DE3329387C2 - - Google Patents

Description

Die quantitative Bestimmung von Cholesterin in freier oder gebundener Form mit Hilfe von Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase ist seit vielen Jahren bekannt. Die Bestimmung von freiem Cholesterin mit Cholesterinoxidase unter Bildung von Cholestenon und Wasserstoffperoxid ist beispielsweise in der DE-PS 22 24 132 und der DE-OS 22 65 122 beschrieben. Die Bestimmung erfolgt dabei entweder durch Ermittlung des Sauerstoffverbrauches, durch Ermittlung der gebildeten Cholestenonmenge oder durch Ermittlung der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge. Der Sauerstoffverbrauch kann beispielsweise mit einer Clark-Elektrode, die Cholestenonmenge photometrisch bei λ = 240 nm und die Wasserstoffperoxidmenge durch gekoppelte Indikatorreaktion mit Peroxidase und Trindersystem oder Katalase und Kageyama-Reaktion bzw. ALDH-Reaktion bestimmt werden.

Gebundenes Cholesterin wird, wie beispielsweise in der DE-OS 25 06 712 beschrieben ist, mit Hilfe von Cholesterinesterase freigesetzt, wonach das freigesetzte Cholesterin wie oben beschrieben bestimmt wird.

Alle diese bekannten Bestimmungsmethoden, wie auch das Verfahren gemäß der DE-OS 26 12 725, waren Endpunktmethoden, die den Sauerstoffverbrauch bzw. die gebildete Cholestenon- oder Wasserstoffperoxidmenge nach im wesentlichen vollständigem Ablauf der Reaktion messen. Solche Endpunktbestimmungen erfordern relativ lange Zeit, da der Ablauf der Reaktion abgewartet werden muß. Dies ist besonders ungünstig bei Verwendung moderner Analysenautomaten, die für einen hohen Probendurchsatz konzipiert sind und nur kurze Inkubationszeiten gestatten. Heute übliche Analysenautomaten sind daher nur mit hoher Analysenfrequenz voll ausgelastet.

Dieses Problem ist bekannt, weswegen man sich in neuerer Zeit um kinetische Bestimmungsmethoden bemüht, die nicht den vollen Reaktionsablauf abwarten müssen, sondern für eine bestimmte Zeitdifferenz den Unterschied im Sauerstoffverbrauch, in der gebildeten Cholestenonmenge oder der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge bestimmen und daher viel kürzere Analysenzeiten benötigen als die Endpunktbestimmungen.

Grundsätzlich sind kinetische Verfahren zur Bestimmung von Enzymsubstraten aus der DE-PS 24 40 011 und der DE-AS 25 58 536 bekannt. In diesen Druckschriften ist aber keine kinetische Bestimmungsmethode für Cholesterin beschrieben.

Auch ist es beispielsweise aus dem Aufsatz "Die Bestimmung von Substanzkonzentrationen auf kinetischer Basis" in "GIT-Labor-Medizin", Heft 2/1981, Seiten 89 bis 94, bekannt, daß bei der kinetischen Bestimmung einer Substratkonzentration die Michaelis-Menten-Gleichung anzuwenden ist, gemäß der die Reaktionsgeschwindigkeit bei Reaktionen erster Ordnung oder pseudoerster Ordnung näherungsweise der Substratkonzentration proportional ist, wenn die Michaelis-Konstante K_m sehr viel größer als die Substratkonzentration im Test ist. Weiterhin ist es bekannt, bei Verwendung von Enzymen, deren Michaelis-Konstante nicht viel größer als die höchste zu bestimmende Substratkonzentration ist, kompetitive Enzyminhibitoren zu verwenden, mit Hilfe deren zu niedrige K_m-Werte der beteiligten Enzyme künstlich erhöht werden.

Die ältere deutsche Patentanmeldung DE-OS 32 08 253 schlägt vor, Phenol oder Phenolderivate als Reaktionspartner für die Farbreaktion mit 4-Aminoantipyrin, nicht als Cholesterinoxidaseinhibitor, bei der Bestimmung des in der LDL-Fraktion enthaltenen Cholesterins in Gegenwart der HDL-Fraktion, also nicht der Gesamtkonzentration zu verwenden.

