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Verfahren zur Gewinnung von Cu Zn Superoxiddismutase aus roten Blut-
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9 2 zellen von Wirbeltieren.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Cu2Zn2Superoxiddismutase
aus roten Blutkörperchen von Wirbeltieren, insbesondere Säugetieren.
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Superoxiddismutasen sind Enzyme, die das radikalische Superoxidanion
°2 in Gegenwart von Protonen nach folgender Gleichung disproportionieren ( Journal
of Biological Chemistry, Band 244, S.6049-5055, 1969 ).
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Superoxid, bzw. seine Folgeprodukte können im physologischen Geschehen
potentiell toxisch wirken, indem sie zum Beispiel die Gelenkflüssigkeit oder auch
das genetische Material angreifen können.
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Es gibt Superoxiddismutasen, die entweder Eisen oder Mangan oder Kupfer
und Zink enthalten. Das letztere Enzym kommt in den Zellen höherer Lebewesen vor
und ist am weitesten verbreitet. Die Kupfer-und Zink enthaltende Superoxiddismutase
( Cu2Zn2Superoxiddismutase ) aus den roten Blutkörperchen vom Rind hat ein Molekulargewicht
von 31 300 und besteht aus zwei identischen Untereinheiten mit je einem Kupfer und
einem Zink. Die Sequenz der Aminosäuren sowie deren räumliche Anordnung ist bekannt.
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Cu2Zn2Superoxiddismutase ist eines der widerstandsfähigsten Enzyme
gegenüber Denaturierung durch Hitze ( Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische
Chemie, Band 353, S. 1059-1068, 1972 ).
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Ebensowenig wird sie durch proteinabbauende Enzyme zerstört.
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Gereinigte Rinderblut-Superoxiddismutase kommt in zwei Ladungsisomeren
mit isoelektrischen Punkten von pH 5,2 und pH 4,9 vor.
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Derzeit findet Cu2Zn2Superoxiddismutase ( im folgenden kurz Superoxiddismutase
genannt ) in zwei Bereichen Anwendung.
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Auf der einen Seite wird es in analytischen Enzymlabors als Testprotein
verwendet und zum anderen wird es pharmakologisch gegen Krankheiten angewandt, die
unter dem Oberbegriff Rheumatismus zusammengefasst sind. Zum Beispiel wird bei Arthritis
ein Mechanismus diskutiert, bei dem 02-Radikale entstehen. Diese wiederum führen
zur Zersetzung der Gelenkflüssigkeit und verschlimmern dadurch das Leiden. Superoxiddismutase
kann die 02-Radikale abfangen und dadurch die Zersetzung der Gelenkflüssigkeit verhindern.
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Bislang ist das Mittel "Orgotein" ( gereinigte Superoxiddismutase
) hauptsächlich bei Gelenksentzündungen von Pferden angewandt worden.
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Mittlerweile ist auch Rinder-Superoxiddismutase für die Anwendung
am Menschen unter dem Handelsnamen "Peroxinorm" auf dem Markt.
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Die Hauptschwierigkeit bei der Isolierung von Superoxiddismutase aus
Blut ist die Abtrennung des Hämoglobins. Die erste Isolierung von Superoxiddismutase
gelang bereits 1938 durch aufwendigeChromatographieverfahren. In den fünfziger und
sechziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde das Enzym durch Behandlung von hämolysierten
roten Blutkörperchen mit Schwermetallsalzen ( z.B. Bleiacetat ) isoliert.
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Im Jahre 1969 wurde eine Isolierungsmethode entwickelt, die auf der
Abtrennung des Hämoglobins mit organischen chlorierten Lösungsmitteln beruht (Journal
of Biological Chemistry, supra). Diese Methode wurde später noch modifiziert und
verbessert (Biochimica et Biophysica Acta, Band 243, S 203-213, 1971). Diese Isol:ierungsmethode
ergibt sehr reine Superoxiddismutase, hat jedoch den Nachteil, daß sie sehr aufwendig
ist (Dauer ca. 7 Tage), einen hohen Verbrauch an Chemikalien hat und aus arbeitsmedizinischen
Gesichtspunkten wegen der Verwendung chlorierter organischer Verbindungen erhebliche
Bedenken bestehen. Die Gesamtausbeute an reiner Superoxiddismutase beträgt lediglich
20c: von dem im roten Blutkörperchen vorkommenden Enzym.
