DE3427888A1 - Process for the immobilisation of biological material - Google Patents

Abstract

The invention relates to a process for the immobilisation of biological material by entrapment in polymerised compounds. Aqueous solutions or dispersions of the biological material are mixed with an aqueous solution of high molecular weight polymerisable compounds which are readily soluble in water and have 2 or more polymerisable functional groups per molecule and a molecular weight above 400. The mixture is subsequently polymerised.

Description

Verfahren zur Immobilisierung von biologischem MaterialProcess for the immobilization of biological material

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen, das nach diesem Verfahren erhältliche immobilisierte biologische Material und dessen Verwendung zu Biotransformationen.The invention relates to methods for immobilizing biological Material by inclusion in polymerized compounds produced by this process available immobilized biological material and its use for biotransformations.

Die Immobilisierung von Biokatalysatoren führt in der Regel zu verfahrenstechnischen und wirtschaftlichen Vorteilen. Es lassen sich chemische und physikalische Eigenschaften, manchmal auch Selektivität und Spezifität des Biokatalysators durch die Immobilisierung modifizieren.The immobilization of biocatalysts usually leads to process engineering and economic benefits. It can be chemical and physical properties, sometimes the selectivity and specificity of the biocatalyst as a result of the immobilization modify.

Die Methoden zur Immobilisierung lassen sich allgemein in folgende Gruppen einteilen - Adsorption an vorgefertigte Träger - Kovalente Bindung an Träger - Quervernetzung - Einschluß in eine Polymermatrix.The methods of immobilization can be broadly divided into the following Allocate groups - adsorption on prefabricated carriers - covalent bonding to carriers - Cross-linking - inclusion in a polymer matrix.

Das Einschlußverfahren beruht darauf, daß das Biomaterial hinsichtlich seines Bewegungsraumes während der Polymerisation in ein Netzwerk mehr oder minder einheitlicher Maschen- und Porenweite eingeschlossen wird.The containment method relies on the biomaterial in terms of its range of motion during the polymerization in a network more or less uniform mesh and pore size is included.

Dieses Polymernetzwerk sollte für den Biokatalysator unpassierbar sein, während es dem Substrat und dem Produkt einer an diesem Katalysator durchgeführten Umsetzung praktisch keinen Widerstand bieten sollte.This polymer network should be impassable for the biocatalyst while it is the substrate and the product of any carried out on this catalyst Implementation should offer practically no resistance.

Herkömmliche Verfahren verwenden niedermolekulare, hydrophile Monomere zum Aufbau des Netzwerkes, beispielsweise Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Acrylamid u.a., die mit der wäßrigen Lösung oder Dispersion des Biomaterials gemischt und anschließend polymerisiert werden.Conventional processes use low molecular weight, hydrophilic monomers to build the network, for example hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, Hydroxypropyl acrylate, hydroxypropyl methacrylate, acrylamide, and others, those with the aqueous Solution or dispersion of the biomaterial mixed and then polymerized will.

Zum Beispiel werden in der US-PS 3 788 950 monofunktionelle Acrylsäurederivate wie Acrylamid mit einer geringen Menge an Vernetzer wie N,N-ethylenbisacrylamid verwendet. In der US-PS 3 859 169 werden z.B. monoester der Acrylsäure mit Glykolen in Verbindung mit einem Vernetzer und einem löslichen Polymer verwendet. Die US-PS 3 860 490 beschreibt den Einsatz niedermolekularer Hydroxyalkyl acrylate und -methacrylate zur Bildung des Polymernetzwerkes.For example, U.S. Patent No. 3,788,950 teaches monofunctional acrylic acid derivatives such as acrylamide with a small amount of crosslinking agent such as N, N-ethylenebisacrylamide used. For example, US Pat. No. 3,859,169 discloses monoesters of acrylic acid with glycols used in conjunction with a crosslinker and a soluble polymer. The US PS 3 860 490 describes the use of low molecular weight hydroxyalkyl acrylates and methacrylates to form the polymer network.

Bei allen diesen Verfahren treten jedoch Schwierigkeiten bei der Steuerung und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten für das biologische Material sowie für dessen Substrate und Produkte auf. Für eine Eignung als Immo- bilisierungsmaterial sind diese Größen jedoch essentiell.However, all of these methods have control difficulties and reproducibility of the permeabilities for the biological material as well as for its substrates and products. For suitability as a real estate bilization material However, these sizes are essential.

Außerdem ist die Verwendung niedermolekularer Acrylsäurederivate wegen ihrer Toxizität nachteilig. Es kann während der Polymerisation zu einer Schädigung des Biokatalysators kommen, oder im Polymerisat befindliche Restmonomere schränkten die Verwendung des immobilisierten Biokatalysators zur Herstellung von Produkten für die Nahrungsmittelindustrie oder für die pharmazeutische Industrie stark ein.In addition, the use of low molecular weight acrylic acid derivatives is due detrimental to their toxicity. It can cause damage during polymerization of the biocatalyst, or the residual monomers in the polymer are restricted the use of the immobilized biocatalyst for the manufacture of products for the food industry or for the pharmaceutical industry.

Es wurde nun ein Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material durch Einschluß in polymerisierbare Verbindungen gefunden, das im wesentlichen darin besteht, gut wasserlösliche höhermolekulare polymerisierbare Verbindungen als polymerisierbares Material zu verwenden, das zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht über 400 besitzt.There has now been a method of immobilizing biological material found by inclusion in polymerizable compounds, essentially therein consists, readily water-soluble higher molecular weight polymerizable compounds than polymerizable Use material that has two or more polymerizable functional groups per molecule and has a molecular weight over 400.

Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material durch Einschluß in polymerisierbare Verbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß wäßrige Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials mit einer wäßrigen Lösung von gut wasserlöslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht über 400 besitzen, gemischt werden und die Mischung polymerisiert wird.The invention accordingly relates to a method for immobilizing biological material by inclusion in polymerizable compounds, which thereby is characterized in that aqueous solutions or dispersions of the biological material with an aqueous solution of readily water-soluble, higher molecular weight, polymerizable Compounds that have two or more polymerizable functional groups per molecule and have a molecular weight of over 400, are mixed and the mixture is polymerized will.

Durch die Verwendung der erfindungsgemäß verwendeten höhermolekularen, bevorzugt zwei oder mehr, ungesättigte Gruppen enthaltenden, härtbaren, wasserlöslichen Verbindungen läßt sich eine bessere Steuerung und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten erreichen, da sich diese Eigenschaften im wesentlichen durch die höhermolekularen, wasserlöslichen Verbindungen ergeben. Außerdem besteht durch die Verwendung von insbesondere höhermolekularen Verbindungen kein Toxizitätsproblem. Niedermolekulare toxische Verunreinigungen können außerdem vor dem Mischen mit dem biologischen Material entfernt werden.By using the higher molecular weight used according to the invention, preferably two or more curable, water-soluble ones containing unsaturated groups Connections can be used for better control and reproducibility of permeabilities because these properties are essentially due to the higher molecular weight, result in water-soluble compounds. In addition, through the use of especially higher molecular weight compounds no toxicity problem. Low molecular weight Toxic impurities can also be produced before mixing with the biological material removed.

Desweiteren wurde gefunden, daß die gut wasserlöslichen erfindungsgemäßen Verbindungen zunächst in einer gewissen Menge Wasser, Pufferlösung, Salzlösung und ähnlichem aufgelöst werden können, womit diese Polymerlösung der wäßrigen Lösung oder Dispersion des biologischen Materials hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie pH-Wert, Salzkonzentration, Viskosität u.a. angepaßt werden kann.It has also been found that the readily water-soluble according to the invention Compounds first in a certain amount of water, buffer solution, and saline solution The like can be dissolved, so that this polymer solution of the aqueous solution or dispersion of the biological material with regard to certain properties such as pH value, salt concentration, viscosity etc. can be adjusted.

