DE3433021A1 - Process for obtaining the globular domain of basement membrane collagen and immunological determination of basement membrane material and autoantibodies - Google Patents

Abstract

The human globular basement membrane collagen domain NC1 can be obtained by subjecting human or animal tissue to a first limiting treatment with bacterial collagenase, separating the resulting breakdown products from non-collagenous proteins by chromatography on weakly basic anion exchanger, then subjecting the collagenous breakdown products to a second collagenase breakdown at elevated temperature and purifying the globular domain NC1 by molecular sieve fractionation, and it has a molecular weight of about 170,000 dalton determined by ultracentrifugation, a hexameric structure with monomeric subunits of molecular weight about 28,000 dalton and a carbohydrate content of about 2%. It is suitable for the determination of basement membrane collagen in body fluids on use of antibodies thereof and for the detection of antibodies directed against the latter in body fluids.

Description

Verfahren zur Gewinnung der globulären Domäne vonMethod for obtaining the globular domain of

Basalmembrankollagen und immunologische Bestimmung von Basalmembranmaterial und Autoantikörpern Beschreibung Die Erfindung betrifft die humane globuläre Domäne NC1 von Basalmembrankollagen (Typ IV), ein einfaches Verfahren zur Isolierung der Domäne NC1 aus verschiedenen menschlichen und tierischen Geweben und die Verwendung des erwähnten humanen Proteinfragments zur immunologischen Bestimmung von Basalmembrankomponenten in Körperflüssigkeiten und von Autoimmunreaktionen gegen Basalmembranen.Basement membrane collagen and immunological determination of basement membrane material and autoantibodies Description The invention relates to human basement membrane collagen (type IV) globular domain NC1, a simple procedure for the isolation of the domain NC1 from various human and animal tissues and the use of said human protein fragment for immunological determination of basement membrane components in body fluids and of autoimmune reactions against Basement membranes.

Bei einer großen Zahl von z. T. sehr häufigen Erkrankungen (Diabetes, Vasculitis, Mephropathien, Neurofibrom, Leberfibrose, epitheliale Tumoren) kommt es zu einer Veränderung in Basalmembranen (Verdickung, Auflösung) vor allem in den Gefäßwänden. Diese Veränderungen stellen oft letale Komplikationen dar Der Nachweis solcher Veränderungen kann mittels Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz erfolgen, erfordert jedoch Biopsiematerial und erlaubt nur qualitative Aussagen. Es konnte kürzlich an entsprechenden Tiermodellen (z. B.With a large number of z. T. very common diseases (diabetes, Vasculitis, mephropathies, neurofibroma, liver fibrosis, epithelial tumors) there is a change in basement membranes (thickening, dissolution) especially in the Vessel walls. These changes often represent fatal complications. Evidence such changes can be made using electron microscopy or immunofluorescence, however, requires biopsy material and only allows qualitative statements. It could recently on corresponding animal models (e.g.

Streptozotozin-Diabetes der Ratte) gezeigt werden, daß sich solche Basalmembranveränderungen relativ früh in einer Erhöhung von Basalmembrankomponenten in der Zirkulation oder in anderen Körperflüssigkeiten manifestieren.Streptozotocin diabetes in the rat) have been shown to be such Basement membrane changes relatively early in an increase in basement membrane components manifest in the circulation or in other body fluids.

Eine weitere Form von pathologischen Basalmembranveränderungen beruht auf Autoimmunreaktionen gegen körpereigene Basalmembranproteine, die über Nachfolgereaktionen (Entzündung, proteolytischer Abbau) zu einer Beeinträchtigung der Funktion von Basalmembranen in verschiedenen Organen (z. B. Niere, Lunge) führen kann.Another form of pathological basement membrane changes is based on autoimmune reactions against the body's own basement membrane proteins, which via subsequent reactions (Inflammation, proteolytic degradation) to an impairment of the function of basement membranes in various organs (e.g. kidneys, lungs).

Solche Erkrankungen sind beim Menschen verschiedene chronische Nierenerkrankungen, multiple Sklerose, Diabetes und einige seltene Erkrankungen wie Goodpasture Syndrom und bullöses Pempbigoid. Es ist zu vermuten, daß viele dieser Autoimmunreaktionen infolge des Mangels an geeigneten empfindlichen Testverfahren bisher nicht entdeckt wurden. Zahlreiche Tierversuche zeigten jedoch, daß einige der Basalmembrankomponenten autoantigene Eigenschaften besitzen, oder daß Antikörper gegen diese Proteine pathologische Veränderungen bewirken.Such diseases are various chronic kidney diseases in humans, multiple sclerosis, diabetes and some rare diseases like Goodpasture Syndrome and bullous pempbigoid. It is believed that many of these autoimmune reactions not yet discovered due to the lack of suitable sensitive test procedures became. However, numerous animal experiments have shown that some of the basement membrane components have autoantigenic properties, or that antibodies against these proteins are pathological Bring about change.

