DE3302360A1 - Reagent composition for determination of p-hydroxybenzoic acid - Google Patents
Reagent composition for determination of p-hydroxybenzoic acidInfo
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Abstract
Description
Bcschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenszusammensetzung zur Bestimmung von p-Hydroxybenzoesäure.Description The present invention relates to a reagent composition for the determination of p-hydroxybenzoic acid.
Seit einiger Zeit wird auf dem Gebiet der Reagentien für die klinische Prüfung die Entwicklung von Reagentien zur Bestimmung von Serumcholinesterase verlangt. Bei der herkömmlichen Bestimmung von Serumcholinesterase werden Arbeitsweisen angewandt, wobei man Cholinesterase auf Cholinester einwirken läßt, um eine organische Säure und Cholin zu erhalten und dann wird die Zunahme des erhaltenen Produktes oder die Abnahme der Cholinester gemessen und es gibt einige Bestimmungsmethoden gemäß diesen Arbeitsweisen. Zum Beispiel ist eine Methode bekannt, die m-Nitrophenolmethode genannt wird, welche Verwenduny von der Zersetzung von Acetylcholin durch Einwirkung von Cholinesterase macht, was die pH-Herabsetzung des Systems durch Bildung von Essigsäure bewirkt.For some time it has been in the field of reagents for clinical Trial calls for the development of reagents for the determination of serum cholinesterase. In the conventional determination of serum cholinesterase, working methods are used whereby cholinesterase is allowed to act on choline ester to form an organic acid and choline to obtain and then the increase in the obtained product or the The decrease in choline esters is measured and there are some methods of determination according to this Working methods. For example, there is known a method called the m-nitrophenol method what uses of the decomposition of acetylcholine by the action of Cholinesterase does what the pH lowering of the system by forming acetic acid causes.
Das heißt, das Substrat wird einem Reagens zugesetzt, das Cholinesterase enthält, und dann wird das Reaktionsgemisch für eine bestimmte Zeitspanne vorinkubiert und nach Zugabe eines m-Nitrophenolreagens als Farbbildner wird die Aktivität an Cholinesterase bezüglich des Grads des Verblassens der gelben Färbung gemessen. Diese Methode wird jedoch durch hinderliche Substanzen in der Probe beeinträchtigt, wie organische Säuren, Puffersubstanzen und dergl. . Außerdem ist sie nicht zuverlässig, weil bei der Messung wegen der Arbeitsbedingungen die Reaktion gestoppt wird und außerdem ist sie ungeeignet für automatische Analysengeräte wegen der erforderlichen langen Reaktionszeit.That is, the substrate is added to a reagent called cholinesterase and then the reaction mixture is preincubated for a certain period of time and after adding an m-nitrophenol reagent as a color former, the activity becomes Cholinesterase measured for degree of yellow color fading. However, this method is affected by obstructive substances in the sample, such as organic acids, buffer substances and the like. Besides, she's not reliable because the reaction is stopped during the measurement due to the working conditions and in addition, it is unsuitable for automatic analysis devices because of the required long response time.
Es gibt auch die DTNB-Methode, bei welcher Cholinthioester wie Acetylthiocholin, Butyrylthiocholin, Propionylthiocholin und dergleichen als synthetische Substrate benutzt werden und Thiocholin, das sich aus diesen Cholinthioestern ergibt, durch Einwirkung von Cholinesterase: gebildet und dann 5,5'-Dithiobisnitrobenzoesäure (DTNB) zugesetzt wird, worauf colorimetrisch bestimmt wird . Da jedoch DTNB mit Thiol reagiert unterliegt dieses Verfahren der Einwirkung von Thiol, wenn eine Thiolgruppe in der Probe vorliegt, beispielsweise wenn Glutathion im Serum vorliegt oder zugesetzt ist.There is also the DTNB method, in which choline thioesters how Acetylthiocholine, butyrylthiocholine, propionylthiocholine and the like as synthetic Substrates are used and thiocholine, which results from these choline thioesters, by the action of cholinesterase: formed and then 5,5'-dithiobisnitrobenzoic acid (DTNB) is added, whereupon it is determined colorimetrically. However, since DTNB with Thiol reacts subject to this process of exposure to thiol when a thiol group is present in the sample, for example if glutathione is present in the serum or added is.