Anschließend werden beide Lösungen bzw. die wäßrige Polymerlösung und die Zelldispersion gemischt und polymerisiert. Dieses Verfahren besitzt besonders Vorteile für empfindliche Biokatalysatoren, die dadurch keinen abrupten Anderungen des umgebenden Mediums ausgesetzt werden, wodurch eine Aktivitätseinbuße bei der Herstellung der polymerisierbaren Mischung weitgehend vermieden wird.Then both solutions or the aqueous polymer solution and the cell dispersion is mixed and polymerized. This procedure has special Advantages for sensitive biocatalysts that do not result in abrupt changes of the surrounding medium, whereby a loss of activity in the Production of the polymerizable mixture is largely avoided.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die mit der guten Wasserlöslichkeit einhergehende große Aufnahmekapazität des Polymeren für wäßrige Lösungen und Suspensionen. Es sind Gewichtsverhältnisse von wäßrigem biologischem Material zu festem Polymer zwischen 1:1 und 30:1 möglich, besonders geeignet sind Verhältnisse zwischen 4:1 und 20:1.Another advantage of the present invention is that of being good Water solubility associated with the large absorption capacity of the polymer for aqueous solutions and suspensions. They are weight ratios of aqueous biological material to solid polymer between 1: 1 and 30: 1 possible, especially ratios between 4: 1 and 20: 1 are suitable.

Durch den möglichen großen Wassergehalt des immobilisierten biologischen Materials vor und nach der Polymerisation befinden sich die Biomaterialien in einer besonders geeigneten, schonenden Umgebung, wodurch die Aktivität stabil gehalten werden kann und wodurch zusätzlich der Substrat- und Produktfluß begünstigt sind.Due to the possible large water content of the immobilized biological Materials before and after the polymerization, the biomaterials are in one particularly suitable, gentle environment, whereby the activity is kept stable can be and whereby the substrate and product flow are also favored.

Durch Variation der Struktur und des Molekulargewichts der polymerisierbaren, gut wasserlöslichen, höhermolekularen Verbindungen sind die Eigenschaften des polymeren Netzwerkes in weitem Maße variationsfähig. Dadurch lassen sich die Vernetzungsdichte, die Permeabilität, das Quellverhalten und weitere Eigenschaften optimieren, um den Anforderungen des biologischen Materials zu entsprechen.By varying the structure and the molecular weight of the polymerizable, Highly water-soluble, higher molecular weight compounds are the properties of the polymer Network can be varied to a large extent. This allows the network density, optimize the permeability, the swelling behavior and other properties in order to achieve the To meet the requirements of the biological material.

Zur Immobilisierung wurden wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht von über 400 besitzen, insbesondere mit Molekulargewichten von 1.000 bis 20.000, insbesondere Verbindungen mit ethylenisch ungesättigten Gruppen, verwendet.Water-soluble, higher molecular weight, polymerizable ones were used for immobilization Compounds that have two or more polymerizable functional groups per molecule and have a molecular weight in excess of 400, particularly with molecular weights from 1,000 to 20,000, especially compounds with ethylenically unsaturated groups, used.

Ihrem Aufbau nach lassen sie sich als Verbindungen beschreiben, die aus der Reaktion von höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit Verbindungen, die polymerisierbare ethylenisch ungesättigte Gruppen enthalten, entstehen. Beide Reaktionspartner müssen dabei funktionelle Gruppen enthalten, die erlauben, sie chemisch mit-oder untereinander zu verknüpfen bzw. mit Hilfe von di-oder mehrfunktionellen Reagentien mit- oder untereinander zu verknüpfen.According to their structure, they can be described as connections that from the reaction of higher molecular weight, hydrophilic compounds with compounds, which contain polymerizable ethylenically unsaturated groups, develop. Both reaction partners must contain functional groups that allow to link them chemically with or with one another or with the help of di- or polyfunctional ones To link reagents with or with one another.

Beispielsweise sind solche höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen Polyethylenglycole, Ethylenoxid-Propylenoxid-Block- und Mischpolymerisate, alkoxylierte, besonders ethoxylierte zwei- oder mehrwertige Alkohole sowie gut wasserlösliche Polymerisate, z. B. ganz oder teilweise verseifte Polyvinylacetate, gut wasserlösliche Polykondensate wie z. B. Polyester, hergestellt aus obigen höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit Di-bzw. Polycarbonsäuren und gut wasserlösliche Polyadditionsverbindungen wie z. B. Polyetherpolyurethane, hergestellt aus obigen höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit Di- bzw. Polyisocyanaten.For example, such high molecular weight, hydrophilic compounds Polyethylene glycols, ethylene oxide-propylene oxide blocks and copolymers, alkoxylated, especially ethoxylated di- or polyhydric alcohols as well as readily water-soluble Polymers, e.g. B. wholly or partially saponified polyvinyl acetates, readily water-soluble Polycondensates such as B. polyester made from the above higher molecular weight, hydrophilic Connections with Di or. Polycarboxylic acids and highly water-soluble polyaddition compounds such as B. polyether polyurethanes made from the above higher molecular weight, hydrophilic Compounds with di- or polyisocyanates.

Ferner können die in den obigen genannten höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen enthaltenen Hydroxylgruppen ganz oder teilweise nach üblichen Verfahren, wie z. B. Umsetzung mit Ammoniak, in Aminogruppen umgewandelt sein.Furthermore, those in the above-mentioned higher molecular weight, hydrophilic Compounds containing hydroxyl groups in whole or in part by conventional methods, such as B. Reaction with ammonia, be converted into amino groups.

Als Verbindungen mit polymerisierbaren, ethylenisch ungesättigten Gruppen sind z. B. geeignet: ungesättigte Carbonsäuren, Säurechloride, Dicarbonsäuren, Säureanhydride oder funktionelle Derivate derselben.As compounds with polymerizable, ethylenically unsaturated Groups are e.g. B. suitable: unsaturated carboxylic acids, acid chlorides, dicarboxylic acids, Acid anhydrides or functional derivatives thereof.

Bevorzugt sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Acrylsäurechlorid, Methacrylsäurechlorid, Itaconsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Isocyanatoethylacrylat, Isocyanatoethylmethacrylat, 4-Isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylat.Acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, acrylic acid chloride are preferred, Methacrylic acid chloride, itaconic acid, Fumaric acid, maleic acid, maleic anhydride, Itaconic anhydride, glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, Hydroxypropyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl methacrylate, isocyanatoethyl acrylate, Isocyanatoethyl methacrylate, 4-isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylate.

Die Verknüpfung der höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit den polymerisierbaren, ethylenisch ungesättigten Verbindungen ist somit unterschiedlichster Natur, beispielsweise ergeben sich Ester-, Ether-, Urethan-, Amid-, Amin- und Harnstoffbindungen. Die Herstellung der Verknüpfung kann dabei nach literaturbekannten Verfahren erfolgen, d. h. beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxyl- oder Aminogruppen mit Säuren, Säurehalogeniden oder Säureanhydriden zu. den entsprechenden Estern oder Amiden, mit Epoxiden zu den entsprechenden Ethern oder Aminen oder mit Isocyanaten zu den entsprechenden Urethanen oder Harnstoffen.Linking the higher molecular weight, hydrophilic compounds with the polymerizable, ethylenically unsaturated compounds are therefore very different Nature, for example, results in ester, ether, urethane, amide, amine and urea bonds. The linkage can be established by processes known from the literature, d. H. for example by reacting the hydroxyl or amino groups with acids, Acid halides or acid anhydrides too. the corresponding esters or amides, with epoxides to the corresponding ethers or amines or with isocyanates to the corresponding urethanes or ureas.

Ferner kann neben der direkten Verknüpfung der höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit den Verbindungen, die die ethylenisch ungesättigten Gruppen enthalten, die Verknüpfung auch mittels bi- oder mehrfunktioneller Reagentien erfolgen.Furthermore, in addition to the direct linkage of the higher molecular weight, hydrophilic Compounds with the compounds containing the ethylenically unsaturated groups, the linkage can also be carried out by means of bifunctional or multifunctional reagents.