Basalmembrankollagen (Typ IV) ist eine in allen Basalmembranen vorkommende Komponente, und neben anderen Funktionen vor allem für die mechanische Stabilität dieser Strukturen verantwortlich. Eine erhöhte Synthese oder Zerstörung von Basalmembranen sollte daher mit einem erhöhten Auftreten von Strukturen des Basalmembrankollagens, z. B. in der Zirkulation verbunden sein.Basement membrane collagen (type IV) is found in all basement membranes Component, and among other functions, primarily for mechanical stability responsible for these structures. An increased synthesis or destruction of basement membranes should therefore be associated with an increased occurrence of structures of the basement membrane collagen, z. B. be connected in the circulation.

Basalmembrankollagen mit einem Molekulargewicht von ca.Basement membrane collagen with a molecular weight of approx.

600 000 besteht aus verschiedenen strukturellen Domänen: einer ca. 330 nm langen Tripelhelix, einer weiteren kurzen (60 nm) Tripelhelix (7S-Domäne) und einer globulären Domäne NC1. Der größte Teil des Basalmembrankollagens des Gewebes ist infolge kovalenter Quervernetzungen unlöslich. Diese Quervernetzungen werden nach Assoziation der Moleküle zu großen, vermutlich regulären Netzwerken ausgebildet. Die Assoziation erfolgt dabei über die 7S-Domäne und die globuläre Domäne NC1, wobei jeweils vier bzw. zwei Moleküle miteinander verknüpft werden. Infolge dieser Anordnung ist die globuläre Domäne NC1 des Gewebekollagens jeweils das Assoziat aus zwei verschiedenen Molekülen.600,000 consists of different structural domains: one approx. 330 nm long triple helix, another short (60 nm) triple helix (7S domain) and a globular domain NC1. Most of the basement membrane collagen in the tissue is insoluble due to covalent cross-links. These cross-links are formed into large, presumably regular networks after association of the molecules. The association takes place via the 7S domain and the globular domain NC1, where four or two molecules are linked together. As a result of this arrangement the globular domain NC1 of the tissue collagen is the associate of two different ones Molecules.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die humane globuläre Basalmembrankollagen-Domäne NC1 zur Verfügung zu stellen, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Isolierung der globulären Domäne NC1 von Basalmembrankollagen zu entwickeln und dieses Material humanen Ursprungs nach entsprechender Markierung zum empfindlichen und quantitativen Nachweis von Basalmembrankollagen in Körperflüssigkeiten einzusetzen.The invention is based on the object, the human globular To provide basement membrane collagen domain NC1, a generally applicable To develop a method for the isolation of the globular domain NC1 from basement membrane collagen and this material of human origin after appropriate labeling for sensitive and quantitative detection of basement membrane collagen in body fluids.

Gleichzeitig soll es die Erfindung ermöglichen, biologische Flüssigkeiten oder Gewebe auf das Vorliegen von Autoantikörpern oder autoreaktiven Immunzellen zu untersuchen.At the same time, the invention should enable biological fluids or tissue for the presence of autoantibodies or autoreactive immune cells to investigate.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch humane globuläre Basalmembrankollagen-Domäne NC1, welche ein Molekulargewicht von etwa 170000 Dalton, bestimmt durch Gleichgewichts-Ultrazentrifugation und Lichtstreuung, hexamere Struktur mit monomeren Untereinheiten von Molekulargewicht etwa 28000 Dalton und einem Kohlenhydratgehalt von etwa 2 % aufweist.According to the invention, this object is achieved by human globular basement membrane collagen domains NC1, which has a molecular weight of about 170,000 Daltons as determined by equilibrium ultracentrifugation and light scattering, hexameric structure with monomeric subunits of molecular weight about 28,000 daltons and a carbohydrate content of about 2%.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der globulären Basalmembrankollagen-Domäne NC1, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man menschliches oder tierisches Gewebe einer ersten limitierenden Behandlung mit bakterieller Kollagenase unterwirft, die erhaltenen Abbauprodukte durch Chromatographie an schwach basischem Anionenaustauscher von nichtkollagenen Proteinen abtrennt, die kollagenen Abbauprodukte dann einem zweiten Kollagenaseabbau bei erhöhter Temperatur unterwirft und die globuläre Domäne NC1 durch Molekularsiebfraktionierung reinigt.Another object of the invention is a method of extraction and purification of the globular basement membrane collagen domain NC1, which is characterized by is that human or animal tissue is given a first limiting treatment with bacterial collagenase subjects the degradation products obtained by chromatography separates from non-collagenous proteins on a weakly basic anion exchanger, the collagen breakdown products then undergo a second breakdown of collagenase at an elevated temperature and purifies the globular domain NC1 by molecular sieve fractionation.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung der globulären Domäne NC1 geht direkt von den Geweben aus und verzichtet auf eine vorherige Reinigung der Basalmembranen, die üblicherweise sehr verlustreich ist.The inventive method for purifying the globular domain NC1 starts directly from the fabric and does not need to be cleaned beforehand the basement membrane, which is usually very lossy.

