DE3412093A1 - HYBRID PLASMIDE WITH A STREPTOMYCETE AND ESCHERICHIA COLI REPLICON - Google Patents

HYBRID PLASMIDE WITH A STREPTOMYCETE AND ESCHERICHIA COLI REPLICON

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DE3412093A1
DE3412093A1 DE19843412093 DE3412093A DE3412093A1 DE 3412093 A1 DE3412093 A1 DE 3412093A1 DE 19843412093 DE19843412093 DE 19843412093 DE 3412093 A DE3412093 A DE 3412093A DE 3412093 A1 DE3412093 A1 DE 3412093A1
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract

1. Claims for the Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A group of at least two shuttle vectors which are compatible in Streptomycetes and have an E. Coli replicon and various Streptomycetes replicons deriving from the plasmids pSG2, pSG5 (obtainable from Streptomyces ghanaensis DSM 2932) and pSVH1. 1. Claim for the Contracting State : AT The use of at least two of the replicons from the group of Streptomycetes plasmids pSG2, pSG5 (obtainable from Streptomyces ghanaensis DSM 2932) and pSVH1 for the construction of mutually compatible shuttle vectors with an E. coli replicon.

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAPT HOE 84/F 074 Dr.KL/mkHOECHST AKTIENGESELLSCHAPT HOE 84 / F 074 Dr.KL / mk

Hybridplasmide mit einem Streptomyceten- und einem Escherichia coli-RepliconHybrid plasmids with a Streptomycete and an Escherichia coli replicon

Die Erfindung betrifft Hybridplasmide, insbesondere sogenannte Pendelvektoren, die durch Fusion von E^ coli-Plasmiden und den Streptomyceten-Plasmiden pSG2 (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 66 701), pSVHl (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 70 522) sowie pSG5 (das Gegenstand der am gleichen Tage eingereichten Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Das Streptomycetenplasmid pSG5, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung" ist und durch die Figur 1 charakterisiert wird) entstehen und deshalb sowohl in E^ οοΙΛ als auch in Streptomyceten autonom replizieren. Weiterhin enthalten die erfindungsgemäßen Pendelvektoren Marker, vorzugsweise Resistenzgene, die eine Selektion in Streptomyceten und/oder in E_^ coil ermöglichen. Diese Pendelvektoren erlauben dadurch die Anwendung erprobter gentechnischer Methoden in E_^ coil, den Rücktransfer nach Streptomyceten und die Untersuchung und Nutzung manipulierter Gene in Streptomyceten. Weitere Aspekte und bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung werden im folgenden näher erläutert.The invention relates to hybrid plasmids, in particular so-called pendulum vectors, which are produced by fusion of E ^ coli plasmids and the streptomycete plasmids pSG2 (European patent application with publication number 66 701), pSVH1 (European patent application with publication number 70 522) and pSG5 (which is the subject of Patent application filed on the same day with the designation "The streptomycete plasmid pSG5, method for its production and its use" and is characterized by FIG. 1) arise and therefore replicate autonomously in both E ^ οοΙΛ and streptomycetes. Furthermore, the pendulum vectors according to the invention contain markers, preferably resistance genes, which enable selection in Streptomycetes and / or in E_ ^ coil. These pendulum vectors allow the application of proven genetic engineering methods in E_ ^ coil , the back transfer to Streptomycetes and the investigation and use of manipulated genes in Streptomycetes. Further aspects and preferred embodiments of the invention are explained in more detail below.

Als Ausgangsplasmide für den E1^ coil·-Anteil dienen bekannte Ej_ coli-Plasmlde, vorzugsweise die aus der Literatur bekannten Plasmide pBR322 und pBR325 (Bolivar et al., Gene g As Parentals for e ^ serve one coil · stake known Ej_ coli -Plasmlde, preferably those known from the literature plasmids pBR322 and pBR325 (Bolivar et al., Gene g

(1977) 95; Bolivar, Gene j\_ (1978) 121) und insbesondere die Plasmide der pAC-Reihe, pACYC177 und pACYCl84 (Chang et al,, J. Bacteriol. 134 (1978) 1141). Diese pAC-Plasmide eignen sich auf Grund ihrer geringen Größe von 4,0 bzw. 4,3 kb hervorragend zur Fusion mit Streptomyceten-Plasmiden.(1977) 95; Bolivar, Gene j \ _ (1978) 121) and in particular the plasmids of the pAC series, pACYC177 and pACYCl84 (Chang et al ,, J. Bacteriol. 134 (1978) 1141). Due to their small size of 4.0 and 4.3 kb, these pAC plasmids are ideally suited for fusion with streptomycete plasmids.

In den erfindungsgemäßen Pendelvektoren können die E^ coli-DNA-Sequenzen unverändert vorliegen oder aber modifiziert sein, beispielsweise durch Einbau von Fremdgenen oder Regulationssequenzen. So kann durch Einbau weiterer E^ coli-Resistenzgene, beispielsweise durch Einbau eines Hindlll-Pragments aus dem Transposon Tn5_ (Jorgensen et al., Mol. gen. Genet. 177 (1977) 65), das ein Gen für Neomycin/ Kanamycin-Reslstenz trägt, in die Hindill-Schnittstelle von ρΑΟΥΟΐ84 ein geeignetes Ausgangsplasmid gewonnen werden, das die Bezeichnung pACYCl84N (Tab. 3) erhielt.In the shuttle vectors according to the invention, the E. coli DNA sequences can be present unchanged or else modified, for example by incorporating foreign genes or regulatory sequences. Thus, by incorporating further E. coli resistance genes, for example by incorporating a Hin dlll fragment from the transposon Tn5_ (Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet. 177 (1977) 65), the gene for neomycin / kanamycin Reslstenz, a suitable starting plasmid can be obtained in the Hin dill site of ρΑΟΥΟΐ84, which was named pACYCl84N (Tab. 3).