Beispiele solcher bi- oder mehrfunktioneller Reagentien sind di- oder mehrfunktionelle Isocyanate wie Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat, Biuretgruppenhaltige Polyisocyanate (z. B. Desmodur N, Umsetzungsprodukt von Hexamethylendiisocyanat mit Wasser), Polyisocyanaten, die aus der Umsatzung von Diisocyanaten mit mehrwertigen Alkoholen entstehen (z. B.Examples of such bi- or polyfunctional reagents are di- or multifunctional isocyanates such as isophorone diisocyanate, tolylene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, Polyisocyanates containing biuret groups (e.g. Desmodur N, reaction product of hexamethylene diisocyanate with Water), polyisocyanates resulting from the conversion of diisocyanates with polyhydric alcohols (e.g.

Desmodur L, Umsetzungsprodukt von Toluylendiisocyanat mit Trimethylolpropan) sowie Di- oder Polyepoxide wie z. B. Bisphenol-A-diglycidylether oder Hexahydrophthalsäurediglycidylester. Die Verknüpfung dieser Reagentien erfolgt dabei z. B. mit den Hydroxylgruppen der höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen und hydroxylgruppenhaltigen Verbindungen, die polymerisierbare, ethylenisch ungesättigte Gruppen enthalten, unter Urethan-bzw. Etherbildung.Desmodur L, reaction product of toluylene diisocyanate with trimethylolpropane) as well as di- or polyepoxides such. B. bisphenol A diglycidyl ether or hexahydrophthalic acid diglycidyl ester. The linking of these reagents takes place, for. B. with the hydroxyl groups of higher molecular weight, hydrophilic compounds and compounds containing hydroxyl groups, which contain polymerizable, ethylenically unsaturated groups, among urethane or. Ether formation.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen können die verschiedenen Verknüpfungsprinzipien auch untereinander kombiniert werden.For the preparation of the compounds according to the invention, the various Linkage principles can also be combined with one another.

Art und Anteil der hydrophilen, höhermolekularen Verbindungen, der Verbindungen, die die ethylenisch ungesättigten Gruppen tragen sowie gegebenenfalls der di-oder mehrfunktionellen Reagentien müssen jedoch so gewählt werden, daß die daraus hergestellten erfindungsgemäßen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen so hydrophil sind, daß die gute Wasserlöslichkeit und große Aufnahmekapazität für wäßrige Lösungen oder Dispersionen an biologischem Material gegeben ist.Type and proportion of the hydrophilic, higher molecular weight compounds, the Compounds which carry the ethylenically unsaturated groups and, if appropriate However, the di- or polyfunctional reagents must be chosen so that the higher molecular weight polymerizable compounds according to the invention produced therefrom are so hydrophilic that good water solubility and large absorption capacity for aqueous solutions or dispersions of biological material is given.

Als bevorzugte wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindungen seien genannt: - Verbindungen, die aus Polyetherpolyolen, deren Hydroxylgruppen teilweise mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren umgesetzt sind, hergestellt sind.As preferred water-soluble, higher molecular weight, polymerizable compounds may be mentioned: - Compounds obtained from polyether polyols, their hydroxyl groups partly with unsaturated carboxylic acids esterified and on the other Partly reacted with isocyanate group-containing derivatives of unsaturated carboxylic acids are made.

Besonders bevorzugt seien genannt: - Verbindungen, die aus Polyethylenglykolen mit einem Molekulargewicht größer 400, deren Hydroxylgruppen teilweise mit Acrylsäure oder Methacrylsäure verestert und zum anderen Teil mit Ìsocyanatoethylmethacrylat oder 4-Isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylat umgesetzt sind, hergestellt sind.Particularly preferred are: - Compounds derived from polyethylene glycols with a molecular weight greater than 400, some of whose hydroxyl groups are mixed with acrylic acid or methacrylic acid and the other part with Ìsocyanatoethyl methacrylate or 4-isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylate are reacted.

Bei der Herstellung können die Hydroxylgruppen der Polyetherpolyole zunächst teilweise mit den isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren umgesetzt werden und anschließend zum anderen Teil mit den ungesättigten Carbonsäuren verestert werden, bevorzugt ist jedoch, zuerst die teilweise Umsetzung mit den ungesättigten Carbonsäuren und anschließend die Umsetzung des anderen Teils der Hydroxylgruppen mit den isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren.The hydroxyl groups of the polyether polyols initially partially with the isocyanate group-containing derivatives of unsaturated carboxylic acids are reacted and then to the other part with the unsaturated carboxylic acids are esterified, but it is preferred first to partially react with the unsaturated Carboxylic acids and then the conversion of the other part of the hydroxyl groups with the isocyanate group-containing derivatives of unsaturated carboxylic acids.

Weiterhin seien als bevorzugte, wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindungen genannt: - Verbindungen, die aus Polyetherpolyolen, deren Hydroxylgruppen teilweise mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten umgesetzt sind, hergestellt sind.Also preferred are water-soluble, higher molecular weight, polymerizable Compounds called: - Compounds made from polyether polyols, their hydroxyl groups partly esterified with unsaturated carboxylic acids and partly with di- or polyfunctional isocyanates are reacted, are produced.

Besonders bevorzugt hierbei seien genannt: - Verbindungen, die aus Polyethylenglykolen mit einem Molekulargewicht größer 400, deren Hydroxylgruppen teilweise mit Acrylsäure oder Methacrylsäure verestert und zum anderen Teil mit Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, biuretgruppenhaltigen Polyisocyanaten oder Polyisocyanaten, die aus der Umsetzung von Diisocyanaten mit mehrwertigen Alkoholen entstehen, hergestellt sind.Particularly preferred are: - Compounds from Polyethylene glycols with a molecular weight greater than 400, their hydroxyl groups partly esterified with acrylic acid or methacrylic acid and partly with Isophorone diisocyanate, tolylene diisocyanate, polyisocyanates containing biuret groups or polyisocyanates resulting from the reaction of diisocyanates with polyhydric alcohols arise, are produced.

Bei der Herstellung können die Hydroxylgruppen der Polyetherpolyole zunächst teilweise mit den di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten umgesetzt werden und anschließend zum anderen Teil mit ungesättigten Carbonsäuren verestert werden.The hydroxyl groups of the polyether polyols are initially partially reacted with the di- or polyfunctional isocyanates and then esterified to the other part with unsaturated carboxylic acids.

Vorteilhafter ist es jedoch, zuerst die teilweise Veresterung und anschließend die Umsetzung mit den di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten durchzuführen.However, it is more advantageous to first carry out the partial esterification and then carry out the reaction with the di- or polyfunctional isocyanates.

Die Polymerisation kann unter Inertgas durchgeführt und in Gegenwart üblicher Radikalstarter wie Azo-bis(isobutyronitril), t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Dicyclohexyl-peroxydicarbonat, Methylethylketonperoxid, Cumolhydroperoxid, Acetyl-cyclohexansulfonyl-peroxid, Dicumylperoxid, Kaliumperoxodisulfat oder Ammoniumperoxodisulfat sowie durch Redoxsysteme wie Kaliumperoxodisulfat-Riboflavin, Kaliumperoxodisulfat-Natriumbisulfit, Wasserstoffperoxid-Verbindungen des zweiwertigen Eisens erfolgen. Als Beschleuniger können ebenfalls zahlreiche Ver- bindungen dienen, z.B. N,N,N' ,N'-Tetramethylethylendiamin oder ß-Dimethylaminopropionitril.The polymerization can be carried out under an inert gas and in the presence common free radical initiators such as azo-bis (isobutyronitrile), t-butyl peroctoate, benzoyl peroxide, Dicyclohexyl peroxydicarbonate, methyl ethyl ketone peroxide, cumene hydroperoxide, acetyl cyclohexanesulfonyl peroxide, Dicumyl peroxide, potassium peroxodisulfate or ammonium peroxodisulfate as well as redox systems such as potassium peroxodisulfate-riboflavin, potassium peroxodisulfate-sodium bisulfite, hydrogen peroxide compounds of divalent iron. Numerous accelerators can also be used Ver bonds serve, e.g. N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine or ß-dimethylaminopropionitrile.