Wesentlich ist eine erste nimitierte Behandlung des Gewebes mit bakterieller Kollagenase, die die globuläre Domäne und große Stücke der kollagenen Tripelhelix in intakter Form aus dem Material herauslöst. Diese Komponenten lassen sich dann leicht, z. B. an DEAE Zellulose von begleitenden nicht-kollagenen Proteinen (z. B.A first nimitated treatment of the tissue with bacterial is essential Collagenase, which is the globular domain and large pieces of the collagen triple helix dissolves out of the material in intact form. These components can then easy, e.g. B. DEAE cellulose from accompanying non-collagenous proteins (e.g. B.

Laminin) abtrennen. Der zweite unter verschärften Bedingungen durchgeführte Kollagenaseabbau zerstört dann alle kollagenen, tripelhelikalen Strukturen mit Ausnahme der quervernetzten 7S-Domäne und der globulären Domäne NC1. Beide Komponenten lassen sich voneinander und von begleitenden Abbaupeptiden in einem einzigen Molekularsiebschritt (z. B. an Agarose) separieren und werden dann mit hoher Reinheit erhalten.Separate laminin). The second carried out under more severe conditions Collagenase breakdown then destroys all collagenous, triple-helical structures with the exception the cross-linked 7S domain and the globular domain NC1. Leave both components from each other and from accompanying degradation peptides in a single molecular sieve step (e.g. on agarose) and are then obtained with high purity.

Das Verfahren läßt sich auf verschiedene Gewebe anwenden, wobei bevorzugt menschliche Placenta, Niere oder Lunge eingesetzt wird. Die Ausbeute an globulärer Domäne NC1 beträgt dabei im Durchschnitt 20 mg pro kg Feuchtgewebe. Das Verfahren läßt sich auch auf tierische Gewebe anwenden, z. B. auf Rinderaorta bzw. das EHS Sarkom der Maus.The method can be applied to different tissues, preferred human placenta, kidney or lungs. The yield of globular Domain NC1 averages 20 mg per kg of wet tissue. The procedure can also be applied to animal tissues, e.g. B. on bovine aorta or the EHS Mouse sarcoma.

Zweckmäßig geht man beim Verfahren der Erfindung von einem Gewebe aus, welches in salzhaltiger Pufferlösung homogenisiert wurde. Ferner ist es von Vorteil für die spätere Reinigung von NC1, das Gewebe vor der ersten Kollagenasebehandlung mit Guanidinhydrochlorid in Anwesenheit eines Proteaseinhibitors zu extrahieren.The method of the invention expediently starts with a fabric from which was homogenized in a salt-containing buffer solution. Furthermore, it is from Advantage for the later cleaning of NC1, the tissue before the first collagenase treatment to extract with guanidine hydrochloride in the presence of a protease inhibitor.

Besonders bewährt hat sich dabei eine Extraktion mit einer etwa 0,5 M KC1 und danach mit einer etwa 6 M Guanidin enthaltenden Lösung.An extraction with an approximate value of 0.5 has proven to be particularly effective M KC1 and then with a solution containing about 6 M guanidine.

Diese Schritte entfernen einen beträchtlichen Teil der Begleitproteine, ohne daß es dabei zu einer Auflösung oder Zerstörung der globulären Domäne NCl kommt.These steps remove a significant amount of the accompanying proteins, without the globular domain NCl being dissolved or destroyed.

Die erste Kollagenasebehandlung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 250C durchgeführt. Die zweite, nicht limitierte Kollagenasebehandlung hingegen wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 450C durchgeführt.The first collagenase treatment is preferably at one temperature carried out from 15 to 250C. The second, unlimited collagenase treatment on the other hand, it is preferably carried out at a temperature of 30 to 450C.