Weiter ist die Enzym-(Cholinoxidase)methode bekannt, bei welcher Benzoylcholin, ein Substrat, durch die Einwirkung von Cholinesterase hydrolisiert wird. Das gebildete Cholin wird zu Wasserstoffperoxid und Betain mittels Einwirkung von Cholinoxidase zersetzt und gebildetes Wasserstoffperoxid wird oxidativ durch Einwirkung von Peroxidase mit Phenol und 4-Aminoantipyrin zur Bildung eines roten Chinonfarbstoffes kondensiert. Aber auch diese Methode unterliegt der Einwirkung von Reduktionsmitteln, wie Ascorbinsäure, Bilirubin, Glutathion und dergleichen und außerdem schwanken die Chinonfarbstoffe, die als Farbbildner von Reagensqualität im Handel sind, in ihrem molekularen Extinktionskoeffizienten von Hersteller zu Hersteller , so daß es ein Problem bei der Anwendung dieser Methode als Standardmethode gibt.The enzyme (choline oxidase) method is also known, in which benzoylcholine, a substrate that is hydrolyzed by the action of cholinesterase. The educated Choline turns into hydrogen peroxide and betaine through the action of choline oxidase decomposed and formed hydrogen peroxide becomes oxidative by the action of peroxidase condensed with phenol and 4-aminoantipyrine to form a red quinone dye. But this method is also subject to the action of reducing agents such as ascorbic acid, Bilirubin, glutathione and the like and also the quinone dyes vary, which are commercially available as reagent grade color formers, in their molecular extinction coefficient manufacturer to manufacturer so there is a problem using this method as a standard method there.
Neben den oben erwähnten Methoden sind noch die Methode bekannt, bei welcher die Absorption von Benzoylcholin als Substrat bei 240 nm bezüglich der Geschwindigkeit der Verminderung gemessen, und eine Methode, bei welcher 3+ Acetylcholin als Substrat verwendet wird und Fe und HyAroxylamin auf Essigsäure einwirken gelassen werden, die sich aus dem Acetylcholin durch die Einwirkung von Cholinesterase ergibt, worauf man anschließend colorimetrisch bestimmt. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, daß sie bei der Anwendung auf viele Proben schwierig sind.In addition to the methods mentioned above, the method at which is the absorption of benzoylcholine as a substrate at 240 nm in terms of velocity the reduction measured, and a method in which 3+ acetylcholine as substrate is used and Fe and HyAroxylamine are allowed to act on acetic acid, which results from the acetylcholine through the action of cholinesterase, whereupon is then determined colorimetrically. However, these methods have the disadvantage that they are difficult to apply to many samples.
Als Methode zur genaueren Bestimmung der Cholinesteraseaktivität als die oben erwähnten herkömmlichen Methoden wird eine Methode vorgeschlagen, wobei p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat verwendet wird, und die daraus durch Einwirkung von Cholinesterase gebildete p-Hydroxybenzoesäure in Protocatechusäure umgewandelt wird, indem man p-Hydroxybenzoathydroxylase und NADPH einwirken läßt, worauf man dann die Geschwindigkeit der Verminderung von NADPH bei dieser Umwandlung bei 340 nm bestimmt (Japanese Journal of Clinical Laoratory Automation (JJCLA), Vol. 6, Supplement, Seite 166, 1981). Wenn man jedoch bei dieser Methode das oben genannte Enzym und das Reagens auf eine Probe einwirken läßt, welche eine bestimmte Menge an Cholinesterase enthält, hat man die Erscheinung festgestellt, daß der scheinbare Wert an Cholinesteraseaktivität, den man erhält, mit der Zunahme der Menge an p-Hydroxybenzoathydroxylase zunimmt.As a method for more accurate determination of cholinesterase activity than the conventional methods mentioned above, a method is proposed wherein p-Hydroxybenzoylcholine is used as a substrate, and derived from it by exposure p-hydroxybenzoic acid formed by cholinesterase is converted into protocatechuic acid is by allowing p-hydroxybenzoate hydroxylase and NADPH to act, whereupon one then the rate of decrease in NADPH in this conversion at 340 nm determined (Japanese Journal of Clinical Laboratory Automation (JJCLA), Vol. 6, Supplement, p. 166, 1981). However, if you do the above with this method Enzyme and the reagent can act on a sample, which a certain amount of cholinesterase, it has been found that the apparent Value of cholinesterase activity obtained with an increase in the amount of p-hydroxybenzoate hydroxylase increases.
Es wurde nun gefunden, daß bei dieser Methode der positive Fehler des erhaltenen Wertes, der über dem wirklichen Wert liegt, daher rührt, daß die gebildete Protocatechusäure als Abkuppler von pvHydroxybenzoathydroxylase wirkt, was zur weiteren Begünstigung der Oxidation von NADPH führt. Bei dieser Methode zur Bestimmung von Cholinesteraseaktivität mit p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat wurde nun eine Methode zur genauen Bestimmung der gebildeten p-Hydroxybenzoesäure gefunden.It has now been found that this method has the positive error of the value obtained, which is above the real value, is due to the fact that the Protocatechuic acid formed acts as a decoupler from pv-hydroxybenzoate hydroxylase, which further promotes the oxidation of NADPH. With this method for the determination of cholinesterase activity with p-hydroxybenzoylcholine as substrate was now a method for the precise determination of the p-hydroxybenzoic acid formed found.