Eine weitere Möglichkeit der Polymerisation besteht in der Bestrahlung der Mischung mit aktinischem Licht. Es eignen sich beispielsweise Hochdruckquecksilberlampen, Niederdruckquecksilberlampen, Fluoreszenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie Sonnenbestrahlung. Eine Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen ist ebenfalls möglich, jedoch muß mit einer gewissen Schädigung des biologischen Materials gerechnet werden.Another possibility for polymerization is irradiation the actinic light mixture. For example, high-pressure mercury lamps are suitable, Low pressure mercury lamps, fluorescent lamps, xenon lamps, charcoal arcs as well Exposure to sunlight. Irradiation with electron beams or gamma rays is also possible, but must result in some damage to the biological material be expected.

Ferner kann die Photopolymerisation durch Photosensibilisatoren beschleunigt werden. Es können bekannte Photosensibilisatoren wie & -Carbonylalkohole, z.B. Benzoin oder Acetoin, Acyloinether wie Benzoinmethylether, Benzoinethylether, Benzoinisopropylether, OC-substituierte Acyloine wie OC-Methylbenzoin und Cc-Methoxybenzoin u.a. sowie durch ionische Gruppen wie z.B. Carbonsäure-, Sulfon säure- oder Aminogruppen modifizierte und dadurch wasserlöslich gemachte Derivate verwendet werden.Furthermore, the photopolymerization can be accelerated by photosensitizers will. Known photosensitizers such as carbonyl alcohols, e.g. Benzoin or acetoin, acyloin ethers such as benzoin methyl ether, benzoin ethyl ether, benzoin isopropyl ether, OC-substituted acyloins such as OC-methylbenzoin and Cc-methoxybenzoin, among others, as well modified by ionic groups such as carboxylic acid, sulfonic acid or amino groups and thereby water-solubilized derivatives are used.

Desweiteren können polycyclische aromatische Verbindungen wie Naphthol und Hydroxyanthracen, Azoamide wie beispielsweise 2-Cyano-2-butylazoformamid sowie Metallsalze wie Uranylnitrat und Eisenchlorid, wie auch Mercaptane, Disulfide, Halogenide oder Farbstoffe verwendet werden.Furthermore, polycyclic aromatic compounds such as naphthol and hydroxyanthracene, azoamides such as 2-cyano-2-butylazoformamide as well Metal salts such as uranyl nitrate and iron chloride, as well as mercaptans, disulfides, halides or dyes can be used.

Das immobilisierte Biomaterial kann während der Polymerisation durch Formgebung nahezu beliebige Gestalt annehmen. Es sind Folien, Filme, Formteile usw. dar- stellbar. Weiterhin können durch Einbau von Stützgeweben die mechanischen Eigenschaften modifiziert werden. Ebenso sind Beschichtungen von Elektroden, Membranen, oder anderen Materialien durchführbar.The immobilized biomaterial can through during the polymerization Shape can take on almost any shape. There are foils, films, molded parts, etc. there- adjustable. Furthermore, by installing supporting fabrics, the mechanical properties are modified. Coating of electrodes, Membranes, or other materials feasible.

Durch die hohe Aufnahmekapazität für Wasser - besonders gut eignen sich Gewichtsverhältnisse von wäßriger Lösung oder Suspension des biologischen Materials zu festem Polymer zwischen 4:1 und 20:1 - die das immobilisierte Material vor und nach der Polymerisation besitzt, ergeben sich auch Vorteile hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Dadurch können einerseits große Mengen an wäßrigen Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials in einer relativ kleinen Menge der polymerisierbaren Verbindungen eingeschlossen werden, andererseits können dadurch Fermenterbrühen direkt oder nach Konzentrierung z.B. durch Mikrofiltration oder Zentrifugieren immobilisiert werden.Due to the high capacity for water - particularly suitable weight ratios of aqueous solution or suspension of the biological material to solid polymer between 4: 1 and 20: 1 - which the immobilized material before and after the polymerization, there are also advantages in terms of economy of the procedure. As a result, on the one hand, large amounts of aqueous solutions or Dispersions of the biological material in a relatively small amount of the polymerizable Compounds are included, on the other hand it can fermenter broths immobilized directly or after concentration, e.g. by microfiltration or centrifugation will.

Desweiteren ist es jedoch vor und nach der Immobilisierung auch möglich, geringere Mengen an Wasser oder wäßrigen Lösungen zu verwenden, sowie einen Teil des Anteils an Wasser gegen andere Flüssigkeiten wie z.B.Furthermore, before and after the immobilization, it is also possible to use smaller amounts of water or aqueous solutions, as well as a part the proportion of water against other liquids such as

Alkohole zu ersetzen.To replace alcohols.

Es ist auch möglich, die immobilisierten biologischen Materialien in anderen als wäßrigen Lösungen, z.B.It is also possible to use the immobilized biological materials in other than aqueous solutions, e.g.

in aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, einzusetzen.in aliphatic or aromatic hydrocarbons.

Die nach vorstehendem Verfahren immobilisierten biologischen Materialien, insbesondere Zellen oder Enzyme, lassen sich als Biokatalysatoren zu Biotransformationen einsetzen.The biological materials immobilized according to the above procedure, in particular cells or enzymes can be used as biocatalysts for biotransformations insert.

Interessante Mikroorganismen für die erfindungsgemäße Immobilisierung sind die folgenden: Aspergillus niger, Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter oxydans, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Protaminobacter rubrum, Serratia plymuthica, Pseudomonas putida, Cunninghamella elegans, Clostridien wie z.B.Interesting microorganisms for the immobilization according to the invention are the following: Aspergillus niger, Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter oxydans, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Protaminobacter rubrum, Serratia plymuthica, Pseudomonas putida, Cunninghamella elegans, clostridia such as e.g.

Clostridium thermoaceticum, Clostridium kluyveri, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Bacillus licheniformis, Streptomyces olivaceus. Clostridium thermoaceticum, Clostridium kluyveri, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Bacillus licheniformis, Streptomyces olivaceus.

Beispiele Beispiel A Immobilisierung von Alkoholdehydrogenase 48,7 g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 800 (hergestellt von dem Chemischen Werken Hüls) wurde mit 4,7 g Acrylsäure unter Zusatz von 0,54 g p-Toluolsulfonsäure und 50 mg Di-tert.-butylhydrochinon sowie 50 mg p-Methoxyphenol in Toluol verestert.Examples Example A Immobilization of alcohol dehydrogenase 48.7 g polyethylene glycol with an average molecular weight of 800 (manufactured by the Chemischen Werken Hüls) was with 4.7 g of acrylic acid with the addition of 0.54 g of p-toluenesulfonic acid and 50 mg of di-tert-butylhydroquinone and 50 mg of p-methoxyphenol esterified in toluene.

25,0 g dieses Esters wurden mit 3,9 g Ioscyanatoethylmethacrylat (hergestellt von Dow Chemicals) unter Zusatz von 4 mg Desmorapid SO (Rheinchemie Rheinau GmbH) umgesetzt.25.0 g of this ester were prepared with 3.9 g of ioscyanatoethyl methacrylate ( from Dow Chemicals) with the addition of 4 mg Desmorapid SO (Rheinchemie Rheinau GmbH) implemented.

1 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes wurden mit 50 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) gemischt und mit 2 g Phosphat-Puffer (pH 7, 0,01 M) versetzt. In dieser Lösung wurde 200 mg Alkoholdehydrogenase (aus Hefe, Fa. Boehringer Mannheim, enthaltend 120 Enzymprotein der Aktivität 40-0 U/mg) gelöst, aus der Lösung ein 500 pm dicker Film gezogen und mittels einer Quecksilberhochdrucklampe 10 min. bestrahlt, so daß ein fester Film entstand.1 g of the polymerizable resin thus obtained was mixed with 50 mg of Irgacure 651 (Ciba-Geigy) and mixed with 2 g of phosphate buffer (pH 7, 0.01 M). In 200 mg of alcohol dehydrogenase (from yeast, Boehringer Mannheim, containing 120 enzyme protein of activity 40-0 U / mg) dissolved from the solution 500 pm thick film drawn and irradiated for 10 minutes using a high-pressure mercury lamp, so that a solid film was created.