Die globuläre Domäne NC1 ist nach der Reinigung in der Ultrazentrifuge einheitlich und besitzt ein Molekulargewicht von 170.000. Die Struktur ist prinzipiell ein Hexamer, wobei die monomeren Untereinheiten ein Molekulargewicht von 28.000 aufweisen. Der größte Teil der Monomeren ist jedoch über Disulfidbrücken oder andere kovalente Quervernetzungen zu dimeren Untereinheiten vereinigt. Das verursacht ein charakteristisches Elektrophoresemuster (in Gegenwart von Na-Dodecylsulfat) von ein bis zwei Monomerenbanden und zwei, üblicherweise stärkeren Dimerenbanden. Diese hexamere Struktur ist unter physiologischen Bedingungen (z. B. neutrale Puffer) stabil auch gegen proteolytischen Abbau. Eine Dissoziation in die Untereinheiten erfolgt bei saurem pH oder in Gegenwart von 8 M Harnstoff. Diese Dissoziation ist weitgehend reversibel. Dialyse gegen neutrale Puffer erlaubt die Rekonstitution zu einer hexameren globulären Struktur.The globular domain NC1 is in the ultracentrifuge after purification uniform and has a molecular weight of 170,000. The structure is fundamental a hexamer, with the monomeric subunits having a molecular weight of 28,000 exhibit. Most of the monomers, however, are via disulfide bridges or others covalent cross-links combined to form dimeric subunits. That caused a characteristic electrophoresis pattern (in the presence of Na dodecyl sulfate) of one to two monomer bands and two, usually stronger, dimer bands. These hexameric structure is under physiological conditions (e.g. neutral buffer) stable also against proteolytic degradation. A dissociation into the subunits takes place at acidic pH or in the presence of 8 M urea. This dissociation is largely reversible. Dialysis against neutral buffers allows reconstitution to a hexameric globular structure.

Die Aminosäurezusammensetzungen der globulären Domäne NC1 aus menschlicher Placenta, Niere oder Lunge sind sehr ähnlich (Tabelle). Der Kohlenhydratgehalt des Materials ist gering (20 %) und beinhaltet sowohl Glukosamin als auch Galaktosamin. Die verschiedenen Untereinheiten der Struktur können sowohl von der 1(IV)- und 2(IV)-Kette des Basalmembrankollagens stammen, die sich in ihren Anfangssequenzen unterscheiden.The amino acid compositions of the globular domain NC1 from human The placenta, kidney or lungs are very similar (table). The carbohydrate content of the Materials is low (20%) and contains both glucosamine and galactosamine. The different Subunits of the structure can be from both of the 1 (IV) and 2 (IV) chains of the basement membrane collagen, which are located in their Differentiate initial sequences.

Diese Basalmembranstruktur NC1, die im folgenden als Antigen bezeichnet wird, ermöglicht die erfindungsgemäße Bestimmung von Basalmembrankollagen im Blut und anderen Körperflüssigkeiten unter Anwendung von an sich bekannten immunologischen Nachweismethoden. Diese Methoden beruhen auf der Konkurrenz einer bekannten Menge markierten Antigens mit einer unbekannten Menge des Antigens in der zu untersuchenden Probe um den gemeinsamen Antikörper. Es können dabei sowohl bekannte Varianten des Radioimmuntests (RIA) als auch des Enzymimmuntests (EIA) eingesetzt werden. Derartige Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden im einzelnen nicht nochmals aufgeführt. Alle diese Verfahren beruhen darauf, daß man mit dem hochgereinigten Antigen in geeigneten Versuchstieren Antiseren (Antikörper) herstellt, und mit diesen oder auch spezifisch isolierten Antikörpern durch entsprechende Inkubation der Reaktionspartner die übliche Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion ablaufen läßt. Je nach der-Menge des in der zu untersuchenden Probe einer Körperflüssigkeit vorhandenen nichtmarkierten Antigens wird nur ein Teil des markierten Antigens in diesem Komplex gebunden und kann entweder durch Isolierung des Komplexes oder im Uberstand gemessen werden. Da die Menge des im Komplex gebundenen markierten Antigens von der Menge des nicht-markierten Antigens abhängig ist, kann auf diese Weise der Gehalt an Basalmembrankollagen bzw. der Domäne NC1 in der Körperflüssigkeit bestimmt werden.This basement membrane structure NC1, hereinafter referred to as the antigen enables the determination of basement membrane collagen in the blood according to the invention and other body fluids using immunological ones known per se Detection methods. These methods rely on competition from a known crowd labeled antigen with an unknown amount of the antigen in the test Sample around the common antibody. Both known variants of the Radioimmunoassays (RIA) as well as the enzyme immunoassay (EIA) can be used. Such Methods are known to the person skilled in the art and are not listed again in detail. All of these methods are based on the fact that one with the highly purified antigen in suitable test animals produces antisera (antibodies), and with these or also specifically isolated antibodies by appropriate incubation of the reaction partners allows the usual antibody-antigen complexation reaction to proceed. Depending on the amount of the unmarked present in the sample of a body fluid to be examined Antigen is bound and only part of the labeled antigen in this complex can be measured either by isolating the complex or in the supernatant. Since the amount of labeled antigen bound in the complex depends on the amount of unlabeled Antigen-dependent, the content of basement membrane collagen or the domain NC1 in the body fluid can be determined.