Schließlich ist aus der DE-OS 30 46 241 bekannt, daß die bisher zum Stand der Technik gehörenden Cholesterinoxidasen einen niedrigen K_m-Wert besitzen und daß mit einer Ausnahme die Verwendung von Enzyminhibitoren bei Cholesterinoxidasen sich als erfolglos erwiesen. Der einzige beschriebene Ausnahmefall ist die Verwendung von 3,4-Dichlorphenol als Enzyminhibitor für eine Cholesterinoxidase, die aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnen wurde. Die deutsche Offenlegungsschrift betont ausdrücklich, daß weder die Kombination von 3,4-Dichlorphenol mit anderen Cholesterinoxidasen noch die Verwendung anderer Isomerer des Dichlorphenols eine ausreichende Erhöhung der Michaelis-Konstante ergeben, um die Cholesterinbestimmung kinetisch durchführen zu können.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, eine kinetische Methode zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin mit Hilfe von Cholesterinoxidase zu bekommen, die nicht auf eine Cholesterinoxidase spezieller Provenienz und nicht auf einen speziellen Inhibitor beschränkt ist. Insbesondere bestand eine speziellere Aufgabenstellung der Erfindung darin, einen Enzyminhibitor verwenden zu können, der gleichzeitig auch als Komponente des farberzeugenden Systems für die quantitative Bestimmung beispielsweise des Wasserstoffperoxids eingesetzt werden kann.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß entgegen der Aussage in der DE-OS 30 46 241 Phenol und Phenolderivate generell als Cholesterinoxidaseinhibitoren bei der kinetischen quantitativen Bestimmung der Gesamtkonzentration von Cholesterin in freier oder gebundener Form verwendet werden können und daß dies keineswegs auf eine Kombination von 3,4-Dichlorphenol mit einer Cholesterinoxidase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces beschränkt ist.

Es wurde durch Darstellung in Lineweaver-Burk-Diagramme gefunden, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Phenol oder Phenolderivaten als Enzyminhibitor um einen nichtkompetitiven Hemmtyp handelt, wobei die Wechselwirkung zwischen den Cholesterinoxidasen und den Inhibitoren nicht im einzelnen geklärt ist. Es ist im Hinblick auf den Stand der Technik überraschend, daß nichtkompetitive Inhibitoren geeignet sind.

Da man nach dieser neuen Erkenntnis nicht mehr an eine spezielle Cholesterinoxidase und einen speziellen Enzyminhibitor gebunden ist, läßt sich die kinetische Bestimmung der Gesamtkonzentration von Cholesterin viel flexibler gestalten und den Erfordernissen anpassen, und man kann einen Enzyminhibitor wählen, der auch in dem farberzeugenden System, wie einem Trindersystem, einsetzbar ist.

Bevorzugte Phenolderivate, die erfindungsgemäß als Cholesterinoxidaseinhibitoren verwendet werden können, sind solche, die zusätzlich zu der phenolischen Hydroxylgruppe einfach bis dreifach kernsubstituiert sind, wobei die Substituenten Halogenatome, besonders Chloratome, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Carboxygruppen, Sulfonylgruppen, Sulfonsäuregruppen, Aminogruppen oder mit C_1-4-Alkylgruppen substituierte Aminogruppen sein können.

Bevorzugt verwendete Cholesterinoxidaseinhibitoren, die gleichzeitig auch als Komponente des farbgebenden Systems bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden können, sind Phenol, 4-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol und 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure.

Das Phenol oder Phenolderivat wird in den Testlösungen zweckmäßig in einer Menge von mindestens 1 g/l bis zur Löslichkeitsgrenze in dem betreffenden Testreagenz, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 2 g/l bis zur Löslichkeitsgrenze benutzt, wobei die stärker bevorzugten Bereiche von dem jeweiligen Phenolderivat abhängen. In jedem Fall ist das Phenol oder Phenolderivat in einer die erforderliche Inhibitorwirkung hervorrufenden Menge zu verwenden, die erheblich über derjenigen liegt, in der Phenolderivate in dem Chromophorsystem normalerweise eingesetzt werden.

Als Cholesterinoxidasen kommen alle bislang bekannten in Betracht, wie solche aus Stämmen von Nocardia, wie Nocardia erythropolis, oder aus Stämmen von Streptomyces, aus Mycobacterium rubrum oder jenen Bakterienstämmen, die in der DE-OS 31 51 616 aufgeführt sind. Andere brauchbare Cholesterinoxidasen stammen aus Stämmen von Brevibacterium oder Pseudomonas.