Ein Viertel des so erhaltenen Präparates (entsprechend 30 mg Alkohol-Dehydrogenase) wurde in kleine Stücke geschnitten und in einem 100 ml Erlenmeyerkolben bis zu einem Endvolumen von 20 ml mit 0,1 M Tris. HC1, pH 8,6 enthaltend 142 mg NAD, Li-Salz (Fa. Boehringer, Mannheim), 0,1 M Semicarbazid, 5 % Ethanol p.A. versetzt.A quarter of the preparation obtained in this way (equivalent to 30 mg alcohol dehydrogenase) was cut into small pieces and placed in a 100 ml conical flask until to a final volume of 20 ml with 0.1 M Tris. HC1, pH 8.6 containing 142 mg NAD, Li salt (Boehringer, Mannheim), 0.1 M semicarbazide, 5% ethanol p.A. offset.

Der Reaktionslösung wurden zu bestimmten Zeiten Proben entnommen und nach Verdünnung das UV-VIS Spectrum des entstehenden NADH gemessen. Nach etwa 50 min. war die Gesamtmenge an NAD zu NADH reduziert worden mit einer Initialgeschwindigkeit von 8,1 p ol/min. Die immobilisierte Alkohol-Dehydrogenase besitzt somit eine spezifische Aktivität von 0,28 U/mg immobilisiertes Enzymprotein. Das immobilisierte Präparat konnte wiederholt verwendet werden.The reaction solution was sampled at certain times and after dilution, the UV-VIS spectrum of the resulting NADH was measured. After about 50 At least the total amount of NAD had been reduced to NADH at an initial rate of 8.1 pol / min. The immobilized alcohol dehydrogenase thus has a specific one Activity of 0.28 U / mg immobilized enzyme protein. The immobilized preparation could be used repeatedly.

Beispiel B Immobilisierung von Lipase 1 g des polymerisierbaren Harzes aus Beispiel A wurde mit 50 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) gemischt und mit 3 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt. In dieser Lösung wurde 0,8 g Lipase (aus Candida cylindracea, Sigma) dispergiert. Die gesamte Mischung wurde anschließend auf ein Polyamidgewebe (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen und mittels einer Quecksilberhochdrucklampe 10 min. bestrahlt, so daß ein fester Film, verstärkt durch das Polyamidgewebe, entstand.Example B Immobilization of Lipase 1 g of the polymerizable resin from Example A was mixed with 50 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) and with 3 g phosphate buffer (0.01 M, pH 7) added. 0.8 g of lipase (from Candida cylindracea, Sigma) dispersed. The entire mixture was then applied to a polyamide fabric (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) and by means of a High pressure mercury lamp irradiated for 10 min., Leaving a solid film, reinforced by the polyamide fabric was created.

160 mg Lipase eingeschlossen in obiges Polymer, entsprechend 72 cm2 zerschnittener Folie, wurden in 40 ml H20 mit 2 g Sucrose-Palmitat-Stearat 15 (Fa. Serva, Heidelberg) bei 250C inkubiert. Freiwerdende Fettsäure wurde mit 0,1 N NaOH per pH-Stat (pH 7,1) titriert.160 mg lipase enclosed in the above polymer, corresponding to 72 cm2 cut film, were in 40 ml H20 with 2 g sucrose palmitate stearate 15 (Fa. Serva, Heidelberg) incubated at 250C. Liberated fatty acid was with 0.1 N NaOH titrated by pH stat (pH 7.1).

Die Aktivität immobilisierte Lipase wurde zu 5,8 mU/mg trockenes Lipase-Präparat errechnet (1 U = 1 pMol freigesetzte Fettsäure pro Minute).The immobilized lipase activity became 5.8 mU / mg dry lipase preparation calculated (1 U = 1 pmol fatty acid released per minute).

Beispiel C Immobilisierung von Esterase 25,0 g des hergestellten Esters aus Beispiel A wurden mit 2,3 g Desmodur N (BAYER AG, Leverkusen) und 1,4 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 7,5 mg Desmorapid S0 (Rheinchemie Rheinau GmbH) umgesetzt.Example C Immobilization of Esterase 25.0 g of the ester produced from Example A, 2.3 g of Desmodur N (BAYER AG, Leverkusen) and 1.4 g of isophorone diisocyanate were added implemented with the addition of 7.5 mg Desmorapid S0 (Rheinchemie Rheinau GmbH).

5 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes, 250 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy), 8,5 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) und 3 ml Esterase-Suspension (aus Schweineleber, Boehringer Mannheim GmhH) wurden gemischt und auf einem Polyamidgewebe (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen.5 g of the polymerizable resin thus obtained, 250 mg of Irgacure 651 (Ciba-Geigy), 8.5 g phosphate buffer (0.01 M, pH 7) and 3 ml esterase suspension (from Pig liver, Boehringer Mannheim GmhH) were mixed and placed on a polyamide fabric (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) elapsed.

Nach Belichten mittels einer Quecksilberhochdrucklampe wurde ein durch das Polyamidgewebe verstärkter Film erhalten.After exposure to a high-pressure mercury lamp, a through get the polyamide fabric reinforced film.

36 cm2 der so erhaltenen Esterase-Folie wurden in 45 ml 0,1 M Natriumphosphat pH 7,0 mit 5 ml einer 100 mM Lösung von Nitroterephthalsäuredimethylester in Methanol bei 300C auf einer Rotationsschüttelmaschine inkubiert.36 cm2 of the esterase film obtained in this way was dissolved in 45 ml of 0.1 M sodium phosphate pH 7.0 with 5 ml of a 100 mM solution of dimethyl nitroterephthalate incubated in methanol at 300C on a rotary shaker.

Die Analyse der Reaktionslösung erfolgte per HPLC.The reaction solution was analyzed by HPLC.

Nach 48 h ist keine Ausgangsverbindung mehr nachweisbar.After 48 hours, no more starting compound can be detected.

Es bildeten sich die beiden Nitroterephthålsäuremonoester sowie in geringer Menge auch Nitroterephthalsäure.The two nitroterephthalic acid monoesters and in small amounts also nitroterephthalic acid.

Beispiel D Immobilisierung von L-Lactat-Dehydrogenase 5 g des in Beispiel C verwendeten polymerisierbaren Harzes wurden mit 250 mg Phenylglyoxylsäure, 5 g Phosphatpuffer (0,01 M pH 7) und 3 ml L-Lactat-Dehydrogenase-Suspension (aus Schweinemuskel, Boehringer Mannheim GmbH, enthaltend 10 mg Enzymprotein, ca. 550 U/mg) gemischt und analog Beispiel C zu einem Film verarbeitet.Example D Immobilization of L-lactate dehydrogenase 5 g of the in Example C polymerizable resin used were mixed with 250 mg of phenylglyoxylic acid, 5 g Phosphate buffer (0.01 M pH 7) and 3 ml L-lactate dehydrogenase suspension (from pig muscle, Boehringer Mannheim GmbH, containing 10 mg enzyme protein, approx. 550 U / mg) mixed and processed into a film analogously to Example C.

Die Hälfte des so erhaltenen Films, enthaltend etwa 15 mg Enzymprotein, wurde zerschnitten hnd in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0), 10 mM NADH, 0,05 M Pyrovat-Na-Salz inkubiert. Die Temperatur betrug 300C, die Reaktionslösung wurde auf einer Schüttelmaschihe mit 200 Bewegungen pro Minute geschüttelt.Half of the film thus obtained, containing about 15 mg of enzyme protein, was cut up in a 100 ml Erlenmeyer flask with 20 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 8.0), 10 mM NADH, 0.05 M Pyrovat Na salt. The temperature was 300C, the reaction solution was shaken on a machine with 200 movements per minute shaken.

Von Zeit zu Zeit wurden Proben entnommen und nach Verdünnung photometrisch die NADH-Abnahme gegen eine Blindprobe ohne immobilisierte L-Lactat Dehydrogenase bestimmt. Nach 60 Minuten war die gesamte Menge an NADH zu NAD oxidiert worden. Die Initialgeschwindigkeit wurde zu 3,9 pMol/min bestimmt, was einer spezifischen Aktivität von 0,26 U/mg eingeschlossenes Enzymprotein entspricht.Samples were taken from time to time and, after dilution, photometrically the NADH decrease against a blank sample without immobilized L-lactate dehydrogenase certainly. After 60 minutes all of the NADH had been oxidized to NAD. The initial speed was determined to be 3.9 pmol / min, which corresponds to a specific activity of 0.26 U / mg included Corresponds to enzyme protein.