Selbstverständlich eignen sich für die erfindungsgemäßen Pendelvektoren auch in anderer Weise modifizierte EU_ coli-Plasmide, in denen das ursprüngliche E^ coli-Replikationssystem erhalten bleibt. Als derart modifizierte E^_ coli-Plasmide gelten auch solche, in die ein weiteres E^ coli-Replikon Inseriert ist, beispielsweise eines der vorstehend genannten Plasmi.de der pAC-Reihe.Of course, other modified EU_ coli plasmids in which the original E. coli replication system is retained are also suitable for the shuttle vectors according to the invention. As such a modified E ^ _ col i plasmids also those in the another E ^ coli replicon is advertised, for example, one of the aforementioned Plasmi.de the pAC series apply.

Vorteilhaft für die Konstruktion der Pendelvektoren sind modifizierte E^ coli-Plasmide mit Resistenzgenen, die in Streptomyceten arbeiten. Diese Streptomyceten-Resistenzgene können auch in ein bereits modifiziertes E^_ coll-Plasmld eingesetzt werden, beispielsweise kann in das Plasmid pBR325d (Tab. 1) die Thiostrepton-Reslstenz aus dem Streptomyceten-Plasmid pIJ6 (Thompson et al., Nature 286 (1980) 525) kloniert werden. Man erhält so ein modifiziertes Ej^ coli-Plasmld, pSLEl40 genannt, das zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Pendelvektoren verwendet werden kann. Modified E ^ c oli plasmids with resistance genes that work in Streptomycetes are advantageous for the construction of the shuttle vectors. These streptomycete resistance genes can also be inserted into an already modified E ^ _ coll plasmid, for example the thiostrepton resistance from the streptomycete plasmid pIJ6 (Thompson et al., Nature 286 (1980 ) 525) can be cloned. A modified E. coli plasmid, called pSLE140, is obtained in this way, which can be used to construct the pendulum vectors according to the invention.

Als weitere Beispiele zur Modifizierung der E^_ coli-Plasinide mit Streptomyceten-Resistenzgenen seien genannt: Das Plasmid pSLEll, in das das Neomycin-Resistenzgen aus dem Streptomyceten-Plasmid pIJ211 (Kieser et al., Mol. gen. Genet. 3^85. (1982) 223) kloniert wurde, sowie die PlasmideFurther examples for modifying the E. coli plasmid with streptomycete resistance genes may be mentioned: The plasmid pSLEll, into which the neomycin resistance gene from the streptomycin plasmid pIJ211 (Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 3 ^ 85 . (1982) 223), as well as the plasmids

-H --H -

pSLE4O und 401, die das Thiostrepton-Resistenzgen aus dem . Streptomyceten-Plasmid pIJ6 tragen.pSLE4O and 401, which contain the thiostrepton resistance gene from the . Carry streptomycete plasmid pIJ6.

In der folgenden Tabelle 1 sind erfindungsgemäß verwendbare 5 Vektoren aufgeführt, die durch Einbau von Resj.stenzgenen 'aus Streptomyceten-Plasmiden erhalten werden und zur Konstruktion von Pendelvektoren dienen können:Table 1 below lists those which can be used according to the invention Listed 5 vectors which are obtained by incorporating Resj.stenzgenen 'from Streptomycete plasmids and for construction of pendulum vectors can serve:

Tabelle 1:Table 1:

ModJiiziertes Ej_ coli- KLonier- Streptomyceten- Resistenz Fig. ^U. coil Repli-kon stelle fragment mit des modifi-Modified E. coli Cloning Streptomycete Resistance Fig. coil Repli-kon place fragment with the modifi-

Resistenz · zi.erten E. coll-Plasmids Resistance reported E. coll plasmids

pSLE^OpSLE ^ O

PSLE401PSLE401

pSLEl40pSLEl40

PSLEIl pBR325 BamHI 6,2 kb Bell- Apr, Cmr, Tcs PSLEIl pBR325 BamHI 6.2 kb Bell Ap r , Cm r , Tc s

Fragment von ■' PIJ211 (Neor)Fragment of ■ 'PIJ211 (Neo r )

pBR325 BamHI 1,1 kb Bell- Apr, Cm^, Tcs pBR325 BamHI 1.1 kb Bell Ap r , Cm ^, Tc s

Fragment aus pIJ6 (Thi.or)Fragment from pIJ6 (Thi.o r )

pBR325 Bell 1,1 kb Bell- Apr, Cmr, Tcr pBR325 Bell 1.1 kb Bell- Ap r , Cm r , Tc r

Fragment aus pIJ6 (Thi.or)Fragment from pIJ6 (Thi.o r )

pBR325d* BamHI 1,1 kb Bell- Apr, Cras, Tcs pBR325d * BamH I 1.1 kb Bell-Ap r , Cra s , Tc s

Fragment aus pU6 (Thi.or)Fragment from pU6 (Thi.o r )

* pBR325d: pBR325 mit deletiertem kleinem EcoRI/Hindlll-Fragment* pBR325d: pBR325 with deleted small EcoRI / HindIII fragment

-JC- -S--JC- -S-

In der folgenden Tabelle 2 sind erfindungsgeniaße Fusions-. plastnide genannt:In the following table 2 are inventive fusion. called plastnide:

Tabelle 2Table 2

E. coli-Plasrnld E. coli plasma

PBR325PBR325

pBR322pBR322

Streptomy-Streptomy Schnittcut Fusions-Fusion RestriktionsRestriction cetenplasraidcetenplasraid stelleJob plasmidplasmid karte desmap of the PusionsplasraidsFusion plasraids pSG2pSG2 P s tiP s ti pSGElpSGEl 66th pSGE2pSGE2 77th pSVHlpSVHl PstlPstl pSVElpSVEl 88th pSYE2pSYE2 99 pSVHlpSVHl PstlPstl PSVE21PSVE21 1010

PBR325PBR325

pSVHlpSVHl

BamHIBamHI

pSVENl-4pSVENl-4

1111th

PACYC177 pSVHl PACYC184 pSG5PACYC177 pSVHl PACYC184 pSG5

PstlPstl

EcoRIEcoRI

PSVE31PSVE31

PSGE55PSGE55

1313th

Diese Plasmide dienen einerseits zur vereinfachten Streptorcyceten-DNÄ-Gewinnung a.us E^ coil, da sie in E^ coil stabil sind und in der hohen Kopienzahl des E_^ coli-Plasmlds vorliegen. Andererseits sind sie als Vorstufen zur Konstruktion von Pendelvektoren geeignet.On the one hand, these plasmids serve to simplify the production of Streptorcycetes DNA from E ^ coil , since they are stable in E ^ coil and are present in the high number of copies of the E_ ^ coli plasmid. On the other hand, they are suitable as preliminary stages for the construction of pendulum vectors.

