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Beschreibung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung
von Rosmarinsäure aus Pflanzenzellkulturen und deren galenische Formulierungen ohne
Extraktion des Wirkprinzips aus den gezüchteten Pflanzenzellen.
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Rosmarinsäure ist ein wichtiger Naturstoff mit bekannten anti-inflammatorischen
(DE-OS 29 52 114) und anti-gonadotropen (Planta med. 39, 245, 1980) Eigenschaften.
Es ist deshalb von großem Interesse, Rosmarinsäure in reiner Form zu gewinnen.
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Rosmarinsäure (3,4-Dihydroxy-0(-C(3 (3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl)-oxy]-phenylpropionsäure
kommt hauptsächlich in Pflanzenarten folgender Gattungen der Unterfamilie der Saturejoideae,
der Familie der Labiatae vor: Acinos, Amaracus, Calamintha, Clinopodium, Glechoma,
Hymenocrater, Hyssopus, Lavendula, Lophanthus, Lycops, Majorana, Meehania, Melissa,
Menthas Micromeria, Monarda, Nepeta, Origanum, Perilla, Perovskia, Prunella, Rosmarinus,
Salvia, Saturea, Schizonepeta, Thymus, Ziziphora (Planta med. 27, 372, 1975).
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Rosmarinsäure wurde auch in den Pflanzenarten folgender Gattungen
der Unterfamilie der Saniculoideae , der Familie der Umbellifera: Astrantia, Eryngium
und Sanicula (Pharmazie 22, 220, 1967) nachgewiesen.
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Außerdem noch in Pflanzenzellkulturen von Ocimum basilicum (Eur. J.
Cell. Biol. 19, 67, 1979). Der Gehalt an Rosmarinsäure liegt jedoch in all diesen
Beispielen nicht höher als 3 %.
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In der DE-OS 30 10 040 wird ein Verfahren beschrieben, um aus Melissa
officinalis, welche einen Rosmarinsäuregehalt von 2,1 °% pro Trockengewicht enthält,
zu extrahieren, wobei die Ausbeute zwischen 50 - 60 % lag.
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Durch Erzeugen von Pflanzenzellkulturen der Pflanzenart Coleus blumei
(Naturwiss. 64, 585, 1977) wurde gefunden, daß sich diese relativ geringen Ausbeuten
an Rosmarinsäure aus der Droge auf bis zu 13% steigern läßt. Das hierzu verwendete
Nährmedium "85" für die Pflanzenzellen nach Gamborg et al. (Exptl. Cell. Res. 50,
151, 1968) mit der sehr hohen Konzentration von 75 g Saccharose/Liter Medium ist
jedoch wegen der komplexen Zusammensetzung unhandlich und teuer.
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Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Rosmarinsäure nach einfachen
Verfahren in hohen Ausbeuten durch Pflanzenzellkulturen zu gewinnen.
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Das Ziel wird erreicht durch das Verfahren gemäß den Patentansprüchen.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man Rosmarinsäure aus
Pflanzenzellkulturen von Coleus blumei in einem neuen Zwei-Stufen-Prozeß in kreisförmig-exzentrisch
bewegten Kulturgefäßens vorzugsweise Erlenmeyer-Glaskolben, unter Verwendung eines
vollständig geänderten Produktionsmediums erhalten kann, wobei die Ausbeute höher
ist als bei allen bekannten Verfahren. Es werden 10 - 20 Gew.-% Rosmarinsäure bezogen
auf Trockensubstanz, vorzugsweise 15 Gew.-,-erreicht.
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Die erste Stufe des Verfahrens dient der dauerhaften Erhaltung der
lebenden Zellkultur. Dazu werden die Zellen von Coleus blumei in Form der Zellsuspensionskultur
in regelmäßigen Abständen teilweise in frisches Erhaltungsmedium überführt und weitergezüchtet.
Das Erhaltungsmedium besteht ausMineralsalzen, Vitaminen und organischen Substanzen,
Phytohormonen und Kohlenhydraten, vorzugweise in der Zusammensetzung nach Gamborg
et al. (Exptl. Cell Res. 50, 151, 1968).