Beispiel E Immobilisierung von Bäckerhefe 100,0 g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.000 (Chemische Werke Hüls) wurde mit 7,2 g Acrylsäure unter Zusatz von 0,92 g p-Toluolsulfonsäure und 0,1 g Di-tert.-butylhydrochinon sowie 0,1 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.Example E Immobilization of Baker's Yeast 100.0 g of polyethylene glycol with an average molecular weight of 1,000 (Chemische Werke Hüls) was with 7.2 g of acrylic acid with the addition of 0.92 g of p-toluenesulfonic acid and 0.1 g of di-tert-butylhydroquinone and 0.1 g of p-methoxyphenol esterified in toluene.

75,0 g des so erhaltenen Esters wurde mit 8,3 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 9 mg Desmorapid S0 umgesetzt.75.0 g of the ester thus obtained was mixed with 8.3 g of isophorone diisocyanate implemented with the addition of 9 mg Desmorapid S0.

5,0 g des polymerisierbaren Harzes wurde mit 0,1 g Irgacure 651 (Ciba-Geigy) und 1,0 g Pufferlösung (0,01 M, pH 7) gemischt. Zu dieser Lösung wurde eine Mischung aus 13,7 g Bäckerhefe (25 % Feststoffgehalt) und 13,7 g Pufferlösung (0,01 M, pH 7) gegeben. Die so erhaltene Mischung wurde nach Ausstreichen auf ein Polyamidgewebe mittels einer Quecksilberhochdrucklampe belichtet, so daß ein fester Film entstand.5.0 g of the polymerizable resin was mixed with 0.1 g of Irgacure 651 (Ciba-Geigy) and 1.0 g of buffer solution (0.01 M, pH 7) mixed. A mixture became this solution from 13.7 g baker's yeast (25% solids content) and 13.7 g buffer solution (0.01 M, pH 7) given. The mixture thus obtained was spread on a polyamide fabric exposed by means of a high-pressure mercury lamp, so that a solid film was formed.

36 cm2 des so erhaltenen Films wurden auf ihre NADH-Oxidase Aktivität getestet. Dazu wurde der Film zerschnitten und in einem 200 ml Erlenmeyerkolben bis zu einem Endvolumen von 50 ml mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 8,0, sowie mit 360 mg NADH (Grad I, Boehringer Mannheim) versetzt und auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 200 rpm gegen eine Blindprobe ohne immobilisierte Bäckerhefe bei 300C inkubiert.36 cm2 of the film obtained in this way were tested for its NADH oxidase activity tested. The film was cut up for this purpose and in a 200 ml Erlenmeyer flasks up to a final volume of 50 ml with 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 8.0, as well as with 360 mg NADH (grade I, Boehringer Mannheim) added and on one Rotary shaker at 200 rpm against a blank sample without immobilized Baker's yeast incubated at 300C.

Die immobilisierten Hefezellen oxidierten NADH mit einer Geschwindigkeit von 5,3 pMol/h, gemessen als Mittelwert über 48 h. Diese Reaktion ist zur NAD-Regenerierung mittels 02 in gekoppelten Enzymsystemen verwendbar.The immobilized yeast cells oxidized NADH at one rate of 5.3 pmol / h, measured as the mean value over 48 h. This reaction is for NAD regeneration can be used in coupled enzyme systems by means of 02.

Beispiel F Immobilisierung von Bäckerhefe 218,9 g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.550 (Chemische Werke Hüls) wurde mit 9,8 g Acrylsäure unter Zusatz von 2,3 g p-Toluolsulfonsäure, 0,23 g Di-tert.-butylhydrochinon sowie 0,23 g p-Methoxyphenöl in Toluol verestert.Example F Immobilization of Baker's Yeast 218.9 g of polyethylene glycol with an average molecular weight of 1,550 (Chemische Werke Hüls) was with 9.8 g of acrylic acid with the addition of 2.3 g of p-toluenesulfonic acid, 0.23 g of di-tert-butylhydroquinone and 0.23 g of p-methoxyphen oil esterified in toluene.

165,8 g des so erhaltenen Esters wurden mit 18,2 g Isocyanatoethylmethacrylat (Dow Chemicals) unter Zusatz von 36 mg Desmorapid So umgesetzt.165.8 g of the ester thus obtained were mixed with 18.2 g of isocyanatoethyl methacrylate (Dow Chemicals) with the addition of 36 mg Desmorapid So implemented.

9,0 g dieses polymerisierbaren Harzes wurden mit 90 mg Irgacure 651 gemischt und mit 2,7 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt. Diese so erhaltene Lösung wurde zu einer Mischung aus 20,0 g Bäckerhefe und 20,0 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) gegeben, daraus ein 500 pm dicker Film gezogen und durch Bestrahlung mittels einer Quecksilberhochdrucklampe polymerisiert.9.0 g of this polymerizable resin were mixed with 90 mg of Irgacure 651 mixed and treated with 2.7 g of phosphate buffer (0.01 M, pH 7). This so obtained Solution became a mixture of 20.0 g of baker's yeast and 20.0 g Phosphate buffer (0.01 M, pH 7) was added, a film 500 μm thick was drawn from it and polymerized by irradiation with a high pressure mercury lamp.

36 m2 der so erhaltenen Folie wurden auf NADH-Oxidase Aktivität getestet. Die zerkleinerte Folie wurde in 200 ml Erlenmeyerkolben bis zu einem Endvolumen von 50 ml mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 8,0, sowie mit 360 mg NADH (Grad I, Fa. Boehringer, Mannheim) versetzt und auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 200 rpm gegen eine Blindprobe der gleichen Zusammensetzung jedoch ohne immobilisierte Bäckerhefe bei 300C inkubiert. NADH wurde mit einer Geschwindigkeit von 7,4 jjMol/h, gemessen als Mittelwert über 48 h, oxidiert.36 m2 of the film obtained in this way were tested for NADH oxidase activity. The crushed film was placed in 200 ml Erlenmeyer flasks to a final volume of 50 ml with 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 8.0, as well as with 360 mg NADH (grade I, Boehringer, Mannheim) and added on a rotary shaker 200 rpm against a blank sample of the same composition but without immobilized Baker's yeast incubated at 300C. NADH was taken at a rate of 7.4 jjMol / h, measured as the mean value over 48 h, oxidized.

Beispiel G Immobilisierung von Protaminobacter rubrum 110,0 g des Esters aus Beispiel F wurden mit 7,4 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 15 mg Desmorapid SO umgesetzt.Example G Immobilization of Protaminobacter rubrum 110.0 g des Esters from Example F were 7.4 g of isophorone diisocyanate with the addition of 15 mg Desmorapid SO implemented.

5,0 g dieses so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes wurden mit 50 mg Irgacure 651 gemischt und mit 2,0 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt, so daß eine Lösung entstand.5.0 g of this polymerizable acrylate resin thus obtained was mixed with 50 mg Irgacure 651 and mixed with 2.0 g phosphate buffer (0.01 M, pH 7), so that a solution arose.

Zur Produktion von Sucrose Mutase wird der Stamm Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) verwendet. Die Nährlösung besteht aus 5 % Dicksaft, 2 % Maisquellwasser und 0,05 % (NH4)2HPO4, der pH-Wert beträgt 7,2. Mit 1 ml einer Protaminobacter rubrum Abschwemmung werden in einem 1 1 Erlenmeyerkolben 200 ml Nährlösung beimpft.The strain Protaminobacter rubrum is used to produce sucrose mutase (CBS 574.77) used. The nutrient solution consists of 5% syrup, 2% corn steep water and 0.05% (NH4) 2HPO4, the pH is 7.2. With 1 ml of a Protaminobacter rubrum Wash off are inoculated in a 1 1 Erlenmeyer flask 200 ml of nutrient solution.

Die Fermentation läuft 15 h bei 310C auf der Rundschüttelmaschine.The fermentation runs for 15 hours at 310C on the rotary shaker.