-C--C-

Die Tabelle 3 nennt erfindungsgemäße Pendelvektorert, die aus modifizierten E^ coli-Plasmiden (Tabelle 1) erhalten wurden und die auf dem E1^ coli-Replicon pBR325 basieren:Table 3 names pendulum vectors according to the invention which were obtained from modified E ^ coli plasmids (Table 1) and which are based on the E 1 ^ coli replicon pBR325:

Tabelle 3:Table 3:

Streptomyceten- Modifiziertes Pendelvektor Restriktionsplasmid E^ coll-Plasmid karteStreptomyces modified shuttle vector restriction plasmid E ^ coll plasmid map

(Figur)(Figure)

pSVHlpSVHl pSLE40pSLE40 pSW254pSW254 (Pstl)(Pstl) (Pstl)(Pstl) (19,5 kb)(19.5 kb) pSG5pSG5 pSLEllpSLEll pSW311pSW311 (EcoRI)(EcoRI) (EcoRI)(EcoRI) (24,3 kb)(24.3 kb) pSG2pSG2 pSLE40pSLE40 PSW154PPSW154P (partiell Pstl) (Pstl)(partially Pstl) (Pstl) (20,7 kb)(20.7 kb)

1515th

1616

Für jeden Pendelvektor sind verschiedene Fusionierungsmöglichkeiten der Ausgangsplasmide gegeben. In Figur 16 sind 4 Varianten dargestellt. Bevorzugt angewandt wurde die Variante pSW154P2-2.For each pendulum vector there are different fusion possibilities given the starting plasmids. 4 variants are shown in FIG. The was preferably used Variant pSW154P2-2.

Die erfindungsgemäßen Pendelvektoren mit E_j_ eoli-Replica der pBR-Reihe sind in E^_ coil in jedem Fall stabil; DeIetionen im Streptomyceten-Plasmidanteil sind nicht beobachtet worden. In Streptomyces exprimieren pSW311 und pSW154P die jeweilige Resistenz (Thiostrepton- bzw. Neomycinresistenz). Die Plasmide können nach S. lividans transformiert werden: ein Beweis dafür, daß die Replikationsgene nicht spezifisch für den ursprünglichen Wirt sind. Aufgrund der Kopienzahl (etwa 10) und der Kompatibilität des Replikons untereinander und mit pIJlOl und SLPl.2 (US-Patentschrift The pendulum vectors according to the invention with E_j_ eoli replica of the pBR series are stable in E ^ _ coil in any case; No deletions in the streptomycete plasmid portion were observed. In Streptomyces, pSW311 and pSW154P express the respective resistance (thiostrepton and neomycin resistance). The plasmids can be transformed into S. lividans : evidence that the replication genes are not specific for the original host. Due to the number of copies (about 10) and the compatibility of the replicon with each other and with pIJ101 and SLP2 (US patent

34120333412033

4 360 597) sind die Pendelvektoren geeignet, bestehende Vektorsysteme so zu erweitern, daß komplexe Biosynthesewege schrittweise in Streptomyces kloniert werden können.4,360,597) the pendulum vectors are suitable, existing To expand vector systems so that complex biosynthetic pathways can be cloned step by step in Streptomyces.

In Tabelle 4 sind modifizierte Plasmide der pAC-Reihe aufgeführt, die Resistenzgene zur Selektion in Streptomyceten tragen und die als Vorstufen zur Konstruktion von Pendelvektoren verwendet werden können:Modified plasmids of the pAC series are listed in Table 4, which carry resistance genes for selection in Streptomycetes and which act as precursors for the construction of pendulum vectors can be used:

TabelleTabel

Plasmid
der
pAC-Reihe Plasmid
the
pAC series

Für Klonie- Kloniertes Frag- Modifl- Resistenz- Restrik-For clones- cloned frag- modifl- resistance- restriction-

rung verwendete
Schnittstelle tion used
interface

PACYC184N BamHIPACYC184N BamHI

pACYCl84
pACYCl84pACYCl84
pACYCl84

pACYCl84 BellpACYCl84 Bell

ment mit Streptomyceten-Resi- stenzgenment with streptomycete resistance genes

3,3 kb BamHI-Pragment aus pIJ2 (Neor)3.3 kb BamHI pragment from pIJ2 (Neo r )

wie obenas above

6,9 kb BamHI-Fragment aus pIJ6 (ThIo1")6.9 kb BamHI fragment from pIJ6 (ThIo 1 ")

1,1 kb BcII-Fragment aus pIJ6 (Thior)1.1 kb BcII fragment from pIJ6 (Thio r )

ziertes verhalten tions-Plasmld des modi- karte der pAC- fizierten (Figur) Reihe Plasmids in
E. coiladorned behavior plasmid of the modified map of the pACfected (figure) series of plasmids in
E. coil

pSLElO Kmr, Cm1 pSLElO Km r , Cm 1

pSLElö Cmr
PSLE21 Cmr pSLElö Cm r
PSLE21 cm r

Cmr, Tcr Cm r , Tc r

1717th

18 1918 19

2020th

Unter Verwendung der in Tabelle 4 genannten modifizierten Plasmide der pAC-Reihe können die in der Tabelle 5 aufgeführten Pendelvektoren konstruiert werden:Using the modified ones mentioned in Table 4 The shuttle vectors listed in Table 5 can be constructed for plasmids of the pAC series:

Tabelle 5:Table 5:

Modifiziertes Restriktion Strepto-Plasmid der myceten-Modified restriction strepto plasmid the mycetus

pAC-Relhe plasmidpAC-Relhe plasmid

pSLElOpSLElO EcoRIEcoRI PSLE16PSLE16 HindlllHindlll PSLE21PSLE21 1111th pSLE4lpSLE4l BaraHIBaraHI

