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Magnetisches immobilisiertes Enzym-
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system und Trägergrundmaterial hierfür Enzymkatalysierte Reaktionen
haben die Vorteile, daß sie mit großer chemischer Spezifität unter relativ milden
Bedingungen ablaufen und oftmals das leisten, was man schwierig, wenn nicht unmöglich
findet, daß nämlich die Versuche im Laboratoriumsmaßstab reproduzierbar sind. Aus
diesem Grund gibt es zunehmende Bestrebungen hinsichtlich der Verwendung enzymatischer
Verfahren in gewerblichem Maßstab. Ein Beispiel von vielen, die genannt werden könnten,
ist die Umwandlung von Glucose in Fructose unter Verwendung von Glucoseisomerase.
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Enzyme sind oftmals wasserlöslich, und wenn sie lediglich in wäßrigen
Lösungen verwendet werden, ist die Enzymrückgewinnung für eine Wiederverwendung
schwierig und aufwendig.
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Wenn man das Enzym andererseits nur einmal verwendet, bekommt man
ein relativ teures Verfahren. Folglich wurden zahlreiche Methoden zur Immobilisierung
entwickelt, bei denen eine wesentliche enzymatische Aktivität entwickelt wird, während
das Enzym selbst fest auf einem wasserunlöslichen Träger gebunden bleibt, so daß
eine Wiederverwendung des Enzyms während langer Zeitdauer und für große Beschikkungsmaterialmengen
möglich ist. Ein Beispiel einer Methode zur Immobilisierung eines Enzyms findet
sich in der US-PS 4 141 857, wo ein Polyamin auf einem Metalloxid, wie Tonerde,
absorbiert, mit einem Überschuß eines bifunktionellen Reagens, wie Glutaraldehyd,
behandelt und so das Amin vernetzt wird und dann die Masse mit Enzym behandelt wird,
um kovalente Bindungen zwischen den am Träger hängenden Aldehydgruppen und einer
Aminogruppe an dem Enzym auszubilden. Das nach dem oben erwähnten Verfahren hergestellte
Trägergrundmaterial hat große Brauchbarkeit bei der Immobilisierung reaktiver chemischer
Dinge, doch sind Enzyme nur eine Klasse solcher reaktiven chemischen Dinge.
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Ein immobilisiertes Enzymsystem ist das Material, welches aus der
Immobilisierüng eines Enzyms auf einem Trägergrundmaterial resultiert. Magnetische
Trägergrundmaterialien und immobilisierte Enzymsysteme bieten verschiedene Vorteile
im Vergleich mit nichtmagnetischen Systemen. Beispielsweise kann die Trennung solcher
Materialien von anderen nichtmagnetischen Feststoffen unter Verwendung eines Magnetfeldes
Trennungen erlauben, die sonst schwierig oder unmöglich durchzuführen sind. Eine
solche Situation ergibt sich im Falle, wo zwei Enzyme mit unterschiedlichen Deaktivierungszeiten
gleichzeitig auf einem Substrat verwendet werden, wobei das eine immobilisierte
Enzymsystem magnetisch und das andere nicht magnetisch ist. In diesem Fall kann,
nachdem ein Enzym verbraucht ist, das andere leicht durch eine magnetische Trennung
der beiden immobilisierten Enzymsysteme gewonnen und wiederverwendet werden, was,
wie zu erkennen ist, große wirtschaftliche Vorteile bietet. Ein anderer Vorteil
solcher magnetischer Materialien ist deren Verwendung in einer magnetisch stabilisierten
Wirbelschicht, was weitere Möglichkeiten in kontinuierlichen Reaktorsystemen ergibt.
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Die US-PS 4 152 210 beschreibt ein Trägergrundmaterial aus feinen
Teilchen ferromagnetischer Materialien. Enzyme werden durch Reagentien daran gebunden,
die mit einem Metalloxidfilm auf der Oberfläche der feinen Teilchen reagieren, oder
sie werden an Polymermaterialien gebunden, die ihrerseits an den Träger gebunden
sind. Ein ernsthafter Nachteil eines solchen Trägergrundmaterials ist seine hohe
Dichte. Dieser Nachteil wird in der US-PS 4 177 253 überwunden, die ein ferromagnetäsches
Material aus einem Kern niedriger Dichte beschreibt, dessen Oberflächemi't magnetischen
Materialien überzogen ist. Da mehr als 50 % der Oberfläche so überzogen sein müssen,
ergibt das letztere Trägergrundmaterial den Nachteil, daß die Zahl der Stellen,
die für anschließende Enzymbindung verfügbar sind, vermindert wird, was wesentliche
Beschränkungen hinsichtlich der Enzymmenge, die immobilisiert werden kann, nach
sich zieht. Da außerdem eine Ober-
flächenbeschichtung mit ferromagnetischem
Material eine Herstellungsmethode erfordert, die ziemlich sorgfältig durchgeführt
werden muß, kompliziert und anspruchsvoll ist, kann man von solchen Trägermaterialien
erwarten, daß sie ziemlich teuer und ihre Herstellung gewerblich undurchführbar
ist. Magnetische Träger für immobilisierte Enzyme und Adsorhentien mit Bioaffinität
wurden von Halling und Dunnill untersucht, siehe Enzyme Microb. Technol., 2, Seiten
2 bis 10 (1980).
