treatment with a double-strand-specific exonuclease such as Bal31, now not only the protruding single strand, but the entire fragment the end where the start codon for the pre-S (1) sequence lies is further shortened, whereby a more favorable distance between the start codon of the pre-S (1) sequence and the Shine-Delgarno sequence is achieved, which are as much as possible 3 to 12 base pairs target.
Die Behandlung mit diesem Enzym erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 20 und 400 C, vorzugsweise 25 und 350 C bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,5, vorzugsweise 7,5 und 8,1; Zeit: 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise 10 bis 20 Minuten.The treatment with this enzyme takes place in an aqueous medium at temperatures between 20 and 400 C, preferably 25 and 350 C at pH values between 7.0 and 8.5, preferably 7.5 and 8.1; Time: 1 to 30 minutes, preferably 10 to 20 minutes.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer, wie: 20 mM Tris-HCl; 12 mM MgCl2; 12 mM CaCl2; 60 mM NaCl; 1 mM EDTA.The required pH is set, for example by buffers such as: 20 mM Tris-HCl; 12 mM MgCl2; 12 mM CaCl2; 60 mM NaCl; 1 mM EDTA.
Beendigung der Enzymreaktion beispielsweise durch Zusatz von 250 mM NaEDTA auf 35 mM.Termination of the enzyme reaction, for example, by adding 250 mM NaEDTA to 35 mM.
Die Inaktivierung dieser Enzyme erfolgt zum Beispiel durch Erhitzen auf 60 bis 750 C, vorzugsweise 60 bis 700 C während 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten.These enzymes are inactivated, for example, by heating to 60 to 750 ° C., preferably 60 to 700 ° C., for 5 to 30 minutes, preferably 5 to 10 minutes.
Weiterhin ist es gegebenenfalls erforderlich, Eir.zelstranglücken in den erhaltenen DNA-Fragmenten zu verschließen. Hierzu wird zusätzlich und zweckmäßig nach Behandlung mit der Exonuclease mit entsprechenden Polymerasen behandelt. Als solche Polymerase kommt zum Beispiel in Frage: Das große Fragment der DNA-Polymerase I aus E.coli nach Klenow oder reverse Transcriptase.Furthermore, it may be necessary to identify single strand gaps to seal in the DNA fragments obtained. This is additional and appropriate treated with appropriate polymerases after treatment with the exonuclease. as Such a polymerase comes into question, for example: The large fragment of DNA polymerase I from E. coli according to Klenow or reverse transcriptase.
Die Behandlung mit dem DNA-Polymerase Fragment erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 60 C und 25° C, vorzugsweise 10 und 140 C bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8.0, vorzugsweise 7,3 und 7,5; Zeit: 10 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 4 bis 16 Stunden je nach Temperatur.The treatment with the DNA polymerase fragment takes place in aqueous Medium at temperatures between 60 C and 25 ° C, preferably 10 and 140 C at pH values between 7.0 and 8.0, preferably 7.3 and 7.5; Time: 10 minutes to 16 hours, preferably 4 to 16 hours depending on the temperature.
Die Einstellung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt beispielsweise durch Puffer wie: 6,6 mM Tris-HCl; 6,6 mM MgCl2; 5 mM NaCl; 1 mM Dithiothreitol.The required pH value is set for example by buffers such as: 6.6 mM Tris-HCl; 6.6 mM MgCl2; 5 mM NaCl; 1 mM dithiothreitol.
Ein geeignetes Fragment wird beispielsweise erhalten durch die Behandlung der HBV-DNA mit der Restriktionsnuclease vom Typ BstEII, gefolgt von einer anschließenden Behandlung mit einer Exonuclease und von einem Schnitt mit EcoRI. Um das durch BstEII hervorgerufene Fragmentende weiter in Richtung der Prä-S(1)-Sequenz zu verschieben, empfiehlt es sich, als Alternative zum Bal31 Verdau die etwa 400 Basenpaar langen DNA-Fragmente mit der Prä-S(1)-Sequenz oder eine rekombinierte DNA aus einem solchen etwa 400 Basenpaar langen Fragment und der DNA eines Plasmids (zum Beispiel Plasmid pGL101) nochmals mit dem Restriktionsenzym AluI zu behandeln, wodurch nun ein DNA-Fragment mit der Prä-S(1)-Sequenz erhalten wird, das eine optimale Distanz von 3 bis 12 Basenpaaren zwischen dem Startcodon der Prä-S(1)-Sequenz und der Shine-Delgarno-Sequenz besitzt. Gegebenenfalls kann hierbei die rekombinierte Plasmid DNA durch Transformierung auf eine Wirtszelle (E.coli-Bakterien) mit anschließender Selektionierung und Klonierung nochmals vermehrt werden, bevor aus ihr nach Lysierung der positiven Klone das DNA-Fragment mit der Prä-S(1)-Sequenz beispielsweise durch Behandeln mit dem Enzym AluI wieder herausgeschnitten wird Die Isolierung der DNA-Fragmente mit der Prä-S(1)-Sequenz kann zum Beispiel in üblicher Weise erfolgen durch: Gelelektrophorese in Polyacrylamidgel von 3,5 bis 8,0 %, vorzugsweise 4 bis 6 % oder in Agarosegelen von 0,9 bis 2,0 %, vorzugsweise 1,2 bis 1,5 8 mit den Puffern und Bedingungen, wie sie in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), Seiten 150 bis 178 angegeben sind. Die Fragmente werden bevorzugt durch Färbung mit Ethidiumbromid und Beleuchtung mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht und durch Vergleich mit Fragmentserien bekannter Größe wird das gewünschte Fragment mit etwa 370 bis 390 Basen identifiziert und die Gelfläche, die dieses Fragment enthält, ausgeschnitten. Die DNA wird aus Agarose durch Electroelution in einem Dialyseschlauch herausgelöst und durch Ionenaustausch mit Diethylaminoethyl-Cellulose gereinigt. Die genauen Verfahren sind im Laboratory Manual (ibid.) beschrieben. Aus Polyacrylamidgel wird das gewünschte DNA-Fragment durch Diffusion in Puffer wie beschrieben eluiert.A suitable fragment is obtained, for example, by the treatment the HBV-DNA with the restriction nuclease of the type BstEII, followed by a subsequent one Treatment with an exonuclease and a cut with EcoRI. To get that through BstEII to move the generated fragment end further in the direction of the pre-S (1) sequence, it is recommended to use the 400 base pairs as an alternative to the Bal31 digestion DNA fragments with the pre-S (1) sequence or a recombined DNA from such approximately 400 base pair long fragment and the DNA of a plasmid (for example plasmid pGL101) to treat again with the restriction enzyme AluI, which now creates a DNA fragment with the pre-S (1) sequence having an optimal distance of 3 to 12 base pairs between the start codon of the pre-S (1) sequence and the Shine-Delgarno sequence. If necessary, the recombined plasmid DNA can be transformed by transformation on a host cell (E. coli bacteria) with subsequent selection and cloning be multiplied again before the DNA fragment from it after lysing the positive clones with the pre-S (1) sequence, for example by treating with the enzyme AluI again The isolation of the DNA fragments with the pre-S (1) sequence is cut out can for example be carried out in the usual way by: gel electrophoresis in polyacrylamide gel from 3.5 to 8.0%, preferably 4 to 6% or in agarose gels from 0.9 to 2.0%, preferably 1.2 to 1.5 8 with the buffers and conditions set out in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual "(Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), p. 150 to 178 are given. The fragments are preferred by coloring made visible with ethidium bromide and illumination with long-wave UV light and by comparison with series of fragments of known size, the desired fragment identified with about 370 to 390 bases and the gel area containing this fragment contains, cut out. The DNA is made from agarose by electroelution in one Dialysis tube detached and ion exchange with diethylaminoethyl cellulose cleaned. The exact procedures are described in the Laboratory Manual (ibid.). The desired DNA fragment is made from polyacrylamide gel by diffusion in buffer eluted as described.
Zur Gewinnung von Polypeptiden, die von der Prä-S(1)-Sequenz kodiert werden, werden die entsprechenden DNA-Fragmente mit der Prä-S(1)-Sequenz, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, mit der DNA eines Vektors (zum Beispiel Plasmid oder virale DNA) kombiniert. Als Plasmide kommen hierfür zum Beispiel in Frage: Plasmide mit einem selektionierbaren Marker-Gen, beispielsweise dem Gen für Ampicillinresistenz und einem starken Promoter, insbesondere die Plasmide pGL101 und pDR540.For the recovery of polypeptides encoded by the pre-S (1) sequence the corresponding DNA fragments with the pre-S (1) sequence that are like described above, with the DNA of a vector (for example Plasmid or viral DNA) combined. As plasmids for this purpose, for example Question: Plasmids with a selectable marker gene, for example the gene for Ampicillin resistance and a strong promoter, especially the plasmids pGL101 and pDR540.
Das Plasmid pGL101 ist in Form des Bakterienstammes E.coli JM101pGL101 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3081 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt.The plasmid pGL101 is in the form of the bacterial strain E. coli JM101pGL101 under the depository number DSM 3081 at the German Collection of Microorganisms, Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen.
Plasmid pGL101 (J.Virol. 37 (1981) 683-697) enthält als Signalsequenz den lac uv 5 Promoter (Gene 20 (1982) 231) der im Normalzustand des E.coli Bakteriums durch ein Regelprotein, den lac-Repressor blockiert ist.Plasmid pGL101 (J. Virol. 37 (1981) 683-697) contains as a signal sequence the lac uv 5 promoter (Gene 20 (1982) 231) which is in the normal state of the E. coli bacterium by a regulatory protein the lac repressor is blocked.
Dieser lac-Repressor wird beispielsweise durch Isopropylthiogalactosid (IPGT), dem sogenannten Induktor, unwirksam gemacht. Nach Zusatz von IGPT wird der lac-Promoter frei und bindet hochwirksam RNA-Polymerase, die ihrerseits DNA-Sequenzen, die nach dem Promoter folgen in mRNA transcribiert. Die von der DNA-Sequenz codierten Proteine werden dann an der mRNA exprimiert, das heißt in Polypeptidketten "translatiert". Das Plasmid pGL101 enthält kurz nach dem lac-Promoter eine Schnittstelle für die Restriktionendonuclease PvuII, in die die Prä-S(1)-Sequenz eingesetzt werden soll.This lac repressor is exemplified by isopropylthiogalactoside (IPGT), the so-called inductor, made ineffective. After adding IGPT, the lac promoter free and binds highly effectively RNA polymerase, which in turn contains DNA sequences, those following the promoter are transcribed in mRNA. Those encoded by the DNA sequence Proteins are then expressed on the mRNA, that is, "translated" into polypeptide chains. The plasmid pGL101 contains a cleavage site for the shortly after the lac promoter Restriction endonuclease PvuII into which the pre-S (1) sequence is to be inserted.
Die Behandlung mit PvuII erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 34 und 400 C, vorzugsweise 36 und 38° C, bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,4, vorzugsweise 7,5 und 7,9; Zeit 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden. Als Reaktionspuffer wird beispielsweise verwendet: 6 mM Tris-HCl; 60 mM NaCl; 6 mM MgCl2; 7 mM beta-Mercaptoethanol.The treatment with PvuII takes place in an aqueous medium at temperatures between 34 and 400 C, preferably 36 and 38 ° C, at pH values between 7.0 and 8.4, preferably 7.5 and 7.9; Time 15 minutes to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. The reaction buffer used is, for example: 6 mM Tris-HCl; 60 mM NaCl; 6 mM MgCl2; 7 mM beta-mercaptoethanol.
Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 250 mM EDTA bis 10 mM Endkonzentration. Inaktivierung durch Erwärmen auf 65 - 800 C, vorzugsweise 65 - 700 C für 10 Minuten.Stop the reaction by adding 250 mM EDTA to a final concentration of 10 mM. Inactivation by heating to 65 - 800 C, preferably 65 - 700 C for 10 minutes.
Plasmid pDR540 (Pharmacia-PL Biochemicals) enthält als Signalsequenz anstelle des lac uV5 Promoters, den tac Promoter, der im Prinzip genauso wirkt, jedoch eine etwa 10 mal stärkere Transcription der nachfolgenden DNA-Abschnitte bewirkt (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 (1983) 21). Dieses Plasmid enthält kurz nach dem tac-Promoter eine BamHI Schnittstelle, in die die Prä-S(1)-Sequenz ebenfalls eingesetzt wurde.Plasmid pDR540 (Pharmacia-PL Biochemicals) contains as a signal sequence instead of the lac uV5 promoter, the tac promoter, which in principle works in the same way, however, about 10 times more transcription of the following DNA segments (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 (1983) 21). This plasmid contains shortly after the tac promoter a BamHI cleavage site in which the pre-S (1) sequence also was used.
Die Behandlung mit BamHI erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen von 34 bis 400 C, vorzugsweise 36 und 380 C, bei pH-Werten zwischen 7,0 und 9,0, vorzugsweise 7,9 und 8,1; Zeit 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden. Als Reaktionspuffer wird beispielsweise verwendet: 10 mM Tris-HCl; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2, 1 mM beta-Mercaptoethanol.The treatment with BamHI takes place in an aqueous medium at temperatures from 34 to 400 C, preferably 36 and 380 C, at pH values between 7.0 and 9.0, preferably 7.9 and 8.1; Time 15 minutes to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. The reaction buffer used is, for example: 10 mM Tris-HCl; 100 mM NaCl; 5mM MgCl2, 1mM beta-mercaptoethanol.
Da BamHI Einzelstrangenden erzeugt, müssen diese noch mit Mung Bean Nuclease oder Enzymen ähnlicher Wirkung, wie vorher beschrieben, entfernt werden.Since BamHI produces single strand ends, these still have to be made with Mung Bean Nuclease or enzymes of similar activity as previously described can be removed.
Die Kombination der aufgeschnittenen Plasmide pGL101 oder pDR540 mit dem Prä-S(1) DNA-Fragment erfolgt mit DNA-Ligase, insbesondere T4-DNA Ligase, in Gegenwart von 0,5 bis 2 mM Adenosintriphosphat (ATP), vorzugsweise 0,8 bis 1,2 mM in wässrigem Medium bei Temperaturen von 0 bis 200 C, vorzugsweise 4 bis 50 C und pH-Werten von 7,0 bis 8,2, vorzugsweise 7,5 bis 7,7. Als Reaktionspuffer wurde beispielsweise verwendet: 66 mM Tris-HCl; 5 mM MgC12; 5 mM DTT; 1 mM ATP.The combination of the cut plasmids pGL101 or pDR540 with the pre-S (1) DNA fragment is carried out with DNA ligase, in particular T4-DNA ligase, in Presence of 0.5 to 2 mM adenosine triphosphate (ATP), preferably 0.8 to 1.2 mM in an aqueous medium at temperatures of 0 to 200 C, preferably 4 to 50 C and pH values from 7.0 to 8.2, preferably 7.5 to 7.7. As a reaction buffer, for example used: 66 mM Tris-HCl; 5mM MgC12; 5mM DTT; 1 mM ATP.
Die so erhaltene Plasmid-DNA in der Reaktionsmischung wird zum Beispiel nach der Methode von Hanahan, J.Mol.The thus obtained plasmid DNA in the reaction mixture is, for example according to the method of Hanahan, J.Mol.
Biol. 166 (1983), 557 - 580 in bakterielle Wirtszellen transferiert und die Zellen mit der Plasmid-DNA selektioniert. Als Wirtszellen kommen in Frage: Bakterien, bevorzugt E.coli Stämme, die keine Restriktions- oder Rekombinationsfähigkeit haben, wie zum Beispiel E.coli-Stamm JM101.Biol. 166: 557-580 (1983) in bacterial host cells transferred and selecting the cells with the plasmid DNA. Possible host cells are: Bacteria, preferably E. coli strains, which have no ability to restrict or recombine such as E. coli strain JM101.
Hierzu wurden E.coli Bakterien in LB-Medium (1 % Bactotrypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl autoklaviert 20 Minuten bei 1200 C) bis zu einer optischen Dichte bei 600 Nanometer (OD600) von 0,1 bis 0,15 kultiviert, dann wird MgCL2 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugefügt und weiter bis zu einer OD600 von 0,55 bis 0,65 kultiviert. Dann wird die Kultur rasch auf 0° C abgekühlt, die Zellen abzentrifugiert und die Zellen dann in dem von Hanahan beschriebenen Transformationspuffer resuspendiert, in der Kälte mit 3 bis 4 % Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt und dann kurz schockgefroren. Nach Zugabe von weiteren 3 bis 4 % DMSO wird die einzuschleusende DNA, etwa 1 bis 4 Ag/ml, zugefügt, erneut in der Kälte inkubiert und schockgefroren. Durch diesen Prozess soll die Aufnahme der DNA in die Zellen bewirkt werden. Schließlich werden die Zellen aufgetaut und in einem zehnfachen Volumen von LB-Medium 0,5 bis 2 Stunden bei 370 C kultiviert. Von diesem Gemisch werden nun Einzelklone hergestellt, indem 0,1 bis 0,2 ml davon auf einem halbfesten Nährboden in 8 cm großen Petrischalen ausgestrichen werden. Der Nährboden besteht aus LB-Medium, in dem 1,5 % Agar in der Hitze aufgelöst wurden (LB-Agar). Um nur solche Bakterienzellen wachsen zu lassen, die tatsächlich eine funktionsfähige Plasmid DNA aufgenommen haben, wurde dem LB-Medium für diesen Zweck das Antibiotikum Ampicillin zugesetzt bevorzugt in Endkonzentrationen von 20 bis 200, vorzugsweise 50 bis 150 ßg/ml (LBA-Agar). Das rekombinierte Plasmid enthält ein Gen, das Ampicillin-Resistenz vermittelt.For this purpose, E. coli bacteria in LB medium (1% Bactotrypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl autoclaved for 20 minutes at 1200 C) until an optical Density cultured at 600 nanometers (OD600) from 0.1 to 0.15, then MgCL2 is up to added to a final concentration of 20mM and further to an OD600 of 0.55 cultivated to 0.65. The culture is then rapidly cooled to 0 ° C. and the cells are centrifuged off and the cells are then resuspended in the transformation buffer described by Hanahan, Treated in the cold with 3 to 4% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then briefly flash frozen. After adding another 3 to 4% DMSO, the DNA to be introduced is about 1 to 4 Ag / ml, added, incubated again in the cold and snap frozen. Through this The process is supposed to bring about the uptake of the DNA into the cells. Eventually be Thaw the cells and reside in a ten-fold volume of LB medium for 0.5 to 2 hours cultivated at 370 C. From this mixture, single clones are now produced by 0.1 to 0.2 ml of it on a semi-solid culture medium in 8 cm Petri dishes be crossed out. The culture medium consists of LB medium in which 1.5% agar in dissolved in heat (LB agar). To let only those bacterial cells grow which actually took up a functional plasmid DNA was added to the LB medium for this purpose the antibiotic ampicillin is added preferably in final concentrations from 20 to 200, preferably 50 to 150 μg / ml (LBA agar). The recombined plasmid contains a gene that mediates ampicillin resistance.
Nach Bebrütung über Nacht bei 37C C werden einige Dutzend bis einige Hundert Bakterienkolonien auf der Agarschicht sichtbar Nur ein kleiner Teil der aufgenommenen Plasmide enthält die gewünschte rekombinierte Plasmid DNA mit der Prä-S(1)-DNA-Sequenz. Zu ihrer Erkennung werden nun mit LBA-Medium angefeuchtete Nitrocellulosemembranen mit 80 mm Durchmesser auf die Agarplatten mit den Klonen aufgelegt und so Replicas der Ausgangsplatte hergestellt. Die Nitrocellulosemembran wird nun auf eine neue Agarplatte gelegt und bebrütet, so daß in spiegelbildlicher Anordnung die Klone der Ausgangsplatte wieder wachsen. Auf dieser Membran werden nun nach bekannten Methoden die Bakterienzellen der Klone lysiert und die DNA in situ mit Alkali in Einzel stränge aufgetrennt. Diese Einzelstränge binden sich hierbei irreversibel an die Membran. Nun wird die Membran mit einer bekannten einzelsträngigen HBV-DNA inkubiert, wobei diese HBV-DNA vorher durch sogenannte Nick-Translation mit 32P markierten Nucleotidtriphosphaten radioaktiv gemacht wurde. Diejenigen Klone, welche Prä-S(1)-DNA eingebaut haben, werden bei diesem Test die 32P markierte HBV-DNA aufgrund ihrer homologenen Basensequenzen binden.After incubation overnight at 37C C, a few dozen to a few Hundreds of bacterial colonies visible on the agar layer. Only a small part of the recorded plasmids contains the desired recombined plasmid DNA with the Pre-S (1) DNA sequence. For their detection, they are now moistened with LBA medium Nitrocellulose membranes 80 mm in diameter on the agar plates with the clones placed on top and thus made replicas of the original plate. The nitrocellulose membrane is now placed on a new agar plate and incubated so that in mirror image Arrange the clones to grow back on the original plate. Be on this membrane the bacterial cells of the clones are now lysed and the DNA in in situ separated into individual strands with alkali. These single strands bind here irreversibly to the membrane. Now the membrane is known to be single-stranded HBV-DNA incubated, this HBV-DNA beforehand by so-called nick translation made radioactive with 32P labeled nucleotide triphosphates. Those clones which have pre-S (1) -DNA incorporated become the 32P-labeled HBV-DNA in this test bind due to their homologous base sequences.
Die entsprechenden Stellen auf der Membran werden durch Schwärzung eines Röntgenfilms erkannt. Die entsprechenden Klone auf der Ausgangsplatte können dann identifiziert und vermehrt werden. Diese gesamte Technik der "in situ" Hybridisierung ist ausführlich in T.Maniatis, E.F. Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories Seite 312 bis 328 beschrieben.The corresponding points on the membrane are marked by blackening of an X-ray film detected. The corresponding clones on the original disk can then identified and multiplied. This entire technique of "in situ" hybridization is detailed in T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories pages 312-328.
Die in situ Hybridisierung kann nicht die Polarität der eingesetzten Prä-S(1)-Sequenz erkennen. Die mRNA kann nur von 5' in 3' Richtung synthetisiert werden, so daß nur die Hälfte der rekombinierten Plasmide, jene mit der richtigen Polarität, zur Synthese von Prä-S(1)-Protein führen werden. Eine Reihe von Klonen mit der Prä-S(1)-Sequenz wurde daher einzeln in LBA Medium kultiviert und aus diesen nach bekannten Methoden Plasmid-DNA (siehe Maniatis et al, Molecular Cloning, Seite 92) isoliert und im Falle von pGL101 durch Schnitte mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sau96I charakterisiert.The in situ hybridization cannot change the polarity of the one used Recognize pre-S (1) sequence. The mRNA can only be synthesized from 5 'to 3' so that only half of the recombined plasmids, those with the right Polarity, will lead to the synthesis of pre-S (1) protein. A series of clones with the pre-S (1) sequence was therefore cultured individually in and from LBA medium plasmid DNA using known methods (see Maniatis et al, Molecular Cloning, p 92) and, in the case of pGL101, by sections with the restriction enzymes EcoRI and Sau96I characterized.