PSG5PSG5

pSG2pSG2

Restrik- Pendel Restriktion vektor tionskarteRestrik pendulum restriction vector map

des Pendelvektors of the pendulum vector

(.Figur) (.Figure)

EcoRI pSW36l 21EcoRI pSW36l 21

HindiII pSWl4l 22HindiII pSWl4l 22

Bell
partiell Bel l
partially

pSWl42 23pSWl42 23

pSWl44BC 24pSWl44BC 24

PSLE41PSLE41

Ml·11 PSW144BG 25 partiellMl 11 PSW144BG 25 partial

PSLE41PSLE41 nn pSLEAlpSLEAl PSLE41PSLE41 titi pSLE4lpSLE4l EcoRIEcoRI pSLE4lpSLE4l BamHIBamHI

pSG5pSG5

BgIII pSWlBgIII pSWl

2626th

pSVHl BgIII PSW244BG 27 partiellpSVHl BgIII PSW244BG 27 partially

BellBell

pSW244 28pSW244 28

EeoRI pSW344E 29EeoRI pSW344E 29

BellBell

PSW344B 30PSW344B 30

Für jeden Pendelvektor sind verschiedene Pusionierungsmöglichkeiten der Ausgangsplasmide gegeben. In den Figuren
sind die Varianten dargestellt.For each pendulum vector there are different possibilities of fusion of the starting plasmids. In the figures
the variants are shown.

Besonders bevorzugte Pendelvektoren sind die Plasmide der Figuren 25 und 27, und zwar jeweils insbesondere diejenige Variante, bei der die Insertion pSLE4l mit der Ziffer 1 bezeichnet ist, sowie die Plasmide der Figuren 26 und 29·Particularly preferred shuttle vectors are the plasmids of FIGS. 25 and 27, and in each case in particular that one Variant in which the insertion pSLE4l is denoted by the number 1 is, as well as the plasmids of Figures 26 and 29

Die erfindungsgemäßen Pendelvektoren mit einem pAC-Replicon sind in E^ coli 3n jedem Fall stabil. Deletionen im Streptomyceten-Plasmidteil sind in Ej_ coli nicht beobachtet worden. Die in Streptomycesarten ausführlich getesteten Vektoren (insbesondere pSW344E, pSVil und pSW24'lBG) sind in den untersuchten Stämmen (u.a. Sj1 livldans, S. geysirensis, S. ghanaensls) stabil und exprimieren die Streptomyceten-Resistenz-gene. The shuttle vectors according to the invention with a pAC replicon are stable in E ^ coli 3n in every case. Deletions in the Streptomycete plasmid part have not been observed in E. coli. The vectors that have been extensively tested in Streptomyces species (in particular pSW344E, pSVil and pSW24'lBG) are stable in the strains investigated (including Sj 1 livldans , S. geysirensis , S. ghanaensls) and express the Streptomycete resistance genes.

Die entscheidenden Vorteile dieser Vektoren sind:The key advantages of these vectors are:

1. Der Wirtsbereich umfaßt auch Stämme (z.B. S. ghanaensis), die von bisher bekannten Vektoren nicht transformiert werden können.1. The host range also includes strains (eg S. ghanaensis) which cannot be transformed by previously known vectors.

2. Die Kopienzahl liegt mit etwa 10 in einer Größenordnung, die die bisher bekannten Vektoren nicht abdecken. Die Kopienzahl anderer Streptornyceten-Plasmide und deren Derivate werden mit 1 (SCP2%, europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 92 388), 3-5 (SLPl.2) und mit 20 Kopien/Zelle (z.B. für pIJlOl u.a., Kieser, a.a.O.) angegeben.2. The number of copies is about 10 in an order of magnitude that the vectors known to date do not cover. The number of copies of other Streptornycete plasmids and their derivatives are given as 1 (SCP2 % , European patent application with the publication number 92 388), 3-5 (SLPl.2) and 20 copies / cell (eg for pIJ101 et al., Kieser, loc. Cit.) .

3. Die Plasmide pSVHl, pSG2 und pSG5 sowie deren Derivate gehören zu unterschiedlichen Kompatibilitatsklassen.3. The plasmids pSVH1, pSG2 and pSG5 and their derivatives belong to different compatibility classes.

Zudem sind sie mit pIJlOl- und SLPl.2-Replikons kompatibel. Somit ist es möglich, parallel unterschiedliche Gene auf verschiedene Replikons in einer Zelle zu untersuchen, und zwar jeweils in ausgesuchter Kopienzahl. They also come with pIJlOl and SLPl.2 replicons compatible. It is thus possible to target different genes to different replicons in a cell in parallel examine, in each case in selected number of copies.

Auf Grund Ihrer vorteilhaften Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Pendelvektoren nicht nur zur Untersuchung von Genen und zur Kartierung von Replikons (beispielsweise durch Transposon-Mutagenese in JS^ co.ll), sondern auch zur Veränderung und zum Transfer von Genen. Die Arbeitsweise ist allgemein bekannt und beispielsweise in den vorstehend genannten Patentdokumenten, den US-Patentschriften 4 332 900, 4 338 400, 4 340 674, 4 343 906, 4 362 816, 4 362 817, 4 393 137 und 4 401 761 sowie in dem Lehrbuch von Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982, beschrieben. Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Pendelvektoren zur Expression von Fremdgenen in Streptomyceten.Due to their advantageous properties, the Pendulum vectors according to the invention not only for investigation of genes and for mapping replicons (for example by transposon mutagenesis in JS ^ co.ll), but also for Modification and transfer of genes. The method of operation is well known and, for example, in the above cited patent documents, U.S. Patents 4,332,900, 4,338,400, 4,340,674, 4,343,906, 4,362,816, 4,362,817, 4,393,137 and 4,401,761 and in the textbook by Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982. The invention thus also relates to the use of the shuttle vectors according to the invention for expressing foreign genes in streptomycetes.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.The invention is explained in more detail in the following examples.