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Das wässrige Erhaltungsmedium enthält 1,6 - 4,9 g/l Mineralsalzmischung
0*056 - 0,168 g/l Vitamine 1 - 3 gll NZ-Amine (Typ A) 1,6 - 4,8 mg/l Phytohormone
10 - 30 g/l Kohlenhydrate Als Mineralsalze werden verwendet: Kaliumnitrat, Magnesiumsulfat,
Natriumhydrogenphosphat, Calciumchlorid, Ammoniumsulfat, Titriplex III, Eisen-II-sulfat,
Borsäure, Zinksulfat, Mangansulfat, Kai iumjodid, Natriummolybdat, Kupfersulfat,
Kobaltchl orid.
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Als Vitamine werden verwendet: myo-Inosit, Thiaminiumdichlorid, Nikotinsäure,
Pyridoxalhydrochlorid.
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Als organische Substanzen werden verwendet: NZ-Amine (Typ A).
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Als Phytohormone werden verwendet: 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 1-Naphthylessigsäure,
Indol-3-essigsäure, Kinetin.
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Als Kohlenhydrate werden Saccharose, Abfallprodukte und Zwischenprodukte
der Zuckerherstellung, wie Melasse und Rohzucker, oder Stärke verwendet.
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In der zweiten Stufe wird die Zellmasse nach hinreichender Vermehrung
im Erhaltungsmedium in Teilmengen in ein Produktionsmedium überführt, vorzugsweise
in einer Menge von 1 -10 g Zellfrischmasse pro Liter Produktionsmedium.
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Das Produktionsmedium besteht aus einer Mischung von -5 -50 Vol.-%
rückgeführtem, konditioniertem Erhaltungsmedium der Inokulumkultur und 95 - 50 Vol.-%
wässriger Nährstofflösung. Diese Nährstofflösung enthält 30 - 100 g/l Kohlenhydrate,
vorzugsweise Saccharose, vorzugsweise eine Menge von 50 g/l. Es können aber auch
Nebenprodukte der Zuckerherstellung, wie Melasse, die auf einen entsprechenden Gesamtzuckergehalt
von 30 - 100 g/l, vorzugsweise 50 g/l, gebracht wird, in Wasser gelöst verwendet
werden. Außerdem können Mineralsalze hinzugefügt werden, vorzugsweise Calciumchlorid
0 - 300 mg/l, vorzugsweise 150 mg/l.
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Nach einer ausreichenden Verweilzeit in einem Bioreaktor, beispielsweise
von 120 - 340 Stunden bei 20 - 30 OC, und ständiger Belüfung ist die Bildung von
Rosmarinsäure erfolgt.
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Die gezüchtete Biomasse wird dann sofort vom verbrauchten Produktionsmedium
separiert, vorzugsweise durch Zentrifugation oder Filtration, und anschließend schnell
getrocknet, vorzugsweise durch Einfrieren der Zellen und anschließender Gefriertrocknung
oder durch Behandlung mit den üblichen Sprühtrocknungsverfahren oder durch Trocknung
im Wirbelschichtverfahren. Das Endprodukt ist ein hellbraunes Zell-Pulver, vorwiegend
aus ganzen Zellen bestehend, von neutralem Geschmack.
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Bei den Untersuchungen zur Optimierung des Verfahrens und Vergrößerung
der Volumina wurde überraschend gefunden, daß die Rührbedingungen im Bioreaktor
die Ausbeute an Rosmarinsäure erheblich beeinflussen. Durch Anwendung von die Zellkultur
nicht schädigenden Rührbedingungen, die unter Vermeidung von starken Scherkräften
das Medium jedoch gut durchmischen, können die Ausbeuten der Chargen erhöht werden.