Die Prä-S(1)-Sequenz enthält etwa 100 Basen vom Beginn der Prä-S(1)-Sequenz entfernt eine Sau96I Stelle, der Vector pGL101 etwa 100 Basen vor der Insertionsstelle eine EcoRI-Stelle. Es entsteht also bei richtiger Polarität ein 200 Basenpaar-Fragment. Bei falscher Polarität sind die letzten 300 Basen des Prä-S(1)-Fragment mit dem lacuv 5 Promoter verknüpft, so daß ein 400 Basenpaar-Fragment vorliegt.The pre-S (1) sequence contains approximately 100 bases from the beginning of the pre-S (1) sequence removes a Sau96I site, the vector pGL101 about 100 bases in front of the insertion site an EcoRI site. If the polarity is correct, a 200 base pair fragment is created. If the polarity is wrong, the last 300 bases of the pre-S (1) fragment are with the lacuv 5 promoter linked so that a 400 base pair fragment is present.
Im Falle des Plasmids pDR540 wurden Prä-S(1) Insertionen der richtigen Polarität durch Schnitte mit Hind III und BalI ermittelt, wobei die richtige Polarität zu einem 260 Basenpaar-Fragment führt, die falsche zu einem 360 Basenpaar-Fragment. Die Größe der Fragmente wurde durch Gelelektrophorese in 5 % Polyacrylamidgel wie vorher beschrieben ermittelt.In the case of plasmid pDR540, pre-S (1) insertions of the correct Polarity determined by sections with Hind III and BalI, using the correct polarity leads to a 260 base pair fragment, the wrong one to a 360 base pair fragment. The size of the fragments was determined by gel electrophoresis in 5% polyacrylamide gel such as previously described.
Die Klone, die rekombinierte Plasmid DNA mit der Prä-S(1)-Sequenz in der richtigen Polarität enthalten, sollten im Prinzip Prä-S(1) Protein der Formel I in Anspruch 8 synthetisieren, mit X = MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg, sofern keine unerkannten Veränderungen der DNA-Sequenz eingetreten sind.The clones, the recombined plasmid DNA with the pre-S (1) sequence Contained in the correct polarity, should in principle be pre-S (1) protein of the formula I synthesize in claim 8, with X = MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg, if none Undetected changes in the DNA sequence have occurred.
Bei zwei Klonen pKG1 und pKG2 wurde die Synthese des Prä-S(1)-Protein eindeutig nachgewiesen. Plasmid pKG1 besteht aus dem Plasmid pGL101 und der Prä-S(1)-Sequenz, pKG2 ist vom Vector pDR540 abgeleitet. Beide Plasmide befinden sich in E.coli JM101 und sind als Stämme E.coli JM101 pKG1 mit der Aufnahme-Nummer DSM 3079 und als E.coli JM101 pKG2 mit der Aufnahme-Nummer DSM 3080 bei der Sammelstelle Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt.In two clones pKG1 and pKG2 the synthesis of the pre-S (1) protein clearly proven. Plasmid pKG1 consists of the plasmid pGL101 and the pre-S (1) sequence, pKG2 is derived from the vector pDR540. Both plasmids are in E. coli JM101 and as strains are E. coli JM101 pKG1 with the admission number DSM 3079 and as E. coli JM101 pKG2 with the registration number DSM 3080 at the collection point German Collection of Microorganisms (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, deposited.
Für die Produktion des Prä-S(1)-Protein wird einer der Stämme in LB-Medium mit 0,5 mM bis 2 mM IPGT, bevorzugt 1 mM, bei 35 bis 39° C, bevorzugt bei 370 C kultiviert und kurz nach Erreichen der stationären Phase abzentrifugiert. Die gepackten Zellen werden danach mit dem Enzym Lysozym, das Bakterienzellwände auflöst, und mit einem nichtionischen Detergens wie beispielsweise Nonidet P40, behandelt. Die Behandlung erfolgt in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 0 und 40 C mit 1 bis 10 mg/ml Lysozym, vorzugsweise 4 bis 6 mg/ml bei pH 7,2 bis 7,6 für 5 bis 15 Minuten, vorzugsweise 8 bis 12 Minuten. Als Puffer dient beispielsweise 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA. Danach wird das Gemisch bei 12 000 bis 18 000 U/Minute für 10 bis 20 Minuten bei 40 C abzentrifugiert. Der Überstand enthält neben löslichen E . coli Proteinen Prä-S(1)-Protein.For the production of the pre-S (1) protein, one of the strains is used in LB medium with 0.5 mM to 2 mM IPGT, preferably 1 mM, at 35 to 39 ° C, preferably at 370 ° C cultivated and centrifuged shortly after reaching the stationary phase. The packed Cells are then treated with the enzyme lysozyme, which dissolves bacterial cell walls, and treated with a nonionic detergent such as Nonidet P40. the Treatment takes place in an aqueous medium at temperatures between 0 and 40 ° C 1 to 10 mg / ml lysozyme, preferably 4 to 6 mg / ml at pH 7.2 to 7.6 for 5 to 15 minutes, preferably 8 to 12 minutes. For example, 10 mM serves as the buffer Tris-HCl and 1 mM EDTA. Thereafter, the mixture is set at 12,000 to 18,000 rpm for Centrifuged at 40 C for 10 to 20 minutes. The supernatant contains in addition to soluble E. coli proteins pre-S (1) protein.
Das Prä-S(1)-Protein kann durch Immunaffinitätschromatographie angereichert und gereinigt werden. Dafür wird der monoklonale Antikörper MA18/7 kovalent an einen festen Träger gebunden. Als Träger sind beispielsweise poröse Glasperlen oder Agarosegelperlen geeignet. Für die kovalente Kopplung können im Handel erhältliche Derivate beider Materialien verwendet werden, zum Beispiel Aminopropylsilan beschichtete Glasperlen mit 140 nm Porenweite (Fluka) oder Bromcyan aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia-PL-Biochemicals). Die Aminogruppe der beschichteten Glasperlen wird mit wässriger Glutardialdehydlösung aktiviert und zwar mit 1 bis 20 %, vorzugsweise 4 bis 8 % bei 0 bis 300 C, vorzugsweise 20 bis 25° C, und bei pH 7 bis 10, vorzugsweise pH 8 bis 9 für 10 bis 60 Minuten, vorzugsweise 20 bis 40 Minuten. Das aktivierte Trägermaterial wird mit niedrigmolekularen alkalischem Puffer gewaschen und mit einem Überschuß MAi 8/7 versetzt.The pre-S (1) protein can be enriched by immunoaffinity chromatography and cleaned. For this, the monoclonal antibody MA18 / 7 is covalently attached to a solid support bound. Porous glass beads or agarose gel beads, for example, are used as carriers suitable. Commercially available derivatives of both can be used for covalent coupling Materials used are, for example, aminopropylsilane coated glass beads Sepharose 4B activated with 140 nm pore size (Fluka) or cyanogen bromide (Pharmacia-PL-Biochemicals). The amino group of the coated glass beads is treated with aqueous glutaraldehyde solution activated with 1 to 20%, preferably 4 to 8% at 0 to 300 ° C., preferably 20 to 25 ° C, and at pH 7 to 10, preferably pH 8 to 9 for 10 to 60 minutes, preferably 20 to 40 minutes. The activated carrier material is washed with low molecular weight alkaline buffer and with an excess May 8/7 postponed.
MAi 8/7 wird vorzugsweise aus Ascitesflüssigkeit gewonnen, und zwar durch Fällung mit 17 % Natriumsulfat.May 8/7 is preferably obtained from ascites fluid, namely by precipitation with 17% sodium sulfate.
Das gefällte Immunglobulin wird in 0,01 M Natriumcarbonat pH 9 wieder aufgelöst und mit dem aktivierten Trägermaterial 2 bis 20 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden bei 0 bis 200 C, vorzugsweise 4 bis 80 C geschüttelt. Dabei tritt die kovalente Kopplung ein. Im Falle des Glutardialdehyd aktivierten Trägers werden die entstandenen Bindungen mit der Struktur einer Schiff'schen Base durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert. Dies geschieht durch Rühren mit 0,05 bis 0,2 % Natriumborhydrid für 1 bis 4 Stunden bei 0° C und pH 9(tal). Danach wird der trägerfixierte Antikörper MA18/7 mit PBS-Puffer, dann mit 3M Natriumthiocyanat (NaSCN) Lösung und wieder mit PBS Puffer gewaschen.The precipitated immunoglobulin is dissolved in 0.01 M sodium carbonate pH 9 again dissolved and with the activated carrier material for 2 to 20 hours, preferably Shaken for 4 hours at 0 to 200 C, preferably 4 to 80 C. The covalent coupling. In the case of glutaraldehyde activated carrier the resulting bonds with the structure of a Schiff base through reduction stabilized with sodium borohydride. This is done by stirring at 0.05-0.2 % Sodium borohydride for 1 to 4 hours at 0 ° C and pH 9 (tal). Then the carrier-fixed Antibody MA18 / 7 with PBS buffer, then with 3M sodium thiocyanate (NaSCN) solution and washed again with PBS buffer.
Der Prä-S(1)-haltige Rohextrakt wird nun mit dem so hergestellten Immunadsorbens umgesetzt. Hierzu kann das Immunadsorbens in eine Chromatographiesäule gepackt werden und dann leitet man langsam den Rohextrakt durch diese Säule oder man fügt dem verdünnten Rohextrakt (1:5 bis 1:20 verdünnt in PBS) das Immunadsorbens zu und schüttelt.The pre-S (1) -containing crude extract is now prepared with the Immune adsorbent implemented. For this purpose, the immunoadsorbent can be placed in a chromatography column are packed and then you slowly pass the crude extract through this column or the immunoadsorbent is added to the diluted crude extract (diluted 1: 5 to 1:20 in PBS) to and shakes.
Die Bindung des Prä-S(1)-Proteins erfolgt bei 0 bis 400 C, vorzugsweise 18 bis 250 C im Verlauf von 0,5 bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis 4 Stunden. Es schließen sich eine gründliche Waschung mit PBS, mit 0,5 bis 1,5 M NaCl-Lösung, bevorzugt 1 M NaCl und wieder mit PBS an, um E.coli-Proteine so gut wie möglich zu entfernen.The pre-S (1) protein is bound at 0 to 400 ° C., preferably 18 to 250 C in the course of 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 4 hours. It followed by a thorough wash with PBS, with 0.5 to 1.5 M NaCl solution, preferably 1 M NaCl and again with PBS to get E. coli proteins as well as possible to remove.
Die Ablösung des Prä-S(1)-Protein erfolgt mit 3 M NaSCN oder mit saurem Puffer von pH 1,8 bis 2,2, beispielsweise mit 0,2 M Citronensäurelösung. Hierzu befindet sich das Immunadsorbens in einer Chromatographiesäule und der Dissoziationspuffer wird durchgepumpt und das Eluat fraktionsweise aufgegangen. In den Fraktionen wird das abgelöste Protein durch die optische Dichte bei 280 Nanometer nachgewiesen. Der spezifische Nachweis von Prä-S(1) erfolgt durch Auftropfen von 5 Al jeder Fraktion auf eine poröse (1,2 Am Poren) Nylonmembran. Nach dem Eintrocknen der Tropfen wird die Membran zuerst in foetales Kalbserum zur Absättigung der unspezifischen Bindungen gelegt, danach wird MA 18/7 zu dem Kalbserum zugefügt und unter Schütteln inkubiert, dann wird mit PBS gewaschen und schließlich ein Antikörper gegen Maus-Immunglobulin zugefügt, der kovalent das Enzym Meerrettich-Peroxidase gebunden enthält. Dieses Peroxidase markierte anti-Maus Ig ist im Handel erhältlich. Es wird 1:100 bis 1:2000, vorzugsweise 1:200 in 20 % foetalem Kalbserum zur Membran gegeben. Dort wo die Membran Prä-S(1)-Protein aus der Probe adsorbiert hat, bindet sich auch MA18/7 und später Peroxidase. Die gebundene Peroxidase wird mit einem bekannten Farbtest nachgewiesen. Das Enzym oxidiert Diaminobenzidin in Gegenwart von H202 zu einem unlöslichen braunen Farbstoff. Die Intensität der braunen Flecke ist ein semiquantitatives Maß für die Menge des vorliegenden Prä-S(1)-Proteins.The pre-S (1) protein is detached with 3 M NaSCN or with acid Buffers from pH 1.8 to 2.2, for example with 0.2 M citric acid solution. For this the immunoadsorbent and the dissociation buffer are in a chromatography column is pumped through and the eluate rises in fractions. In the political groups will the detached protein was detected by the optical density at 280 nanometers. The specific detection of pre-S (1) is carried out by dropping 5 μl of each fraction on it on a porous (1.2 µm pore) nylon membrane. After the drops have dried up the membrane first in fetal calf serum to saturate the unspecific bonds laid, then MA 18/7 is added to the calf serum and incubated with shaking, then it is washed with PBS and finally an antibody against mouse immunoglobulin added, which contains the enzyme horseradish peroxidase bound covalently. This Peroxidase-labeled anti-mouse Ig is commercially available. It is 1: 100 to 1: 2000, preferably 1: 200 in 20% fetal calf serum added to the membrane. There where the membrane Has adsorbed pre-S (1) protein from the sample, MA18 / 7 and later also binds Peroxidase. The bound peroxidase is detected with a known color test. The enzyme oxidizes diaminobenzidine in the presence of H202 to an insoluble brown Dye. The intensity of the brown spots is a semiquantitative measure of the Amount of pre-S (1) protein present.
Die Fraktionen, die in dem besagten Test eine starke Reaktion ergeben, werden vereinigt und in einem Dialysierschlauch oder einer Ultrafiltrationshülse (zum Beispiel der Kolloidhülse der Firma Sartorius) gegen PBS dialysiert und bis zur weiteren Verwendung eingefroren, wenn diese nicht innerhalb von einigen Tagen erfolgt.The fractions which give a strong reaction in the said test, are combined and placed in a dialysis tube or an ultrafiltration sleeve (for example the colloid sleeve from Sartorius) dialyzed against PBS and up to Frozen for further use, if not within a few days he follows.
Zu dem Verfahren b): Es werden Hepatitis B-Viruspartikel oder Hepatitis B-Oberflächenantigen eingesetzt. Diese Ausgangsmaterialien werden vorher auf bekannte Weise gereinigt. Das Verfahren erfolgt bei Temperaturen zwischen 0 - 1000 C, vorzugsweise 20 - 500 C in wässrigen Medium.Regarding method b): There are hepatitis B virus particles or hepatitis B surface antigen used. These starting materials are previously known Way cleaned. The process is carried out at temperatures between 0-1000 ° C., preferably 20 - 500 C in aqueous medium.
Die Behandlung mit Bromcyan erfolgt vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 0 - 500 C in wässrigem Medium bei pH-Werten unter 7. Der saure pH-Wert kann eingestellt werden mit anorganischen Säuren (zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure) oder organischen Säuren. Als organische Säuren kommen zum Beispiel solche mit PK-Werten zwischen 3 und 4,9 in Frage (zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure). Das Bromcyan wird im aber schuß verwendet, beispielsweise mindestens 2facher bis maximal Sfacher Überschuß (bezogen auf Gewicht). Bei der Behandlung mit Bromcyan erhält man Peptide, die im wesentlichen aus der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz bestehen sowie gegebenenfalls auch Fragmente von solchen Peptiden.The treatment with cyanogen bromide is preferably carried out at temperatures between 0 - 500 C in an aqueous medium at pH values below 7. The acidic pH value can be adjusted with inorganic acids (e.g. hydrochloric acid, sulfuric acid, Phosphoric acid) or organic acids. As organic acids come for example those with PK values between 3 and 4.9 are possible (e.g. formic acid, acetic acid). The cyanogen bromide is used but shot, for example at least 2 times up a maximum of 5 times the excess (based on weight). When treated with cyanogen bromide peptides are obtained which essentially consist of the pre-S (1) amino acid sequence and also, if appropriate, fragments of such peptides.
Die Behandlung mit dem Detergenz erfolgt vorzugsweise zwischen 20 - 1000 C, insbesondere 35 bis 400 C während 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten in wässrigem Medium. Als Detergentien kommen zum Beispiel in Frage: lösliche Salze von aliphatischen Schwefelsäuremonoestern, zum Beispiel Natriumlaurylsulfat.The treatment with the detergent is preferably carried out between 20 - 1000 C, in particular 35 to 400 C for 5 to 30 minutes, preferably 5 to 10 minutes in aqueous medium. As detergents, for example: soluble ones Salts of aliphatic sulfuric acid monoesters, for example sodium lauryl sulfate.
Die Konzentration der Detergentien in dem wässrigen Medium ist zum Beispiel 0,1 bis 20 %, vorzugsweise 0,5 bis 3 %. Als weitere Zusatzstoffe bei dieser Detergenzbehandlung kommen noch in Frage: Reagenzien, welche Disulfidbrücken spalten, das heißt Verbindungen mit freien SH-Gruppen, wie organische Sulfhydrylverbindungen, beispielsweise Dithiothreit, Dithioerythrit, 2-Mercapto-ethanol. Man erhält durch die vorstehend angegebene Detergenz-Behandlung dissoziierte Virus-Proteine. Die so erhaltene Proteinmischung enthält unter anderem 2 Proteine mit dem Molgewicht 39 000 und 42 000 Dalton (Protein P39 und Protein GP42), die durch Gelelektrophorese in bekannter Weise isoliert werden können.The concentration of detergents in the aqueous medium is for Example 0.1 to 20%, preferably 0.5 to 3%. As further additives in this Detergent treatment can still be considered: reagents that split disulfide bridges, that is, compounds with free SH groups, such as organic sulfhydryl compounds, for example dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol. Dissociated virus proteins are obtained by the detergent treatment given above. The protein mixture obtained in this way contains, among other things, 2 proteins with the molecular weight 39,000 and 42,000 daltons (protein P39 and protein GP42) determined by gel electrophoresis can be isolated in a known manner.
Die durch die Detergenz-Behandlung erhaltene Peptid-Mischung kann durch anschließende Behandlung mit Protease noch weiter in kleinere Peptide mit der Prä-S(1)-Sequenz zerlegt werden.The peptide mixture obtained by the detergent treatment can by subsequent treatment with protease even further into smaller peptides with of the pre-S (1) sequence.
Als Protease kommen zum Beispiel in Betracht: V8 Protease aus Staphylococcus aureus.Examples of proteases that can be considered are: V8 protease from Staphylococcus aureus.
Diese Protease spaltet Polypeptidketten bevorzugt an Stellen mit Glutaminsäure. Diese Reaktion findet bei Temperaturen von 20 bis 500 C, vorzugsweise 35 bis 400 C bei pH 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,2 bis 7,6 im Verlauf von 1 bis 4 Tagen statt. Die Reaktionsmischung soll nicht mehr als 2 % Natriumlaurylsulfat und 2 % Dithiothreitol enthalten, vorzugsweise jeweils 0,5 bis 1,2 %.This protease cleaves polypeptide chains preferentially at sites with glutamic acid. This reaction takes place at temperatures from 20 to 500.degree. C., preferably 35 to 400.degree C at pH 6.0 to 8.0, preferably 7.2 to 7.6 in the course of 1 to 4 days. The reaction mixture should not contain more than 2% sodium lauryl sulfate and 2% dithiothreitol contain, preferably 0.5 to 1.2% each.
Das abgespaltene Protein mit der Prä-S(1)-Sequenz läßt sich aus dem Gemisch beispielsweise durch Geletektrophorese abtrennen. Hierfür.wird Polyacrylamidgel mit 10 bis 18 % Polymergehalt, vorzugsweise 13 bis 15 % eingesetzt. Das Gel hat die Form von flachen Schichten mit eingeformten Probentaschen. Das Puffersystem ist von Laemmli angegeben worden (Nature 227, 1970, 680-685), weitere Angaben zur Ausführung der Elektrophorese und zur Isolierung der aufgetrennten Proteine finden sich in "Virology" 123, 1982, 436-442. Nach beendigter Elektrophorese befinden sich die Proteine je nach ihrer Größe in einer bestimmten Zone des flachen Gels. Die Zone, wo sich das Prä-S(1)-Protein befindet, läßt sich durch Vergleich mit bekannten Vergleichproteinen bestimmen, wobei diese Proteine und die Proteine des Probengemisches am besten durch eine Färbung mit Silber sichtbar gemacht werden. Die Zone mit dem 18 000 Dalton großen Proteinfragment wird ausgeschnitten, zerkleinert und mit Puffer lösung eluiert.The cleaved protein with the pre-S (1) sequence can be removed from the Separate the mixture, for example by gel electrophoresis. Polyacrylamide gel is used for this with 10 to 18% polymer content, preferably 13 to 15%. The gel has the shape of flat layers with molded-in sample pockets. The buffer system has been given by Laemmli (Nature 227, 1970, 680-685), further information on Find the execution of the electrophoresis and the isolation of the separated proteins in "Virology" 123, 1982, 436-442. When the electrophoresis is complete, the the proteins depending on their size in a specific zone of the flat gel. the Zone where the pre-S (1) protein is located can be passed through comparison Determine with known comparison proteins, these proteins and the proteins of the sample mixture can best be made visible by coloring it with silver. The zone with the 18,000 Dalton protein fragment is cut out and comminuted and eluted with buffer solution.
Durch die anschließende Behandlung mit Protease erhält man Peptide, die im wesentlichen aus der Prä-S(1)- und Prä-S(2)-Aminosäuresequenz bestehen.Subsequent treatment with protease gives peptides, consisting essentially of the pre-S (1) and pre-S (2) amino acid sequence.
Zu dem Verfahren c): Dieses Verfahren erfolgt durch Synthese aus den entsprechenden, gegebenenfalls in üblicher Weise geschützten Aminosäuren, in herkömmlicher Weise. Ebenfalls ist die Verwendung automatischer Peptid-Synthesierer, zum Beispiel Beckman Model 990 Peptid Synthetisierer möglich unter Verwendung der auf übliche Weise im Handel erhältlichen geschützten Aminosäuren.Regarding process c): This process is carried out by synthesis from the corresponding amino acids, optionally protected in a conventional manner, in conventional Way. Also is the use of automatic peptide synthesizers, for example Beckman Model 990 peptide synthesizer possible using the standard Way, commercially available protected amino acids.