Die Herstellung der Antiseren kann in üblicher Weise durch subkutane Injektion von Versuchstieren, vorzugsweise Kaninchen, erfolgen. Zweckmäßig wird dabei das Antigen zusammen mit kompletten Freund'schen Adjuvans appliziert. Als ausreichend erweist sich dabei die zweimalige Injektion von 0,1 bis 0,2 mg der globulären Domäne NC1 als Antigen. Das gebildete Antiserum wird dann wie üblich gewonnen und kann als solches verwendet werden. Es ist auch möglich, die im Serum vorhandenen Antikörper nach Methoden der Affinitätschromatographie zu reinigen.The antisera can be prepared in the usual way by subcutaneous Injection of test animals, preferably rabbits, take place. Will be expedient the antigen is applied together with complete Freund's adjuvant. as Two injections of 0.1 to 0.2 mg of the globular have proven to be sufficient Domain NC1 as an antigen. The antiserum formed is then obtained as usual and can be used as such. It is also possible to use those present in the serum Purify antibodies by affinity chromatography methods.

Die Markierung des Antigens kann prinzipiell mit bekannten Methoden der Einführung des Radionuklids Jod 125 in Proteine erfolgen. Dabei erweist sich die Markierung der globulären Domäne mit dem Bolton-Hunter-Reagenz (Biochem. J. 133, 529-539, 1973) als besonders vorteilhaft. Die Markierung nach der Chloramin T Methode verläuft weniger erfolgreich und produziert markierte Antigene, die nur noch 20 bis 50 % an den Antikörper binden.In principle, the antigen can be labeled using known methods the introduction of the radionuclide iodine 125 into proteins. It turns out labeling of the globular domain with the Bolton-Hunter reagent (Biochem. J. 133, 529-539, 1973) as particularly advantageous. The mark after the chloramine T method is less successful and only produces labeled antigens still bind 20 to 50% to the antibody.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Bestimmung besteht darin, die Trennung des mit dem spezifischen Antiserum gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes von nichtgebundenem Antigen durch Verwendung eines zweiten Antikörpers (Antiserums) durchzuführen.There is a preferred embodiment of the determination according to the invention therein, the separation of the antigen-antibody complex formed with the specific antiserum of unbound antigen by using a second antibody (antiserum) perform.

Bevorzugt wird hierbei als zweiter Antikörper ein Antiserum gegen Immunglobulin G der für die Gewinnung des Antiserums verwendeten Tierart eingesetzt. Die Trennung des damit in unlösliche Form überführten Antigen-Antikörper-Komplexes von der Lösung kann nach hierfür üblichen Methoden, wie z. B. Abzentrifugieren, erfolgen. Nach Abtrennung der Antigen-Antikörper-Komplexe wird die Markierung (Radioaktivität, Enzymaktivität), die im Komplex gebunden ist, gemessen. Anhand einer Eichkurve, die mittels Proben von bekanntem Antigengehalt erstellt wurde, läßt sich dann die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Menge an Antigen feststellen.In this case, an antiserum against is preferred as the second antibody Immunoglobulin G of the animal species used to obtain the antiserum is used. The separation of the antigen-antibody complex thus converted into insoluble form from the solution can for this purpose conventional methods, such as. B. centrifugation, take place. After separating the antigen-antibody complexes, the marking (radioactivity, Enzyme activity), which is bound in the complex, measured. Using a calibration curve, which was created using samples of known antigen content, can then be the Determine the amount of antigen contained in the sample to be examined.

Das erfindungsgemäße immunologische Bestimmungsverfahren erlaubt die Messungen von Konzentrationen bis in den Bereich von 1 ng/ml. Damit ist es möglich, dieses Verfahren zur Feststellung von Basalmembrankollagen in Körperflüssigkeiten einzusetzen. Bei normalen Individuen liegt die Konzentration des Antigens im Bereich 5 bis 20 ng/ml und kann sich bei Erkrankungen mit Basalmembranveränderungen (Diabetes, Tumoren) signifikant erhöhen.The immunological determination method according to the invention allows Measurements of concentrations down to the range of 1 ng / ml. This makes it possible this method of determining basement membrane collagen in body fluids to use. In normal individuals, the concentration of the antigen is in the range 5 to 20 ng / ml and can develop in diseases with changes in the basement membrane (diabetes, Tumors) increase significantly.