Mit dieser Vorkultur werden in einem 30 Liter Fermenter 20 Liter obiger Nährlösung angeimpft und 16 h bei 310C fermentiert. Die Fermentationslosung wurde durch Mikrofiltration um den Faktor 10 konzentriert.With this preculture, 20 liters of the above become in a 30 liter fermenter Inoculated with nutrient solution and fermented at 310C for 16 h. The fermentation solution was concentrated by a factor of 10 by microfiltration.

17,5 g dieser konzentrierten Fermenterlösung wurde mit der obigen Acrylatharzlösung vermischt und in ein Polyamidgewebe (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen. Nach Bestrahlung für 15 Minuten mittels einer Quecksilberhochdrucklampe entstand ein polyamidverstärkter Film.17.5 g of this concentrated fermenter solution was mixed with the above Acrylate resin solution mixed and wrapped in a polyamide fabric (Monodur PA 250 N, Verseidag industrial textiles GmbH) expired. After irradiation for 15 minutes using a high pressure mercury lamp a polyamide-reinforced film was created.

Zum Test der immobilisierten Protaminobacter rubrum Zellen wurde deren Sucrose Mutase Aktivität gemessen.To test the immobilized Protaminobacter rubrum cells, their Sucrose mutase activity measured.

Hierzu wurden 36 cm2 Folie in 50 ml 50 %-Sucrose-Lösung pH 7,0, bei 300C auf einer Rotationsschüttelmaschine inkubiert und zu verschiedenen Zeiten Proben genommen.For this purpose, 36 cm2 of foil in 50 ml of 50% sucrose solution, pH 7.0, were added Incubated 300C on a rotary shaker and samples at various times taken.

Die Bestimmung des Umsatzes von Sucrose zu Isomaltulose erfolgte per HPLC. Die Umsatzrate betrug 0,60 g/h Sucrose, was 620 U/g Trockenzellen entspricht. 1 pMol/ min umgesetzte Sucrose entspricht 1 U.The conversion of sucrose to isomaltulose was determined by HPLC. The conversion rate was 0.60 g / h sucrose, which corresponds to 620 U / g dry cells. 1 pmol / min converted sucrose corresponds to 1 U.

Beispiel H Immobilisierung von Protaminobacter rubrum 80,0 g des Esters aus Beispiel F wurden mit 4,2 g Desmodur N und 2,6 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 13 mg Desmorapid S0 umgesetzt.Example H Immobilization of Protaminobacter rubrum 80.0 g of the ester from Example F were with 4.2 g Desmodur N and 2.6 g isophorone diisocyanate under Addition of 13 mg Desmorapid S0 implemented.

Analog Beispiel G wurden 10 g dieses polymerisierbaren Harzes, 100 mg Irgacure 651 und 4 g Phosphatpuffer vermischt und nach Zusatz von 50 g der mikrofiltrierten Fermentationsbrühe daraus ein Film hergestellt.Analogously to Example G, 10 g of this polymerizable resin, 100 mg Irgacure 651 and 4 g phosphate buffer mixed and after adding 50 g of the microfiltered Fermentation broth made a film from it.

Analog Beispiel G erfolgte die Bestimmung der Sucrose Mutase. Die Umsatzrate betrug 1,06 g/h Sucrose, was 910 U/g Trockenzellen entspricht.The sucrose mutase was determined analogously to Example G. the The conversion rate was 1.06 g / h sucrose, which corresponds to 910 U / g dry cells.

Beispiel J Immobilisierung von Lipase 197 g Oktaethylenglykol wurden mit 36 g Acrylsäure unter Zusatz von 2 g p-Toluolsulfonsäure und 0,35 g di-tert.-butylhydrochinon sowie 0,35 p-Methoxyphenol in Toluol verestert. 100 g des so erhaltenen Esters wurden mit 47 g Isophorondiisocyanat und 90 mg Desmorapid S0 umgesetzt.Example J Immobilization of Lipase 197 g of octaethylene glycol were added with 36 g of acrylic acid with the addition of 2 g of p-toluenesulfonic acid and 0.35 g of di-tert-butylhydroquinone and 0.35 p-methoxyphenol esterified in toluene. 100 g of the ester thus obtained was reacted with 47 g of isophorone diisocyanate and 90 mg of Desmorapid S0.

5 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes wurden in 2 g 0,01 Sl Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, gelöst, mit 6 g einer Lipase-Suspension (Lipase aus Candida cylindracea, Fa. Sigma; 17 % Feststoffgehalt) gemischt und mit 100 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) zersetzt.5 g of the polymerizable resin thus obtained was 0.01 in 2 g Sl potassium phosphate buffer, pH 7.0, dissolved with 6 g of a lipase suspension (Lipase from Candida cylindracea, Sigma; 17% solids content) mixed and decomposed with 100 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy).

Diese wäßrige Lipase-Mischung wurde auf ein Polyamid-Stützgewebe (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen und durch 10-minütige Bestrahlung mit einer Hg-Hochdrucklampe polymerisiert.This aqueous lipase mixture was applied to a polyamide support fabric (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) and by 10-minute irradiation polymerized with a high pressure mercury lamp.

72 cm2 der so erhaltenen immobilisierten Lipase werden in 40 ml Wasser pH 7,1 eingebracht und mit 1,0 g Sucrose-Palmitat-Stearat 15 (Fa. Serva, Heidelberg) bei 250C versetzt. Freiwerdende Fettsäuren werden am pH-Staten mit 0,1 N NaOH titriert. Pro Stunde werden 2,74 ml 0,1 N NaOH verbraucht, was 274 pMol freier Fettsäure entspricht. Pro cm2 immobilisierter Lipase-Folie errechnen sich 0,065 pMol/min freiwerdende Fettsäure.72 cm2 of the immobilized lipase obtained in this way are dissolved in 40 ml of water pH 7.1 introduced and 1.0 g of sucrose palmitate stearate 15 (Serva, Heidelberg) offset at 250C. Fatty acids released are titrated with 0.1 N NaOH on the pH stat. 2.74 ml of 0.1 N NaOH are consumed per hour, which corresponds to 274 pmoles of free fatty acid. Per cm2 of immobilized lipase film, 0.065 pmol / min is calculated to be released Fatty acid.

Beispiel K Immobilisierung von Protaminobacter rubrum Die Anzucht von Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) erfolgte analog Beispiel G.Example K Immobilization of Protaminobacter rubrum The cultivation of Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) was carried out analogously to Example G.

20 g des polymerisierbaren Harzes aus Beispiel F wurden mit 6 g Phosphatpuffer (0.01 M, pH 7.0) versetzt. Diese so erhaltene Lösung wurde mit 180 g durch Mikrofiltration etwa um den Faktor 10 konzentrierten Protaminobacter Zellsuspension vermischt. Nach Auflösen von 0,4 g Ammoniumperoxodisulfat in dieser Lösung wurden 0,4 g N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin zugesetzt, gut durchgemischt und schnell in mehrere Schalen gegossen, sodaß die Schichtdicke des ausgegossenen Materials etwa 3 mm betrug. Nach wenigen Minuten setzte die Polymerisation ein, die polymerisierten Scheiben wurden in kleine Stücke der Größe 5 x 5 x 3 mm zerschnitten und in eine 500 ml Säule gefüllt.20 g of the polymerizable resin from Example F were mixed with 6 g of phosphate buffer (0.01 M, pH 7.0) added. This solution thus obtained was extracted with 180 g by microfiltration Protaminobacter cell suspension concentrated by a factor of about 10. To Dissolving 0.4 g of ammonium peroxodisulfate in this solution was 0.4 g of N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine added, good mixed and quickly poured into several bowls, so that the layer thickness of the poured material was about 3 mm. After a few In minutes, the polymerization started, the polymerized disks became small Pieces of size 5 x 5 x 3 mm cut up and placed in a 500 ml column.

Nach Einstellen eines Durchflusses von etwa 90 ml/h wurden bei 300C 72 % der Sucrose einer 50 % Sucroselösung zu Isomaltulose und Nebenprodukten umgesetzt.After setting a flow rate of about 90 ml / h, at 300C 72% of the sucrose in a 50% sucrose solution is converted into isomaltulose and by-products.