Zunächst wird die Isolierung des Plasmids pSG5 beschrieben:First, the isolation of the plasmid pSG5 is described:

Zur Kultivierung des Stammes S. ghanaensls DSM 2932 fürFor the cultivation of the strain S. ghanaen sls DSM 2932 for

eine anschließendea subsequent AA. 1010 SS. Lyse sind folgendeLyse are as follows II. 33 SS. Medien geeignet:Media suitable: 3030th SS. LysemedlumLysis medlum 44th SS. Lysemedium BLysis medium B VJlVJl SS. Lysemedium CLysis medium C 1010 66th Glucoseglucose 44th SS. Yeast Extr.Yeast Extr. 33 gG CASO-BouillonCASO broth 11 11 PeptonPeptone 22 SS. PeptonPeptone 1010 gG (Merck # 5459)(Merck # 5459) Yeast Extr.Yeast Extr. 44th SS. Malzextr.Malt extr. 340340 SS. GlycinGlycine KH2PO4 KH 2 PO 4 0,50.5 SS. Glucoseglucose VJlVJl SS. H2OH 2 O K2HPO]1 -K 2 HPO] 1 - 1010 SS. SucroseSucrose 11 SS. MgSO4 MgSO 4 11 11 GlycinGlycine 11 11 GlycinGlycine MgCl2-OH2OMgCl 2 -OH 2 O H2OH 2 O H2OH 2 O

In einem 500 ml Erlenmeyerkolben werden ca, 100 ml Nährmedium mit einer homogenisierten Einzelkolonl.e beimpft und 2-3 Tage bei 300C im Rundschüttler (120 rpm) inkubiert.In a 500 ml Erlenmeyer flask ca be inoculated 100 ml of nutrient medium with a homogenized Einzelkolonl.e and incubated 2-3 days at 30 0 C in a rotary shaker (120 rpm).

Ca. 50 ml einer 3 Tage alten, homogenisierten Flüssig-. kultur werden in JA-20 Bechern einer Beckman-Kühlzentrifuge J21C geerntet (10 min, 10000 rpm, 25°C) und einmal in TESu (10 mM TriS'HCl, 1 mM EDTA (pH 8), 10 % Sucrose), gewaschen. 2 g Zellen werden In 5 ml Lysozymlösung ' resuspendiert (0,3 M Sucrose, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 25 mM EDTA (pH 8), 4 mg/ml Lysozym) und bei 370C im Rundschüttler (100 rpm) inkubiert. Nach 30 - 45 min sind die Zellen protoplastiert. Durch Zugabe von 2,5 ml Lysemix (0,3 M NaOH, 2 % Natrium-Dodeeylsulfat) und sofortiges kräftiges Mischen erfolgt die Auflösung der Zellmembran und eine Denaturierung der DNA. Eine lOminütige Hitzebehandlung (700C) komplettiert die Lyse und Denaturierung. Bei Raumtemperatur werden 800 ul saure Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben (Herstellung der sauren Phenol/Chlorform-Lösung: 500 ml Chloroform, 200 ml H3O, 500 g Phenol, 0,5 g Hydroxychinolin misehen und untere Phase benutzen), um die Proteine au denaturieren und die DNA zu renaturieren. Das Gemisch wird ca. 20 see in einem Schüttler ((^VORTEX) durchmischt und dann in der Kühlzentrifuge pelletiert (15 min, 12000 rpm, 40C).Approx. 50 ml of a 3-day-old, homogenized liquid. culture are harvested in JA-20 beakers of a Beckman J21C refrigerated centrifuge (10 min, 10000 rpm, 25 ° C.) and washed once in TESu (10 mM TriS'HCl, 1 mM EDTA (pH 8), 10 % sucrose). 2 g of cells are suspended in 5 ml of lysozyme solution 'resuspended (0.3 M sucrose, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 25 mM EDTA (pH 8), 4 mg / ml lysozyme) and incubated at 37 0 C in a rotary shaker (100 rpm) incubated. After 30-45 minutes, the cells are protoplasted. By adding 2.5 ml of lysis mix (0.3 M NaOH, 2 % sodium dodecyl sulfate) and immediately vigorous mixing, the cell membrane is dissolved and the DNA is denatured. A lOminütige heat treatment (70 0 C) completes the lysis and denaturation. 800 μl of acidic phenol / chloroform solution are added at room temperature (preparation of the acidic phenol / chloroform solution: 500 ml of chloroform, 200 ml of H 3 O, 500 g of phenol, 0.5 g of hydroxyquinoline, and use the lower phase) Denature proteins and renature DNA. The mixture is about 20 lake in a shaker ((^ VORTEX) mixed and then in the refrigerated centrifuge pelleted (15 min, 12000 rpm, 4 0 C).

7 ml des plasmidhaltigen Überstands werden dann in der Ultrazentrifuge weitergereinigt: 7 g CsCl, 7 ml Lysat und 0,2 ml Ethidiumbromidlösung (30 mg/ml) werden gemischt und in einer Ultrazentrifuge (^R^KONTRON TGA50) 48 h bei 34000 rpm (200C) zentrifugiert. Die Plasmidbande wird nach UV-Bestrahlung über Fluoreszenz sichtbar gemacht und mit der Spritze entnommen. Die Lösung wird entfärbt und dialysiert und steht dann für weitere Untersuchungen zur Verfügung. Sie enthält ca. 1 ng Plasmid-DNA/20 μΐ Lösung.7 ml of the plasmid-containing supernatant are then further purified in the ultracentrifuge: 7 g CsCl, 7 ml lysate and 0.2 ml ethidium bromide solution (30 mg / ml) are mixed and placed in an ultracentrifuge (^ R ^ KONTRON TGA50) for 48 h at 34,000 rpm ( 20 0 C) centrifuged. The plasmid band is made visible by fluorescence after UV irradiation and removed with the syringe. The solution is decolorized and dialyzed and is then available for further investigations. It contains approx. 1 ng of plasmid DNA / 20 μΐ solution.