Neben der Bestimmung von Antigen in biologischem Material läßt sich das Verfahren auch zum Nachweis von Antikörpern (bevorzugt Autoantikörpern) gegen das Antigen heranziehen. Dazu werden verschiedene Verdünnungen der potentiellen Antikörperquellen, wie z. B. Serum mit dem markierten Antigen wie bereits beschrieben, inkubiert und die Antigen-Antikörper-Komplexe abgetrennt und auf die gebundene Menge an Antigen analysiert. Als Vergleich dazu werden analoge Bindungsversuche mit einem Normalserum durchgeführt (Negativkontrolle). Der Unterschied in der Bindungsaktivität gegenüber dieser Negativkontrolle wird dann als Maß für das Vorliegen von Autoantikörpern bewertet.In addition to the determination of antigen in biological material, the method also for the detection of antibodies (preferably autoantibodies) against draw the antigen. To do this, various dilutions of the potential Antibody sources such as B. Serum with the labeled antigen as already described, incubated and the antigen-antibody complexes separated and the bound amount analyzed on antigen. As a comparison, analogous binding experiments with a Normal serum carried out (negative control). The difference in binding activity this negative control is then used as a measure of the presence of autoantibodies rated.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.

Beispiel 1 Herstellung der globulären Domäne NC1 aus Humangewebe 1 kg Placenta, Niere oder Lunge werden in 5 1 0,5 M KCl, 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 homogenisiert und 24 Stunden bei 4"C gerührt. Der verbleibende Rückstand wird dann je einmal mit 2 1 bzw. 1 1 6 M Guanidin-Hydrochlorid bei 4"C extrahiert. Alle ExXtraktionspuffer enthalten p-Hydroxymercuribenzoat und Phenylmethansulfonylfluorid (je 20 mg/l) als Proteaseinhibitoren. Der verbleibende Rückstand wird dann gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ca. 20 g des lyophilisierten Rückstandes werden in 800 ml 0,2 M NaCl, 0,002 M CaCl2, 0,05 M Tris-HCl pH 7,4 homogenisiert und mit 8 mg bakterieller Kollagenase 24 Stunden bei Raumtemperatur abgebaut.Example 1 Production of the globular domain NC1 from human tissue 1 kg placenta, kidney or lung are homogenized in 5 1 0.5 M KCl, 0.1 M Tris-HCl pH 7.4 and stirred for 24 hours at 4 ° C. The remaining residue is then each once with 2 1 or 1 1 6 M guanidine hydrochloride extracted at 4 "C. All extraction buffers contain p-hydroxy mercury benzoate and phenyl methanesulfonyl fluoride (20 mg / l each) as Protease inhibitors. The remaining residue is then dialyzed against water and lyophilized. About 20 g of the lyophilized residue are dissolved in 800 ml of 0.2 M NaCl, 0.002 M CaCl2, 0.05 M Tris-HCl pH 7.4 and homogenized with 8 mg bacterial Collagenase degraded for 24 hours at room temperature.

Dieser Abbau wird einmal wiederholt und die vereinigten Uberstände werden nach Zugabe von EDTA (0,005 M) mit 3 M NaCl gefällt. Das Präzipitat wird in 2 M Harnstoff, 0,05 M Tris-HCl pH 8,6 gelöst und über eine Säule von DEAE Zellulose (2,5 x 25 cm), die im gleichen Puffer äquilibriert ist, gegeben. Das nicht an die Säule gebundene Material wird gegen 0,2 M Ammoniumbikarbonat pH 7,9 dialysiert und nach Zugabe von 5 bis 10 mg Kollagenase nochmals 24 Stunden bei 370C abgebaut und anschließend lyophilisiert. Die endgültige Reinigung erfolgt dann in einer Agarose A1,5 m Säule in 1 M CaCl2, 0,05 M Tris-HCl pH 7,4. Das so erhaltene Produkt weist die in der folgenden Tabelle angegebene Aminosäurenzusammensetzung auf.This degradation is repeated once and the combined supernatants are precipitated with 3 M NaCl after adding EDTA (0.005 M). The precipitate will dissolved in 2 M urea, 0.05 M Tris-HCl pH 8.6 and passed through a column of DEAE cellulose (2.5 x 25 cm) equilibrated in the same buffer. Not that to them Column bound material is dialyzed against 0.2 M ammonium bicarbonate pH 7.9 and after the addition of 5 to 10 mg collagenase again degraded for 24 hours at 370C and then lyophilized. The final purification then takes place in an agarose A1.5 m column in 1 M CaCl2, 0.05 M Tris-HCl pH 7.4. The product thus obtained has the amino acid composition given in the table below.

TABELLE: Aminosäurezusammensetzung der globulären Domäne NC1 von Basalmembrankollagen isoliert aus menschlicher Placenta, Niere oder Lunge. TABLE: Amino acid composition of the globular domain NC1 of Basement membrane collagen isolated from human placenta, kidney or lung.