Diese Synthese von beispielsweise Peptiden gemäß Anspruch 7 oder 8 erfolgt zum Beispiel in der hierfür üblichen Weise aus den entsprechenden geschützten Aminosäuren, indem man zunächst die Carboxy-terminale Aminosäure des zu synthetisierenden Peptids, deren i-ständige Aminogruppe geschützt ist, an einen hierfür üblichen synthetischen Träger kovalent bindet, die i-Amino-Schutzgruppe abspaltet, an die so erhaltene freie Aminogruppe die nächstfolgende geschützte Aminosäure über ihre Carboxy-Gruppe bindet, dann wiederum die NC-Amino-Schutzgruppe dieser zweiten Aminosäure abspaltet, hieran die nächste Aminosäure bindet und in dieser Weise Schritt für Schritt die übrigen Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids in der richtigen Reihenfolge verknüpft und nach Verknüpfung aller Aminosäuren das fertige Peptid vom Träger abspaltet und gegebenenfalls weitere vorhandene Seitenfunktions-Schutzgruppen abspaltet.This synthesis of, for example, peptides according to claim 7 or 8 takes place, for example, in the manner customary for this purpose from the corresponding protected Amino acids by first taking the carboxy-terminal amino acid of the one to be synthesized Peptide whose amino group in the i position is protected to a synthetic one customary for this purpose Carrier covalently binds, splits off the i-amino protective group, to the thus obtained free amino group the next protected amino acid via its carboxy group binds, then in turn cleaves off the NC amino protective group of this second amino acid, to this the next amino acid binds and in this way step by step the remaining amino acids of the peptide to be synthesized in the correct order linked and after all amino acids have been linked, the finished peptide is split off from the carrier and splitting off any other side function protective groups present.
Die Reaktionen zur Verknüpfung der Aminosäuren finden in dem Temperaturbereich von 10 - 40C C, vorzugsweise 20 -30° C, gegebenenfalls in einem hierfür üblichen indifferenten Lösungs- oder Suspensionsmittel (zum Beispiel Dichlormethan) statt, wobei gegebenenfalls zur Verbesserung der Löslichkeit bis zu 20 % Dimethylformamid zugesetzt werden kann.The reactions for linking the amino acids take place in the temperature range from 10-40 ° C., preferably 20-30 ° C., optionally in a customary one for this inert solvents or suspending agents (e.g. dichloromethane) instead, optionally with up to 20% dimethylformamide to improve solubility can be added.
Als synthetisches Trägermaterial kommen synthetische Polymere in Frage, zum Beispiel quellbares Polystyrolharz in Perlenform (beispielsweise ein chlormethyliertes Copolymerisat aus Polystyrol und 1 % Divinylbenzol).Synthetic polymers can be used as the synthetic carrier material, for example swellable polystyrene resin in bead form (e.g. a chloromethylated Copolymer made of polystyrene and 1% divinylbenzene).
Als Schutzgruppen für die 56-ständigen Aminogruppen kommen zum Beispiel in Frage: tertiäre Butyloxycarbonylgruppe, Carbobenzoxygruppe beziehungsweise Carbobenzthiogruppe (gegebenenfalls jeweils mit p-Brom- oder p-Nitro-benzylrest), Trifluoracetylgruppe, Phthylrest, o-Nitrophenoxy-acetylgruppe, Tritylgruppe, p-Toluolsulfonylgruppe, Benzylgruppe, im Benzolkern substituierte Benzylreste (p-Brom- oder p-Nitro-benzylrest), C-Phenyl-ethylrest. Hierzu wird auch auf das Buch von Jesse P. Greenstein und Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, Inc., Volume 2, beispielsweise Seite 883 und folgende sowie The Peptids, Volume 2, Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Ed. E. Gross and J. Meienhofer, Academic Press, New York, 1980, Tabelle III, Seite 20 und Tabelle IV, Seite 21 verwiesen. Diese Schutzgruppen kommen grundsätzlich auch für den Schutz von weiteren funktionellen Seitengruppen (OH-Gruppen, NH2-Gruppen) der in Frage kommenden Aminosäuren in Frage.The protective groups for the 56 amino groups are, for example in question: tertiary butyloxycarbonyl group, carbobenzoxy group or carbobenzthio group (optionally with p-bromine or p-nitro-benzyl radical in each case), trifluoroacetyl group, Phthyl group, o-nitrophenoxy-acetyl group, trityl group, p-toluenesulfonyl group, benzyl group, Benzyl radicals substituted in the benzene nucleus (p-bromine or p-nitro-benzyl radical), C-phenyl-ethyl radical. See also the book by Jesse P. Greenstein and Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, Inc., Volume 2, for example Page 883 and following as well as The Peptids, Volume 2, Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Ed. E. Gross and J. Meienhofer, Academic Press, New York, 1980, table III, page 20 and Table IV, page 21 referenced. These protecting groups come in principle also for the protection of other functional side groups (OH groups, NH2 groups) of the amino acids in question.
Vorhandene Hydroxygruppen (Serin, Threonin) werden vorzugsweise durch Benzylgruppen und ähnliche Gruppen geschützt. Weitere nicht i -ständige Aminogruppen (zum Beispiel Aminogruppen in k>)-Stellung; Guanidinogruppe des Arginins) werden vorzugsweise mit Nitro-Gruppen geschützt.Existing hydroxyl groups (serine, threonine) are preferably through Benzyl groups and similar groups protected. Other non-i-amino groups (for example amino groups in k>) position; Guanidino group of arginine) preferably protected with nitro groups.
Die Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren miteinander erfolgt nach den hierfür üblichen Methoden. Insbesondere kommen in Frage: Methode der symmetrischen Anhydride (in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid), Carbodiimid-Methode, Carbodiimid-Hydroxybenzotriazol-Methode.The linking of the individual amino acids with one another takes place after the usual methods for this. In particular come into question: Method of symmetrical Anhydrides (in the presence of dicyclohexylcarbodiimide), carbodiimide method, carbodiimide-hydroxybenzotriazole method.
Als weitere Methoden kommen zum Beispiel in Frage: Azid-Methode; Mischanhydrid-Methode; N-Carbonsäureanhydrid-Methode; Methode der aktivierten Ester; Verwendung von modifizierten Carbodiimiden.Other possible methods are, for example: azide method; Mixed anhydride method; N-carboxylic acid anhydride method; Activated ester method; Use of modified Carbodiimides.
Die angegebenen Peptidsynthese-Methoden sind beispielsweise in dem Buch: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Ed. H.-D. Jakubke, H. Jeschkeit, Verlag Chemie, Weinheim, 1982 beschrieben.The specified peptide synthesis methods are for example in the Book: Amino Acids, Peptides, Proteins, Ed. H.-D. Jakubke, H. Jeschkeit, Verlag Chemie, Weinheim, 1982.
Für die Verknüpfung von Arginin wird vorzugsweise die Carbodiimid-Methode benutzt, für die Verknüpfung von Asparagin sowie von Glutamin wird vorzugsweise die Carbodiimid-Hydroxy-benzotriazol-Methode benutzt (siehe The Peptids, Volume 2, Ed. E. Gross and J. Meienhofer).The carbodiimide method is preferred for linking arginine used for linking asparagine and glutamine is preferred uses the carbodiimide-hydroxy-benzotriazole method (see The Peptids, Volume 2, ed. E. Gross and J. Meienhofer).
Für die übrigen Aminosäuren wird im allgemeinen die Methode der symmetrischen oder gemischten Anhydride benutzt.For the other amino acids, the symmetrical method is generally used or mixed anhydrides are used.
Beispielhaft ist die Synthese für das Peptid Cc beziehungsweise Cd (Seite 24) im folgenden angegeben): Die Sequenz dieser Oligopeptide ist in der Figur 6 dargestellt. Zur Synthese wurden Na-tertiär-Butyloxycarbonyl (No(-BOC) geschützte L-Aminosäuren (Fluka) verwendet. Die Seitengruppenfunktionen des L-Serin und L-Threonin waren zusätzlich mit O-Benzyl-Gruppen, die des L-Arginin mit NM -Nitro-Gruppen geschützt.The synthesis for the peptide Cc or Cd is exemplary (Page 24) given below): The sequence of these oligopeptides is in the figure 6 shown. For the synthesis, Na-tertiary-butyloxycarbonyl (No (-BOC) were protected L-amino acids (Fluka) used. The side group functions of L-serine and L-threonine were additionally protected with O-benzyl groups, those of L-arginine with NM-nitro groups.
Zuerst wurde No<-BOC-L-Prolin über eine 4-Oxymethylphenylacetat-Verbindung (J.Am.Chem.Soc. 98 (1976) 7357-7362; J.Org.Chem. 43 (1978) 2845-2852) an das Trägermaterial Biobeads S-X1 (Bio-Rad) gebunden (BOC-Pro-PAM-Polystyrol).First it became No <-BOC-L-proline via a 4-oxymethylphenyl acetate compound (J.Am.Chem. Soc. 98 (1976) 7357-7362; J.Org.Chem. 43 (1978) 2845-2852) to the carrier material Biobeads S-X1 (Bio-Rad) bound (BOC-Pro-PAM-Polystyrene).
Nach Abspaltung der N-terminalen BOC-Schutzgruppe durch Säure (Nature 206 (1965) 619-620) wird die nächste Nd-BOC-geschützte Aminosäure gekoppelt. Bei diesen Kupplungsschritten wurden 3 verschiedene Verfahren angewendet. No(-BOC-N -Nitro-L-Arginin wurde unter Anwendung von Dicyclohexyl-Carbodiimid (DCC; J.Am.Chem.After cleavage of the N-terminal BOC protective group by acid (Nature 206 (1965) 619-620) the next Nd-BOC-protected amino acid is coupled. at 3 different procedures were used for these coupling steps. No (-BOC-N -Nitro-L-arginine was obtained using dicyclohexyl-carbodiimide (DCC; J. Am. Chem.
Soc. 77 (1955) 1067-1068; J.Am.Chem.Soc. 88 (1966) 1013-1030), N-BOC-L-Asparagin und L-Glutamin unter Anwendung von Dicyclohexylcarbodiimid/ 1 -Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBT; Chem.Ber. 103 (1970) 788-798; J.Org.Chem.Soc. 77 (1955) 1067-1068; J.Am.Chem.Soc. 88 (1966) 1013-1030), N-BOC-L-asparagine and L-glutamine using dicyclohexylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole (DCC / HOBT; Chem. Ber. 103 (1970) 788-798; J.Org.Chem.
45 (1980) 555-560) und die restlichen geschützten Aminosäuren über symmetrische Anhydride gebunden (SA; J.Am.Chem.Soc. 97 (1975) 6584-6585; Angew. Chem.45 (1980) 555-560) and the rest of the protected amino acids bound via symmetrical anhydrides (SA; J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 6584-6585; Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 10 (1971) 336; Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Int. Ed. Engl. 10 (1971) 336; Hoppe-Seyler's Z.Physiol.
Chem. 353 (1972) 1973-1976). Nach Kupplung der 10. Aminosäure L-Asparagin wurde das Trägermaterial geteilt und an die eine Hälfte N -BOC-L-Alanin gebunden. Die Synthesen wurden getrennt bis zur 16. Aminosäure weitergeführt und getrennt gespalten. Die Abspaltung der fertigen Peptide vom Trägermaterial unter gleichzeitiger Abspaltung der Seitenfunktions-Schutzgruppen wurde mit Hydrogenfluorid und 10 % (v/v) Anisol durchgeführt (Bull.Chem.Soc.Jpg. 40 (1967) 2164-2167; J.Org.Chem. 35 (1970) 3151-3152; J.Am.Chem.Soc. 97 (1975) 3485-3496).Chem. 353 (1972) 1973-1976). After coupling the 10th amino acid L-asparagine the carrier material was divided and bound to one half of the N -BOC-L-alanine. The syntheses were continued separately up to the 16th amino acid and separated split. The cleavage of the finished peptides from the carrier material with simultaneous Cleavage of the side functional protective groups was carried out with hydrogen fluoride and 10% (v / v) anisole (Bull.Chem.Soc.Jpg. 40 (1967) 2164-2167; J.Org.Chem. 35 (1970) 3151-3152; J.Am.Chem.Soc. 97 (1975) 3485-3496).
Der Prä-S(1)-Anteil der Proteine P39/GP42 befindet sich auf der Oberfläche des HBV-Partikels. Immunisiert man Mäuse mit HBV-Partikeln, bilden sie Antikörper gegen Prä-S(1)-Polypeptide. Aus den Milzzellen einer so immunisierten Maus wurde nach bekannten Methoden (J.Immunol. 23; 1548-1550) (1979)) eine Hybridomzell-Linie erzeugt, die einen monoklonalen Antikörper (MA18/7) gegen Prä-S(1)-Polypeptid produziert. Die Zell-Linie und der entsprechende Antikörper werden sowohl in vitro als Zellkultur als auch in vivo als Ascites-Tumor in BALB/c Mäusen weiter vermehrt.The pre-S (1) part of the proteins P39 / GP42 is on the surface of the HBV particle. If mice are immunized with HBV particles, they form antibodies against pre-S (1) polypeptides. The spleen cells of a mouse immunized in this way became according to known methods (J. Immunol. 23; 1548-1550) (1979)) a hybridoma cell line which produces a monoclonal antibody (MA18 / 7) against pre-S (1) polypeptide. The cell line and the corresponding antibody are used both in vitro as a cell culture as well as in vivo as an ascites tumor in BALB / c mice.
MA18/7-Antikörper reagieren gut mit HBV-Partikeln der Subtypen adw2 oder ayw, mit HBsAg Filamenten und in etwa 5 bis 20 mal geringer Bindungsstärke pro Antigenmenge mit 20 nm HBsAg-Partikeln. Isoliertes P39/GP42 bindet ebenfalls MA18/7. Spaltet man die Prä-S-Sequenz aus P39/GP42 mit einer Glutaminsäure spezifischen Protease, so entsteht ein aminoterminales Polypeptidfragment von 164 beziehungsweise 175 Aminosäuren das ebenfalls MAi 8/7 bindet. Die Spaltstelle befindet sich 1 Codon nach dem Aminoende des HBsAg Hauptproteins. Durch diese Behandlung läßt sich aus HBV, Filamente und HBsAg 20 nm Partikel ein Polypeptid erzeugen, das die wichtigsten virusspezifischen Antigendeterminanten enthält.MA18 / 7 antibodies react well with HBV particles of the subtypes adw2 or ayw, with HBsAg filaments and about 5 to 20 times lower bond strength per amount of antigen with 20 nm HBsAg particles. Isolated P39 / GP42 also binds MA18 / 7. The pre-S sequence from P39 / GP42 is cleaved with a specific glutamic acid Protease, an amino-terminal polypeptide fragment of 164 and 164, respectively, is formed 175 amino acids that also binds MAi 8/7. The cleavage site is 1 codon after the amino end of the main HBsAg protein. This treatment leaves out HBV, filaments and HBsAg 20 nm particles produce a polypeptide that is the most important contains virus-specific antigen determinants.
Die Erfindung betrifft daher auch den monoklonalen Antikörper MAi 8/7 beziehungsweise die Hybridzell-Linie Go 1 A 18/7-1. Dieser Antikörper MAi8/7 besitzt eine hohe Spezifität für Peptide, die die Prä-S(1)-Aminosäuresequenz enthalten. Der neue Antikörper MA18/7 ist insbesondere zur Hochreinigung und zum Nachweis von Peptiden mit der Prä-S(1)-Sequenz geeignet.The invention therefore also relates to the monoclonal antibody MAi 8/7 or the hybrid cell line Go 1 A 18 / 7-1. This antibody MAi8 / 7 has a high specificity for peptides containing the pre-S (1) amino acid sequence. The new antibody MA18 / 7 is particularly suitable for high purification and for the detection of Peptides with the pre-S (1) sequence are suitable.
Erfindungsgemäß erhält man die neuen Immunglobulinproduzierenden Hybridzell-Linien durch Zellfusion.According to the invention, the new immunoglobulin-producing hybrid cell lines are obtained by cell fusion.
Hierzu werden Milzzellen, die unmittelbar nach ihrer Entnahme aus den immunisierten Mäusen (zum Beispiel Stamm BALB/c) mit Myelomzellen, zum Beispiel Myelomzellen X63-Ag8-653 genau nach der Methode, die in der Broschüre Hybridoma Techniques, Verlag Cold Spring Harbor Laboratory 1980, Cold Spring Harbor, Staat New York, USA hierfür angegeben ist fusioniert, anschließend kloniert (unter Bedingungen der limitierenden Verdünnung), selektioniert und kultiviert. X63-Ag8-653 Myelom-Zellen sind ein Subklon aus dem P3-X63-Ag8 Myelom-Subklon, siehe Kearney, J. et al (1979), Journal of Immunology 123, No. 4, 1548.For this purpose, spleen cells, which are made immediately after their removal the immunized mice (for example strain BALB / c) with myeloma cells, for example Myeloma cells X63-Ag8-653 exactly according to the method described in the brochure Hybridoma Techniques, published by Cold Spring Harbor Laboratory 1980, Cold Spring Harbor, State New York, USA specified for this is fused, then cloned (under conditions the limiting dilution), selected and cultivated. X63-Ag8-653 myeloma cells are a subclone from the P3-X63-Ag8 myeloma subclone, see Kearney, J. et al (1979), Journal of Immunology 123, No. 4, 1548.
Die Kulturen, welche Hybridzellwachstum zeigen, werden auf den Gehalt an Prä-S(1)-spezifischen Antikörpern auf folgende Weise geprüft: Aus Kulturüberständen von Näpfen, in denen das Hybridzellwachstum durch Bildung von Zellhaufen erkennbar wurde, werden Aliquote in Mikrotiternäpfe gegeben, die mit verdünnten HBV-Partikeln beschichtet waren (die HBV-Partikel waren mit Natriumphosphat-Lösung vom pH 7,4 verdünnt). Durch Zugabe von bekanntem anti-Maus Immunglobulin, das durch Peroxidase markiert war, wird in bekannter Weise festgestellt (Farbreaktion), ob sich Antikörper aus den entsprechenden Kulturen an das HBV-Antigen gebunden haben (siehe die erwähnte Broschüre Hybridoma Techniques). Die Proben, die eine kräftige Farbreaktion zeigen, werden dann in größere Kulturgefäße gegeben und darauf geprüft, ob sie mit Prä-S(1)-Polypeptiden (zum Beispiel den Peptiden P39 beziehungsweise GP42 reagieren, hingegen nicht mit dem in Virology Band 123 (1982), Seiten 436 - 442 beschriebenen Peptid GP33. Die Kulturen, die diese Voraussetzungen erfüllen, werden noch einmal unter den Bedingungen der limitierenden Verdünnung kloniert. Die so erhaltenen Klone produzieren monoklonale Antikörper gegen Prä-S(1)-Peptide. Einer der so erhaltenen Antikörper wird als MA18/7 bezeichnet und in üblicher Weise als Zellkultur vermehrt. Diese Vermehrung erfolgt zum Beispiel in Flaschen in RPMI Earle 199/10 % foetalem Kalbserum, wobei die Innenwand der Flaschen pro cm2 mit 103 peritonealen Macrophagen der Maus (Stamm NMRI) bedeckt ist. Die Kulturen werden bei 370 C und 5 % C02/Luft gehalten. Die Vermehrung kann aber zum Beispiel auch erfolgen als Ascitestumor in syngenen Mäusen, zum Beispiel BALB/c Mäusen. Hierzu werden den Mäusen 10 Tage vorher 0,5 ml Pristan (2,6,10,13-Tetramethyl-pentadecan) intraperitoneal injiziert, dann werden 3 x 106 der entsprechenden Hybridomzellen injiziert.The cultures that show hybrid cell growth are based on the content tested on pre-S (1) -specific antibodies in the following way: From culture supernatants of wells in which the hybrid cell growth can be recognized by the formation of cell clusters aliquots are placed in microtiter wells containing diluted HBV particles were coated (the HBV particles were with sodium phosphate solution of pH 7.4 diluted). By adding the well-known anti-mouse immunoglobulin produced by peroxidase was marked, it is determined in a known manner (color reaction) whether there are antibodies bound to the HBV antigen from the corresponding cultures (see the aforementioned brochure Hybridoma Techniques). The samples that show a strong color reaction will then placed in larger culture vessels and checked for pre-S (1) polypeptides (For example, the peptides P39 and GP42 react, but not with the peptide GP33 described in Virology Volume 123 (1982), pages 436-442. the Cultures that meet these requirements are once again under the conditions the limiting dilution cloned. The clones thus obtained produce monoclonals Antibodies against pre-S (1) peptides. One of the antibodies so obtained is named MA18 / 7 referred to and propagated in the usual way as a cell culture. This increase occurs for example in bottles in RPMI Earle 199/10% fetal calf serum, with the inner wall of the bottles per cm2 covered with 103 peritoneal mouse macrophages (NMRI strain) is. The cultures are kept at 370 C and 5% CO 2 / air. The increase can but for example also occur as an ascites tumor in syngeneic mice, for example BALB / c mice. For this purpose, the mice are given 0.5 ml of pristane (2,6,10,13-tetramethylpentadecane) 10 days beforehand. injected intraperitoneally, then 3 x 106 of the corresponding hybridoma cells injected.
Die Isolierung des neuen monoklonalen Antikörpers aus der Ascitesflüssigkeit der tumortragenden Mäuse erfolgt nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch fraktionierte Fällung vorzugsweise mit Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat und gegebenenfalls anschließender Chromatographie über einen geeigneten Träger, vorzugsweise auf Zellulose-Basis, wie zum Beispiel Diethylaminoethyl-Zellulose.The isolation of the new monoclonal antibody from the ascites fluid the tumor-bearing mice is carried out according to known methods, for example by fractionated Precipitation preferably with sodium sulphate or ammonium sulphate and, if necessary, subsequent Chromatography on a suitable carrier, preferably cellulose-based, such as diethylaminoethyl cellulose.
Die Isolierung aus Hybridomüberstand (Zellkulturüberstand) erfolgt in bekannter Weise, vorzugsweise durch Bindung an Sepharose (perlförmiges Agarose-Gel), an welche Staphylococcen-Protein A gekoppelt ist und anschließende Ablösung mittels einer wässrigen Pufferlösung.The isolation from hybridoma supernatant (cell culture supernatant) takes place in a known way, preferably by binding to Sepharose (pearl-shaped agarose gel), to which staphylococcal protein A is coupled and subsequent Detachment by means of an aqueous buffer solution.