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Ebenfalls 1969 wurde auch eine rein wässrige Isolierungsmethode entwickelt,
die durch Modifizierungen bis auf 50% Gesamtausbeute gesteigert werden konnte (
FEBS Letters, Band 155, S. 15-18, 1983 ). Diese Isolierung, die auf der Bindung
von Superoxiddismutase an schwach basische Ionenaustauscher beruht, liefert ebenfalls
ein sehr reines Enzym. Sie ist jedoch sehr aufwendig und allenfalls für den Labormaßstab
geeignet.
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Desweiteren ist eine Isolierungsmethode bekannt, die eine Verbindung
der früheren Schwermetallmethode mit der Hitzebehandlung darstellt ( JA-OS 53-31
206 ). Hierbei werden hämolysierte rote Blutkörperchen in Gegenwart zweiwertiger
Metallsalze erhitzt und dadurch Hämoglobin ausgefällt. Diese Isolierungsmethode
liefert nur unreine Superoxiddi smutase von vergleichsweise geringer Aktivität.
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Eine andere bekannte Methode ( JA-OS 49-50 195 ) unterwirft hämolysierte
rote Blutkörperchen einer Hitzebehandlung mit anschließender proteolytischer Zersetzung
des Oberstandes. Auch hier erhält man geringe Ausbeuten von relativ unreinem Enzym.
Außerdem ist die Anwendung proteolytischer Enzyme im technischen Maßstab schlecht
kontrollierbar.
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Schließlich ist eine Isolierungsmethode bekannt ( DE-PS Nr. 31 24
228), die eine Verbesserung der beiden letztgenannten Methoden darstellt. In zwei
Verfahrensstufen werden hämolysierte rote Blutkörperchen in Gegenwart eines anorganischen
Neutralsalzes und eines Obergangsmetallsalzes erhitzt und der gebildete Niederschlag
entfernt. Bei dieser Methode erhält man nach der zweimaligen Hitzebehandlung klare
Lösungen ohne störendes Hämoglobin, jedoch ist die Verfahrenstechnik durch die zweimalige
Erhitzung recht aufwendig. Die Verwendung von Neutralsalzen erfordert einen zusätzlichen
Dialyseschritt vor der Chromatographie.
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Nach den Angaben dieser Patentschrift erhält man ein Protein, das
eine Komplexverbindung mit Superoxiddismutase und Hämoglobin bilden kann.
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Dieses sogenannte Affinitätsprotein soll bei Hitzedenaturierung, Gefrieren
oder Altern von roten Blutkörperchen Komplexe mit Superoxiddismutase bilden und
diese dadurch inaktivieren. Es soll sich bei diesem Affinitätsprotein um ein Lipoprotein
handeln, das durch die
Zugabe der einwertigen Neutralsalze mit anschließender
Hitzebehandlung abgetrennt werden kann.
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Neuere der Erfindung zugrunde liegende Untersuchungen lassen diese
Theorie zweifelhaft erscheinen. Zwar ist bekannt, daß bei der Reinigung von Superoxiddismutase
ein Begleitprotein auftritt, das ähnliche Eigenschaften wie die Superoxiddismutase
hat, jedoch zeigt dieses kaum lipophile Eigenschaften. Es kann weder bei hohen noch
bei niederen Ionenstärken durch stark lipophile Adsorptionsgele abgetrennt werden.
Außerdem ist die bekannte Isolierungsmethode widersprüchlich. Würde nämlich beim
Altern der obengenannte Komplex aus Superoxiddismutase und dem Affinitätsprotein
entstehen, so wäre die Ausbeute an freier Superoxiddismutase aus gealterten roten
Blutkörperchen geringer als bei nicht gealterten. Dies ist nicht der Fall.
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Desweiteren wurde dabei gefunden, daß die Hitzebehandlung von hämolysierten
roten Blutkörperchen in bezug auf Superoxiddismutase bei hohen Salzkonzentrationen
wesentlich ungünstiger verläuft als bei niederen Salzkonzentrationen. Hohe Salzkonzentrationen
stabilisieren Hämogl obi n, während niedere Salzkonzentrationen die Superoxi ddi
smutase stabilisieren. Bei Anwendung niederer Salzkonzentrationen besteht außerdem
der Vorteil, daß die Dialyse des Rohextrakts für die nachfolgende Chromatographie
entfällt.