Placenta Niere Lunge Hydroxyprolin 4 8 5 Asparaginsäure X 66 67 66 Threonin 60 55 56 Serin 102 120 123 Glutaminsäure 91 104 104 Prolin 67 61 64 Glycin 88 113 105 Alanin 69 73 76 Cystein 41 37 36 Valin 42 33 35 Methionin 17 22 19 Isoleucin 44 40 43 Leucin 64 71 70 Tyrosin 32 38 39 Phenylalanin 37 39 39 Histidin 29 31 32 Hydroxylysin 6 8 8 Lysin 25 26 27 Arginin 51 54 53 Tryptophan 65 n.b. n.b. Placenta kidney lungs hydroxyproline 4 8 5 aspartic acid X 66 67 66 Threonine 60 55 56 Serine 102 120 123 Glutamic acid 91 104 104 Proline 67 61 64 Glycine 88 113 105 alanine 69 73 76 cysteine 41 37 36 valine 42 33 35 methionine 17 22 19 isoleucine 44 40 43 Leucine 64 71 70 Tyrosine 32 38 39 Phenylalanine 37 39 39 Histidine 29 31 32 Hydroxylysine 6 8 8 Lysine 25 26 27 Arginine 51 54 53 Tryptophan 65 n.d. n.b.

Beispiel 2 Herstellung der markierten Domäne NC1 (=Antigen) 25 ßg der nach Beispiel 1 erhaltenen globulären Domäne NC1 in 0,05 ml 0,1 M Natriumborat pH 8,5 werden mit 1 mCi Jod 125-markiertem Bolton-Hunter Reagenz (3-Jod-lphydroxyphenylpropionsäure-N-hydroxy-succinimidester) 45 Minuten bei 4"C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 ml 0,2 M Glycin in 0,1 M Boratpuffer pH 8,5 gestoppt. Nicht-gebundenes Reagenz wird dann durch Dialyse gegen Puffer oder durch Gelfiltration an BioGel P2 entfernt.Example 2 Production of the marked domain NC1 (= antigen) 25 μg the globular domain NC1 obtained according to Example 1 in 0.05 ml of 0.1 M sodium borate pH 8.5 with 1 mCi iodine 125-labeled Bolton-Hunter reagent (3-iodine-lphydroxyphenylpropionic acid-N-hydroxy-succinimide ester) Incubated for 45 minutes at 4 ° C. The reaction is stopped by adding 0.2 ml of 0.2 M glycine stopped in 0.1 M borate buffer pH 8.5. Unbound reagent is then subjected to dialysis removed against buffer or by gel filtration on BioGel P2.

i Beispiel 3 Durchführung der immunologischen Bestimmung (Radioimmuntest) Die Konzentration der globulären Domäne NC1 in einer unbekannten Serumprobe wird in folgendem Inhibitionstest bestimmt: Eine bestimmte Menge des durch zweimalige Injektion von 0,15 mg NC1 in komplettem Freund'schen Adjuvans in Kaninchen gewonnenen spezifischen Antikörpers oder Antiserums wird mit der unbekannten Probe 16 Stunden bei 40C vorinkubiert und nach Zugabe von 1 ng markiertem Antigen gemäß Beispiel 2 weitere 8 Stunden bei 4"C inkubiert. Danach wird ein Uberschuß von Antikörper gegen Kaninchen-Immunoglobulin G zugesetzt und nach weiteren 16 Stunden bei 40C das im Immunkomplex gebundene Antigen durch Zentrifugation abgetrennt. Die Inhibitionsaktivität der unbekannten Probe wird mit der Aktivität einer Standardkonzentration nicht nicht-markiertem Antigen verglichen. i Example 3 Carrying out the immunological determination (radioimmuno test) The concentration of the globular domain NC1 in an unknown serum sample will be Determined in the following inhibition test: A certain amount of by two times Injection of 0.15 mg NC1 in complete Freund's adjuvant into rabbits specific antibody or antiserum will be with the unknown sample for 16 hours preincubated at 40C and after adding 1 ng of labeled antigen according to the example 2 incubated for a further 8 hours at 4 ° C. An excess of antibody is then used against rabbit immunoglobulin G added and after a further 16 hours at 40C the antigen bound in the immune complex is separated off by centrifugation. the Inhibitory activity the unknown sample becomes unlabelled with the activity of a standard concentration Compared antigen.