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Als besonders geeignet hat sich ein sogenannter Spiral- oder Wendelrührer
erwiesen.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß von der getrockneten,
definierte Mengen Rosmarinsäure enthaltenden Biomasse der Pflanzenzellen von Coleus
blumei direkt pharmazeutische Präparationen hergestellt werden können, z.B durch
Mischen, Granulieren, Dragieren oder Lyophilisieren, vorzugsweise als Tabletten
und/oder Kapseln durch Mischen der getrockneten Biomasse der Pflanzenzellen mit
entsprechenden anorganischen. oder organischen, festen oder flüssigen pharmazeutischen
Hilfsstoffen. Die Präparate können enteral oder parenteral verabreicht werden.
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Auf diese Weise können vorzugsweise Tabletten oder Kapseln hergestellt
werden, die neben der den Wirkstoff in therapeutischen Mengen enthaltenden Biomasse
Gleitmittel, wie Silica, Talkum, Stearinsäure oder deren Salze, wie Magnesium-oder
Calciumstearat und/oder Polyethylenglycol enthalten.
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Sie können auch Bindemittel enthalten, wie Magnesiumaluminiumsilikate,
Getreidestärke, Gelatine, Methylcellulose, Natriumcarboxylmethylcellulose, und/oder
Polvinylpyrrolidon und möglicherweise Füllstoffe wie Agar, Alginate oder deren Salze,
wie Natriumalginat und/oder Absorbentinen, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Süßstoffe
und Brausemittel.
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Außerdem wurde überraschenderweise gefundene daß durch die Beimengung
von getrockneten Zellen aus Pflanzenzellkulturen der Phytostandard von Pflanzendrogen
bezüglich der Inhaltsstoffe verbessert wird und sich bezüglich einer bestimmten
pharmakologischen Wirkung steigern läßt, vorzugsweise durch Beimischen von Zellen
von Coleul-blumei-Pflanzenzellkulturen zu Rosmarinsäure-haltigen Pflanzendrogen,
wie Melissa piperita, Melissa officinalis, Rosmarinus officinalis.
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Beispiel 1 Die von Explantaten einer Pflanze der Art Coleus blumei
mit den bekannten Verfahren der Kallusinduktion erzeugten Zellkulturen werden als
Zellsuspensionskulturen durch Überführen von jeweils ca. 30 Vol.-% Inokulum in frisches
Erhaltungsmedium unter aseptischen Bedingungen nach jeweils 7 Tagen in permanentem
Wachstum gehalten.
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Das Erhaltungsmedium besteht aus Wasser mit Kaliumnitrat 2,5 g/l,
Magnesiumsulfat 250 mg/l, Natriumdihydrogenphosphat 172 mg/l, Calciumchlorid 150
mg/l, Ammoniumsulfat 134 mg/l, Titriplex 111R 34,3mg/l, Eisen-II-sulfat 25,6 mg/l,
Borsäure 3 mg/l, Zinksulfat 3 mg/l> Mangansulfat 1 mg/l, Kaliumjodid 0>75
mg/l, Natriummolybdat 0,25mg/l, Kupfersulfat 0,25 mg/l, Kobaltchlorid 0,25 mg/l,
meso-Inosit 100 mg/l, Thiaminiumdichlord 10 mg/l, Nikotinsäure 1 mg/l, Pyridoxalhydrochlorid
1 mg/l, NZ-Amine (Typ A) 2 g/l, 2,4-Dichlorphenoxyessig säure 2 m/l, Naphthylessigsäure
0,5 mg/l, Indolessigsäure 0,5 mg/T, Kinetin 0,2 mg/l und Saccharose 20 g/l.
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Sämtliche Komponenten werden in Wasser vorgelöst oder suspendie, in
vorgelegtem Wasser vereinigt, auf den pH 5,5 mittels 0,1 N HCl oder 0,1 N KOH eingestellt
und dann auf das gewünschte Endvolumen aufgefüllt. Das Erhaltungsmedium wird chargenweise
in einem Autoklaven 25 Minuten lang bei 121"C und 1 bar Druck erwärmt und dadurch
sterilisiert.
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Die im Erhaltungsmedium auf einem Kreisschüttler (150 UpM und 5 cm
Exzentrizität) bei 25° + 1°C, Schwachlicht von ca.