Somit liefert die vorliegende Erfindung eine Reagenszusammensetzung zur Bestimmung von p-Hydroxybenzoesäure, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie p-Hydroxybenzoathydroxylase, reduziertes Coenzym und Protocatechuat - D 3,4-Dioxygenase oder Protocatechua 4,5-Dioxygenase enthält sowie ein Verfahren zur genauen Bestimmung von p-Hydroxybenzoesäure.Thus, the present invention provides a reagent composition for the determination of p-hydroxybenzoic acid, which is characterized in that it p-Hydroxybenzoate hydroxylase, reduced coenzyme and protocatechuate - D. 3,4-Dioxygenase or Protocatechua 4,5-Dioxygenase contains and a method for accurate determination of p-hydroxybenzoic acid.
Erfindungsgemäß wird die genaue Bestimmung von p-Hydroxybenzoesäure möglich durch Entfernung von Protocatechusäure, die als Abkoppler von p-Hydroxybenzoathydroxylase-und zur weiteren Begünstigung der Oxidation von NADPH wirkt. Protocatechusäure wird aus der Reaktion genommen, indem man Protocatechuat-3,4-dioxygenase oder Protocatechuat 4,5-dioxygenase verwendet. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Reagens zusammensetzung macht es auch bei der Bestimmung von Cholineseraseaktivitäten mit p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat möglich, die genaue Bestimmung der Cholinesteraseaktivität durchzuführen, da keine Einwirkung von Reduktionsmitteln (beispielsweise --Ascorbinsäure, Bilirubin, Glutathion und dergleichen) auftritt und außerdem der molekulare Extinktionskoeffizient von reduziertem Coenzym eindeutig ist im Vergleich zu den herkömmlichenMethoden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher als Standardmethode eingesetzt werden.The exact determination of p-hydroxybenzoic acid is according to the invention possible by removing protocatechuic acid, which acts as a decoupler from p-hydroxybenzoate hydroxylase and acts to further promote the oxidation of NADPH. Protocatechuic acid will taken from the reaction by taking protocatechuate 3,4-dioxygenase or protocatechuate 4,5-dioxygenase used. The application of the reagent composition according to the invention also does it in the determination of choline serase activities with p-hydroxybenzoylcholine as a substrate possible to carry out the exact determination of the cholinesterase activity, as there is no effect of reducing agents (e.g. ascorbic acid, bilirubin, Glutathione and the like) and also the molecular extinction coefficient of reduced coenzyme is clear compared to the conventional methods. The method according to the invention can therefore be used as a standard method.
Die in der Erfindung verwendete p-Hydroxybenzoathydroxylase gehört zu den Flavoproteinmonooxygenasen, welche einen externen Elektronendonator erfordern und der Begriff umfaßt das Enzym, welches durch die Enzymnummer EC 1.14.13.2 definiert ist. Die Wirkung wird durch die folgende Formel gezeigt. The p-hydroxybenzoate hydroxylase used in the invention belongs to the flavoprotein monooxygenases which require an external electron donor, and the term includes the enzyme defined by enzyme number EC 1.14.13.2. The effect is shown by the following formula.
reduziertes oxidiertes Coenzym Coenzym Zu diesen Enzymen gehören diejenigen , die aus Mikroorganismen erhalten werden, insbesondere diejenigen von Pseudomonas, beispielsweise Pseudomonas desmolytica, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida und dergleichen.reduced oxidized coenzyme coenzyme About these enzymes include those obtained from microorganisms, especially those from Pseudomonas, for example Pseudomonas desmolytica, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida and the like.
Das reduzierte Coenzym, das in der Erfindung verwendet wird, umfaBt NADPH, NADH und dergleichen Die in der Erfindung verwendete Protocatechoat 3,4-dioxygenase ist ein Enzym, das Protocatechusäure in 3-Carboxy-cis-muconsäure (ß-Carboxymuconsäure ) überführt. Es gehört zu den nonheme eisenhaltigen Dioxygenasen. Es sei Bezug genommen auf ein Enzym, das durch die Enzymnummer EC 1.13.1.3 definiert ist. Die Wirkung dieses Enzyms wird durch die folgende Formel gezeigt. The reduced coenzyme used in the invention includes NADPH, NADH and the like. The protocatechoate 3,4-dioxygenase used in the invention is an enzyme that converts protocatechuic acid to 3-carboxy-cis-muconic acid (β-carboxymuconic acid). It belongs to the nonheme iron-containing dioxygenases. Reference is made to an enzyme which is defined by the enzyme number EC 1.13.1.3. The action of this enzyme is shown by the following formula.