Eine Erhöhung des Durchflusses auf 135 ml/h führte zu einer Abnahme des Sucroseumsatzes auf 52.7 %.Increasing the flow rate to 135 ml / h led to a decrease of sucrose sales to 52.7%.

Beispiel L Immobilisierung von Bäckerhefe 10 g des polymerisierbaren Harzes aus Beispiel G wurden mit 4.0 g Phosphatpuffer (0.01 M, pH 7.0) versetzt, sodaß eine Lösung entstand. Diese so erhaltene Lösung wurde zu einer Mischung aus 17.5 g Bäckerhefe und 17.5 g Phosphatpuffer (0.01 M, pH 7.0) gegeben. Dann wurden 0.2 g Ammoniumpersulfat aufgelöst und mit 0.2 g N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin versetzt. Nach intensivem Durchmischen polymerisierte die Lösung nach wenigen Minuten im Becherglas.Example L Immobilization of baker's yeast 10 g of the polymerizable Resin from Example G was mixed with 4.0 g of phosphate buffer (0.01 M, pH 7.0), so that a solution arose. This solution thus obtained became a mixture of 17.5 g baker's yeast and 17.5 g phosphate buffer (0.01 M, pH 7.0) are added. Then were Dissolve 0.2 g of ammonium persulfate and add 0.2 g of N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine offset. After thorough mixing, the solution polymerized after a few minutes in the beaker.

Der entstandene Block wurde in kleine Stücke (ungefähr 5 x 5 x 3 mm zerschnitten und auf NADH-Oxidase Aktivität getestet, analog Beispiel F. Dabei wurden 10 g des feuchten Polymerisats in den Test eingesetzt.The resulting block was cut into small pieces (approximately 5 x 5 x 3 mm cut up and tested for NADH oxidase activity, analogously to Example F. 10 g of the moist polymer used in the test.

NADH wurde mit einer Rate von 19.3 pMol/h oxidiert.NADH was oxidized at a rate of 19.3 pmol / h.

Als Kontrollversuch lief ein Parallelansatz gleicher Zusammensetzung ohne immobilisierte Bäckerhefe, bei dem jedoch keine Abnahme des NADH-Gehalts festgestellt wurde.A parallel batch of the same composition was run as a control test without immobilized baker's yeast, in which, however, no decrease in the NADH content was found became.

Claims (15)

Patentansprüche 1. Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß wäßrige Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials mit einer wäßrigen Lösung von gut wasserlöslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht über 400 besitzen, gemischt werden und die Mischung polymerisiert wird.Claims 1. A method for immobilizing biological Material by inclusion in polymerized compounds, characterized in that that aqueous solutions or dispersions of the biological material with an aqueous Solution of highly water-soluble, higher molecular weight, polymerizable compounds, the two or more polymerizable functional groups per molecule and a molecular weight possess over 400, are mixed and the mixture is polymerized. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein radikalischer Polymerisationsinitiator und/ oder ein radikalisches Polymerisationsinitiatorsystem und/oder ein Beschleuniger zugesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a radical Polymerization initiator and / or a radical polymerization initiator system and / or an accelerator is added. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserlöslicher radikalischer Polymerisationsinitiator, insbesondere Ammoniumperoxodisulfat und ein wasserlöslicher Beschleuniger wie N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin zugesetzt wird.3. The method according to claim 2, characterized in that a water-soluble radical polymerization initiator, in particular ammonium peroxodisulfate and a water-soluble accelerator such as N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine was added will. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Photoinitiator zugesetzt wird und die Polymerisation durch Bestrahlung erfolgt.4. The method according to claim 1, characterized in that a photoinitiator is added and the polymerization takes place by irradiation. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis der wäßrigen Lösung oder der Dispersion des biologischen Materials zu der gut wasserlöslichen polymerisierbaren höhermolekularen Verbindung bzw.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that the weight ratio of the aqueous solution or the dispersion of the biological Materials to the readily water-soluble polymerizable higher molecular weight compound or deren wäßrigen Lösungen zwischen 1:1 bis 30:1, insbesondere zwischen 4:1 bis 20:1 liegt. their aqueous solutions between 1: 1 to 30: 1, in particular between 4: 1 to 20: 1. 6. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gut wasserlöslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen aus Polyetherpolyolen, deren Hydroxylgruppen teilweise mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren umgesetzt sind, hergestellt sind.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the readily water-soluble, higher molecular weight, polymerizable compounds Polyether polyols, the hydroxyl groups of which are partially with unsaturated carboxylic acids esterified and partly unsaturated with derivatives containing isocyanate groups Carboxylic acids are implemented, are produced. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Polyetherpolyole Polyethylenglykole mit einem MW von 400 und größer sind, b) die ungesättigten Carbonsäuren Acrylsäure und/ oder Methacrylsäure sind, c) die isocyanatgruppenhaltigen Derivate ungesättigter Carbonsäuren Isocyanatoethylacrylat, Isocyanatoethylmethacrylat und/oder 4-Isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylat sind.7. The method according to claim 6, characterized in that a) the polyether polyols Are polyethylene glycols with a MW of 400 and greater, b) the unsaturated carboxylic acids Acrylic acid and / or methacrylic acid are, c) the derivatives containing isocyanate groups unsaturated carboxylic acids isocyanatoethyl acrylate, isocyanatoethyl methacrylate and / or Are 4-isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylate. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die gut wasserlöslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen aus Polyetherpolyolen, deren Hydroxylgruppen teilweise mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten umgesetzt sind, hergestellt sind.8. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the highly water-soluble, higher molecular weight, polymerizable compounds made from polyether polyols, whose hydroxyl groups are partially esterified with unsaturated carboxylic acids and for other part are reacted with di- or polyfunctional isocyanates, produced are. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Polyetherpolyole Polyethylenglykole mit einem MW von 400 und größer sind, b) die ungesättigten Carbonsäuren Acrylsäure und/ oder Methacrylsäure sind, c) die di- oder mehrfunktionellen Isocyanate Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat, biuretgruppenhaltige Polyisocyanate und/oder Polyisocyanate, die aus der Umsetzung von Diisocyanaten mit mehrwertigen Alkoholen entstehen, sind.9. The method according to claim 8, characterized in that a) the polyether polyols Are polyethylene glycols with a MW of 400 and greater, b) the unsaturated carboxylic acids Acrylic acid and / or methacrylic acid are, c) the di- or polyfunctional isocyanates Isophorone diisocyanate, tolylene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, biuret group-containing Polyisocyanates and / or polyisocyanates resulting from the reaction of diisocyanates are formed with polyhydric alcohols. 10. Verfahren nach vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immobilisierung direkt Fermentationsbrühen, gegebenenfalls nach vorhergehender Konzentrierung, verwendet werden.10. The method according to the preceding claims, characterized in that that for immobilization directly fermentation broths, optionally after the preceding one Concentration, can be used. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen oder Enzyme in Gegenwart von Desinfektionsmitteln, Bakteriziden oder Fungiziden immobilisiert werden, somit chemisch sterilisiert in den Bioreaktor überführt werden und die Sterilisationsmittel vor Anlauf der Reaktion aus dem geschlossenen, sterilen Reaktorsystem ausgewaschen werden.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that cells or enzymes in the presence of disinfectants, bactericides or Fungicides are immobilized, thus chemically sterilized and transferred to the bioreactor and the sterilization agents are removed from the closed, sterile reactor system are washed out. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Material Protaminobacter rubrum eingeschlossen wird.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that Protaminobacter rubrum is included as biological material. 13. Immobilisiertes biologisches Material erhältlich nach einem der vorhergehenden Ansprüche.13. Immobilized biological material obtainable according to one of the preceding claims. 14. Verwendung des immobilisierten biologischen Materials nach Anspruch 13 zu Biotransformationen.14. Use of the immobilized biological material according to claim 13 on biotransformations. 15. Verwendung des nach Anspruch 12 hergestellten biologischen Materials zur Umwandlung von Sucrose zu Isomaltulose.15. Use of the biological material produced according to claim 12 to convert sucrose to isomaltulose.