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100 Lux Fluoran und bei einer rel. Luftfeuchtigkeit von 50 * 10% in
zu 40 % gefüllten Erlenmeyer-Glaskolben vermehrten Chargen der Vorkultur von Coleus
blumei werden vereinigt und als Inokulum in einen mit frischem Erhaltungsmedium
gefüllten Anzucht-Bioreaktor überführt. Dabei wird ein Volumenverhältnis von 30
Teilen Vorkultur mit 70 Teilen Erhaltungsmedium eingehalten. Diese erste Stufe des
erfindungsgemäßen Verfahrens dient der dauerhaften Erhaltung der Zellkultur, wobei
jeweils immer 30 Vol.-% in frisches Erhaltungsmedium in einem Bioreaktor überführt
werden. 70 Vol.-CiÓ stehen zur überführung in Produktionsmedium zur Verfügung.
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Die Vorkultur wird im entsprechenden Animpfverhältnis in den Produktions-Bioreaktor
transferiert, in dem Produktionsmedium vorgelegt ist. Es werden 30 Volumenteile
Vorkultur mit 70 Volumenteilen Produktionsmedium kombiniert.
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Das Produktionsmedium besteht aus zwei Volumenteilen wässriger Saccharoselösung
(75 g/l) und einem Volumenteil verbrauchtem Alt- Erhaltungsmedium von der Vorkultur
das ggfs.
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filtriert wird, um unerwünschte Feststoffe abzutrennen.
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Der Bioreaktor wird mit einer Temperatur von 25 + 1"C und mit einer
Belüftung (Preßluft) von 0,6 vvm (Volumen Luft pro Arbeitsvolumen pro Minute) gefahren.
Die Umwälzung der Zellmassen wird durch einen speziell konstruierten Wendelrührer,
dessen konstruktive Gestaltung in der gleichzeitig eingereichten Anmeldung Nr. beschrieben
ist, mit einer Drehzahl von 50 UpM unterstützt und gewährleistet.
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Das Maximum der Rosmarinsäurebildung liegt am 7. Tag der Kultivierung
mit einer Ausbeute von 3,1 g + 5 % Rosmarinsäure pro Liter Medium entsprechend 0,4
g Rosmarinsäure pro Liter pro Tag. Bezogen auf die Trockenmasse wird eine Rosmarinsäuregehalt
von 16 - 18 % erreicht. Die Schaumbildung wird mit 0,1 ml UcolubR Antischaummittel
pro Liter Medium unterdrückt.
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Zum Zeitpunkt der maximalen Ausbeute wird die Zellmasse geerntet,
vom Altmedium durch Filtration separiert, der Zellkuchen bei -200C tiefgefroren
und in einer Gefriertrockungsanlage lyophilisiert.
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Beispiel 2 Herstellung von Pflanzenzellen enthaltenden Tabletten.
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200 mg getrocknete Pflanzenzellen von Coleus blumei, gemäß Beispiel
1, 25 mg Zucker und 2 mg Calciumstearat werden gut gemischt, zu Tabletten gepreßt
und mit einer Schutzschicht, bestehend aus Gelatine-Zucker-Wasser im Verhältnis
24 : 105, 6 : 52, der ein Farbstoff Eisenoxyd hinzugesetzt wird, überzogen. Die
Tabletten enthalten in dieser Zubereitung 30 mg Rosmari nsäure.
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Beispiel 3 Herstellung von Pflanzenzellen enthaltenden Kapseln.
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350 mg getrocknete Pflanzenzellen von Coleus blumei gemäß Beispiel
1, 30 mg Talkum und 60 mg Aerosil 200 werden gut gemischt, granuliert und in Gelatine-Kapseln
gefüllt.
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Beispiel 4 4 g Folia Melissae werden mit 0,4 g getrockneten nach Beispiel
1 hergestellten Zellen von Coleus blumei angereichert und gemischt und i bekannten
Verfahren in papierene Teebeutel gefüllt zur späteren Heißwasserextraktion. bei
Anwendung.