Als Cholesterinesterasen können ebenfalls beliebige bekannte Cholesterinesterasen verwendet werden, wie solche aus Mikroorganismen oder Pankreas. Beispiele hierfür sind solche aus Stämmen von Candida, Rhizopus, Aspergillus, Actinomyces oder Streptomyces, wie solche, wie in der DE-PS 25 06 712 beschrieben sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Reagenzien enthalten Cholesterinoxidase und ein System zur Bestimmung von H₂O₂ oder Cholestenon sowie gegebenenfalls Cholesterinesterase und erfindungsgemäß Phenol oder ein Phenolderivat als Cholesterinoxidaseinhibitor. Im allgemeinen enthält das Reagenz auch eine Puffersubstanz, wobei alle Puffer in Betracht kommen, die im Aktivitätsbereich der beteiligten Enzyme zu puffern vermögen, vorzugsweise im pH-Bereich von 6 bis 8, besonders bevorzugt etwa 6,5. Als besonders geeignet erwiesen sich Phosphatpuffer, Hepespuffer und Trispuffer.

Besonders geeignete Reagenzzusammensetzungen sind folgende:

0,2 bis 5×10³ U/l Cholesterinoxidase (beispielsweise aus Nocardia oder Streptomyces),
0,2 bis 10×10³ U/l Cholesterinesterase (aus Mikroorganismen und Pankreas),
0,1 bis 30×10³ U/l Peroxidase,
eine inhibierende Menge, vorzugsweise 1 bis 50, besonders 2 bis 25 g/l Phenol oder Phenolderivat,
1 bis 20 g/l nichtionisches Detergens,
1 bis 50 mMol/l Natriumcholat und
20 bis 200 mMol/l Phosphatpuffer pH 6,5.

Wenn das Reagenz 4-Chlorphenol enthält, so ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 2,5 bis 12 g/l enthalten. Im Falle von Phenol ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 10 bis 15 g/l enthalten. Im Falle von 2,4-Dichlorphenol ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 2 bis 5 g/l enthalten.

Daneben kann das erfindungsgemäße Reagenz noch übliche Zusatzstoffe für enzymatische Reagenzien, wie Stabilisierungsmittel, z. B. Mannit, Bactericide, wie Azid, oder anorganische Salze enthalten.

Das Wesen der vorliegenden Erfindung ist unabhängig von dem speziellen Chromophor, so daß alle H₂O₂- bzw. Cholestenon-Bestimmungssysteme in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können.

Beispiel 1

Es wurde folgendes Reagenz verwendet:

1000 U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces
1000 U/l Peroxidase
0,3 mMol/l 4-Aminophenazon
2 g/l 2,4-Dichlorphenol
10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan
1 g/l Natriumcholat
30 Mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5

Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 25°C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Das Probevolumen lag bei 10 µl, das Reagenzvolumen bei 1000 µl.

Es ergaben sich folgende Δ E's zwischen der zweiten und dritten Minute:

100 mg/dl 0,029
200 mg/dl 0,058
400 mg/dl 0,117

Linearität ist somit bei mindestens 400 mg/dl gegeben.

Beispiel 2

Es wurde folgendes Reagenz verwendet:

400 U/l Cholesterinoxidase aus Nocardia erythropolis
10 000 U/l Peroxidase
0,3 mMol/l 4-Aminophenazon
10 g/l Phenol
15 g/l Hydroxypolyethoxydodecan
15 g/l Natriumcholat
30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5

Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 25°C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Die Probevolumen lagen bei 10 µl, das Reagenzvolumen bei 1000 µl.

Es ergaben sich folgende Δ E's zwischen der dritten und vierten Minute:

100 mg/dl 0,010
200 mg/dl 0,020
400 mg/dl 0,039

Linearität ist somit bei mindestens 400 mg/dl gegeben.

Beispiel 3

Es wurde folgendes Reagenz verwendet:

400 U/l Cholesterinoxidase aus Nocardia erythropolis
10 000 U/l Peroxidase
0,3 mMol/l 4-Aminophenazon
8 g/l 4-Chlorphenol
15 g/l Hydroxypolyethoxydodecan
25 g/l Natriumcholat
30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5

Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 25°C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Das Probevolumen hatte 10 µl, das Reagenzvolumen 1000 µl.