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Die gereinigte Superoxiddismutase, die nach dem oben beschriebenen
Verfahren gereinigt wurde, hat eine durchschnittliche spezifische Enzymaktivität
von 2200 U/mg Protein. Hochgereinigte Superoxiddismutase, die nach früheren Verfahren
hergestellt wurde, hat aber eine spezifische Aktivität von 3300 U/mg Protein (Journal
of Biological Chemistry, supra).
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Das heißt, das erstgenannte Enzym ist nur zu zwei Dritteln angereichert
und enthält noch 30C. Verunreinigungen durch andere Proteine.
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Superoxiddismutase ist immunologisch äußerst schwach aktiv. Enzyme
verschiedener Tierarten einschließlich des Menschen gleichen sich in der Sequenz
der Aminosäurereste. Deshalb läßt sich das gereinigte Enzym aus Rinderblut auch
problemlos am Menschen anwenden. Grundvoraussetzung
dafür ist allerdings,
daß die Superoxiddismutase absolut frei von Fremdproteinen ist. Bei Anwesenheit
auch nur geringer Spuren an Fremdproteinen können starke allergische Reaktionen
beim Patienten auftreten, die das primäre Krankheitsbild (z.B. Arthritis) bei weitem
übertreffen.
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Die Superoxiddismutase, die nach dem oben beschreibenen Verfahren
gereinigt wurde, ist nur bis zu zwei Dritteln Reinheit angereichert. Aus den genannten
Gründen bestehen daher erhebliche Bedenken bei klinischer Anwendung.
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Demgemäß ist es Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Isolierung
von Superoxiddismutase verfügbar zu machen, das auch in großtechnischem Maßstab
einfach,schnell und billig ist und auch eine absolute Reinheit des Endproduktes
ermöglicht.
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Diese Aufgabe ist mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs
1 gelöst und mit jenen der Unteransprüche weitergebildet. Das erfindungsgemäße Verfahren
arbeitet in seiner ersten Stufe im Prinzip ohne chemische oder biochemische Zusätze.
Es kann frisches, tiefgefrorenes oder konserviertes Blut verwendet werden. Eine
teilweise Abtrennung von Blutnlasr;a ist zu empfehlen, vorzuziehen ist jedoch dessen
vollständige Entfernung.
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Vorteilhaft, aber nicht erforderlich ist die Stabilisierung des Blutes
mit saurem Citrat, so daß ein pH von 6.5-7.0 erreicht wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren beginnt mit der Hämolyse der roten
Blutkörperchen, wobei mit dem zwei- bis vierfachen Volumen an destilliertem oder
Leitungswasser unter heftigem Rühren verdünnt wird. Die Lösung wird dann 1-60 Minuten,
vorzugsweise 10-20 Minuten, z.B. 15 Minuten 0 unter starkem Rühren auf Temperaturen
von 60-90 C, vorzugsweise von 70-800C, z.B. bei 750C erhitzt. Dabei werden 93-97
des Hämoglobins und die meisten Nichthämoglobinproteine außer Superoxiddismuase
ausgefällt. Es wird bewußt in Kauf genommen, daß noch geringe Mengen Hämoglobin
im überstand der Superoxiddismutaselösung verbleiben, die Lösung also noch schwach
rot ist. Das restliche Hämoglobin kann durch die nachfolgende Chromatographie leicht
abgetrennt werden.
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Nach dem Abkühlen der Lösung wird zentrifugiert oder filtriert oder
durch mehrere Lagen Textilgewebe gepreßt. Der klare Oberstand wird mit verdünnter
Essigsäure auf pH 6.4 bis 6.8 eingestellt und an Diethylaminoethyl-Ionenaustauschern,
vorzugsweise DEAE-Cellulose (Partikelgröße 40-160 cm, etherverbrückte Diethylaminoethyl-Glucose
und Quervernetzung der Cellulose mit Epichlorhydrin; unter dem Handelsnamen der
Firma Pharmacia "DEAE-Sephacel") chromatographiert.