Der so hergestellte Antikörper kann nun direkt zum Nachweis für Prä-S(1)-Peptide beziehungsweise nach seiner kovalenten Bindung an einen biologisch inaktiven Träger zur Hochreinigung von Prä-S(1)-Peptiden verwendet werden. Die kovalente Bindung des Antikörpers erfolgt hierbei an einen entsprechend aktivierten Träger, vorzugsweise auf Agarose-Basis (wobei die Agarose zum Beispiel mit Bromcyan aktiviert ist) oder an porösen Glasperlen, beispielsweise an Aminopropylgruppen enthaltenden Glasperlen (Firma Fluka/Schweiz). Zur Hochreinigung wird zum Beispiel eine Lösung des Prä-S(1)-Peptids bei schwach basischen pH, zum Beispiel bei einem pH 7 - 9 über einen so hergestellten Antikörper-Affinitätsträger gepumpt, solange bei neutralem pH gewaschen, bis das Eluat proteinfrei ist, und anschließend das gebundene Peptid mit der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz mit konzentrierten Lösungen von chaotropen Ionen beispielsweise hochmolarer (2 molar bis Sättigung, insbesondere 3 molar) Alkalithiocyanat-Lösung, beispielsweise Natriumthiocyanat-Lösung bei pH 7 oder mit sauren Pufferlösungen zwischen pH 1,6 - 2,5 eluiert. Die so erhaltenen proteinhaltigen Fraktionen können beispielsweise vom Eluierungsmittel durch Dialyse bei pH 7 oder Gelfiltration (zum Beispiel Sephadex G25) befreit werden, wobei diese Maßnahmen unter Verwendung von physiologischen Puffern durchgeführt werden.The antibody produced in this way can now be used directly to detect pre-S (1) peptides or after its covalent bond to a biologically inactive carrier can be used for high purification of pre-S (1) peptides. The covalent bond of the antibody is carried out on a correspondingly activated carrier, preferably based on agarose (where the agarose is activated with cyanogen bromide, for example) or on porous glass beads, for example on glass beads containing aminopropyl groups (Company Fluka / Switzerland). For example, a solution of the pre-S (1) peptide is used for high purification at a weakly basic pH, for example at a pH 7-9 above one prepared in this way Antibody affinity carriers are pumped and washed at neutral pH until the Eluate is protein-free, and then the bound peptide with the pre-S (1) amino acid sequence with concentrated solutions of chaotropic ions, for example, high molar (2 molar to saturation, in particular 3 molar) alkali thiocyanate solution, for example sodium thiocyanate solution eluted at pH 7 or with acidic buffer solutions between pH 1.6-2.5. The so obtained protein-containing fractions can, for example, from the eluent by dialysis at pH 7 or gel filtration (for example Sephadex G25), these Measures can be carried out using physiological buffers.
Die Zell-Linie Go 1 A 18/7-1 ist unter der Nr. 84101501 bei folgender Sammelstelle hinterlegt: Public Health Laboratory Service, National Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4OJG, Großbritannien.The cell line Go 1 A 18 / 7-1 is under the number 84101501 at the following Collection point on file: Public Health Laboratory Service, National Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4OJG, UK.
Diese Zell-Linie produziert den monoklonalen Antikörper MA 18/7, der bezüglich seiner konstanten Merkmale zur Immunoglobulin-Klasse IgG1/kappa gehört. Der Antikörper verbindet sich mit der Prä-S(1)-Aminosäuresequenz von Proteinen oder/beziehungsweise mit Proteinen, die Fragmente dieser Prä-S(1)-Aminosäuresequenz enthalten, wobei solche mindestens 6 Aminosäuren enthalten müssen.This cell line produces the monoclonal antibody MA 18/7, the with regard to its constant characteristics Immunoglobulin class IgG1 / kappa belongs. The antibody binds to the pre-S (1) amino acid sequence of proteins or / or with proteins, the fragments of this pre-S (1) amino acid sequence contain, whereby such must contain at least 6 amino acids.
Die Hybridzellen Go 1 A18/7-i können gefroren in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, in dem weiter unten beschriebenen Kulturmedium, welches zusätzlich 10 % Dimethylsulfoxid enthält. Die Einfrierrate sollte langsam sein, etwa 1 - 20 C/Minute. Zum Zwecke der weiteren Vermehrung werden die gefrorenen Zellen beispielsweise (Minitubes mit 3X106 gefrorenen Zellen) schnell aufgetaut und langsam (innerhalb von 10 Minuten) mit 10 ml Kulturmedium vermischt, welches beispielsweise die folgende Zusammensetzung hat: 24,35 g Medium 199/Earle (siehe Morgan, J.F. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, Seite 1, 1950) 26,00 g RPMI/1640 (siehe Moore, G.E. et al., J. Am. Med.The hybrid cells Go 1 A18 / 7-i can be frozen in liquid nitrogen are kept in the culture medium described below, which in addition Contains 10% dimethyl sulfoxide. The rate of freezing should be slow, around 1 - 20 C / minute. For the purpose of further propagation, the frozen cells are for example (Minitubes with 3X106 frozen cells) thawed quickly and slowly (within of 10 minutes) mixed with 10 ml of culture medium, which for example the following Composition has: 24.35 g Medium 199 / Earle (see Morgan, J.F. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, p. 1, 1950) 26.00 g RPMI / 1640 (see Moore, G.E. et al., J. Am. Med.
Assoc. 199, Seite 519, 1967; Earle, W.R. et al, J. Nat. Cancer Inst. 4, Seite 165, 1943) 10,00 g NaHC03 50 ml Glutamin 200 mM 50 ml Nicht-essentielle Aminosäuren (Mischung der üblichen nicht-essentiellen Aminosäuren) 50 ml Antibiotikum-Antimycotikum-Lösung 50 ml Natriumsalz der Brenztraubensäure 100 mM in MEM (minimales essentielles Medium) 500 ml foetales Kalbserum ad 5 Liter mit bidestilliertem Wasser und mit CO2 auf pH 6,9 - 7,0 gebracht und durch Filtration sterilisiert. Assoc. 199, p. 519, 1967; Earle, W.R. et al, J. Nat. Cancer Inst. 4, page 165, 1943) 10.00 g NaHCO3 50 ml glutamine 200 mM 50 ml non-essential Amino acids (mixture of the usual non-essential amino acids) 50 ml antibiotic-antimycotic solution 50 ml sodium salt of pyruvic acid 100 mM in MEM (minimal essential medium) 500 ml of fetal calf serum ad 5 liters with double-distilled water and with CO2 pH 6.9 - 7.0 brought and sterilized by filtration.
Auch das folgende Kulturmedium kann beispielsweise verwendet werden: Mixed-Medium 80/20 aus 80 % RPMI 1640 20 8 Medium 199/Earle zusätzlich: 20 g NaHCO3 100 ml 200 mM L-Glutamin 100 ml 100x nicht-essentielle Aminosäuren 100 ml 100x Antibiotikum-Antimycoticum-Lösung: 10 000 Einheiten Penicillin 10 000 ßg Streptomycin 25 ßg Fungizone 100 ml 100 mM Natriumpyruvat 1 Liter FCS (fötales Kälberserum) auf 10 Liter mit bidestilliertem Wasser auffüllen, mit CO2 auf pH 6,7-7,0 einstellen und durch Filtration sterilisieren.The following culture medium can also be used, for example: Mixed medium 80/20 from 80% RPMI 1640 20 8 Medium 199 / Earle additionally: 20 g NaHCO3 100 ml 200 mM L-glutamine 100 ml 100x non-essential amino acids 100 ml 100x antibiotic-antimycotic solution: 10,000 units of penicillin 10,000 µg streptomycin 25 µg Fungizone 100 ml 100 mM Sodium pyruvate 1 liter of FCS (fetal calf serum) to 10 liters with double-distilled Fill up with water, adjust to pH 6.7-7.0 with CO2 and sterilize by filtration.
Anschließend werden die Zellen zentrifugiert (500fache der Erdbeschleunigung), die sedimentierten Zellen in 30 ml des zuvor angegebenen Mediums resuspendiert und anschließend in Zellkulturflaschen mit 75 cm2 Bodenfläche gegeben.Then the cells are centrifuged (500 times the acceleration due to gravity), the sedimented cells are resuspended in 30 ml of the medium specified above and then placed in cell culture flasks with a floor area of 75 cm2.
Polypeptide mit der Prä-S(1)-Sequenz, insbesondere solche, die im wesentlichen aus der Prä-S(1)-Sequenz bestehen, oder aus Untereinheiten dieser Prä-S(1)-Sequenz, sind als Impfstoffe gegen Hepatitis B-Virus-Erkrankungen geeignet. Solche Impfstoffe enthalten als Wirkstoffe mindestens 1 erfindungsgemäßes Peptid (zum Beispiel ein Peptid gemäß Anspruch 8). Der Impfstoff kann aber auch 2 oder mehr der erfindungsgemäßen Peptide (zum Beispiel gemäß Anspruch 8) enthalten.Polypeptides with the pre-S (1) sequence, especially those that are im consist essentially of the pre-S (1) sequence, or of subunits of this pre-S (1) sequence, are suitable as vaccines against hepatitis B virus diseases. Such vaccines contain as active ingredients at least 1 peptide according to the invention (for example a Peptide according to claim 8). The vaccine can, however, also 2 or more of the invention Contain peptides (for example according to claim 8).
Vorzugsweise handelt es sich um Impfstoffe, die als Wirkstoff mindestens ein Peptid der Formel I mit den angegebenen Bedeutungen für X enthalten und gegebenenfalls zusätzlich noch ein Peptid der Formel IV mit den angegebenen Bedeutungen für X. Vorzugsweise hat X hierbei die Bedeutung: MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg-OH.Preferably, it is vaccines that as an active ingredient at least contain a peptide of the formula I with the meanings given for X and optionally in addition, a peptide of the formula IV with the meanings given for X. Here, X preferably has the meaning: MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg-OH.
Das Gemisch dieser beiden Peptide hat den Vorteil, daß hier neben den Antikörpern gegen alle Virussubtypen auch die Mehrzahl der subtyp-spezifischen Antikörper gegen die Prä-S(1)-Sequenz induziert wird.The mixture of these two peptides has the advantage that here besides the antibodies against all virus subtypes also contain the majority of the subtype-specific Antibody against the pre-S (1) sequence is induced.
Die Anwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Polypeptide oder Oligopeptide zur Bekämpfung von Hepatitis B-Erkrankungen erfolgt in der für Impfstoffe üblichen Art beispielsweise durch Injektion oder in Form von Sprays.The use of the polypeptides or oligopeptides obtained according to the invention to combat hepatitis B diseases takes place in the usual way for vaccines Art for example by injection or in the form of sprays.
Insbesondere bewirken die erfindungsgemäßen Prä-S(1)-Peptide eine Immunisierung gegenüber Hepatitis B-Virus-Partikeln, kaum dagegen gegen die ungefährlichen HBsAg 20 nm Partikel.In particular, the pre-S (1) peptides according to the invention bring about a Immunization against hepatitis B virus particles, but hardly against the harmless ones HBsAg 20 nm particles.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Prä-S(1)-Peptide werden zur Herstellung von Impfstoffen durch Immunaffinitätschromatographie und die üblichen Verfahren gereinigt (Filtration, insbesondere Molekularfiltration und Gelfiltration, Separation, Gradientenzentrifugation, Adsorption und anschließende Elution usw.), gegebenenfalls konzentriert (Zonenzentrifugation, Molekularfiltration, Adsorption und anschließende Elution), durch Hinzufügen von Stabilisatoren stabilisiert und mit geeigneten Konservantien (zum Beispiel Benzylalkohol, Chlorbutanol, Thiomersal, Phenol, Kresol) haltbar gemacht.The pre-S (1) peptides obtained according to the invention are used for production of vaccines by immunoaffinity chromatography and the usual methods cleaned (filtration, especially molecular filtration and gel filtration, separation, Gradient centrifugation, adsorption and subsequent elution, etc.), if necessary concentrated (zone centrifugation, molecular filtration, adsorption and subsequent Elution), stabilized by adding stabilizers and with suitable preservatives (for example benzyl alcohol, chlorobutanol, thimerosal, phenol, cresol) made durable.
Weiterhin kann die Antigenität der Impf stoffe durch Hinzufügen von Adjuvantien verstärkt beziehungsweise eine Depotwirkung erzielt werden.Furthermore, the antigenicity of the vaccines can be increased by adding Adjuvants are strengthened or a depot effect can be achieved.
Dazu kommen beispielsweise Freund'sches Adjuvans, ölige und andere organische Adjuvantien insbesondere jedoch Aluminiumverbindungen wie Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat in Frage.In addition, there are, for example, Freund's adjuvant, oily and others organic adjuvants but especially aluminum compounds such as aluminum oxide, Aluminum hydroxide and aluminum phosphate in question.
Die Prä-S(1)-Peptide können ebenfalls als Bestandteil von Kombinationsimpfstoffen verwendet werden.The pre-S (1) peptides can also be used as a component of combination vaccines be used.
Beschreibung der hinterlegten Mikroorganismen, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt sind. Es handelt sich um folgende Mikroorganismen (Reinkulturen): 1) E.coli K490 pHBV991 mit der Hinterlegungsnummer DSM 3082.Description of the microorganisms deposited with the Germans Collection of Microorganisms (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen according to the Budapest Agreement are deposited. These are the following microorganisms (Pure cultures): 1) E. coli K490 pHBV991 with the deposit number DSM 3082.
Der Mikroorganismus E.coli (Escherichia coli) K490 pHBV991 produziert den Klon pHBV991. Es handelt sich um das Bacterium Escherichia coli K12 Stamm 490, welches das Plasmid pHBV991 enthält (Reinkultur). Das Plasmid besteht aus dem Ausgangsplasmid pBR322 und Hepatitis B-Virus-DNA (Isolat F991), die in die BamHI-Stelle insertiert ist. Das Plasmid exprimiert kein virales Genprodukt. The microorganism E.coli (Escherichia coli) K490 produces pHBV991 the clone pHBV991. It is the bacterium Escherichia coli K12 strain 490, which contains the plasmid pHBV991 (pure culture). The plasmid consists of the starting plasmid pBR322 and hepatitis B virus DNA (isolate F991) inserted into the BamHI site is. The plasmid does not express a viral gene product.
2) E.coli Je101 pGL101 mit der Hinterlegungsnummer DSM 3081.2) E. coli Je101 pGL101 with the depository number DSM 3081.
Dieser Mikroorganismus ist ein Escherichia coli K12 Abkömmling (Messing et al, 1981, Nucleic Acids Res. This microorganism is a descendant of Escherichia coli K12 (brass et al, 1981, Nucleic Acids Res.
9:309) mit Plasmid pol101. Das Plasmid ist eine rekombinante DNA aus dem Origin und der B-Lactamase von pBR322, aus dem tac-promoter und aus einem Prä-s(1)-Fragment der Hepatitis B-Virus-DNA. Es exprimiert Ampicillinresistenz. 9: 309) with plasmid pol101. The plasmid is a recombinant DNA from the origin and the B-lactamase of pBR322, from the tac promoter and from one Pre-s (1) fragment of hepatitis B virus DNA. It expresses resistance to ampicillin.
3) E.coli JM101 pKG1 mit der Hinterlegungsnummer DSM 3079.3) E. coli JM101 pKG1 with the depository number DSM 3079.
Dieser Mikroorganismus ist ein Escherichia coli K12 Abkömmling (Messing et al, 1981, Nucleic Acids Res. This microorganism is a descendant of Escherichia coli K12 (brass et al, 1981, Nucleic Acids Res.
9:309) mit Plasmid pKG1. Das Plasmid ist eine rekombinante DNA aus dem Origin und der B-Lactamase von pBR322, aus dem lacuv5-Promoter und aus einem Prä-s <1)-Fragment der Hepatitis B-Virus-DNA. 9: 309) with plasmid pKG1. The plasmid is made from recombinant DNA the Origin and the B-lactamase from pBR322, from the lacuv5 promoter and from a pre-s <1) fragment of the hepatitis B virus DNA.
Ex exprimiert Ampicillinresistenz und ein Prä-s(1)-Polypeptid mit 119 Aminosäuren. Ex expresses ampicillin resistance and a pre-s (1) polypeptide with 119 amino acids.
4) E.coli JM10i pKG2 mit der Hinterlegungsnummer DSM 3080.4) E. coli JM10i pKG2 with the depository number DSM 3080.
Dieser Mikroorganismus ist ein Escherichia coli K12 Abkömmling (Messing et al, 1981, Nucleic Acids Res. This microorganism is a descendant of Escherichia coli K12 (brass et al, 1981, Nucleic Acids Res.
3:309) mit Plasmid pKG2. Das Plasmid ist eine rekombinante DNA aus dem Origin und der B-Lactamase von pBR322, aus dem tac-Promoter und aus einem Prä-s(l)-Fragment der Hepatitis B-Virus-DNA. Es exprimiert Ampicillinresistenz und ein Prä-s(i)-Polypeptid mit 119 Aminosäuren. 3: 309) with plasmid pKG2. The plasmid is made from recombinant DNA the origin and the B-lactamase from pBR322, from the tac promoter and from a pre-s (l) fragment the hepatitis B virus DNA. It expresses ampicillin resistance and a pre-s (i) polypeptide with 119 amino acids.
Die Züchtungs- und Aufbewahrungsbedingungen für die vorstehend unter 1) bis 4) genannten Mikroorganismen sind die folgenden: Medium: Luria Broth: Hefeextrakt Difco 10 g, Bactotrypton Difco 10 g, NaCl 5 g, pH mit NaOH einstellen, auf 11 mit dest. H2O, 100 mg Ampicillin (Binotal, Bayer) in steriler Lösung zufügen, pH vor Sterilisation: 7,5, Sterilisation 20 Minuten bei 1200 C, Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob, Bebrütungstemperatur: 370 C, Bebrütungsdauer: über Nacht, Aufbewahrung bei: 40 C, Überimpfungsintervall: 3 Monate.The cultivation and storage conditions for the above under 1) to 4) mentioned microorganisms are the following: Medium: Luria Broth: yeast extract Difco 10 g, Bactotrypton Difco 10 g, NaCl 5 g, adjust pH with NaOH to 11 with least. Add H2O, 100 mg ampicillin (Binotal, Bayer) in sterile solution, pH before Sterilization: 7.5, sterilization 20 minutes at 1200 C, behavior towards oxygen: aerobic, incubation temperature: 370 C, incubation time: overnight, storage at: 40 C, vaccination interval: 3 months.
Aufbewahrungsbedingungen: 4" C auf Agar oder -200 C in 50 % Glycerin-LB-Ampicillin. Bedingungen für die Lebensfähigkeitsprüfung: Ausstreichen auf Agar mit dem oben angegebenen Luria Broth-Medium.Storage conditions: 4 "C on agar or -200 C in 50% glycerol-LB-ampicillin. Conditions for viability testing: streak on agar with the above specified Luria Broth medium.
Beispiele Soweit nicht besonders angegeben, werden in den folgenden Beispielen allgemein erwähnte Verfahrensschritte, wie zum Beispiel enzymatische Reaktionen, Präzipitieren, Reinigungen usw. gemäß den Anleitungen des Buches Molecular Cloning, A Laboratory Manual, von T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, durchgeführt.Examples Unless otherwise specified, in the following Examples of generally mentioned process steps, such as, for example, enzymatic Reactions, precipitation, purifications, etc. according to the instructions in the book Molecular Cloning, A Laboratory Manual, by T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982.
Im folgenden bedeutet stets: M : wässrige Lösung, die pro Liter ein Mol der betreffenden Substanz enthält, mM : wässrige Lösung, die pro Liter ein Millimol der betreffenden Substanz enthält, : : wässrige Lösung, die pro Liter ein Mikromol der betreffenden Substanz enthält.In the following always means: M: aqueous solution that per liter Mole of the substance in question contains, mM: aqueous solution that per liter is one millimole of the substance in question contains:: aqueous solution that contains one micromole per liter contains the substance in question.
Beispiel I: 1. Herstellung der Ausqangs-DNA pHBV991: Isolierung der HBV-Partikel (HBV = Hepatitis B-Virus) Als Rohstoff für die Gewinnung der HBV-DNA werden zunächst HBsAg positive Blutkonserven gesammelt, die von Blutspendediensten ausgesondert werden. Die Proben werden auf HBsAg mit der quantitativen Immunelektrophorese (Develop. Biol. Standard 30, 1975, 78-87) und auf HBeAg mit einem handelsüblichen Radioimmunassay (RIA) untersucht. Proben mit mehr als 25 ßg HBsAg/ml und mit einem HBeAg-Titer über 1:100 enthalten mit großer Wahrscheinlichkeit mehr als 108 HBV-Partikel/ml und sind als Startmaterial geeignet. Etwa 5 z der HBsAg positiven Blutspender haben solche Werte. Natürlich kann von solchen Blutspendern oder bekannten HBV-Trägern gezielt Blutplasma durch Plasmaphorese gesammelt werden. Als Startmenge werden mindestens 10 ml, besser aber 40 bis 70 ml Plasma verwendet.Example I: 1. Production of the starting DNA pHBV991: Isolation of the HBV particles (HBV = hepatitis B virus) As raw material for the extraction of HBV DNA First, HBsAg positive blood products are collected by blood donation services be weeded out. The samples are analyzed for HBsAg using quantitative immunoelectrophoresis (Develop. Biol. Standard 30, 1975, 78-87) and for HBeAg with a commercially available radioimmunoassay (RIA) investigated. Samples with more than 25 µg HBsAg / ml and with an HBeAg titer above 1: 100 contains and is very likely to contain more than 108 HBV particles / ml suitable as starting material. About 5 z of HBsAg positive blood donors have such Values. Of course, it can be targeted from such blood donors or known HBV carriers Blood plasma can be collected by plasmaphoresis. At least 10 ml, but better 40 to 70 ml of plasma are used.
Das Plasma wird zunächst bei 10 000 U/Minute und 4" C in einem Winkelrotor zentrifugiert. Sediment und Fettschicht werden verworfen, das geklärte Plasma mit einer Pipette abgesaugt. Je 10 ml des geklärten Plasmas werden in einem Ultrazentrifugenröhrchen der Maße 14 x 95 mm auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten bestehend aus 2 ml 30 %iger (Gewicht/Volumen) und 0,5 ml 20 %iger Saccharoselösung geschichtet. Die Lösung ist in 130 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4 angesetzt. Je nach verfügbarer Plasmamenge werden bis zu sechs Zentrifugenröhrchen auf diese Weise gefüllt und 4 Stunden bei 38 000 U/Minute und 10° C in einem Schwingbecherrotor ultrazentrifugiert. Der erhaltende Überstand wird einschließlich der Lipide vollständig abgesaugt.The plasma is first run at 10,000 rpm and 4 "C in an angle rotor centrifuged. Sediment and fat layer are discarded, the clarified plasma with aspirated with a pipette. 10 ml each of the cleared plasma are placed in an ultracentrifuge tube the dimensions 14 x 95 mm consisting of a discontinuous sucrose gradient layered from 2 ml of 30% (weight / volume) and 0.5 ml of 20% sucrose solution. The solution is made up in 130 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4. Depending on the available Plasma amount up to six centrifuge tubes are filled in this way and Ultracentrifuged for 4 hours at 38,000 rpm and 10 ° C. in a swinging beaker rotor. The supernatant obtained, including the lipids, is completely sucked off.