Zu diesen Enzymen gehören diejenigen , die aus Mikroorganismen erhalten werden, insbesondere diejenigen von Pseudomonas und Nocardia und Neurospora.These enzymes include those obtained from microorganisms especially those from Pseudomonas and Nocardia and Neurospora.
Die in der Erfindung verwendete Protocatechuat-4,5-dioxygnae ist ein Enzym, das Protocatechusäure in 2-Hydroxy-4-carboxymuconsaure -semialdehyd überführt.The protocatechuate 4,5-dioxygnae used in the invention is a Enzyme that converts protocatechuic acid into 2-hydroxy-4-carboxymuconic acid semialdehyde.
Es gehört zu den nonheme eisenhaltigen Dioxygenasen.It belongs to the nonheme iron-containing dioxygenases.
Bezug genommen sei auf ein Enzym, das durch die Enzymnummer EC 1.13.11.8 definiert ist. Die Wirkung dieses Enzyms wird durch die folgende Formel gezeigt. Reference is made to an enzyme which is defined by the enzyme number EC 1.13.11.8. The action of this enzyme is shown by the following formula.
Zu diesem Enzymen gehören diejenigen, die aus Mikroorganismen erhalten werden, insbesondere aus Pseudomonas.These enzymes include those obtained from microorganisms especially from Pseudomonas.
Die Reagens zusammensetzung der Erfindung enthält p-Hydroxybenzoathydroxylase, reduziertes Coenzym und Protocatechuat 3,4-Dioxygenase oder .Protocatechuat-4 , 5-dioxygenase. Die Mengen an Enzym und Coenzym können wahlweise je nach der Probe ausgewählt werden.The reagent composition of the invention contains p-hydroxybenzoate hydroxylase, reduced coenzyme and protocatechuate 3,4-dioxygenase or protocatechuate-4, 5-dioxygenase. The amounts of enzyme and coenzyme can be optional depending on the sample to be selected.
Die mit der Reagens zusammensetzung der Erfindung zu messende p-Hydroxybenzoesäure kann beliebigen Ursprunges sein, beispielsweise P-Hydroxybenzoesäure wie sie erhalten wird, wenn man Cholinesterase auf p-Hydroxybenzoylcholin einwirken läßt. Auch P-Hydroxybenzoesäure, die aus p-Hydroxybenzoesäurederivaten freigesetzt ist, wie aus dem Reaktionsprodukt von p-Hydroxybenzoesäure mit Maltoligosaccharid, das Reaktionsprodukt von p-Hydroxybenzoesäure mit Peptid und dergleichen kann ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagens zusammensetzung gemessen werden.The p-hydroxybenzoic acid to be measured with the reagent composition of the invention can be of any origin, for example p-hydroxybenzoic acid as received when cholinesterase is allowed to act on p-hydroxybenzoylcholine. Also p-hydroxybenzoic acid, which is released from p-hydroxybenzoic acid derivatives, such as from the reaction product of p-hydroxybenzoic acid with maltoligosaccharide, the reaction product of p-hydroxybenzoic acid with peptide and the like can also be carried out using the inventive Reagent composition can be measured.
Zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität wird zu der Reagenszusammensetzung der Erfindung p-Hydroxybenzoylcholin, eine Pufferlösung und gegebenenfalls Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD) gegeben. Das pH der Pufferlösung ist 5,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,5 bis 9,0 Als Puffer können die Phosphate, organische Säuren und diejenigen wie sie im weitem Umfang auf dem Gebiet der Biochemie eingesetzt werden, benutzt werden, wobei sich Konzentrationen von etwa 0,5 M bis etwa 0,01 M eignen.To determine cholinesterase activity, add to the reagent composition of the invention p-hydroxybenzoylcholine, a buffer solution and optionally flavin adenine dinucleotide (FAD) given. The pH of the buffer solution is 5.0 to 11.0, preferably 7.5 to 9.0 As a buffer can use the phosphates, organic acids and those like them by far Scope in the field used in biochemistry, with concentrations from about 0.5 M to about 0.01 M being suitable.
P-Hydroxybenzoylcholin als Substrat kann in Form des Salzes vorliegen, wobei die Konzentration 0,01 bis 100 mM, vorzugsweise 0,1 bis 10 mM sein kann.P-Hydroxybenzoylcholine as a substrate can be in the form of the salt, wherein the concentration can be 0.01 to 100 mM, preferably 0.1 to 10 mM.