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Unter diesen Bedingungen wird das restliche Hämoglobin vollständig
abgetrennt. Das gewonnene Eluat wird lyophilisiert. Dabei wird das oben beschriebene
Begleitprotein der Superoxiddismutase vollständig denaturiert. Alternativ kann das
Volumen auch durch Ultrafiltration verkleinert werden. Die verbleibende gelöste
Superoxiddismutase wird anschließend einer Gelfiltration in destilliertem Wasser
unterworfen.
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Man erhält so ein salzfreies hochreines Produkt (Gelfiltration über
epichlorhydrin-vernetztes Dextran ; Handelsbezeichnung der Firma Pharmacia "Sephadex
G-75").
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Das gesamte Isolierungsverfahren kann ohne Beeinträchtigung von Ausbeute
und Reinheit in destilliertem oder Leitungswasser sowie bei Temperaturen von 0-400C,
vorzugsweise von 0-200C, z.B. bei 4 0C durchgeführt werden Nachfolgend werden drei
Beispiele für Isolierungsverfahren nach obigem Muster angeführt. Superoxiddismutase
ist das einzige Kupferprotein der roten Blutkörperchen (FEBS Letters, Band 155,
S. 15-18. 190X3) Somit kann der Kupfergehalt der einzelnen Lösungen direkt mit dem
Gehalt an Superoxiddismutase korreliert werden. Ein Liter rote Blutkörperchen vom
Rind enthalten ca. 500 sg Kupfer. Das entspricht ca. 120 mg Superoxiddi smutase.
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Reinheitskriterien für das Enzym waren UV-Spektroskopie sowie Aktivitätsbestimmungen
mit dem Cytochrom-c-Reduktase Test (Journal of Biological Chemistry, 1963, supra)
oder dem Formazan-Test (FERS Letters, Band 61, s. 209-212, 1976).
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1. Beispiel 375 ml rote Blutkörperchen vom Rind wurden gewaschen und
drei Monate eingefroren. Der Kupfergehalt betrug 185 cig ( - 45 mg Superoxiddismutase
). Nach dem Auftauen wurde 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert, mit 750 ml
Wasser verdünnt und für 15 Minuten auf 750C erhitzt.
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Der Überstand enthielt 125 pg Kupfer ( - 31 mg Superoxiddismutase
) entsprechend 68 % Ausbeute. Er war schwach rot gefärbt. Bei der Ionenaustauschchromatographie
an einer Diethylaminoethyl-Cellulose-Säule lief das rote Hämoglobin durch die Säule
hindurch, während die Superoxiddismutase vollständig gebunden wurde. Die letztere
wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 - 200 mM eluiert. Sie wurde lyophilisiert
und in 12 ml Leitungwasser gelöst. Der verbleibende Niederschlag beimLösen enthielt
kein Kupfer. Nach einer Molekularsiebfiltration mit destilliertem Wasser wurde lyophilisiert.
Die Ausbeute betrug 27 mg mit einer spezifischen Aktivität von 3 300 U/mg. Die Dauer
der Isolierung war 4 Tage.
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2.~Beispiel 250 ml menschliche rote Blutkörperchen, die sechs Wochen
konserviert waren, wurden 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert und dann mit
zwei Volumina Wasser verdünnt. Der Kupfergehalt betrug 120 9 ( - 30 mg Superoxiddismutase).
Erhitzen auf 74-760C für 15 Minuten und Abtrennen des Niederschlags ergab einen
Oberstand von 550 ml mit einem Kupfergehalt von 78 9 ( - 20 mg Superoxiddismutase).
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Ionenaustauscher- und Gelfiltrations-Chromatographie des Oberstandes
wurde wie im 1. Beispiel durchgeführt. Die Ausbeute an Superoxiddismutase betrug
17 mg mit einer spezifischen Aktivität von 3100 U/mg.
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3. Beispiel 320 ml frische rote Blutkörperchen wurden einmal mit 0,7
% NaCl gewaschen und danach mit 1 000 ml Wasser verdünnt. Der Kupfergehalt betrug
165 pg ( - 40 mg Superoxiddismutase ). Die Erhitzungsbedingungen waren wie im Beispiel
1. Im Oberstand des erhitzten Hämolysats befanden sich 110 po Kupfer ( - 27 mg Superoxiddismutase.
Die weitere Reinigung der Superoxiddismutase wurde wie in Beispiel 1 und 2 durchgeführt.
Die Ausbeute an Superoxiddismutase betrug 23 mg mit einer spezifischen Aktivität
von 3 200 U/mg.