DNA-Markierung Das Sediment jedes Röhrchens wird mit 100 Mikroliter folgender frisch angesetzter Lösung versetzt: 20 mM MgCl2; 25 mM NH4Cl; 25 mM Tris-HCl pH 7,6; 0,5 % Nonidet-P40; 0,2 % Beta-Mercaptoethanol; 2,5 mg/ml desoxy-Adenosintriphosphat; 2,5 mg/ml desoxy-Thymidintriphosphat; 2,5 mg/ml desoxy-Guanosintriphosphat; 10 Mikrocurie 125 Jod-desoxy-Cytidintriphosphat. Durch Auf- und Abziehen (mindestens zehnmal) der Lösung mit einer Pipette wird das Sediment gründlich suspendiert, danach werden die Sedimente vereinigt und in einem verschlossenen Plastikgefäß 3 Stunden bei 370 C inkubiert. Hierbei baut die HBV-DNA Polymerase radioaktives 125-Jod-desoxy-Cytidin in die HBV-DNA ein und füllt die Einzelstranglücke der HBV-DNA.DNA labeling The sediment of each tube is 100 microliters the following freshly prepared solution is added: 20 mM MgCl2; 25 mM NH4Cl; 25 mM Tris-HCl pH 7.6; 0.5% Nonidet-P40; 0.2% beta-mercaptoethanol; 2.5 mg / ml deoxy adenosine triphosphate; 2.5 mg / ml deoxy thymidine triphosphate; 2.5 mg / ml deoxy guanosine triphosphate; 10 Mikrocurie 125 iodine deoxy cytidine triphosphate. By pulling on and off (at least ten times) the solution with a pipette, the sediment is thoroughly suspended, after which the sediments are combined and placed in a sealed plastic jar for 3 hours incubated at 370C. Here, the HBV-DNA polymerase builds radioactive 125-iodine-deoxy-cytidine into the HBV-DNA and fills the single-strand gap of the HBV-DNA.
DNA-Freisetzung Das Gemisch von 0,1 bis maximal 1 ml wird in einem 14 x 95 mm Ultrazentrifugenröhrchen auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten, bestehend aus 6 ml 30 %iger Lösung, 5 ml 20 %iger und 1 bis 2 ml 10 %iger Lösung in 130 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl; 0,1 % Rinderserumalbumin geschichtet. Nach 8 Stunden bei 38 000 U/Minute und 40 C wird der Uberstand wieder sorgfältig abgezogen und zum Sediment 100 Mikroliter folgender frisch angesetzter Lösung gegeben: 40 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,3 % Natriumlaurylsulfat; 40 mM EDTA; 2 mg/ml Proteinase K.DNA release The mixture of 0.1 to a maximum of 1 ml is in one 14 x 95 mm ultracentrifuge tubes on a discontinuous sucrose gradient, Consists of 6 ml of 30% solution, 5 ml of 20% and 1 to 2 ml of 10% solution in 130 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl; 0.1% bovine serum albumin layered. After 8 hours at 38,000 rpm and 40 ° C., the supernatant is carefully removed again and 100 microliters of the following freshly made solution were added to the sediment: 40 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.3% sodium lauryl sulfate; 40 mM EDTA; 2 mg / ml proteinase K.
Das Sediment wird wie vorher gründlich resuspendiert und dann 4 Stunden bei 370 C inkubiert, wobei die HBV-DNA freigesetzt wird.The sediment is thoroughly resuspended as before and then 4 hours incubated at 370 C, releasing the HBV DNA.
Phenolextraktion Die HBV-DNA wird nun durch Phenolextraktion gereinigt.Phenol extraction The HBV DNA is now purified by phenol extraction.
Die gesamte Lösung, etwa 120 Al, wird in ein 1,5 ml-V-förmiges Zentrifugengefäß gegeben und dann wird dasselbe Volumen an Phenol, das mit Puffer verflüssigt ist, zugesetzt. Die beiden Flüssigkeiten werden durch Vibrieren oder Rotieren gründlich vermischt. Hierfür ist ein Vortex Mischer geeignet. Nun wird die Emulsion wieder getrennt, indem etwa 30 Sekunden in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert, das heißt, es wird vol beschleunigt bis etwa 2000 CXNz te und dann abgibremst. Die obere wässrige Phase wird abgenommen und in einem neuen Gefäß erneut mit Phenol extrahiert. Danach wird in der beschriebenen Weise zweimal mit Diethylether, der mit Wasser gesättigt war, extrahiert, wobei nun die wässrige Phase unten ist.The entire solution, about 120 Al, is placed in a 1.5 ml V-shaped centrifuge tube and then the same volume of phenol, which is liquefied with buffer, is added. The two liquids are thoroughly vibrated or rotated mixed. A vortex mixer is suitable for this. Now the emulsion is back separated by about 30 seconds in an Eppendorf centrifuge centrifuged, that is, it is fully accelerated to about 2000 CXNz te and then braked. the The upper aqueous phase is removed and again with phenol in a new vessel extracted. Then in the manner described twice with diethyl ether, the was saturated with water, extracted, the aqueous phase now being at the bottom.
Alkoholfällung Die verbliebene wässrige DNA-Lösung, etwa 100 ßl, wird pro 100 Al mit 25 ßl 3M Natriumacetat und mit 20 ßl einer wässrigen transfer-RNA-Lösung mit 1 mg/ml als Trägersubstanz versetzt, danach mit 330 ßl Ethanol. Das Gemisch wird auf -70 bis -80° C abgekühlt und nach 15 Minuten wieder in einem V-Gefäß bei Raumtemperatur 5 Minuten bei maximaler Drehzahl, zum Beispiel 12 000 U/Minute, abzentrifugiert. Der Überstand wird völlig abgesaugt, das Sediment wird im Vakuum kurz getrocknet und in 50 l 10 mM Tris-HCl pH 7,4 1 mM EDTA aufgelöst und kühl gelagert. Wegen des radioaktiven Zerfalls soll innerhalb von einer Woche weitergearbeitet werden.Alcohol precipitation The remaining aqueous DNA solution, about 100 μl, becomes per 100 μl with 25 μl of 3M sodium acetate and with 20 μl of an aqueous transfer RNA solution mixed with 1 mg / ml as a carrier substance, then with 330 μl of ethanol. The mixture is cooled to -70 to -80 ° C and after 15 minutes again in a V-shaped vessel Room temperature for 5 minutes at maximum speed, for example 12,000 rpm, centrifuged off. The supernatant is completely suctioned off, the sediment is briefly dried in vacuo and dissolved in 50 l of 10 mM Tris-HCl pH 7.4 1 mM EDTA and stored in a cool place. Because of the radioactive decay should be continued within a week.
Restriktionsanalyse Bevor die HBV-DNA kloniert werden kann, muß sie mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, das möglichst nur eine Schnittstelle in der HBV-DNA hat. In einem Probensatz werden 2 bis 3 Al der HBV-DNA mit 0,5 ijg DNA des Bakteriophagen Lambda (im Handel erhältlich) in 2 ßl H2O mit etwa 10 Einheiten BamHI und mit 5 ßl Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0; 200 mM NaCl; 10 mM MgC12; 2 mM beta-Mercaptoethanol) versetzt, so daß etwa 10 ßl Endvolumen erhalten werden. Ein Kontrollansatz ohne BamHI wird gleich behandelt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 370 C werden 10 ßl Elektrophoresepuffer mit 1 % Natriumlaurylsulfat, 10 % Glyzerin und 0,1 % eines Orange-Farbstoffes, der üblicherweise als Markerfarbstoff für elektrophoretische Wanderungen verwendet wird, zum Beispiel Orange G (Merck, Bestell-Nr. 6878) zugesetzt und die Mischung in eine Elektrophoreseauftragstasche gegeben.Restriction Analysis Before the HBV DNA can be cloned, it must be cut with a restriction enzyme, if possible, only one cleavage site in the HBV DNA. In a set of samples, 2 to 3 AI of the HBV-DNA with 0.5 μg DNA of the bacteriophage lambda (commercially available) in 2 ßl H2O with about 10 units BamHI and with 5 μl reaction buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0; 200 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 2 mM beta-mercaptoethanol) added, so that about 10 μl final volume are obtained. A control batch without BamHI is treated in the same way. After 1 hour of incubation at 370 C. 10 μl electrophoresis buffer with 1% sodium lauryl sulfate, 10% glycerol and 0.1% of an orange dye, commonly used as a marker dye for electrophoretic Walks is used, for example Orange G (Merck, order no. 6878) added and placing the mixture in an electrophoresis application bag.
Parallel dazu sollte eine Probe mit einem Gemisch von DNA-Fragmenten bekannter Größe aufgetragen werden, zum Beispiel Lambda-DNA, die mit HindIII gespalten ist.In parallel should a sample with a mixture of DNA fragments known size can be applied, for example lambda DNA that has been cleaved with HindIII is.
Die Elektrophorese erfolgt mit 1,1 % Agarosegel, das durch Erhitzen von 2,2 g Agarose mit 200 ml Elektrophoresepuffex hergestellt wurde. Der Puffer ist: 40 mM Tris-Base; 20 mM Natriumacetat; 1 mM EDTA; pH mit Eisessig auf 8,2 einstellen. Die Elektrophorese selbst kann in jeder Laborüblichen Horizontal- oder Vertikal-Gelelektrophorese-Apparatur vorzugsweise in Flachgelen durchgeführt werden, wobei die Hinweise des Herstellers zu beachten sind.The electrophoresis is done with 1.1% agarose gel, which is obtained by heating of 2.2 g of agarose was made with 200 ml of electrophoresis puffex. The buffer is: 40 mM Tris base; 20 mM sodium acetate; 1mM EDTA; Adjust pH to 8.2 with glacial acetic acid. The electrophoresis itself can be carried out in any standard laboratory horizontal or vertical gel electrophoresis apparatus preferably be carried out in flat gels, following the manufacturer's instructions must be observed.
Die Wanderungsstrecke in der betreffenden Apparatur sollte zwischen 15 und 30 cm liegen, die Geldicke zwischen 2 und 6 mm, der Probenauftrag liegt auf der Minus-Pol-Seite und sollte mindestens 20 ßl Probe fassen können. Man läßt bei rund 4 bis 6 Volt/cm Feldstärke laufen, bis nach einigen Stunden das Orange G als Zone das Ende des Gels in Richtung Plus-Pol erreicht hat. Dann wird das Gel entnommen und 30 Minuten in 1 Liter Ethidiumbromidlösung (500 Ag/Liter) gebadet.The migration distance in the apparatus in question should be between 15 and 30 cm, the gel thickness between 2 and 6 mm, the sample application is on top the minus pole side and should be able to hold at least 20 ßl sample. One leaves around 4 to 6 volts / cm field strength run until after a few hours the orange G as Zone has reached the end of the gel in the direction of the plus pole. Then the gel is removed and bathed in 1 liter of ethidium bromide solution (500 Ag / liter) for 30 minutes.
Dabei färben sich die DNA-Banden der zur Probe beigefügten Lambda-DNA, die ebenfalls mit BamHI verdaut wurden, sowie die Banden der bekannten DNA-Fragmente in der Vergleichsspur. Durch Beleuchtung mit langwelligem UV-Licht werden die DNA-Fragmente als rote fluoreszierende Banden sichtbar. Die Menge der HBV-DNA reicht allerdings unter Umständen nicht aus, um hier sichtbar zu werden. Es ist vorteilhaft, das Bandenmuster mit einem Orangefilter im Dunkeln bei Belichtungszeiten zwischen 10 und 240 Sekunden zu fotografieren. Zur Darstellung der HBV-DNA wird das Gel nach einer der üblichen Methoden getrocknet, wobei es auf einen stabilen Filterkarton oder eine hydrophile Kunststoffolie (zum Beispiel Gelbond) gelegt wird. Bei Verwendung von Filterkarton muß ein handelsüblicher Geltrockner mit Vakuumanschluß verwendet werden. Bei Verwendung von Gelbondfolie wird die Flüssigkeit durch Auflegen von Filterpapier herausgesaugt. Das getrocknete Gel bleibt als dünne Schicht auf dem Gelträger und wird nun im Dunkeln mit einem Röntgenfilm und einer Röntgenverstärkerfolie in engem Kontakt gebracht, zum Beispiel mit Kodak XAR-Film und Dupont Hiplus-Verstärkerfolie und einer Röntgenkassette.The DNA bands of the lambda DNA added to the sample are colored, which were also digested with BamHI, as well as the bands of the known DNA fragments in the comparison lane. Illumination with long-wave UV light removes the DNA fragments visible as red fluorescent bands. However, the amount of HBV DNA is sufficient may not be enough to be visible here. It is beneficial to use the banding pattern with an orange filter in the dark with exposure times between Photograph 10 and 240 seconds. The gel is used to represent the HBV DNA one of the usual methods of drying it, placing it on a sturdy filter cardboard or a hydrophilic plastic film (for example Gel Bond) is placed. Using A commercially available gel dryer with a vacuum connection must be used for filter cardboard will. When using gel bond film, the liquid is removed by applying Filter paper sucked out. The dried gel remains as a thin layer on the Gel carrier and is now in the dark with an X-ray film and an X-ray intensifying screen brought into close contact, for example with Kodak XAR film and Dupont Hiplus intensifying screen and an X-ray cassette.
Relative Positionen des Films und des Gels zueinander werden durch einen Nadelstich markiert und durch Klebeband fixiert. Die mit 125 Jod markierte HBV-DNA schwärzt an den entsprechenden Stellen des Gels den Röntgenfilm.Relative positions of the film and the gel to each other are determined by Marked a needle prick and fixed it with adhesive tape. The one labeled with 125 iodine HBV-DNA blackens the X-ray film at the corresponding points on the gel.
Der Film wird nach einigen Stunden bis Tagen entwickelt.The film will develop after a few hours to days.
Die HBV-DNA ist ohne Restriktionsschnitt teils circulär, teils linear, so daß im Gel beziehungsweise am Röntgenfilm zwei Banden sichtbar werden: Eine, die einer DNA-Fragmentgröße von etwa 4000 Basenpaaren entspricht, die der circulären Form entspricht und eine zweite, die den etwa 3000 bis 3200 Basenpaaren der linearen Form entspricht, also etwas weiter gewandert ist. Nach einem Schnitt an einer Stelle wird die circuläre DNA in eine lineare DNA umgewandelt, so daß die Gelbande der circulären DNA im BamHI verschwindet.The HBV-DNA is partly circular, partly linear, without a restriction cut, so that two bands are visible in the gel or on the X-ray film: One, which corresponds to a DNA fragment size of about 4000 base pairs, which corresponds to the circular Form and a second that corresponds to the approximately 3000 to 3200 base pairs of the linear Shape corresponds, so has wandered a little further. After a cut in one place the circular DNA is converted into a linear DNA, so that the gel band of the circular DNA in BamHI disappears.
Schneidet das Restriktionsenzym an mehr als einer Stelle, so entstehen neue DNA-Fragmente mit weniger als 3000 Basenpaaren. Das HBV-DNA-Isolat aus Blutkonserve F 991 wurde für die weitere Bearbeitung ausgewählt, weil es offensichtlich nur eine BamHI-Schnittstelle hatte. Nur für solche Isolate ist das weitere Vorgehen geeignet.If the restriction enzyme cuts at more than one point, then arise new DNA fragments less than 3000 base pairs. The HBV DNA isolate from blood F 991 was selected for further processing because there was obviously only one BamHI site. Just for such isolates the next step is Approach suitable.
Die restliche HBV-DNA-Menge von etwa 45 l wird in demselben Puffer wie vorher mit 100 Einheiten BamHI in 100 Al Endvolumen verdaut, jedoch wird keine Lamda-DNA zugefügt und das Volumen entsprechend vergrößert.The remaining amount of HBV-DNA of about 45 l is in the same buffer Digested as before with 100 units BamHI in 100 AI final volume, but none is digested Lamda DNA added and the volume increased accordingly.
Nach einer Stunde bei 370 C wird BamHI durch Phenol-und Ether-Extraktion wie vorher beschrieben entfernt.After one hour at 370 ° C., BamHI is extracted by phenol and ether removed as previously described.
Diese BamHI geschnittene HBV-DNA wird für die Rekombination und Klonierung verwendet.This BamHI cut HBV DNA is used for recombination and cloning used.
DNA-Rekombination Als Vector wird das im Handel erhältliche Plasmid pBR322 verwendet. 6 g reine Plasmid-DNA werden, wie im Absatz vorher beschrieben, mit 10 Einheiten BamHI in 50 111 geschnitten, durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt und in 50 ßl H2O aufgenommen. Dazu werden 200 ijl 100 mM Tris-HCl pH 8,0 und 2 Al bakterielle alkalische Phosphatase (15,7 mg/ml; 45 Einheiten/mg in Ammoniumsulfatlösung, Hersteller Worthington) zugesetzt. Die Phosphatase war vorher 25 Minuten auf 650 C erhitzt worden, um verunreinigende Desoxyribonucleasen zu inaktivieren. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 650 C inkubiert und dann wie vorher mit Phenol und Ether extrahiert.DNA recombination The commercially available plasmid is used as a vector pBR322 used. 6 g of pure plasmid DNA are, as described in the previous paragraph, Cut into 50 111 with 10 units of BamHI by phenol extraction and ethanol precipitation cleaned and taken up in 50 ßl H2O. For this purpose 200 μl of 100 mM Tris-HCl pH 8.0 and 2 Al bacterial alkaline phosphatase (15.7 mg / ml; 45 units / mg in ammonium sulfate solution, Manufacturer Worthington) added. The phosphatase was previously at 650 for 25 minutes C to inactivate contaminating deoxyribonucleases. The reaction mixture was incubated for 60 minutes at 650 ° C. and then extracted with phenol and ether as before.
30 ßl dieser desphosphorylierten Plasmid-DNA und 50 ßl BamHI geschnittener HBV-DNA werden gemischt und zunächst mit Ethanol, wie vorher beschrieben, gefällt. Die getrocknete DNA wird mit 50 ßl folgender frisch angesetzter Lösung aufgenommen: 30 mM Tris-HCl pH 7,6; 15 mM MgCl2; 50 mM KCl; 20 mM Dithiothreitol; 20 ßg/ml Rinderserumalbumin reinst; 1 mM Adenosintriphosphat, 0,2 Einheiten T 4 - DNA-Ligase (im Handel erhältlich). Die Mischung wird 24 Stunden bei 12,50 C inkubiert.30 μl of this desphosphorylated plasmid DNA and 50 μl of BamHI cut HBV-DNA are mixed and first precipitated with ethanol as previously described. The dried DNA is taken up with 50 μl of the following freshly prepared solution: 30 mM Tris-HCl pH 7.6; 15mM MgCl2; 50 mM KCl; 20 mM dithiothreitol; 20 µg / ml bovine serum albumin pure; 1 mM adenosine triphosphate, 0.2 units T 4 - DNA ligase (commercially available). The mixture is incubated at 12.50 ° C. for 24 hours.
Transformation der E.coli-Zellen Das benötigte LB-Medium besteht aus 1 % Bactotrypton (pankreatischer Verdau von Milchcasein); 0,5 % Hefe-Extrakt, 1 % NaCl in destilliertem H2O und ist 20 Minuten bei 1200 C autoklaviert. Eine Kolonie von E.coli K12 Stamm 490 (oder einem anderen für diese Zwecke üblichen E.coli-Stamm) wird in 100 ml LB-Medium in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben übergeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 370 C kultiviert, wobei der sterile Kolben mit lose sitzenden Aluminiumkappen abgedeckt ist Von dieser Vorkultur werden 6 ml auf 400 ml LB-Medium in einen 2 Liter Erlenmeyerkolben übertragen. Dieser wird bei 370 C geschüttelt, wobei alle 20 Minuten die optische Dichte (OD) bei 550 nm gemessen wird. Bei Erreichen einer OD 550 von 0,6 bis 0,7 wird der Kolben durch Schwenken in Eiswasser auf 0° C abgekühlt. Dann werden die Bakterien in der Kälte 10 Minuten bei 6000 U/Minute abzentrifugiert.Transformation of the E. coli cells The required LB medium consists of 1% Bactotrypton (pancreatic digestion of milk casein); 0.5% yeast extract, 1 % NaCl in distilled H2O and is autoclaved at 1200 C for 20 minutes. A colony of E.coli K12 strain 490 (or another E.coli strain commonly used for this purpose) is inoculated into 100 ml of LB medium in a 1 liter Erlenmeyer flask and over Cultivated overnight with shaking at 370 C, with the sterile flask with loose fitting Aluminum caps are covered. 6 ml of this preculture are transferred to 400 ml of LB medium Transfer to a 2 liter Erlenmeyer flask. This is shaken at 370 C, the optical density (OD) at 550 nm is measured every 20 minutes. Upon reaching an OD 550 of 0.6 to 0.7 is the flask by swiveling in ice water to 0 ° C cooled. Then the bacteria are in the cold for 10 minutes at 6000 rpm centrifuged off.
Die Zellen werden in einem kleinen Volumen eiskalter 15 mM NaCl-Lösung suspendiert und dann wird mit eiskalter 15 mM NaCl auf 400 ml aufgefüllt. Die Zellen werden erneut wie oben bei 40 C abzentrifugiert und nun in 200 ml eiskalter 60 mM CaCl2-Lösung aufgenommen und 20 Minuten auf Eis belassen. Dann wird wieder abzentrifugiert und in 40 ml eiskalter 60 mM CaCl2-Lösung suspendiert. Die Zellen können bis zur Verwendung maximal bis 1 Tag auf Eis aufbewahrt werden. 200 Al dieser Zellen werden in einem sterilen Plastik-Reagenzröhrchen mit 15 bis 30 ßl der rekombinierten DNA, wie sie nach der Ligase-Reaktion vorliegt, vermischt und 30 Minuten auf Eis belassen. Danach wird das Röhrchen exakt 120 Sekunden in ein 420 C warmes Wasserbad gebracht und dann wieder 5 Minuten auf Eis gestellt. Dann werden 2 ml LB-Medium zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei 370 C inkubiert. Nun werden 100 ßl davon auf 8 cm große Petrischalen, die 10 ml Nährboden enthalten, ausgestrichen. Der halbfeste Nährboden besteht aus 1,5 g Agar, 10 g Bactotrypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl; 1 Liter destilliertem H2O. Die Komponenten werden gemischt, 20 Minuten bei 1200 C autoklaviert und auf 55" C abgekühlt. Dazu werden 4 ml einer sterilen Lösung von 25 mg/ml Ampicillin (Natriumsalz) in Wasser zugemischt.The cells are placed in a small volume of ice-cold 15 mM NaCl solution suspended and then made up to 400 ml with ice-cold 15 mM NaCl. The cells are centrifuged again as above at 40 C and now in 200 ml of ice-cold 60 mM CaCl2 solution taken up and left on ice for 20 minutes. Then it is centrifuged again and suspended in 40 ml of ice-cold 60 mM CaCl2 solution. The cells can reach up to Use can be kept on ice for a maximum of 1 day. 200 Al of these cells become in a sterile plastic test tube with 15 to 30 μl of the recombined DNA, as it is after the ligase reaction, mixed and left on ice for 30 minutes. Then the tube is placed in a 420 C water bath for exactly 120 seconds and then put back on ice for 5 minutes. Then 2 ml of LB medium are added and the mixture is incubated at 370 ° C. for 1 hour. Now 100 ßl of it are 8 cm size Petri dishes containing 10 ml culture medium are streaked out. The semi-solid nutrient medium consists of 1.5 g agar, 10 g Bactotrypton, 10 g yeast extract, 5 g NaCl; 1 liter of distilled H2O. The components are mixed, autoclaved for 20 minutes at 1200 C and exposed 55 "C. For this purpose, 4 ml of a sterile solution of 25 mg / ml ampicillin (Sodium salt) mixed in water.