Das reduzierte Coenzym kann ebenfalls in Form des Salzes vorliegen, und-die Konzentration beträgt etwa 0,05 bis etwa 1 mM, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 mM.The reduced coenzyme can also be in the form of the salt, and the concentration is about 0.05 to about 1 mM, preferably 0.1 to 0.3 mM.
FAD kann auch in Form des Salzes vorliegen und die Konzentration ist etwa 0,001 bis etwa 0,1 mM, vorzugsweise 0,01 bis 0,05 mM. Anstelle von FAD können auch FMN, Riboflavin, Riboflavin-4',5'-cyclophosphat, Flavinpeptid, Riboflavinglucosid und fettlösliche Riboflavinderivate verwendet werden.FAD can also be in the form of the salt and the concentration is about 0.001 to about 0.1 mM, preferably 0.01 to 0.05 mM. Instead of FAD you can also FMN, riboflavin, riboflavin-4 ', 5'-cyclophosphate, flavin peptide, riboflavin glucoside and fat-soluble riboflavin derivatives can be used.
Die p-Hydroxybenzoathydroxylasewird zweckmäßig in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 50 Einheiten/ml, insbesondere bevorzugt 0,2 bis 5 Einheiten/ml angewandt.The p-hydroxybenzoate hydroxylase is useful in an amount of about 0.01 to about 50 units / ml, particularly preferably 0.2 to 5 units / ml applied.
.Protocatechuat- 3,4-dioxygenase oder Protocatechuat- 4 ,5-dioxygenase wird in einer Menge von etwa 0,001 bis etwa 10 Einheiten/ml, insbesondere vorzugsweise 0,02 bis 1 Einheit/ml angewandt.Protocatechuate 3,4-dioxygenase or Protocatechuate 4,5-dioxygenase is used in an amount of from about 0.001 to about 10 units / ml, most preferably 0.02 to 1 unit / ml applied.
Zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität wird die flüssige Reaktionsmischung, welche die oben genannten Reagentien enthält, vorher bei einer bestimmten Temperatur gehalten. Dann wird eine geeignete Menge der Probe zugegeben und die Veränderung des reduzierten Coenzyms oder die Menge an verbrauchtem Sauerstoff wird gemessen.To determine the cholinesterase activity, the liquid reaction mixture, which contains the above-mentioned reagents, beforehand at a certain temperature held. Then an appropriate amount of the sample is added and the change of the reduced coenzyme or the amount of oxygen consumed is measured.
Die Reaktionstemperatur beträgt etwa 10 °C bis etwa 45 oC, insbesondere und vorzugsweise 20 OC bis 40 OC.The reaction temperature is about 10 ° C to about 45 oC, in particular and preferably 20 ° C to 40 ° C.
Das pH ist etwa 5,0 bis etwa 11,0, besonders bevorzugt 7,5 bis 9,0.The pH is about 5.0 to about 11.0, more preferably 7.5 to 9.0.
Es kann jede biochemische Substanz als Probe benutzt werden, insbesondere Serum, Urin und dergleichen.Any biochemical substance can be used as a sample, in particular Serum, urine and the like.
Als Methode zur Messung der Veränderung von reduziertem Coenzym wird die Veränderung der Absorption von NADPH (in der Nähe von 340 nm) gemessen, jedoch können auch andere Methoden, wie die Fluoreszenzmethode, die Lumineszenzmethode, der Immunoassay, die Elektrodenmethode oder dergleichen angewandt werden.As a method of measuring the change in reduced coenzyme is used the change in absorbance of NADPH (near 340 nm) was measured, however other methods, such as the fluorescence method, the luminescence method, the immunoassay, the electrode method or the like can be used.
Die Menge an verbrauchtem Sauerstoff kann polarimetrisch, wie beispielsweise mit der Sauerstoffelektrode und dergleichen gemessen werden.The amount of oxygen consumed can be polarimetric, such as can be measured with the oxygen electrode and the like.
In dieser Reaktion wird p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat zuerst durch Einwirkung von Cholinesterase, die in der Probe enthalten ist, unter Freisetzung von p-Hydroxybenzoesäure zersetzt (erste Reaktion). Als nächstes wird p-Hydroxybenzoesäure in Protocatechusäure über führt durch Einwirkung von p-HydroxYhenzoathydroxylase und gleichzeitig mit dieser Reaktion wird eine äquimolare Menge an Sauerstoff verbraucht, um die gleiche äquimolare Menge des reduzierten Coenzyms in das oxidierte Coenzym zu oxid2ren (2. Reaktion).In this reaction, p-hydroxybenzoylcholine is used as the substrate first by the action of cholinesterase, which is contained in the sample, with release decomposed by p-hydroxybenzoic acid (first reaction). Next is p-hydroxybenzoic acid converts into protocatechuic acid by the action of p-hydroxylhenzoate hydroxylase and simultaneously with this reaction an equimolar amount of oxygen is consumed, by the same equimolar amount of the reduced coenzyme in the oxidized coenzyme to oxid2ren (2nd reaction).