Beispiel 1:Example 1:

Herstellung des Plasmids pSLE40 (als Beispiel eines modifizierten Plasmids der pBR~Reihe):Production of the plasmid pSLE40 (as an example of a modified plasmid of the pBR ~ series):

pBR325-DNA kann aus plasmldtragenden Zellen nach den bekann-. ten Verfahren (Maniatls et al.) gewonnen werden. Das Plasmid pIJ6 kann aus Streptomyces lividans TC14 mit den bekannten Streptorayceten-Techniken isoliert werden (siehe Isolierung von pSG5, pSG2 oder z.B. Thompson et al., ' Nature £86 (I98O) 525 oder US-Patentschrift 4 36O 597).pBR325-DNA can be obtained from plasma-carrying cells according to the known. th method (Maniatls et al.) can be obtained. The plasmid pIJ6 may be made of Strep tomyces lividan s TC14 with the known Streptorayceten techniques are isolated (see isolation of pSG5, pSG2 or, for example, Thompson et al., "Nature £ 86 (I98O) 525 or U.S. Patent 4 36O 597).

Zur Klonierung wird das Plasmid pBR325 mit dem Restriktionssenzym BamHI linearisiert. 1 ug DNA wird im Spaltungspuffer (50 mM Tris.HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 50 mM NaCl) in Gegenwart von 1 unit BamHI (Hersteller: BRL, Neu Isenburg) 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Phenolisierung (Maniatis et al.) gestoppt und die DNA durch Ethanolfällung gereinigt. Zur Gewinnung des DNA-Fragments, das die Thiostreptonresistenz trägt, wird pIJ6-DNA mit Bell genschnitten (Verfahren wie oben, mit der Änderung Bell statt BamHI, Inkubation 500C statt 37°C). Eine anschließende Behandlung von pBR325 mit alkalischer Phosphatase (aus Kälberdarm, Hersteller: Boehringer Mannheim) entfernt die 5'-Phosphatenden der DNA und verhindert die Religierung von PBR325 (Maniatis et al.). Die beiden DNA-Proben (im Spaltungspuffer) werden gemischt (0,1 ng pBR325 und 1 ng pIJ6) und auf 700C erhitzt, um Η-Brücken zu öffnen. Durch Zugabe von Mercaptoethanol (Endkonz. 10 mM) und ATP (0,1 mM) werden die Reaktionsbedingungen eingestellt. Die DNA wird in Gegenwart von 1 unit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) bei 4°C für 12 h Inkubiert. Mit dem DNA-Gemisch wird E^ coil transformiert (Maniatis et al.) und die Zellen auf Chloramphenlcolresistenz und Tetracyclinsensltivität selektioniert. For cloning, the plasmid pBR325 is linearized with the restriction enzyme Bam HI. 1 μg of DNA is incubated in the cleavage buffer (50 mM Tris.HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl, 50 mM NaCl) in the presence of 1 unit of BamHI (manufacturer: BRL, Neu Isenburg) at 37 ° C. for 1 hour. The reaction is stopped by phenolization (Maniatis et al.) And the DNA is purified by ethanol precipitation. To obtain the DNA fragment carrying the thiostrepton resistance, pIJ6 DNA is mixed with Bel l oxy itten (procedure as above, with the change Bel l instead of Bam HI, incubation 50 0 C instead of 37 ° C). A subsequent treatment of pBR325 with alkaline phosphatase (from calf intestine, manufacturer: Boehringer Mannheim) removes the 5'-phosphate ends of the DNA and prevents religation of PBR325 (Maniatis et al.). The two DNA samples (in cleavage buffer) are mixed (0.1 ng pBR325 and 1 ng pIJ6) and heated to 70 0 C, to open Η-bridges. The reaction conditions are set by adding mercaptoethanol (final concentration 10 mM) and ATP (0.1 mM). The DNA is incubated in the presence of 1 unit of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim) at 4 ° C. for 12 h. E ^ coil is transformed with the DNA mixture (Maniatis et al.) And the cells are selected for resistance to chloramphenol and tetracycline sensitivity.

Einzelkolonien werden einer Schnellyse (T. Eckhardt, Plasmid 1_ (1978) 584) zur Größenbestimmung unterworfen. Es ist b.ekannt, daß das Thiostreptonresistenzgen auf einem 1,1 kb langen Bcll-Pragment des pIJ6-Plasmids lokalisiert ist (Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 165 (1982) 223), d.h. imIndividual colonies are subjected to rapid lysis (T. Eckhardt, Plasmid 1_ (1978) 584) to determine their size. It is known that the thiostrepton resistance gene is localized on a 1.1 kb long BclI fragment of the pIJ6 plasmid (Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 165 (1982) 223), ie im

Agarosegel wird ein Plasmid der Größe 6,9 kb (pBR325 5,8 kb + Thiostrepton-Resitenzgen (Thior) 1,1 kb) gesucht. Aus. Zellen, die ein Plasmid der geforderten Länge tragen, wird DNA Isoliert (s. oben) und durch eine Restriktionsanalyse geklärt, ob das richtige DNA-Fragment inseriert ist. Restriktionsschnitts teilen des Fragments sind bekannt (Kieser et al.), so daß die erfolgreiche Klonlerung verfiziert werden kann.Agarose gel, a plasmid of size 6.9 kb (pBR325 5.8 kb + thiostrepton resistance gene (Thio r ) 1.1 kb) is searched for. The end. Cells that carry a plasmid of the required length, DNA is isolated (see above) and a restriction analysis is used to determine whether the correct DNA fragment has been inserted. Restriction cut parts of the fragment are known (Kieser et al.), So that successful cloning can be verified.

Beispiel 2: Example 2:

Herstellung des Pendelvektors pSW3HCreation of the pendulum vector pSW3H

Das Plasmid pSLEll kann aus E^ coil nach den bekannten Verfahren (Maniatis et al.) gewonnen werden. Das Plasmid pSG5 wird aus S_._ ghanaensis isoliert wie oben beschrieben.The plasmid pSLEll can be obtained from E ^ coil by the known methods (Maniatis et al.). The plasmid pSG5 is isolated from S. ghana ensis as described above.