Es ergaben sich folgende Δ E's zwischen der ersten und vierten Minute:

 50 mg/dl 0,014
100 mg/dl 0,031
200 mg/dl 0,057
400 mg/dl 0,119
800 mg/dl 0,238

Die Linearität ist bis mindestens 800 mg/dl gegeben.

Beispiel 4

Es wurde folgendes Reagenz verwendet:

1000 U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces
100 U/l Cholesterinesterase aus Mikroorganismen
200 U/l Cholesterinesterase aus Pankreas
10 000 U/l Peroxidase
0,3 mMol/l 4-Aminophenazon
2,5 g/l 4-Chlorphenol
10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan
1 g/l Natriumcholat
30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5

Auf einem handelsüblichen Analyseautomaten (ACP 5040 der Firma Eppendorf Gerätebau Hamburg) wurde die kinetische Cholesterinbestimmung im Serum mit der folgenden Einstellung durchgeführt:

Methode Kinetik
Temperatur 25°C
Takt 12 sec
Wellenlänge Hg 546 nm
Abgleich E 0,0
Faktor/Standard 200
Rotordrehung 1
Auswertenummer 0
Spülposition 18
Startposition 0
Volumenposition 1 500 µl
Volumenposition 2  10 µl
Volumenposition 5   0 µl

Die Präzision in der Serie, die erzielt wurde, zeigen folgende zwei Beispiele

1. Probe
2. Probe
n = 11
n = 12
= 81,6	= 90,8
s = 0,924	s = 3,24
VK = 1,13%	VK = 3,57

Hierin bedeutet n die Anzahl der gemessenen Werte, den Mittelwert der gemessenen Werte, s die Standardabweichung und VK den Variationskoeffizienten.

Eine Messung von Kontrollserum erbrachte folgende Ergebnisse:

Gemessener Wert ( aus n = 3)
Sollwert
93,7
97
168,7	159
94,3	99
113,3	114
162,0	148
418,3	409

Es ist ersichtlich, daß die gemessenen Werte mit den Sollwerten innerhalb der Meßgenauigkeit gut übereinstimmten.

Beispiel 5

Es wurde folgendes Reagenz verwendet:

1000 U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces
100 U/l Cholesterinesterase aus Mikroorganismen
400 U/l Cholesterinesterase aus Pankreas
10 000 U/l Peroxidase
0,3 mMol/l 4-Aminophenazon
2,5 g/l 4-Chlorphenol
10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan
1 g/l Natriumcholat
30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5

Auf einem handelsüblichen Analysenautomaten (Gemsaec der Firma Electro Nucleonics) wurde die kinetische Cholesterinbestimmung im Serum mit folgender Einstellung durchgeführt:

Rotoloader

Analyzer
Reaktionstemperatur|25°C
Wellenlänge	500 nm
Vorfilter	430-560 nm

Control
Reaktionsart
kinetisch
Art des Laufes	Auto
Initial Reading (IR)	120
Reading Interval (RI)	20
Number of Readings (NR)	4

Computer
IR = 120
AD = 4
RI - 20	CD = 1
NR = 4	HI = 220
SC = 200	LO = 140
KT = 0	SA = 1,2
TF = 145	RM = 2,0
TC = 1	XX = 0

Es wurde menschliches Serum mit Cholesteringehalten mit bis zu 700 mg/dl untersucht. Hierbei ergab sich ein linearer Verlauf bis mindestens 500 mg/dl Cholesterin.

Claims (3)

1. Verwendung von Phenol oder eines Phenolderivates, ausgenommen 3,4-Dichlorphenol in Kombination mit einer Cholesterinoxidase aus einem Mikroorganismus aus der Gattung Streptomyces, als Cholesterinoxidaseinhibitor bei der kinetischen quantitativen Bestimmung der Gesamtkonzentration von Cholesterin in freier oder gebundener Form.

2. Verwendung von Phenol oder eines Phenolderivates, das außer der phenolischen Hydroxylgruppe 1 bis 3 Substituenten aus der Gruppe der Halogenatome, insbesondere Chloratome, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Carboxygruppen, Sulfonylgruppen, Sulfonsäuregruppen, Aminogruppen oder durch C_1-4-Alkylgruppen substituierten Aminogruppen aufweist, nach Anspruch 1.

3. Verwendung von Phenol, 2,4-Dichlorphenol, 4-Chlorphenol oder 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure nach Anspruch 1 oder 2.