Die gebildete Protocatechusäure bildet 3-Carboxy-cis-cismuconsäure durch Einwirkung von Protocatechuat-3,4-dioxygenase, und gleichzeitig mit dieser Reaktion wird eine äquimolare Menge an Sauerstoff verbraucht (3.The protocatechuic acid formed forms 3-carboxy-cis-cismuconic acid by the action of protocatechuate 3,4-dioxygenase, and simultaneously with this Reaction, an equimolar amount of oxygen is consumed (3rd
Reaktion).Reaction).
Alle diese Reaktionen können gleichzeitg durchgeführt werden oder die erste Reaktion kann von der 2. und der folgenden Reaktion getrennt werden.All of these reactions can be carried out simultaneously or the first reaction can be from the 2nd and the following reaction separately will.
Unter Anwendung der Reagens zusammensetzung der Erfindung kann die Bestimmung der Cholinesteraseaktivität genau und mit guter Reproduzicrbarkeit durchgeführt werden.Using the reagent composition of the invention, the Determination of the cholinesterase activity carried out precisely and with good reproducibility will.
Auch kann die Bestimmung mit kleiner Mengen an zugesetzter p-Hydroxybenzoathydroxylase durchgefuhrt werden.The determination with small amounts of added p-hydroxybenzoate hydroxylase can also be carried out be performed.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, wobei teilweise auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommenwird. Es bedeuten: Figur 1 zeigt die Veränderung der Absorption bei 340 nm wenn Protocatechuat-4,5-dioxygenase bei einer Messung von p-Hydroxybenzoesäure einmal zugesetzt wurde ( und nicht zugesetzt wurde ( Figur 2 zeigt das Verhältnis zwischen scheinbarer Cholinesteraseaktilvität und p-Hydroxybenzoathydroxylase, erhalten mit (- -----w) -) und ohne (> o) Zugabe von Protocatechuat-3,4-dioxygenase (0,1 Einheiten/ml).The following examples illustrate the invention, in part on Reference is made to the accompanying drawings. It denotes: FIG. 1 shows the change the absorbance at 340 nm when protocatechuate 4,5-dioxygenase in a measurement of p-hydroxybenzoic acid was added once (and not added (Fig 2 shows the relationship between apparent cholinesterase activity and p-hydroxybenzoate hydroxylase, obtained with (- ----- w) -) and without (> o) addition of protocatechuate 3,4-dioxygenase (0.1 units / ml).
Die Methode zur Bestimmung der Aktivität jeden Enzyms ist wie folgt: Aktivität von P-Hydroxybenzoathydroxylat: Zu 3,0 ml eines Reaktionsgemisches (37 °C) enthaltend Trismaleatpuffer 50 mM (pH 8,2) p-Hydroxybenzoesäure 0,5 mM NADPH 0,3 mM FAD 0,02 mM werden 50 ßl des verdünnten Enzyms gegeben und die Abnahme in der Absorption der Reaktionslösung bei 340 nm wird gemessen. Die Menge an Enzym, die 1 uMol NADPH pro Minute verändert wird als eine Einheit genommen (der molekulare Extinktionskoeffizient von NADPH ist 2 6,22 cm /MiRromol).The method for determining the activity of each enzyme is as follows: Activity of P-hydroxybenzoate hydroxylate: To 3.0 ml of a reaction mixture (37 ° C) containing trismaleate buffer 50 mM (pH 8.2) p-hydroxybenzoic acid 0.5 mM NADPH 0.3 mM FAD 0.02 mM are added to 50 μl of the diluted enzyme and the decrease in the absorbance of the reaction solution at 340 nm is measured. The amount of enzyme the 1 µmol NADPH changed per minute is taken as a unit (the molecular Is the extinction coefficient of NADPH 2 6.22 cm / miRromol).
Aktivität von Protocatechuat -3,4-dioxygenase.Activity of protocatechuate -3,4-dioxygenase.
Zu 3,0 ml eines Reaktionsgemisches (24 "C) enthalten Protocatechusäure 0,4 mM Trisacetatpuffer 50 mM (pH 7,5) werden 50 Wl des verdünnten Enzymes gegeben und die Verminderung in der Absorption der Reaktionslösung bei 290 nm wird gemessen. Die Menge an Enzym, welche ein Mol Protocatechusäure pro Minute verändert wird als eine Einheit genommen (der molekulare Extinktionskoeffizient von Protocatechusäure ist 3,8 cm2/Mikromol).To 3.0 ml of a reaction mixture (24 "C) contain protocatechuic acid 0.4 mM trisacetate buffer 50 mM (pH 7.5) are added to 50 μl of the diluted enzyme and the decrease in absorbance of the reaction solution at 290 nm is measured. The amount of enzyme that changes one mole of protocatechuic acid per minute is called taken a unit (the molecular extinction coefficient of protocatechuic acid is 3.8 cm2 / micromole).