Zur Klonierung worden beide Plasmj.de parallel mit EcoRI linearisiert. 1 ug DNA wird im Spaltungspuffer in Gegenwart von 1 unit EcoRI (Hersteller; Boehringer Mannheim) 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Phenolisierung gestoppt, die DNA durch Ethanolfällung gereinigt (Maniatis et al.).Both Plasmj.de were linearized in parallel with EcoR I for cloning. 1 ug of DNA is incubated in the cleavage buffer in the presence of 1 unit of EcoRI (manufacturer; Boehringer Mannheim) at 37 ° C. for 1 h. The reaction is stopped by phenolization and the DNA is purified by ethanol precipitation (Maniatis et al.).

pSLEll-DNA wird zweckrnä&igerweise noch mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Religierung zu unterbinden (Maniatis et al.).pSLEII-DNA is expediently treated with more alkaline Phosphatase treated to prevent religation (Maniatis et al.).

Die DNA-Proben (im Spaltungspuffer) werden dann gemischt (0,2 ug pSLEll, 1 ug pSG5), auf 700C erhitzt und durch Zugabe von Mercaptoethanol (Endkonz. 10 mM) und ATP (0,1 mM) auf die Ligase-Reaktionsbedingungen eingestellt. In Gegenwart von 1 unit T1J-DNA-LJgase (Boehringer Mannheim) wird das Gemisch 12 h bei 4°C inkubiert.
35The DNA samples (in cleavage buffer) are then mixed (0.2 ug pSLEll, 1 ug pSG5), heated to 70 0 C and quenched by addition of mercaptoethanol (final conc. 10 mM) and ATP (0.1 mM) of the ligase -Reaction conditions set. In the presence of 1 unit T 1 J-DNA LJgase (Boehringer Mannheim) is incubated the mixture for 12 h at 4 ° C.
35

- /it - w - / it - w

Anschließend wird das Geraisch nach E. coli transformiert (Maniatis et al.) und auf Kolonien mit Ampicillinresistenz und Chloramphenicolsensitivität selektioniert. Kolonien mit entsprechendem Resistenzmuster werden einer Schnellyse zur GröföenbeStimmung unterworfen. Aus Zellen, die ein Plasmid der geforderten Länge (24,3 kb) enthalten, wird Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse geklärt, ob der gewünschte Pendelvektor pSW311 vorliegt.The Geraisch is then transformed into E. coli (Maniatis et al.) And selected for colonies with ampicillin resistance and chloramphenicol sensitivity. Colonies with a corresponding resistance pattern are subjected to a rapid lysis to determine the size. Plasmid DNA is isolated from cells which contain a plasmid of the required length (24.3 kb) and restriction analysis is used to determine whether the desired shuttle vector pSW311 is present.

In analoger Weise können die in der"Tabelle 3 genannten Hybridplasmide hergestellt werden.In an analogous manner, those mentioned in "Table 3" can be used Hybrid plasmids are produced.

Beispiel 3:Example 3:

Herstellung des Plasmids pSLE4l (als Beispiel eines modifizierten Plasmids der pAC-Reihe):Preparation of the plasmid pSLE4l (as an example of a modified plasmid of the pAC series):

Konstruktion von pSLE4lConstruction of pSLE4l

pACYCl84-DNA kann aus plasmidtragenden Zellen nach den bekannten Verfahren (Maniatis et al.) gewonnen werden. WiIdtyp-E. coli-Zellen besitzen allerdings eine Dam-Methylase, die die DNA so modifizieren, daß die erforderliche Restriktion mit Bell nicht möglich ist. Zur DNA-Isolierung wird in diesem Falle also eine Dam"-Mutante von Ej_ coil verwendet.pACYCl84-DNA can be obtained from plasmid-carrying cells by the known methods (Maniatis et al.). Wild-type E. coli cells, however, have a Dam methylase which modifies the DNA in such a way that the required restriction with Bell is not possible. For DNA isolation that is, a Dam "mutant is used by Ej_ coil in this case.

Das Plasmid pIJ6 kann aus Streptomyces li.vi.dans TCl4 nach den bekannten Streptomyceten-Techniken isoliert werden (siehe oben).
30The plasmid pIJ6 can be isolated from Streptomy ces li.vi.dans TCl4 by the known streptomycete techniques (see above).
30th

Zur Klonierung wird das Plasmid pACYCl84 mit dem Restriktionsenzym BcI1I linearisiert.For cloning, the plasmid pACYCl84 is linearized with the restriction enzyme BcI 1 I.

1 ug DNA wird im Spaltungspuffer in Gegenwart von 1 unit Bell (Hersteller: BRL, Neu-Isenburg) 1 h bei 500C inkubiert. Die Reaktion wird durch Phenollsierung gestoppt und1 μg DNA is incubated in the cleavage buffer in the presence of 1 unit Bell (manufacturer: BRL, Neu-Isenburg) at 50 ° C. for 1 h. The reaction is stopped by phenolation and

die DNA durch Ethanolfällung gereinigt. Eine anschließende Behandlung mit alkalischer Phosphatase (aus Kälberdarm, Hersteller: Boehringer Mannheim) entfernt die 5'-Phosphatenden der DNA und verhindert die Rellgierung von pACYCl84. Zur Gewinnung des DNA-Fragments, das die Thiostreptonresistenz trägt, wird pU6-DNA mit Bell geschnitten (Verfahren s.o.)·the DNA was purified by ethanol precipitation. A subsequent treatment with alkaline phosphatase (from calf intestines, Manufacturer: Boehringer Mannheim) removes the 5'-phosphate ends of the DNA and prevents pACYCl84 from re-alloying. To obtain the DNA fragment showing the thiostrepton resistance carries, pU6-DNA is cut with Bell (Procedure see above)

Die beiden DNA-Proben (im Spaltungspuffer) werden gemischt (0,1 ug pACYCl84, 1 |ig pIJ6) und auf 700C erhitzt, um Η-Brücken zu öffnen. Durch Zugabe von Mercaptoethanol (Endkonz. 10 mM) und ATP (0,1 mM) werden die Reaktionsbedingungen eingestellt. Die DNA wird in Gegenwart von 1 unit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) bei 40C für 12 h inkubiert. The two DNA samples (in cleavage buffer) are mixed (0.1 ug pACYCl84, 1 | ig pIJ6) and heated to 70 0 C, to open Η-bridges. The reaction conditions are set by adding mercaptoethanol (final concentration 10 mM) and ATP (0.1 mM). The DNA is incubated in the presence of 1 unit of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim) at 4 ° C. for 12 h.