10 ml dieser Lösung werden in sterile Petrischalen ausgegossen und erstarren lassen. Die Platten halten sich bei 40 C 2 Wochen.10 ml of this solution are poured into sterile Petri dishes and freeze. The plates can be kept at 40 C for 2 weeks.
Die bestrichenen Platten werden über Nacht bei 370 C in den Brutschrank gelegt. Aus den erschienenen Kolonien müssen nun jene herausgefunden werden, die tatsächlich Plasmide in Form von rekombinierter DNA haben. Durch BamHI wird das Resistenzgen gegen Tetracyclin im Plasmid pBR 322 zerstört. Wenn hier eine fremde DNA eingesetzt ist, verliert das Plasmid seine Tetracyclin-Resistenz.The coated plates are left in the incubator at 370 ° C. overnight placed. From the colonies that have appeared, those who actually have plasmids in the form of recombined DNA. BamHI makes that Resistance gene against tetracycline in plasmid pBR 322 destroyed. If there is a stranger here DNA is inserted, the plasmid loses its tetracycline resistance.
Es werden die erhaltenen Kolonien parallel in definierter Anordnung auf LB-Agar mit 20 ßg Tetracyclin/ml geimpft, (1 Liter Nährboden von 550 C wird mit 2 ml einer Lösung von 10 mg Tetracyclin-HCl in 50 % Ethanol versetzt und in Petrischalen gegossen) und daneben noch einmal in der gleichen Anordnung auf LB-Ampicillin-Platten. Hierfür eignen sich pro einzelner Kolonie jeweils sterile Zahnstocher Nach Bebrütung über Nacht bei 370 C wird das Kolonie-Wachstum auf beiden Nährböden verglichen. Kolonien, die auf dem ampicillinhaltigen Nährboden, nicht aber auf den tetracyclinhaltigen gewachsen sind, sind Kandidaten für E.coli-Klone, die das gewünschte Plasmid mit eingebauter HBV-DNA enthalten.The colonies obtained are parallel in a defined arrangement inoculated on LB agar with 20 μg tetracycline / ml, (1 liter nutrient medium at 550 C is mixed with 2 ml of a solution of 10 mg tetracycline HCl in 50% ethanol and in Petri dishes poured) and next to it again in the same arrangement on LB ampicillin plates. Sterile toothpicks after incubation are suitable for each individual colony The colony growth on both culture media is compared overnight at 370.degree. Colonies on the ampicillin-containing medium, but not on the tetracycline-containing are candidates for E. coli clones that carry the desired plasmid built-in HBV DNA.
Die endgültige Identifizierung erfolgt durch Isolierung und Restriktionsanalyse der Plasmide aus den Kandidatenklonen. Hierfür werden die Klone mit sterilen Zahnstochern jeweils auf einem Sechstel der Fläche einer 8 cm Petrischale mit LB-Ampicillin-Agar verstrichen, über Nacht bei 370 C kultiviert und mit sterilen Zahnstochern abgeerntet und in einem V-Zentrifugengefäß mit 200 iil Puffer (25 % Saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) gründlich suspendiert. Dazu werden jeweils 66 ßl Lysozymlösung (10 mg/ml) zugemischt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden 54 ßl 250 mM EDTA pH 8,0 zugemischt.Final identification is made by isolation and restriction analysis the plasmids from the candidate clones. To do this, the clones are made with sterile toothpicks respectively spread on one sixth of the area of an 8 cm Petri dish with LB ampicillin agar, cultivated overnight at 370 C and harvested with sterile toothpicks and placed in a V-centrifuge tube with 200 µl buffer (25% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.0) thoroughly suspended. To this end, 66 μl of lysozyme solution (10 mg / ml) are added in each case. After 5 minutes at room temperature, 54 μl of 250 mM EDTA pH 8.0 are added.
Nach 5 Minuten wird 320 ßl Detergenslösung zugefügt: 0,1 % Alkylphenylpolyethylenglykol (Triton X-100) als Detergens; 7 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8,0.After 5 minutes, 320 μl of detergent solution are added: 0.1% alkylphenyl polyethylene glycol (Triton X-100) as a detergent; 7 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8.0.
Nach 15 Minuten bei 65" C im Wasserbad werden die Lösungen bei 40 C 20 Minuten lang bei maximaler Drehzahl zum Beispiel 12 000 U/Minute geklärt. Die Überstände werden in neue V-Gefäße überführt und mit einem gleichen Volumen Isopropanol (etwa 550 ßl) vermischt, 2 Stunden bei -200 C stehen gelassen und das DNA-Präzipitat wird 5 Minuten bei Maximaldrehzahl abgeschleudert. Der Überstand wird vollständig abgenommen, im Vakuum kurz getrocknet und in 75 l H2O wieder aufgelöst. Dieses sogenannte Minilysat liefert Plasmid-DNA, die für die Restriktionsanalyse geeignet ist.After 15 minutes at 65 "C in the water bath, the solutions are at 40 C Clarified for 20 minutes at maximum speed, for example 12,000 rpm. the Supernatants are transferred into new V-tubes and with an equal volume of isopropanol (about 550 μl) mixed, left to stand for 2 hours at -200 C and the DNA precipitate is spun off at maximum speed for 5 minutes. The supernatant becomes complete removed, briefly dried in vacuo and redissolved in 75 liters of H2O. This so-called Minilysat supplies plasmid DNA that is suitable for restriction analysis.
10 ßl des Minilysats werden mit den vorher beschriebenen Bedingungen mit BamHI verdaut und elektrophoretisch in 1,1 % Agarosegel wie vorher beschrieben analysiert. Die DNA-Fragmente des Plasmids werden durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Als Vergleichssubstanz wird 1 ßg HindIII gespaltene Lambda-DNA (im Handel erhältlich) mit analysiert. Wenn eine Kolonie ein Plasmid enthält, das die volle 991-DNA oder eine HBV-DNA mit einer BamHI-Stelle eingebaut hat, entsteht neben dem 4000 Basenpaar-Fragment von PBR322 ein 3200 BP-Fragment im entsprechenden Minilysat. Es ist klar, daß nicht alle, vermutlich sogar nur wenige HBV-DNA-Isolate, nur eine BamHI-Stelle haben. Um exakt den gleichen experimentellen Weg beschreiten zu können, müssen relativ viele HBV-Isolate untersucht werden. Alternativ können analoge Experimente mit EcoRI und anderen Plasmiden, zum Beispiel pACYC 184, durchgeführt werden.10 ßl of the minilysate are with the previously described conditions Digested with BamHI and electrophoresed in 1.1% agarose gel as previously described analyzed. The DNA fragments of the plasmid are identified by staining with ethidium bromide made visible. 1 μg of HindIII cleaved lambda DNA is used as a comparison substance (commercially available) with analyzed. When a colony contains a plasmid that has incorporated the full 991 DNA or an HBV DNA with a BamHI site in addition to the 4000 base pair fragment of PBR322, a 3200 BP fragment in the corresponding Minilysate. It is clear that not all, and probably only a few, HBV DNA isolates, have only one BamHI site. To the exact same experimental path To be able to walk, a relatively large number of HBV isolates have to be examined. Alternatively analog experiments with EcoRI and other plasmids, for example pACYC 184, be performed.
Ein ausgewählter E.coli-Stamm mit dem Plasmid pHBV 991 wird auf LB-Ampicillin Agar ausgestrichen und zur Erhaltung der Lebensfähigkeit alle 3 Monate auf neue Nährboden überimpft. Die Kulturen müssen vor dem Austrocknen gesichert sein. Eine Lagerung bis zu 1 Jahr bei -20° C ist möglich, wenn eine LB-Ampicillin Flüssigkultur mit 20 % Glycerin versetzt wird.A selected E. coli strain with the plasmid pHBV 991 is on LB ampicillin Agar streaked and renewed every 3 months for viability Inoculated nutrient medium. The cultures must be secured against drying out. One Storage for up to 1 year at -20 ° C is possible if an LB ampicillin liquid culture is used is mixed with 20% glycerine.
Präparation der pHBV 991 DNA Wie vorher beschrieben, wird in 100 ml LB-Ampicillin-Medium eine Übernachtkultur von 200 ml des E.coli-Stamm mit pHBV 991 angelegt Mit 20 ml dieser Vorkultur werden 400 ml LB-Ampicillin-Medium in einem 2 Liter-Kolben beimpft, parallel können bis zu 6 Erlenmeyerkolben mit 400 ml verwendet werden. Die weiteren Angaben gelten pro Kolben. Die Vermehrung erfolgt unter Schütteln bei 370 C. Die OD600 wird verfolgt, am bequemsten in einem parallel mitgefärbten Klettkolben, der einen seitlichen Ansatz hat, der direkt in ein Photometer gebracht werden kann. Bei einer OD600 von 0,4 (nach 2 bis 3 Stunden) werden pro Kolben 2,5 ml Chloramphenicol (34 mg/ml in Ethanol) zugefügt, dann wird über Nacht bei 370 C weitergeschüttelt. Dann werden die Zellen bei 6000 U/Minute für 10 Minuten bei 40 C abzentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen, die Zellen werden in insgesamt 100 ml eiskaltem Puffer (130 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA) suspendiert und wieder abzentrifugiert. Der Überstand wird weggegossen und das Pellet mit 9 ml Lyse-Puffer (50 mM Glucose; 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA) suspendiert und dann wird 1 ml Lysozymlösung (50 mg in 1 ml Lyse-Puffer) zugegeben. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden 20 ml Denaturierungslösung (1 % Natriumlaurylsulfat; 200 mM NaOH) zugefügt, 10 Minuten auf Eis unter leichtem Schwenken gelagert. Dann werden 15 ml hochmolare Acetatlösung (3 M Kaliumacetat, 2 M Essigsäure) zugefügt, kräftig gerührt und weitere 10 Minuten auf Eis gehalten. Dann wird 20 Minuten bei 20 000 U/ Minute und 40 C zentrifugiert. Der Überstand ist klares Lysat", das mit 0,6 Volumen Isopropanol vermischt wird.Preparation of the pHBV 991 DNA As previously described, in 100 ml LB ampicillin medium culture an overnight culture of 200 ml of the E. coli strain with pHBV 991 applied With 20 ml of this preculture, 400 ml of LB ampicillin medium are in a 2 liter flasks inoculated, up to 6 Erlenmeyer flasks with 400 ml can be used in parallel will. The other details apply per piston. Propagation takes place with shaking at 370 ° C. The OD600 is followed, most conveniently in a parallel colored Velcro piston that has a lateral attachment that is brought directly into a photometer can be. At an OD600 of 0.4 (after 2 to 3 hours), 2.5 per flask ml of chloramphenicol (34 mg / ml in ethanol) is added, then overnight at 370 C kept shaking. Then the cells are at 6000 rpm for 10 minutes at 40 C centrifuged. The supernatant is poured off, the cells are in total 100 ml of ice-cold buffer (130 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 mM EDTA) suspended and centrifuged off again. The supernatant is poured away and the pellet with 9 ml lysis buffer (50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl pH 8.0; 10 mM EDTA) suspended and then 1 ml of lysozyme solution (50 mg in 1 ml of lysis buffer) is added. After 5 minutes 20 ml of denaturing solution (1% sodium lauryl sulfate; 200 mM NaOH) was added, stored for 10 minutes on ice with gentle swirling. Then will 15 ml high molar acetate solution (3 M potassium acetate, 2 M acetic acid) added, vigorously stirred and kept on ice for a further 10 minutes. Then 20 minutes at 20,000 RPM and 40 C centrifuged. The supernatant is clear lysate "that is 0.6 volume Isopropanol is mixed.
Nach 15 Minuten bei 20 bis 250 C wird das Präzipitat bei 12 000 U/Minute bei 200 C 20 Minuten zentrifugiert, der Uberstand verworfen, das Sediment mit 70 %igem Ethanol gewaschen, im Vakuum kurz getrocknet und in 8 ml 10 mM Tris 1 mM EDTA (TE) aufgelöst.After 15 minutes at 20 to 250 C the precipitate is at 12,000 rpm Centrifuged at 200 C for 20 minutes, the supernatant discarded, the sediment with 70 Washed% ethanol, dried briefly in vacuo and in 8 ml of 10 mM Tris 1 mM EDTA (TE) resolved.
Pro jedem ml dieser DNA-Lösung werden 1 g festes Cäsiumchlorid hinzugefügt und gelöst und jedem ml dieser CsCl-Lösung werden 80 ßl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) zugegeben. Die Dichte soll 1,55 g/cm3 betragen und wird notfalls mit TE-Puffer oder CsCl nachgestellt. Diese Lösung wird in durchsichtige verschließbare Zentrifugenröhrchen (zum Beispiel Quickseal 16 x 76 mm von Beckmann) gebracht, notfalls werden die Röhrchen mit Paraffinöl randvoll gemacht. Nach 36 Stunden bei 200 C und 45 000 U/Minute in einem Winkelrotor (zum Beispiel Beckmann Ti 70.1) werden die Röhrchen entnommen, wobei meist schon bei Normallicht zwei rote Zonen sichtbar werden. Die untere Zone wird durch Anstechen mit einer Injektionsnadel abgenommen, wobei durch Einstechen einer zweiten Nadel von oben Luft zugeführt wird. Das Ethidiumbromid wird aus der so gewonnenen Lösung durch 5 maliges Ausschütteln mit dem gleichen Volumen wassergesättigtes n-Butanol extrahiert; das Cäsiumchlorid wird durch je 2 stündige Dialyse in einer Kollodiumhülse (Sartorius) gegen 3 mal 100 ml TE-Puffer entfernt. Die pHBV 991 DNA wird dann mit Ethanol gefällt und in 50 ßl TE-Puffer pro 400 ml Ausgangskultur aufgelöst. Die DNA-Konzentration dieser Lösung wird in einer geeigneten Verdünnung W-photometrisch bestimmt, wobei eine OD280 von 1 50 ßg reiner DNA/ml entsprechen.1 g of solid cesium chloride is added for each ml of this DNA solution and dissolved and 80 μl of ethidium bromide solution (10 mg / ml) was added. The density should be 1.55 g / cm3 and if necessary it will be with TE buffer or CsCl adjusted. This solution is placed in clear, sealable centrifuge tubes (for example Quickseal 16 x 76 mm from Beckmann), if necessary the tubes are made to the brim with paraffin oil. After 36 hours at 200 C and 45,000 rpm in the tubes are removed from an angle rotor (e.g. Beckmann Ti 70.1), whereby two red zones are usually already visible in normal light. The lower zone is removed by piercing with a hypodermic needle, whereby by piercing a second needle is supplied with air from above. The ethidium bromide is made from the Solution obtained in this way by shaking out 5 times with the same volume of water-saturated n-butanol extracted; the cesium chloride is by dialysis for 2 hours in one Collodion tube (Sartorius) against 3 times 100 ml of TE buffer removed. The pHBV 991 DNA is then precipitated with ethanol and in 50 μl TE buffer per 400 ml Starting culture dissolved. The DNA concentration of this solution is in a suitable Dilution determined by UV photometry, with an OD280 of 150 μg of pure DNA / ml correspond.
Bei dem Klon K490 pHBV991 besteht die Prä-S(1)-Nucleotidsequenz aus 119 Codons.In the case of clone K490 pHBV991, the pre-S (1) nucleotide sequence consists of 119 codons.
Der Klon ist unter der Bezeichnung K490 pHBV991 bei der Sammelstelle "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland" hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer DSM 3082.The clone is at the collection point under the designation K490 pHBV991 "German Collection of Microorganisms (DSM), Griesebachstrasse 8, 3400 Göttingen, Federal Republic of Germany "and has the depository number DSM 3082.
Anstelle des hier verwendeten Stammes 490 von E.coli K12 können auch alle anderen für die Gelklonierung geeigneten E.coliK-Abkömmlinge verwendet werden.Instead of the strain 490 of E. coli K12 used here, all other E.coliK derivatives suitable for gel cloning can be used.
2. Herstellung der Prä-S(1)-Fragmente aus pHBV991 a) BstEII/Bal31/EcoRI-Fragment 260 ßg Hepatitis B-DNA (Klon pHBV991) in 200 Fl, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 und 1 mM EDTA (Puffermischung TE) wurden mit 600 Einheiten BstEII unter Zugabe von 200 ßl Reaktionspuffer 5 Stunden bei 600 C verdaut. Der Reaktionspuffer enthält 200 mM Tris-HCl pH 7,4; 100 mM KCl; 10 mM MgCl2.2. Production of the pre-S (1) fragments from pHBV991 a) BstEII / Bal31 / EcoRI fragment 260 μg of hepatitis B DNA (clone pHBV991) in 200 μl, 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and 1 mM EDTA (buffer mixture TE) were with 600 units of BstEII with the addition of 200 μl Reaction buffer digested at 600 ° C. for 5 hours. The reaction buffer contains 200 mM Tris-HCl pH 7.4; 100 mM KCl; 10 mM MgCl2.
Die Lösung wurde dann auf eine kleine Chromatographiesäule mit etwa 1 ml Diethylaminoethyl-Cellulose in TE-Puffer gegeben. The solution was then applied to a small chromatography column with approx 1 ml of diethylaminoethyl cellulose was added to TE buffer.
Nachdem die Lösung eingezogen war, wurde mit 5 ml TE gewaschen. Danach wurden dreimal 0,5 ml 2 M NaCl in TE nacheinander aufgegeben und das Eluat getrennt aufgefangen. Daraus wurde durch Zugabe von jeweils 1 ml Ethanol die DNA wie früher, jedoch ohne weiteren Salzzusatz, gefällt und wieder in insgesamt 275 ßl TE aufgelöst. Nun wurden 275 Al Puffer aus 24 mM CaC12; 24 mM MgC12; 400 mM NaCl; 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA; 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin zugesetzt und das Gemisch auf 300 C vorgewärmt. Nach Zugabe von genau 0,6 Einheiten Bal3i wird genau 16 Minuten und bei einem zweiten ansonsten identischen Ansatz 18 Minuten verdaut. Da die Bal31 linear mit der Zeit die Enden verkürzt, sollte durch die zwei verschiedenen Zeiten die Wahrscheinlichkeit erhöht werden, daß Fragmente der richtigen Länge erhalten werden. Jede einzelne Bal31-Charge muß erst in Probeansätzen auf ihre Wirkung geprüft werden. Es sollten rund 28 Basen pro Ende entfernt werden. After the solution had been absorbed, it was washed with 5 ml of TE. Thereafter 0.5 ml of 2 M NaCl in TE were applied three times in succession and the eluate was separated caught. By adding 1 ml of ethanol each time, the DNA was transformed into the but without any additional salt added, it is precipitated and dissolved again in a total of 275 μl TE. Now 275 A1 buffers were made from 24 mM CaC12; 24mM MgC12; 400 mM NaCl; 40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2mM EDTA; 0.5 mg / ml bovine serum albumin added and the mixture to 300 C preheated. After adding exactly 0.6 units of Bal3i, exactly 16 minutes and digested for 18 minutes in a second otherwise identical batch. Since the Bal31 linearly shortened with time the ends should be by the two different times the likelihood of getting fragments of the correct length will be increased will. Each individual Bal31 batch must first be tested for its effectiveness in trial runs will. Around 28 bases should be removed per end.
Die Reaktionen wurden jeweils durch Zugabe von 70 ßl 250 mM Na2EDTA gestoppt, die Mischungen der beiden Ansätze dann 10 Minuten auf 600 C erhitzt und dann 2 Stunden in einer Kollodiumhülse gegen 100 ml TE dialysiert. Danach wurde die DNA mit EcoRI verdaut.The reactions were each carried out by adding 70 μl of 250 mM Na2EDTA stopped, the mixtures of the two approaches then heated to 600 C for 10 minutes and then dialyzed against 100 ml TE in a collodion tube for 2 hours. After that it was the DNA digested with EcoRI.
Es wurde das gleiche Volumen Puffer mit 200 mM Tris-HCl pH 7,5; 100 mM NaCl; 20 mM MgCl2 und 1000 Einheiten EcoRI zugegeben und für 2 Stunden bei 370 C inkubiert.The same volume of buffer with 200 mM Tris-HCl pH 7.5; 100 mM NaCl; 20 mM MgCl2 and 1000 units EcoRI added and for 2 hours at 370 C incubated.
EcoRI wurde durch Erhitzen (10 Minuten/600 C) inaktiviert. Die DNA wurde mit dem doppelten Volumen Ethanol präzipitiert, in 20 l 6,6 mM Tris-HCl pH 7,4, 6,6 mM MgC12, 1 mM Dithiothreitol, 5 mM NaCl, 100 AM Desoxyadenosintriphosphat, 100 ßM Desoxythymidintriphosphat aufgelöst und mit 0,2 Einheiten Klenow-Polymerase 16 Stunden bei 140 C inkubiert. Die etwa 370 bis 400 Basenpaare großen DNA-Fragmente wurden in 5 % Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Gel- und Kammerpuffer waren 60 mM Tris-Borat, 60 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8,3 (TBE). Das Gel war 20 cm lang, 18 cm breit und 1 mm dick. Die Probenauftragstaschen waren 8 mm breit und wurden mit jeweils 10 Al beschickt. Die Proben wurden vor der Elektrophorese mit 0,2 Volumen von 50 % Glycerin; 0,05 % Bromphenolblau in TBE versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 240 Volt bis nach 2 bis 4 Stunden das Bromphenolblau die Anodenseite des Gels erreicht hat. Danach befinden sich die gewünschten Fragmente im mittleren Drittel, wo sie durch Färbung mit Ethidiumbromidlösung (0,5 Ag/ml) im UV-Licht sichtbar gemacht wurden. Die Fragmentzonen wurden ausgeschnitten, zerkleinert und gewogen, dann mit demselben Volumen 0,5 M Ammonacetat; 1 mM EDTA versetzt und über Nacht bei 37° C über Kopf rotiert.EcoRI was inactivated by heating (10 minutes / 600 C). The DNA was precipitated with twice the volume of ethanol, in 20 l of 6.6 mM Tris-HCl pH 7.4, 6.6 mM MgC12, 1 mM dithiothreitol, 5 mM NaCl, 100 AM deoxyadenosine triphosphate, Dissolve 100 µM deoxythymidine triphosphate and add 0.2 units of Klenow polymerase Incubated at 140 ° C. for 16 hours. The approximately 370 to 400 base pairs of DNA fragments were separated electrophoretically in 5% polyacrylamide gel. Gel and chamber buffer were 60 mM Tris-borate, 60 mM boric acid, 1 mM EDTA, pH 8.3 (TBE). The gel was 20 cm long, 18 cm wide and 1 mm thick. The sample application pouches were 8 mm wide and were charged with 10 Al each. The samples were using prior to electrophoresis 0.2 volume of 50% glycerin; 0.05% bromophenol blue in TBE was added. Electrophoresis took place at 240 volts until after 2 to 4 hours the bromophenol blue was on the anode side of the gel. After that, the desired fragments are in the middle Third, where they are visible by staining with ethidium bromide solution (0.5 Ag / ml) in UV light were made. The fragment zones were cut out, crushed and weighed, then with the same volume of 0.5 M ammonium acetate; 1 mM EDTA offset and rotated overhead overnight at 37 ° C.