Aktivität von Protocatechuat- 4, 5-dioxygenase: Zu 3,0 ml einer Reaktionsmischung (24 °C) enthaltend Protocatechusäure 0,33 mM Phosphatpuffer 50 mM (pH 7,0) werden 0,1 ml des verdünnten Enzyms gegeben (enthaltend 50 mM eines Phosphatpuffers und 10 % Methanol) und die Verminderung in der Absorption der Reaktionslösung bei 250 nm wird gemessen. Die Menge an Enzym, welche ein AMol Protocatechusäure pro Minute verändert, wird als eine Einheit genommen (der molekulare Extinktionskoeffizient 2 von PrQtocatechusäure ist 8,0 cm /Mikromol).Activity of protocatechuate 4,5-dioxygenase: To 3.0 ml of a reaction mixture (24 ° C) containing protocatechuic acid 0.33 mM phosphate buffer 50 mM (pH 7.0) 0.1 ml of the diluted enzyme (containing 50 mM of a phosphate buffer and 10% methanol) and the decrease in the absorption of the reaction solution at 250 nm is measured. The amount of enzyme that produces one AMol of protocatechuic acid per minute changed, is taken as a unit (the molecular extinction coefficient 2 of prtocatechuic acid is 8.0 cm / micromole).
Beispiel 1 Das Reaktionsgemisch wurde wie unten beschrieben hergestellt und p-Hydroxybenzoesäure wurde gemessen.Example 1 The reaction mixture was prepared as described below and p-hydroxybenzoic acid was measured.
Trismaleatpuffer (pH 8,2) 50 mM NADPH 0,3 mM FAD 0,03mM p-Hydroxybenzoathydroxylase 1 U/ml Protocatechuat-4,5-dioxygenase 0 , 1 U/Ml 4,0 ml des obigen Reaktionsgemisches wurden bei 37 OC 10 Minuten lang vorinkubiert und zu dem Zeitpunkt, wo die Absorption bei 340 nm konstant wurde, wurden 50 Al einer p-Hydroxybenzoesäurelösung zugesetztz. Die Absorption bei 340 nm nahm ab und die Veränderung der Absorption nach 15 Minuten wurde aufgezeichnet. Die Konzentration der p-Hydroxybenzoesäurelösung betrug jeweils 0; 0,2.5 ; 0,50 ; 0,75 und 1,0 mM. Trismaleate buffer (pH 8.2) 50mM NADPH 0.3mM FAD 0.03mM p-hydroxybenzoate hydroxylase 1 U / ml protocatechuate 4,5-dioxygenase 0.1 U / Ml 4.0 ml of the above reaction mixture were preincubated at 37 OC for 10 minutes and at the point where the absorption became constant at 340 nm, 50 μl was added to a p-hydroxybenzoic acid solution. The absorbance at 340 nm decreased and the change in absorbance after 15 minutes was recorded. The concentration of the p-hydroxybenzoic acid solution was in each case 0; 0.2.5; 0.50; 0.75 and 1.0 mM.
Wie in Figur 1 gezeigt, war der erhaltene Wert ohne Zusatz von Protocatechuat-4,5-dioxygenase nicht richtig, sondern es ergab sich eine positive Abweichung. Der Wert stimmte jedoch mit dem theoretischen Wert überein, wenn Protocatechuat -4, 5-dioxygenase zugeführt wurde.As shown in Figure 1, the value obtained was without the addition of protocatechuate 4,5-dioxygenase not correct, but there was a positive deviation. The value was right however, agree with the theoretical value when protocatechuate -4, 5-dioxygenase was fed.
Beispiel 2 Das nachstehende Reaktionsgemisch wurde hergestellt und die Aktivität von Serumcholinesierasewurde gemessen.Example 2 The following reaction mixture was prepared and the activity of serum choline serum was measured.