Mit dem DNA-Gemisch wird E. coli transformiert (Maniatis et E. coli is transformed with the DNA mixture (Maniatis et

y ————— y —————

al.) und die Zellen auf Tetracyclin- und Chloramphenicolresistenz selektioniert.al.) and the cells selected for tetracycline and chloramphenicol resistance.

Einzelkolonien werden einer Schnellyse zur Größenbestimmung unterworfen. Im Agarosegel wird ein Plasmid der Größe 5,4 kb (pACYC 184 4,3 kb + Thior 1,1 kb) gesucht. Aus Zellen, die ein Plasmid der geforderten Länge tragen, wird DNA isoliertIndividual colonies are subjected to rapid lysis to determine their size. A plasmid of size 5.4 kb (pACYC 184 4.3 kb + Thio r 1.1 kb) is searched for in the agarose gel. DNA is isolated from cells which carry a plasmid of the required length

(s. oben) und durch eine Restriktionsanalyse geklärt, ob das richtige DNA-Fragment inseriert ist. Die Restriktionsschnitte des Fragments sind bekannt (Kieser et al.), so daß die erfolgreiche Klonierung verifiziert werden kann.(see above) and a restriction analysis clarified whether the correct DNA fragment has been inserted. The restriction cuts of the fragment are known (Kieser et al.), So that the successful cloning can be verified.

Beispiel 4:Example 4:

Herstellung des Plasmids pSW344EConstruction of plasmid pSW344E

Das Plasmid pSLE4l kann aus E_;_ coil nach den bekannten Verfahren (Maniatis et al.) gewonnen werden. Das Plasmid pSG5 wird aus S^ ghanaensis 2932 isoliert wie oben beschrieben.The plasmid pSLE41 can be obtained from E _; _ coil by the known method (Maniatis et al.). The plasmid pSG5 is isolated from S ^ ghanaensis 2932 as described above.

Zur Klonierung werden beide Plasmide parallel mit EcoRI llnearisiert. 1 ng DNA wird im Spaltungspuffer in Gegenwart von 1 unit EcoRI (Hersteller: Boehringer Mannheim) 1 h bei 370C inkukubiert. Die Reaktion wird durch Phenolisierung gestoppt und die DNA durch Ethanolfällung gereinigt. pSLE4l-DNA wird zweckmäßigerweise noch mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Religierung zu unterbinden. Die DNA-Proben (im Spaltungspuffer) werden dann gemischt (0,2 ug pSLE41, 1 ug pSG5), auf 700C erhitzt und durch Zugabe von Mercaptoethanol (Endkonz. 10 mM) und ATP (0,1 mM) auf die Ligase-Reaktionsbedingungen eingestellt. In Gegenwart von 1 unit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) wird das Gemisch 12 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wird das Gemisch nach E_^_ coil transformiert (Maniatis et al.) und auf Kolonien mit Tetracyclinresistenz und Chlora.mphen3.colsensitivität selektioniert.For the cloning, both plasmids are linearized in parallel with EcoR I. 1 ng DNA in digestion buffer in the presence of 1 unit of EcoR I (manufactured by Boehringer Mannheim) inkukubiert 1 h at 37 0 C. The reaction is stopped by phenolization and the DNA is purified by ethanol precipitation. pSLE41-DNA is expediently treated with alkaline phosphatase in order to prevent religation. The DNA samples (in cleavage buffer) are then mixed (0.2 ug pSLE41, 1 ug pSG5), heated to 70 0 C and quenched by addition of mercaptoethanol (final conc. 10 mM) and ATP (0.1 mM) of the ligase -Reaction conditions set. The mixture is incubated at 4 ° C. for 12 h in the presence of 1 unit of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim). The mixture is then transformed into E _ ^ _ coil (Maniatis et al.) And selected for colonies with tetracycline resistance and Chlora.mphen3.col sensitivity.

Kolonien mit entsprechendem Resistenzmuster werden einer Schnellyse zur Größenbestimmung unterworfen. Aus Zellen, die ein Plasmid der geforderten Länge (18,1 kb) enthalten, wird DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse geklärt, ob die DNA das entsprechende Restriktionsrauster liefert, das bei. einer Ligierung von pSLE4l und pSG5 gefordert .werden muß.Colonies with a corresponding resistance pattern are subjected to rapid lysis to determine their size. From cells which contain a plasmid of the required length (18.1 kb), DNA is isolated and clarified by restriction analysis whether the DNA provides the corresponding restriction pattern, the at. ligation of pSLE41 and pSG5 must be required.

In analoger Weise können die in der Tabelle 5 genannten Hybridplasmide hergestellt v/erden.The hybrid plasmids mentioned in Table 5 can be produced in an analogous manner.

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Claims (4)

. HOE 84/F PATENTANSPRÜCHE: HOE 84/F. HOE 84 / F PATENT CLAIMS: HOE 84 / F 1. Hybridplasmid, enthaltend ein Streptomyceten-Replicon, das sich von den Plasmiden pSG2, pSG5 oder pSVHl ableitetj und ein E^ coli-Replicon.1. Hybrid plasmid, containing a Streptomycete replicon, which is derived from the plasmids pSG2, pSG5 or pSVHl and an E ^ c oli replicon. 2. Plasmid nach Anspruch 1, in dem das Ej^ coli-Replicon sich von einem Plasmid der Reihe pBR322, pBR325, pACYC177 oder pACYCl84 ableitet.2. Plasmid according to claim 1, in which the Ej ^ coli replicon is derived from a plasmid of the series pBR322, pBR325, pACYC177 or pACYCl84. 3. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, das in Streptomyceten und E_^_ _co_li repliziert wird.3. Plasmid according to claim 1 or 2, which is replicated in Streptomycetes and E _ ^ _ _co_li. 4. Verwendung der Plasmide nach Anspruch 1 bis 3 zur Expression von Genen in Streptomyceten.4. Use of the plasmids according to claim 1 to 3 for the expression of genes in Streptomycetes.
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