Danach wurde scharf bei 10 000 U/Minute 10 Minuten bei 20° C abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit 2 Volumina Ethanol präzipitiert und in 20 Al TE gelöst. Then it was centrifuged off sharply at 10,000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. The supernatant was precipitated with 2 volumes of ethanol and dissolved in 20 Al TE.
b) BstEII/EcoRI Fragment 50 Fg pHBV 991 DNA in 40 ßl TE wurden mit 40 l 200 mM Tris-HCl pH 7,4; 100 mM KCl; 10 mM MgCl2 und mit 120 Einheiten BstEII versetzt und 2 Stunden bei 600 C im Wasserbad inkubiert, dann wurden 20 ßl 250 mM NaCl, 50 mM MgC12 und 200 Einheiten EcoRI zugesetzt und weitere 2 Stunden bei 37° C verdaut.b) BstEII / EcoRI fragment 50 μg pHBV 991 DNA in 40 μl TE were with 40 liters of 200 mM Tris-HCl pH 7.4; 100 mM KCl; 10 mM MgCl2 and with 120 units of BstEII added and incubated for 2 hours at 600 C in a water bath, then 20 μl of 250 mM NaCl, 50 mM MgCl2 and 200 units EcoRI added and a further 2 hours at 37 ° C digested.
Dann wird die Lösung 5 Minuten auf 70" C im Wasserbad erhitzt, danach wird in einer Mikrokollodiumhülse 1 Stunde gegen 100 ml TE dialysiert. Diese Lösung (etwa 150 Al) wurde mit dem gleichen Volumen 60 mMol Natriumacetatpuffer pH 4,46; 100 mM NaCl; 2 mM ZnCl2; 10 % Glycerin-Puffer und mit 100 Einheiten Mung Bohnen Nuclease versetzt und 10 Minuten bei 370 C inkubiert. Danach wurden 30 ßl 250 mM Na2EDTA zugefügt, das Gemisch wie unter 1) angegeben ist (siehe Phenolextraktion, Alkoholfällung) mit Phenol/Ether extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde in 20 ßl TE aufgenommen und das 400 Basenpaare lange Fragment wie unter 2a) elektrophoretisch isoliert und nach Ethanolpräzipitation in 20 ßl TE aufgelöst. Then the solution is heated to 70 "C in a water bath for 5 minutes, then is dialyzed against 100 ml TE in a microcollodion tube for 1 hour. This solution (about 150 μl) was added with the same volume of 60 mmol sodium acetate buffer pH 4.46; 100 mM NaCl; 2 mM ZnCl2; 10% glycerin buffer and with 100 units of mung beans Nuclease was added and the mixture was incubated at 370 ° C. for 10 minutes. Then 30 μl of 250 mM Na2EDTA added, the mixture is as specified under 1) (see phenol extraction, Alcohol precipitation) extracted with phenol / ether and precipitated with ethanol. The DNA was taken up in 20 ßl TE and the 400 base pair fragment as under 2a) isolated electrophoretically and dissolved in 20 μl TE after precipitation with ethanol.
c) Alu I/EcoRI Fragment Der folgende Schritt dient der Vermehrung des beziehungsweise der DNA-Fragmente, die die Prä-S(1)-Sequenz enthalten (die zum Beispiel gemäß 2b) oder auch 2a) erhalten wurden), wobei außerdem aus solchen Fragmenten durch das Restriktionsenzym AluI überflüssige Basenpaare abgespalten werden.c) Alu I / EcoRI fragment The following step is used for propagation des or the DNA fragments that contain the pre-S (1) sequence (the Example according to 2b) or 2a) were obtained), and also from such fragments superfluous base pairs are cleaved off by the restriction enzyme AluI.
Als Vector wurde das Plasmid pGL101 verwendet, das von Thummel et al beschrieben wurde (J.Virol. 37, 1981, 683-697). Das Plasmid wurde in E.coli JM101 wie unter 1) angegeben vermehrt, extrahiert und gereinigt. 10 Ag pGL101 DNA in 15 ijl TE wurden mit 15 ul Reaktionspuffer 12 mM Tris-HCl pH 7,4; 120 mM NaCl; 12 mM MgCl2; 15 mM beta-Mercaptoethanol; 0,02 % Triton X100 und mit 20 Einheiten PvuII versetzt und 2 Stunden bei 370 C inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf 650 C erwärmt, um PvuII zu inaktivieren.The plasmid pGL101 was used as a vector, which was published by Thummel et al (J. Virol. 37, 1981, 683-697). The plasmid was in E. coli JM101 propagated, extracted and purified as indicated under 1). 10 Ag pGL101 DNA in 15 ijl TE were treated with 15 ul reaction buffer of 12 mM Tris-HCl pH 7.4; 120 mM NaCl; 12 mM MgCl2; 15 mM beta-mercaptoethanol; 0.02% Triton X100 and with 20 units of PvuII and incubated at 370 ° C. for 2 hours. The mixture was at 650 for 10 minutes C heated to inactivate PvuII.
Ag Fragment in 10 ijl TE von Abschnitt 2b) wurde mit 0,3 llg DNA des Plasmids pGL101, die mit EcoRI-PvuII geschnitten war, vermischt und in 20 gll 50 mM Tris HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM Adenosintriphosphat mit 0,1 Einheiten T4-DNA Ligase 18 Stunden bei 49 C ligiert. Mit einem Drittel des Ansatzes wurde nach der Methode von Hanahan, E.coli Stamm JM10i (Amersham Braunschweig) transformiert und auf ampicillinhaltigen Platten selektioniert. Transformanten mit dem Prä-S(1)-Fragment wurden durch in situ Hybridisierung der Kolonien auf Nitrocellulosemembranen mit 32P-markierter Hepatitis B-Virus-DNA identifiziert. Von positiven Klonen wurden Mini-Lysate hergestellt und die darin enthaltene Plasmid-DNA mit AluI verdaut. Hierbei entsteht wieder ein 450 Basenpaar-Fragment, das im wesentlichen die Prä-S (1)-Sequenz enthält. Von einem ausgewählten Klon mit dem erwarteten 450 Basenpaar-Fragment im AluI-Verdau wurde gereinigte Plasmid-DNA in präparativem Maßstab hergestellt, 50 g davon mit AluI verdaut und das gewünschte DNA-Fragment mit der Prä-S(1)-Sequenz durch Gelelektrophorese isoliert und nach Ethanolpräzipitation in 20 ul TE gelöst.Ag fragment in 10 μl TE from section 2b) was mixed with 0.3 μl of DNA des Plasmid pGL101, which was cut with EcoRI-PvuII, mixed and in 20 gII 50 mM Tris HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 1 mM adenosine triphosphate with 0.1 unit of T4 DNA Ligase ligated at 49 ° C for 18 hours. One third of the approach was after the Method of Hanahan, E. coli strain JM10i (Amersham Braunschweig) transformed and selected on plates containing ampicillin. Transformants with the pre-S (1) fragment were carried out by in situ hybridization of the colonies onto nitrocellulose membranes using 32P-labeled hepatitis B virus DNA identified. From positive clones Mini-lysates are produced and the plasmid DNA contained therein is digested with AluI. Here there is again a 450 base pair fragment which essentially has the pre-S (1) sequence contains. From a selected clone with the expected 450 base pair fragment im AluI digestion, purified plasmid DNA was prepared on a preparative scale, 50 g of it digested with AluI and the desired DNA fragment with the pre-S (1) sequence isolated by gel electrophoresis and, after ethanol precipitation, dissolved in 20 μl of TE.
3. Expression des Prä-S(1)-Polypeptids a) Transcriptionskontrolle durch den LacUV5 Promoter.3. Expression of the pre-S (1) polypeptide a) Transcription control by the LacUV5 promoter.
Das BstEII/Bal31/EcoRI Fragment beziehungsweise das Alu I/EcoRI Fragment wurden wie unter Abschnitt 2c mit pGL101 ligiert und in E.coli JM 101 kloniert. Die richtige Polarität der Fragmentinsertion wurde durch Doppelverdau der jeweiligen Plasmid DNA mit EcoRI und Sau96I und Bestimmung der Fragmentgrößen ermittelt. Bei richtiger Polarität entsteht neben den Fragmenten mit 1400, 616, 222, 79, 18, 17 Basenpaaren ein 200 Basenpaar-Fragment, bei falscher Polarität stattdessen ein Fragment mit 380 Basenpaaren. The BstEII / Bal31 / EcoRI fragment or the Alu I / EcoRI fragment were ligated with pGL101 as described in Section 2c and cloned into E. coli JM 101. The correct polarity of the fragment insertion was determined by double digestion of the respective Plasmid DNA determined with EcoRI and Sau96I and determination of the fragment sizes. at correct polarity arises next to the fragments with 1400, 616, 222, 79, 18, 17 Base pairs a 200 base pair fragment, if the polarity is incorrect, a fragment instead with 380 base pairs.
b) Transcriptionskontrolle durch den tac-Promoter. b) Transcription control by the tac promoter.
50 ßg Plasmid DNA pDR540 (Pharmacia-PL Biochemicals) wurden mit BamHI (New England Biolabs) verdaut, und die überstehenden Enden wie vorher beschrieben mit Mung-Bean-Nuclease verkürzt. 0,3 Ag der mit Phenol extrahierten und Athanol gefällten DNA wurden mit 1 ßg des AluI/EcoRI Fragments wie vorher beschrieben ligiert und die rekombinierte DNA kloniert. 50 μg of plasmid DNA pDR540 (Pharmacia-PL Biochemicals) were mixed with BamHI (New England Biolabs) digested and the protruding ends as previously described shortened with mung bean nuclease. 0.3 Ag of the phenol extracted and ethanol Precipitated DNA was ligated with 1 μg of the AluI / EcoRI fragment as previously described and cloned the recombined DNA.
Klone mit der richtigen Polarität wurden durch Verdau der Plasmide mit HindIII und BalI bestimmt. Bei richtiger Polarität wird ein 250 Basenpaar Fragment erhalten, bei falscher stattdessen ein 360 Basenpaar-Fragment. Clones with the correct polarity were made by digesting the plasmids determined with HindIII and BalI. If the polarity is correct, it becomes a 250 base pair fragment received, if wrong, a 360 base pair fragment instead.
c) Identifizierung der Prä-S(1)-Polypeptid produzierenden Klone. c) Identification of the pre-S (1) polypeptide producing clones.
Klone mit der richtigen Polarität wurden auf Nitrocellulosemembranen ausgestrichen, die Membranen auf Agar-Nährboden gelegt, der aus LB-Medium, 100 Rg/ml Ampicillin und 1 mM Isopropylthioglactosid bestand, und über Nacht bei 370 C kultiviert. Die Kolonien wurden in situ durch Auflegen auf feuchtes Filterpapier mit 5 mg/ml Lysozym und Chloroformdampf in 15 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Die Membran wurde dann mit 1:4 verdünntem Hybridomkulturüberstand des monoklonalen Antikörpers MA18/7 1 Stunde bei 370 C geschüttelt, 3mal mit 0,2 % TWEEN 20 gewaschen, mit Antikörper gegen Maus IgG, peroxidasemarkiert, (Dakopatts) 1:1000 in 20 % Kalbserum 1 Stunde bei 370 C geschüttelt, 3mal mit 0,5 % Detergens TWEEN 20 in PBS gewaschen und mit 0,01 % Diaminobenzidin, 0,03 % H2O2 gefärbt. Clones with the correct polarity were placed on nitrocellulose membranes crossed out that The membranes are placed on agar medium, which consists of LB medium consisted of 100 µg / ml ampicillin and 1 mM isopropylthioglactoside, and about Cultivated at 370 C overnight. The colonies were found in situ by placing on moist Filter paper with 5 mg / ml lysozyme and chloroform vapor in 15 minutes at room temperature lysed. The membrane was then diluted 1: 4 with hybridoma culture supernatant of the monoclonal MA18 / 7 antibody shaken for 1 hour at 370 C, washed 3 times with 0.2% TWEEN 20, with antibodies against mouse IgG, peroxidase-labeled, (Dakopatts) 1: 1000 in 20% calf serum Shaken for 1 hour at 370 ° C., washed 3 times with 0.5% detergent TWEEN 20 in PBS and stained with 0.01% diaminobenzidine, 0.03% H2O2.
Die positiven Kolonien färbten sich deutlich stärker als negative Kontrollkolonien.The positive colonies were markedly more colored than the negative ones Control colonies.
Extraktion und Anreicherung des Prä-s(1>-Polypeptids a) Für die Anreicherung des gewünschten Produkts wurde ein Immunabsorbens hergestellt. 3 g poröse Aminopropyl-Glasperlen (Glasperlen, die Aminopropylgruppen enthalten) mit 140 nm Porenweite (Fluka) wurden mit 6 % Glutardialdehyd in 0,3 M NaHCO3 bei Raumtemperatur 30 Minuten geschüttelt, gründlich mit Wasser gewaschen und dann mit 50 mg des monoklonalen Antikörpers MA18/7 (mit den konstanten Merkmalen Immunoglobulin G1/Kappa) aus Maus Ascites (gereinigt durch zweimalige Fällung mit 17 % Natriumsulfat) in 0,01 M NaHCO3 pH 9,1 vier Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Perlen wurden mit 0,13 M NaCl und 0,02 M Na-Phosphat pH 7,4 (Lösung PBS) gewaschen und dann mit 5 ml 0,1 % Natriumborhydrid in 0,01 M NaHCO3 für 2 Stunden auf Eis gerührt. Dann wurden die Glasperlen in einer Minisäule zuerst mit 20 ml PBS, dann mit 2 ml 3 M NaSCN und anschließend nochmals mit 20 ml PBS gewaschen.Extraction and enrichment of the pre-s (1> -Polypeptide a) For the An immunoabsorbent was produced to enrich the desired product. 3 g porous aminopropyl glass beads (glass beads containing aminopropyl groups) with 140 nm pore size (Fluka) were treated with 6% glutaraldehyde in 0.3 M NaHCO3 at room temperature Shaken for 30 minutes, washed thoroughly with water and then with 50 mg of the monoclonal Antibody MA18 / 7 (with the constant characteristics immunoglobulin G1 / kappa) from mouse Ascites (purified by double precipitation with 17% sodium sulfate) in 0.01 M NaHCO3 pH 9.1 shaken for four hours at room temperature. The pearls were 0.13M NaCl and 0.02 M Na phosphate pH 7.4 (PBS solution) and then washed with 5 ml 0.1 % Sodium borohydride in 0.01 M NaHCO3 for 2 hours on ice. Then the Glass beads in a mini column first with 20 ml PBS, then with 2 ml 3 M NaSCN and then washed again with 20 ml of PBS.
b) Ein Prä-S(1) exprimierender E.coli Klon, zum Beispiel pKG1 gemäß 3a) oder pKG2 gemäß 3b) wurde über Nacht in LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin kultiviert und 10 ml davon auf 400 LB-Medium mit 1 mM IPTG in einem 2 Liter Kolben überimpft und bei 370 C geschüttelt. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 2,5 wurden die Zellen abzentrifugiert und das Pellet im gleichen Volumen 10 mM Tris HCl pH 7,4, 1 mM EDTA (Pufferlösung TE) suspendiert, mit 5 mg/ml Lysozym und mit 1 % Nonidet P40 in TE versetzt. Nach 10 Minuten auf Eis wurde bei 12000 U/Minute 15 Minuten bei 4" C zentrifugiert. Der Überstand ist klares Lysat.b) A pre-S (1) expressing E. coli clone, for example pKG1 according to 3a) or pKG2 according to 3b) was cultivated overnight in LB medium with 100 g / ml ampicillin and 10 ml of it inoculated into 400 LB medium with 1 mM IPTG in a 2 liter flask and shaken at 370C. At an optical density at 600 nm of 2.5 were the cells centrifuged and the pellet in the same volume 10 mM Tris HCl pH 7.4, 1 mM EDTA (buffer solution TE) suspended, with 5 mg / ml lysozyme and with 1% Nonidet P40 shifted to TE. After 10 minutes on ice at 12,000 rpm it became 15 minutes centrifuged at 4 "C. The supernatant is clear lysate.
c) 6,5 ml klares Lysat wurden im Verlauf von einer Stunde durch 1 ml Immunadsorbens (gemäß a) hergestellt) in eine Minisäule (Maße 5 x 50 mm) gepumpt.c) 6.5 ml of clear lysate were in the course of one hour by 1 ml of immunoadsorbent (produced according to a)) is pumped into a mini column (dimensions 5 × 50 mm).
Die Säule wurde nacheinander mit 2 ml TE, 2 ml 0,5 M NaCl, 20 ml H20 jeweils mit 0,2 % TWEEN 20 gewaschen. Dann wurde das Prä-S(1)-Polypeptid mit 2 ml 3 M NaSCN in TE-Puffer abgelöst, wobei 100 al Fraktionen aufgefangen wurden. Die ersten drei Fraktionen enthalten etwa 10-fach angereichertes Prä-S(1)-Polypeptid in gereinigter Form. Das Eluat wird vereinigt, 2 Stunden gegen PBS-Lösung (0,13 M NaCl + 0,02 M Na-Phosphat pH 7,4) dialysiert und eingefroren. The column was sequentially filled with 2 ml TE, 2 ml 0.5 M NaCl, 20 ml H20 washed with 0.2% TWEEN 20 each. Then the pre-S (1) polypeptide was used 2 ml of 3 M NaSCN dissolved in TE buffer, 100 μl fractions being collected. The first three fractions contain approximately 10-fold enriched pre-S (1) polypeptide in purified form. The eluate is combined, 2 hours against PBS solution (0.13 M NaCl + 0.02 M Na phosphate pH 7.4) dialyzed and frozen.
Das erhaltene Polypeptid hat die Formel I gemäß Anspruch 8, worin X = MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg-OH ist. The polypeptide obtained has the formula I according to claim 8, wherein X = MetGlnTrpLeuProArgAlaPheArg-OH.
Erläuterung von technischen Ausdrücken und Abkürzungen: Tris: Trishydroxymethylaminoethan EDTA: Ethylendiaminotetraessigsäure TE: wässrige Puffermischung, die pro Liter 10 mMol Tris-HCl pH 7,4 und 1 mMol EDTA enthält LB-Medium: Dieses Medium besteht aus 1 % eines pankreatischen Verdaus von Milchcasein (Bactotrypton), 0,5 % Hefeextrakt und 1 % NaCl in destilliertem Wasser und wurde 20 Minuten im Autoklaven auf 1200 C erhitzt PBS: Wässrige Puffermischung, die pro Liter 130 mMol NaCl und 20 mMol Natriumphosphat pH 7,4 enthält.Explanation of technical terms and abbreviations: Tris: Trishydroxymethylaminoethane EDTA: ethylenediaminotetraacetic acid TE: aqueous buffer mixture, which per liter 10 1 mmol Tris-HCl pH 7.4 and 1 mmol EDTA contains LB medium: This medium consists of 1% of a pancreatic digest of milk casein (Bactotrypton), 0.5% yeast extract and 1% NaCl in distilled water and was heated to 1200 for 20 minutes in the autoclave C heated PBS: Aqueous buffer mixture containing 130 mmol NaCl and 20 mmol per liter Contains sodium phosphate pH 7.4.
TWEEN 20: Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat Offener Ableserahmen: Längste mögliche kontinuierliche Abfolge von Codons, die mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stopcodon endet.TWEEN 20: Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate Open reading frame: Longest possible continuous sequence of codons that begins with a start codon and ends with a stop codon.
Codon: Dreiereinheit von Nucleotidbasen, die eine Aminosäure in einer Polypeptidsequenz codieren oder als eines der drei Stopcodons (TAA, TGA, TAG) den Abbruch der Proteinbiosynthese codieren.Codon: three unit of nucleotide bases that form an amino acid in a Encode the polypeptide sequence or as one of the three stop codons (TAA, TGA, TAG) Code termination of protein synthesis.
Startcodon (ATG): Erforderlich für den Beginn der Proteinbiosynthese, codiert auch die Aminosäure Methionin am Aminoende der Proteinsequenz oder innerhalb der Proteinsequenz.Start codon (ATG): Required for the start of protein synthesis, also encodes the amino acid methionine at or within the amino end of the protein sequence the protein sequence.
EcoRI: Restriktionsendonuclease (zum Beispiel Firma BRL) BstEII: Restriktionsendonuclease (zum Beispiel Firma BRL) BGlII: Restriktionsendonuclease (zum Beispiel Firma BRL) Bal31: Doppelstrangspezifische Exonuclease (Firma BRL) Klenow-Polymerase: DNA-Polymerase Fragment nach Klenow (Firma Boehringer-Mannheim) Mung-Bean-Nuclease: Einzelstrangspezifische Exonuclease (Firma PL-Biochemicals) Alul: Restriktionsenzym (Firma BRL) T4-DNA-Ligase: Enzym, das verschiedene DNA-Moleküle verbindet (Firma Biolabs) Sau 96I: Restriktionsendonuclease (Firma New England Biolabs) BamHI: Restriktionsendonuclease (Firma New England Biolabs) HindIII: Restriktionsendonuclease (Firma New England Biolabs) BalI: Restriktionsendonuclease (Firma New England Biolabs) Expressionsplasmid pGL101: Gegenüber seinem Ausgangsplasmid pBR322 ist es durch einen EcoRI-PvuII-Restriktions-Schnitt um 2066 Basen verkürzt. In die entstandene Lücke wurde unter Regenerierung der EcoRI- und PvuII-Stelle ein DNA-Fragment insertiert, das den induzierbaren Lac UV5-Promoter trägt.EcoRI: restriction endonuclease (for example from BRL) BstEII: restriction endonuclease (for example company BRL) BGIII: restriction endonuclease (for example company BRL) Bal31: double-strand-specific exonuclease (from BRL) Klenow polymerase: DNA polymerase Fragment according to Klenow (Boehringer-Mannheim Company) Mung Bean Nuclease: Single-strand-specific Exonuclease (from PL Biochemicals) Alul: restriction enzyme (from BRL) T4 DNA ligase: Enzyme that connects different DNA molecules (company Biolabs) Sau 96I: restriction endonuclease (New England Biolabs) BamHI: restriction endonuclease (New England Biolabs) HindIII: restriction endonuclease (New England Biolabs) BalI: restriction endonuclease (New England Biolabs Company) Expression plasmid pGL101: Compared to its starting plasmid pBR322 it is shortened by 2066 bases by an EcoRI-PvuII restriction cut. The EcoRI and PvuII sites were regenerated into the resulting gap Inserted DNA fragment which carries the inducible Lac UV5 promoter.