Claims (13)

Patentansprüche 1. Humane globuläre Basalmembrankollagen-Domäne NC1, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 170000 Dalton, bestimmt durch Gleichgewichts-Ultrazentrifugation und Lichtstreuung, hexamere Struktur mit monomeren Untereinheiten von Molekulargewicht etwa 28000 Dalton und einem Kohlenhydratgehalt von etwa 2 %. Claims 1. Human globular basement membrane collagen domain NC1, characterized by a molecular weight of about 170,000 Daltons as determined by Equilibrium ultracentrifugation and light scattering, hexameric structure with monomeric ones Subunits of molecular weight about 28,000 Daltons and a carbohydrate content of about 2%. 2. Humane globuläre Basalmembrankollagen Domäne NC1 gemäß Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie in markierter Form vorliegt.2. Human globular basement membrane collagen domain NC1 according to claim 1, that it is indicated that it is in a marked form. 3. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der globulären Basalmembrankollagen-Domäne NC1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches oder tierisches Gewebe einer ersten limitierenden Behandlung mit bakterieller Kollagenase unterwirft, die erhaltenen Abbauprodukte durch Chromatographie an schwach basischem Anionenaustauscher von nichtkollagenen Proteinen abtrennt, die kollagenen Abbauprodukte dann einem zweiten Kollagenaseabbau bei erhöhter Temperatur unterwirft und die globuläre Domäne NC1 durch Molekularsiebfraktionierung reinigt.3. Process for the recovery and purification of the globular basement membrane collagen domain NC1, characterized in that human or animal tissue of a first subject to limiting treatment with bacterial collagenase, the obtained Degradation products by chromatography on weakly basic anion exchanger of separates non-collagenous proteins, the collagenous degradation products then a second one Collagenase degradation at elevated temperature subjects and the globular domain NC1 Purifies by molecular sieve fractionation. 4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man ein Gewebe verwendet, welches in salzhaltiger Pufferlösung homogenisiert wurde.4. The method according to claim 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that a tissue is used which is homogenized in a salt-containing buffer solution became. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gewebe verwendet, welches mit Guanidinhydrochlorid in Anwesenheit eines Proteaseinhibitors extrahiert wurde.5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that one a tissue used, which with guanidine hydrochloride in the presence of a protease inhibitor was extracted. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man humanes Placenta-, Nieren- oder Lungengewebe oder Gewebe von Rinderaorten oder EHS-Sarcomgewebe verwendet.6. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in, that one human placenta, kidney or lung tissue or tissue from bovine aorta or EHS sarcoma tissue is used. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Kollagenasebehandlung bei einer Temperatur von 15 bis 25"C durchgeführt wird.7. The method according to any one of claims 3 to 6, characterized in, that the first collagenase treatment is carried out at a temperature of 15 to 25 "C will. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Kollagenasebehandlung bei einer Temperatur von 30 bis 450C durchgeführt wird.8. The method according to any one of claims 3 to 7, characterized in that that the second collagenase treatment is carried out at a temperature of 30 to 450C will. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als schwach basisches Anionenaustauschermaterial ein mit Diethylaminoethanol-Gruppen modifiziertes Kohlehydrat verwendet wird.9. The method according to any one of claims 3 to 8, characterized in that that as a weakly basic anion exchange material with diethylaminoethanol groups modified carbohydrate is used. 10. Verwendung von gegen humane globuläre Basalmembrankollagen-Domäne NC1 gemäß Anspruch 2 gerichteten Antikörpern zur Bestimmung von Basalmembrankollagen in Körperflüssigkeiten nach der Methode des Radioimmunassay (RIA) oder des Enzymimmunassays (EIA).10. Use of against human globular basement membrane collagen domain NC1 according to claim 2 directed antibodies for the determination of basement membrane collagen in body fluids using the radioimmunoassay (RIA) or enzyme immunoassay method (EIA). 11. Verwendung gemäß Anspruch 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Anti-NCl-Antikörper in Form von Antiserum, von isolierten Antikörpern oder von monoklonalen Antikörpern eingesetzt werden.11. Use according to claim 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that the anti-NCl antibodies in the form of antiserum, from isolated antibodies or used by monoclonal antibodies. 12. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich gegen Immunoglobulin G der für die Gewinnung des Anti-NCl-Antikörpers verwendeten Tierart gerichtete Antikörper einsetzt.12. Use according to claim 10 or 11, characterized in that that one also against immunoglobulin G for the production of the anti-NCl antibody used species-directed antibodies. 13. Verwendung von humaner markierter globulärer Basalmembrankollagen-Domäne NC1 nach Anspruch 2 zum Nachweis von hiergegen gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten nach der Methode des Radioimmunassay (RIA) oder Enzymimmunassay (EIA).13. Use of human labeled globular basement membrane collagen domain NC1 according to claim 2 for the detection of antibodies directed against this in body fluids according to the radioimmunoassay (RIA) or enzyme immunoassay (EIA) method.