Trismaleatpuffer (pH 8,2) 50 mM p-Hydroxybenzoylcholin 0,75 mM NADPH 0,3 mM FAD 0,02 mM p-Hydroxybenzoathydroxylase 0 - 2 U/ml (Protocatechuat-3,4-dioxygenase 0,1 U/ml) 4,0 ml des obigen Reaktionsgemisches wurden 10 Minuten lang bei 37 OC vorinkubiert und zu dem Zeitpunkt, wo die Absorption bei 340 nm konstant wurde, wurden 50 ßl eines Kontrollserums (Moni-trol II, DADE Co) zum Start der Reaktion zugesetzt. Die Änderung der Absorption bei 340 nm während 5 bis 10 Minuten wurde aufgezeichnet. Die Aktivität von Cholinesterase wurde ausgedrückt als eine Einheit durch die Menge an Enzym, welche 1 WMol NADPH pro Minute ändert (der molekulare E.xtinktions-2 koeffizient ist 6,22 cm iMikromol). Trismaleate buffer (pH 8.2) 50 mM p-hydroxybenzoylcholine 0.75 mM NADPH 0.3 mM FAD 0.02 mM p-hydroxybenzoate hydroxylase 0-2 U / ml (protocatechuate-3,4-dioxygenase 0.1 U / ml) 4.0 ml of the above reaction mixture were added for 10 minutes at 37.degree preincubated and at the point in time when the absorbance at 340 nm became constant, were 50 μl of a control serum (Moni-trol II, DADE Co) at the start the Reaction added. The change in absorbance at 340 nm for 5 to 10 minutes was recorded. The activity of cholinesterase was expressed as one Unit by the amount of enzyme that changes 1 WMol NADPH per minute (the molecular E. absorbance-2 coefficient is 6.22 cm iMicromole).
Bei dieser Messung wurde gefunden, daB bei Xnderung der Menge an p-Hydroxybenzoat der scheinbare Wert an Serumcholinesterase sich ändert mit der Menge an Hydroxylase wie dies Figur 2 zeigt. Der Wert der Serumcholinesterase wurde jedoch konstant, wenn 0,1 U/ml an Protocatechuat-3,4-dioxygenase zugesetzt wurden. In diesem Falle erfolgte die Reaktion auch rascher und die Dosierung an p-Hydroxybenzoathydroxylase konnte wirtschaftlich klein gehalten werden.In this measurement it was found that when the amount of p-hydroxybenzoate the apparent level of serum cholinesterase changes with the amount of hydroxylase as Figure 2 shows. However, the serum cholinesterase value became constant, when 0.1 U / ml of protocatechuate 3,4-dioxygenase was added. In this case the reaction also took place more rapidly and the dosage of p-hydroxybenzoate hydroxylase took place could be kept economically small.
Bezugsbeispiel 1 Die Cholinoxidasemethode wurde wie folgt durchgeführt.Reference Example 1 The choline oxidase method was carried out as follows.
Reaktionsgemisch: Trismaleatpuffer (pH 8,2) 50 mM Phenol 100 mg/dl 4-Aminoantipyrin 20 rug/dl Peroxidase 100 u/dl (Purpurogallineinheit) Cholinoxidase 100 U/dl Chlorbenzoylcholin 50 mg/dl dl = Deziliter 2,0 ml des Reaktionsgemisches wurden bei 37 °C 10 Minuten vorinkubiert und dann wurden 20 al der Probe zugegeben. Nach genau 5-minütigem Inkubieren bei 37 °C wurden 2,0 ml einer Abstoppiösung (Neostigminsulfat, 100 mg/l-ll) zugesetzt. Nach 10-minütigem Inku- bicc bei 37 °C wurde die Absorption der Reaktionslösung bei 500 nm gemessen. In der gleichen Weise, jedoch ohne Zusatz von Probe, wurden Blindversuche durchgeführt.Reaction mixture: Trismaleate buffer (pH 8.2) 50 mM phenol 100 mg / dl 4-Aminoantipyrine 20 rug / dl peroxidase 100 u / dl (purpurogalline unit) choline oxidase 100 U / dl chlorobenzoylcholine 50 mg / dl dl = deciliter 2.0 ml of the reaction mixture were preincubated at 37 ° C. for 10 minutes and then 20 μl of the sample were added. After incubating for exactly 5 minutes at 37 ° C, 2.0 ml of a stop solution (neostigmine sulfate, 100 mg / l-ll) added. After 10 minutes of incubation bicc at 37 ° C the absorbance of the reaction solution was measured at 500 nm. In the same way, but without the addition of sample, blank tests were carried out.
Das Verhältnis zwischen der Methode der vorliegenden Erfindung, X, (Beispiel 2) und der Cholinoxidasemethode, Y, wurde durch die folgende Gleichung ausgedrückt, welche zeigt, daß das Verhältnis gut ist.The relationship between the method of the present invention, X, (Example 2) and the choline oxidase method, Y, was given by the following equation in terms of which shows that the relationship is good.
Y = 1,82X + 36 # = 0,995 (n = 48) Leerseite Y = 1.82X + 36 # = 0.995 (n = 48) Blank page
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