Diese Variante des in E.coli natürlich vorkommenden Lac-Promoters kann Gene unabhängig von der Bindung des CAP-Genproduktes exprimieren. This variant of the lac promoter naturally occurring in E. coli can express genes independently of the binding of the CAP gene product.
Literaturstelle: J.Virol. 37 (1981), 683-697. Reference: J. Virol. 1981, 37: 683-697.
Beispiel II Herstellung eines Polypeptids, welches die Prä-S(1)-und die Prä-S(2)-Aminosäuresequenz enthält aus Hepatitis B-Virus (HBV) oder Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg).Example II Preparation of a Polypeptide Comprising the Pre-S (1) and the pre-S (2) amino acid sequence contains from hepatitis B virus (HBV) or hepatitis B virus surface antigen (HBsAg).
Das Peptid gemäß diesem Beispiel ist das Prä-S-Polypeptid, welches aus der Prä-S(1)- und der Prä-S(2)-Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 besteht plus den beiden Aminosäuren Methionin und Glutaminsäure im Anschluß an Prä-S(2).The peptide according to this example is the pre-S polypeptide, which consists of the pre-S (1) and the pre-S (2) amino acid sequence according to FIG. 1 plus the two amino acids methionine and glutamic acid following pre-S (2).
Geeignet sind als Ausgangsmaterial besonders HBV-Partikel oder HBsAg-Filamente, die in üblicher Weise oder wie am Schluß dieses Beispiels angegeben ist gereinigt wurden. Geeignet sind auch gereinigte HBsAg 20 nm Partikel, soweit diese Partikel ausreichende Mengen der Proteine P39 und GP42 enthalten. Der Proteingehalt der jeweiligen Probe wird durch UV-Photometrie bei 280 nm Wellenlänge festgestellt, wobei ein Extinktionskoeffizient von 4,3 für eine Lösung von 1 mg/ml HBV- oder HBsAg-Protein angenommen wurde.HBV particles or HBsAg filaments are particularly suitable as starting material, which is cleaned in the usual way or as indicated at the end of this example became. Purified HBsAg 20 nm particles are also suitable, provided these particles are used Contain sufficient amounts of the proteins P39 and GP42. The protein content of each Sample is determined by UV photometry at 280 nm wavelength, using an extinction coefficient of 4.3 was assumed for a solution of 1 mg / ml HBV or HBsAg protein.
40 Mikrogramm gereinigte HBV-Partikel oder 400 ßg gereinigte HBsAg Filamente oder 4 mg HBsAg 20 nm Partikel in 0,4 ml wässriger Lösung, die 130 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphat pH 7,5 enthält (Pufferlösung PBS) wurde mit 0,1 ml einer wässrigen Lösung von 500 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5 % Natriumdodecylsulfat; 5 % Dithiothreit und danach mit 0,125 mg reiner Protease aus Staphylococcus aureus V8 in 50 Al PBS versetzt.40 micrograms of purified HBV particles or 400 µg of purified HBsAg Filaments or 4 mg HBsAg 20 nm particles in 0.4 ml aqueous solution containing 130 mM NaCl containing 20 mM sodium phosphate pH 7.5 (buffer solution PBS) was mixed with 0.1 ml of a aqueous solution of 500 mM Tris-HCl pH 7.4; 0.5% sodium dodecyl sulfate; 5% dithiothreitol and then with 0.125 mg of pure protease from Staphylococcus aureus V8 in 50 μl of PBS offset.
Das Gemisch wurde bei 370 C inkubiert. Nach 24 Stunden und nach 48 Stunden wurden jeweils weitere 50 al Proteaselösung zugesetzt. Nach 72 Stunden wurde die Lösung mit 0,6 ml einer wässrigen Lösung von 6 % Natriumdodecylsulfat, 10 % Dithiothreit, 140 mM Tris-HCl pH 6,8; 22 % Glycerin; 0,03 % Bromphenolblau versetzt und 5 Minuten auf 950 C erhitzt. Danach wurde die Lösung in Aliquoten von 50 ßl einer Elektrophorese durch 15 %iges Polyacrylamidgel unterzogen. Das Trenngel hatte 1,5 mm Dicke, war 18 cm breit und 24 cm lang. Es hatte am Minuspol 10 Probetaschen. Eine außen liegende Probentasche enthielt ein Proteinmarkergemisch mit bekannten Molgewichten. Das Puffersystem ist von Laemmli beschrieben (Nature Band 227 (1970), Seiten 680 - 685).The mixture was incubated at 370 ° C. After 24 hours and after 48 A further 50 μl of protease solution were added in each case for hours. After 72 hours it was the solution with 0.6 ml of an aqueous solution of 6% sodium dodecyl sulfate, 10% Dithiothreitol, 140 mM Tris-HCl pH 6.8; 22% Glycerin; 0.03% bromophenol blue added and heated to 950 C for 5 minutes. The solution was then aliquoted from 50 μl electrophoresed through 15% polyacrylamide gel. The separation gel was 1.5 mm thick, 18 cm wide and 24 cm long. It had 10 sample pockets on the negative pole. An external sample pocket contained a protein marker mixture with known Molecular weights. The buffer system is described by Laemmli (Nature Volume 227 (1970), Pages 680-685).
Die Elektrophorese erfolgte bei 3 - 6 Volt/cm über Nacht. Dann wurde das Gel entnommen, ein 2 cm breiter Längsstreifen mit einem aufgetrennten Aliquot und den Proteinmarkern ausgeschnitten und mit Silber nach der Methode von Merill et al. (Science 211 (1981) 1437) gefärbt. Durch Vergleich mit den Proteinmarkern bekannten Molgewichts ließ sich die 18 000 Dalton Bande des Prä-S-Fragments im Protease Verdau identifizieren.The electrophoresis was carried out at 3-6 volts / cm overnight. Then became removed the gel, a 2 cm wide longitudinal strip with a separated aliquot and the protein markers cut out and silvered according to the method of Merill et al. (Science 211 (1981) 1437). By comparison with the protein markers known molecular weight, the 18,000 Dalton band of the pre-S fragment in the protease Identify digestion.
Die entsprechende Zone im nicht angefärbten Gelanteil wurde ausgeschnitten, mit einem Zellhomogenisator mit rotierendem Pistill (nach Potter-Elvehjem) zerkleinert und mit 3 Volumina 0,1 M Ammoniumbicarbonatlösung in Wasser 2 Stunden geschüttelt. Nach scharfem Abzentrifugieren (10 000 U/min) wurde der Überstand mit dem Prä-S Proteinfragment gefriergetrocknet.The corresponding zone in the non-stained part of the gel was cut out, comminuted with a cell homogenizer with a rotating pestle (according to Potter-Elvehjem) and shaken with 3 volumes of 0.1 M ammonium bicarbonate solution in water for 2 hours. After vigorous centrifugation (10,000 rpm), the supernatant with the pre-S Protein fragment freeze-dried.
Da das Prä-S Polypeptid mit 18 000 Dalton nur aus den Proteinen P39 und GP42, nicht aber aus den anderen Proteinen des HBV oder HBsAg hervorgeht, muß gesichert sein, daß das Ausgangsmaterial diese Proteine enthält.Since the pre-S polypeptide with 18,000 daltons only consists of the proteins P39 and GP42, but not from the other proteins of HBV or HBsAg, must Be certain that the starting material contains these proteins.
Dies läßt sich am geeignetsten durch analytische Polyacrylamidgelelektrophorese mit 0,75 mm dicken Gelschichten, ansonsten wie vorher beschrieben, feststellen.This can most suitably be done by analytical polyacrylamide gel electrophoresis Determine with 0.75 mm thick gel layers, otherwise as described above.
Wenn man 2 g reines HBsAg-Protein pro Elektrophoresetasche startet, muß in der Silberfärbung bei den Positionen von etwa 39 000 und 42 000 Dalton eine deutlich erkennbare gefärbte Bande erkennbar werden.If you start 2 g of pure HBsAg protein per electrophoresis bag, must be one in the silver coloring at the positions of about 39,000 and 42,000 daltons clear recognizable colored bands become recognizable.
Die Reinigung der HBV-Partikel und der HBs-Filamente erfolgte auf folgende Weise: Menschliches Blutplasma (etwa 150 ml) mit mehr als 108 Hepatitis B-Viren pro ml wurde mit TNE-Puffer (0,13 M NaCl, 10 mM Trishydroxyaminomethan HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA in Wasser) durch eine Chromatographiesäule (10 cm dick, 100 cm lang) mit perlförmigem 6 %igen Agarosegel (zum Beispiel Biogel A5M) gepumpt. Die aufgefangenen 500 Fraktionen von 15 ml wurden auf virales Core Antigen mit dem Enzymimmuntest (J.Virol. Band 42, 1982, Seite 761) untersucht, wobei die Virushülle vor dem Test durch Behandlung mit 0,5 % Nonidet P40 und 0,3 % B-Mercaptoethanol (jeweils Endkonzentration) vorher abgespalten wurde. Die positiven Fraktionen wurden vereinigt und je 30 ml davon in 10 bis 12 Zentrifugenröhrchen mit 38 ml Fassungsvermögen auf 8 ml 30 %ige Saccharoselösung in TNE-Puffer (Gewicht/Gewicht) geschichtet. Die Röhrchen wurden im Schwingbecherrotor (zum Beispiel SW28 der Firma Beckmann) 24 Stunden bei 25 000 U/min und 100 C zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Sediment von je 6 Röhrchen in 1 ml TNE-Puffer suspendiert. Diese Virus suspension wurde auf einen Saccharose-Konzentrationsgradienten von 30 bis 55 % in TNE-Puffer in einem 13 ml Zentrifugenröhrchen (zum Beispiel für den Rotor SW 42 Ti der Firma Beckmann) geschichtet und 20 Stunden bei 34 000 U/min und'100 C zentrifugiert. Es wurden Fraktionen von 400 ßl nach Anstechen des Röhrchenbodens gesammelt, 25 iil Anteile der Fraktionen wurden quantitativ auf Core-Antigen (nach dem oben angegebenen Enzymimmuntest) und HBsAg (analog dem oben angegebenen Enzymimmuntest) untersucht. Die Fraktion mit der maximalen Core-Antigenaktivität enthält vorwiegend Hepatitis B-Virus-Partikel (HBV-Partikel) und kaum anderes Protein. Die HBsAg Peakfraktion besteht vorwiegend aus HBsAg Filamenten.The HBV particles and the HBs filaments were cleaned on the following way: human blood plasma (about 150 ml) with more than 108 hepatitis B viruses per ml were treated with TNE buffer (0.13 M NaCl, 10 mM trishydroxyaminomethane HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA in water) through a chromatography column (10 cm thick, 100 cm long) with a pearl-shaped 6% agarose gel (for example Biogel A5M). the 500 fractions of 15 ml collected were tested for viral core antigen using the enzyme immunoassay (J.Virol. Volume 42, 1982, page 761) examined, with the virus envelope before the test by treatment with 0.5% Nonidet P40 and 0.3% B-mercaptoethanol (final concentration in each case) was previously split off. The positive fractions were pooled and 30 ml each of which in 10 to 12 centrifuge tubes with 38 ml capacity to 8 ml 30% Sucrose solution layered in TNE buffer (w / w). The tubes were in the swinging bucket rotor (for example SW28 from Beckmann) 24 hours at 25,000 Rpm and 100 C centrifuged. The supernatant was completely removed, the sediment suspended from 6 tubes in 1 ml TNE buffer. This virus suspension was on a sucrose concentration gradient of 30 to 55% in TNE buffer in one 13 ml centrifuge tube (e.g. for the Beckmann SW 42 Ti rotor) layered and centrifuged at 34,000 rpm and 100 ° C. for 20 hours. It became factions of 400 μl collected after piercing the bottom of the tube, 25 parts of the fractions were quantitative for core antigen (according to the enzyme immunoassay given above) and HBsAg (analogous to the enzyme immunoassay given above) investigated. The faction with of the maximum core antigen activity contains predominantly hepatitis B virus particles (HBV particles) and hardly any other protein. The HBsAg peak fraction consists predominantly made of HBsAg filaments.
Beispiel III Monoklonale Antikörper gegen Prä-S(1) a) Reinigung von Hepatitis B-Viren und Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg): Menschliches Blutplasma (etwa 150 ml) mit mehr als 108 Hepatitis B-Viren pro ml wurde mit TNE-Puffer (0,13 M NaCl, 10 mM Trishydroxymethylaminoethan HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA in Wasser) durch eine Chromatographiesäule (10 cm dick, 100 cm lang) mit perlförmigem 6 %igen Agarosegel (zum Beispiel Biogel A5M) gepumpt. Die aufgefangenen 500 Fraktionen von 15 ml wurden auf virales Core Antigen mit dem Enzymimmuntest (J.Virol. Band 42, 1982, Seite 761) untersucht, wobei die Virushülle vor dem Test durch Behandlung mit 0,5 % Nonidet P40 und 0,3 % B-Mercaptoethanol (jeweils Endkonzentration) vorher abgespalten wurde. Die positiven Fraktionen wurden vereinigt und je 30 ml davon in 10 bis 12 Zentrifugenröhrchen mit 38 ml Fassungsvermögen auf 8 ml 30 %ige Saccharoselösung in TNE-Puffer (Gewicht/Gewicht) geschichtet. Die Röhrchen wurden im Schwingbecherrotor (zum Beispiel SW28 der Firma Beckmann) 24 Stunden bei 25 000 U/min und 10° C zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Sediment von je 6 Röhrchen in 1 ml TNE-Puffer suspendiert. Diese Virussuspension wurde auf einen Saccharose-Konzentrationsgradienten von 30 bis 55 % in TNE-Puffer in einem 13 ml Zentrifugenröhrchen (zum Beispiel für den Rotor SW 42 Ti der Firma Beckmann) geschichtet und 20 Stunden bei 34 000 U/min und 10° C zentrifugiert. Es wurden Fraktionen von 400 Al nach Anstechen des Röhrchenbodens gesammelt, 25 ßl Anteile der Fraktionen wurden quantitativ auf Core-Antigen (nach dem oben angegebenen Enzymimmuntest) und HBsAg (analog dem oben angegebenen Enzymimmuntest) untersucht. Die Fraktion mit der maximalen Core-Antigenaktivität enthält vorwiegend Hepatitis B-Virus-Partikel (HBV-Partikel) und kaum anderes Protein. Die HBsAg Peakfraktion besteht vorwiegend aus HBsAg Filamenten.Example III Monoclonal Antibodies Against Pre-S (1) a) Purification of Hepatitis B Virus and Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg): Human blood plasma (about 150 ml) with more than 108 hepatitis B viruses per ml was treated with TNE buffer (0.13 M NaCl, 10 mM trishydroxymethylaminoethane HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA in water) a chromatography column (10 cm thick, 100 cm long) with a pearl-shaped 6% agarose gel (for example Biogel A5M). The collected 500 fractions of 15 ml were for viral core antigen with the enzyme immunoassay (J.Virol. Volume 42, 1982, page 761) examined, with the virus envelope before the test by treatment with 0.5% Nonidet P40 and 0.3% B-mercaptoethanol (each final concentration) was previously split off. The positive fractions were pooled and 30 ml each in 10 to 12 centrifuge tubes with 38 ml capacity to 8 ml 30% sucrose solution in TNE buffer (weight / weight) layered. The tubes were placed in a vibrating bucket rotor (for example SW28 from the company Beckmann) centrifuged at 25,000 rpm and 10 ° C for 24 hours. The supernatant was completely removed, the sediment of 6 tubes each suspended in 1 ml TNE buffer. This virus suspension was on a sucrose concentration gradient of 30 up to 55% in TNE buffer in a 13 ml centrifuge tube (e.g. for the Rotor SW 42 Ti from Beckmann) layered and 20 hours at 34,000 rpm and Centrifuged 10 ° C. There were fractions of 400 μl after piercing the bottom of the tube collected, 25 μl portions of the fractions were quantitatively determined for core antigen (according to the enzyme immunoassay given above) and HBsAg (analogous to the one above specified enzyme immunoassay). The fraction with the maximum core antigen activity contains mainly hepatitis B virus particles (HBV particles) and hardly any other protein. The HBsAg peak fraction consists mainly of HBsAg filaments.
b) Herstellung des Zellklons Go 1/A 18/7-1 0,5 ml der gemäß a) erhaltenen Fraktionen, die vorwiegend HBV-Partikel enthalten, wurden gegen physiologische NaCl-Lösung dialysiert und mit 0,5 ml komplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert und intraperitoneal in eine Maus des Stamms Balb/c injiziert. Nach 4 Wochen wurden 0,5 ml HBV-Partikel in inkomplettem Frend'schen Adjuvans (ohne Mycobakterien) erneut injiziert. Vier Tage später wurde die Milz der Maus entnommen, zerkleinert und nach bekannten Methoden (siehe die Broschüre: Hybridoma Techniques, Verlag Cold Spring Harbor Laboratory, 1980, Cold Spring Harbor, Staat New York, USA) mit Maus Myelom Zellen des Typs P3X68-Ag8.653 (J.Immunol.b) Production of the cell clone Go 1 / A 18 / 7-1 0.5 ml of the one obtained according to a) Fractions that predominantly contain HBV particles were countered against physiological NaCl solution dialyzed and emulsified with 0.5 ml of complete Freund's adjuvant and intraperitoneally injected into a mouse of the Balb / c strain. After 4 weeks, 0.5 ml of HBV particles became re-injected in incomplete Frend's adjuvant (without mycobacteria). Four Days later, the mouse's spleen was removed, minced, and using known methods (see the brochure: Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980, Cold Spring Harbor, New York State, USA) with mouse myeloma cells of the type P3X68-Ag8.653 (J. Immunol.
Band 23 (1980), Seite 1548) fusioniert. Die Hybridzellen wurden nach bekannten Methoden (siehe die zuvor genannte Broschüre Hybridoma Techniques) kloniert (Methode der limitierenden Verdünnung), selektioniert und kultiviert. Um die Zellklone zu identifizieren, die Antikörper gegen Hepatitis B-Virus produzieren, wurde die Zellkulturflüssigkeit (das heißt der Überstand der Klone) in Mikrotiternäpfe gegeben, die wie folgt vorbehandelt waren: HBV-Partikel wurden in 20 mM Natriumphosphat pH 7,4 auf 1:100 verdünnt und jeweils 50 Mikroliter dieser verdünnten HBV-Mischung in die Mikrotiternäpfe gegeben; nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde die HBV-Mischung entfernt. Anschließend wurden 100 Mikroliter einer 1 %igen Rinderserumalbumin-Lösung in der Pufferlösung PBS (130 mM NaCl, 20 mM Natriumphoshat pH 7,5) für 2 Stunden in die Mikrotiternäpfe gegeben, dann entfernt und die Näpfe 3 mal mit PBS-Pufferlösung gewaschen. Die Bindung der Antikörper wurde nach Zugabe von Peroxidase markiertem anti-Maus Immunglobulin durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht (siehe die Broschüre Hybridoma Techniques). Die Klone, wo der Überstand eine kräftige Farbreaktion ergab, wurden in größere Kulturgefäße verbracht und darauf geprüft, ob sie mit Prä-S(1)-Polypeptiden (zum Beispiel mit den Peptiden P39 beziehungsweise GP42) reagieren, jedoch nicht mit dem Polypeptid GP33 (Virology, Band 123, 1982, Seiten 436 - 442). Zwei Klone erfüllten diese Voraussetzungen. Einer davon, der als Klon Go 1 A18/7-1 bezeichnet wird, wurde rekloniert und in größeren Kulturen oder in Mäusen (Balb/c) als Ascites-Tumor vermehrt.Volume 23 (1980), page 1548) merged. The hybrid cells were after known methods (see the aforementioned brochure Hybridoma Techniques) cloned (Limiting dilution method), selected and cultivated. To the cell clones to identify those who produce antibodies to hepatitis B virus was the Cell culture fluid (i.e. the supernatant of the clones) is placed in microtiter wells, which were pretreated as follows: HBV particles were in 20 mM sodium phosphate pH 7.4 diluted to 1: 100 and 50 microliters each of this diluted HBV mixture placed in microtiter wells; after 4 hours at room temperature the HBV mixture became removed. Then 100 microliters of a 1% bovine serum albumin solution were added in the buffer solution PBS (130 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate pH 7.5) for Put in the microtiter wells for 2 hours, then removed and the wells with 3 times Washed PBS buffer solution. The binding of the antibodies was increased after the addition of peroxidase labeled anti-mouse immunoglobulin made visible by a color reaction (see the Hybridoma Techniques brochure). The clones where the supernatant gave a strong color reaction were transferred to larger culture vessels and checked for whether they were contaminated with pre-S (1) polypeptides (for example with the peptides P39 or GP42) react, but not with the polypeptide GP33 (Virology, vol. 123, 1982, pages 436-442). Two clones met these requirements. One of them, called clone Go 1 A18 / 7-1 was recloned and found in larger cultures or in mice (Balb / c) as an ascites tumor increased.
Der Klon Go 1 A18/7-1 produziert den Antikörper MA 18-7.The clone Go 1 A18 / 7-1 produces the antibody MA 18-7.
Der Antikörper befindet sich in der Zellkulturflüssigkeit oder in 1000fach höherer Konzentration in der Ascites Flüssigkeit. (Die Vermehrung in Mäusen erfolgt nach: Kennett, R.H., McKearn, T.J., Bechtol, K.D., Editors, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: a new dimension in biological analyses, Plenum Press New York und London, 1982, Seiten 403-404). Der Klon Go 1 A18/7-1 produziert ein Immunglobulin mit den konstanten Eigenschaften IgG1, kappa, das sich spezifisch an P39/GP42 in HBV-Partikeln, HBsAg Filamenten und 20 nm Partikeln und an Prä-S(1)-Polypeptid bindet. Auch an P39/GP42, das durch Detergentien, Reduktionsmittel und Hitze denaturiert wurde, bindet sich der Antikörper MA18/7. Spaltet man P39/GP42 mit V8 Protease, so bindet sich der Antikörper spezifisch an das Prä-S(1)-Polypeptid mit der Masse 18 000 Dalton.The antibody is located in the cell culture fluid or in 1000 times higher concentration in the ascites fluid. (Propagation in mice is based on: Kennett, R.H., McKearn, T.J., Bechtol, K.D., Editors, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: a new dimension in biological analyzes, Plenum Press New York and London, 1982, pages 403-404). The clone Go 1 A18 / 7-1 produces an immunoglobulin with the constant properties of IgG1, kappa, which specifically binds to P39 / GP42 in HBV particles, HBsAg filaments and 20 nm particles and binds to pre-S (1) polypeptide. Also on P39 / GP42 that has been denatured by detergents, reducing agents and heat, the antibody MA18 / 7 binds. If P39 / GP42 is cleaved with V8 protease, it binds the antibody specifically binds to the pre-S (1) polypeptide with a mass of 18,000 daltons.
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