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Es ist äußerst erwünscht, ein magnetisches Trägergrundmaterial zu
haben, dessen einziger Unterschied von einem herkömmlichen derartigen Material in
seinen magnetischen Eigenschaften besteht und das durch einfache Verfahren leicht
hergestellt werden kann. Teilweise erfordert dies ein magnetisches Trägermaterial,
dessen ferromagnetische Materialien nicht als ein Oberflächenüberzug gebunden sind
und das durch eine Abwandlung in der grundsätzlichen Herstellungsmethode gewonnen
werden kann.
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Ein Ziel- der Erfindung ist es, ein magnetisches poröses Trägergrandmaterial
zu bekommen. Eine Ausführungsform besteht in einem porösen hitzebeständigen anorganischen
Oxid, in dessen Innerem dispergierte Teilchen von ferromagnetischen Materialien
sich befinden, wobei dieses Oxid mit einem Polyamin imprägniert ist, welches mit
einem Überschuß eines bifunktionellen Reagens vernetzt ist und so daran hängende
funktionelle Gruppen liefert. In einer spezielleren Ausführungsform besitzen die
Teilchen eine Größe von wenigstens 0,05 µm und sind aus der Gruppe Eisen, Kobalt
und Nickel ausgewählt. In einer spezielleren Ausführungsform ist das Polyamin Polyäthylenimin
und das bifunktionelle Reagens Glutaraldehyd.
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Die Trägergrundmaterialien der US-PS 4 141 857 sind breit wirksam
und erfreuten sich weiter erfolgreicher Verbreitung für verschiedene Enzyme. Die
vorliegendf Erfindung betr-ìfft Trägergrundmaterialien, die Vorteilc hlbfn, wLlche
(i rl(m
magnetischen 'ir( ergrundmaterial zukommen, während man
die Vortel]e ç rl der genannten Patentschrift bechriebenen Trägergrundmaterials
ausnutzt. Kurz gesagt ist das Trägergrundmaterial nach der Erfindung ein poröses
hitzebeständiges anorganisches Oxid, in dessen Innerem sich dispergierte Teilchen
ferromagnetischer Materialien befinden, wobei das Oxid mit einem Polyamin imprägniert
ist, das mit einem Überschuß eines bifunktionellen Reagens vernetzt ist, so daß
man daran hängende funktionelle Gruppen bekommt.
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Unter den porösen hitzebeständigen anorganischen Oxiden nach der Erfindung
finden sich Tonerde, Thoriumoxid, Magnesia, Kieselsäure und Kombinationen derselben,
wobei Tonerde bevorzugt ist. Solche Oxide können in der Form von Granalien oder
Pulvern mit einer Größe so klein wie etwa 100 Maschen (US-Siebreihe) in der Form
von Kugeln, Pellets, Extrudaten und dergleichen vorliegen.
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Ein Punkt der Neuheit der Erfindung ist jener, daß im gesamten Inneren
dieser Oxide Teilchen magnetischer bzw. ferromagnetischer Materialien dispergiert
sind. Die Dispersion ferromagnetischer Teilchen erfolgt mehr oder weniger gleichmäßig
in dem gesamten Körper des Oxids. Wegen einer solchen gleichmäßigen Dispergierung
sind einige ferromagnetische Teilchen auch auf der Oberfläche des Oxids. Es sei
jedoch betont, daß die Anwesenheit von etwas ferromagnetischem Material auf der
Oberfläche nach der Erfindung zufällig auftritt und nicht Teil der Erfindung ist.
Es sei auch bemerkt, daß nur ein relativ kleiner Anteil der ferromagnetischen Teilchen
sich auf der Oberfläche befindet, und dieser Anteil ist geringer und allgemein wesentlich
geringer als etwa 10 % der Gesamtheit.
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Die Teilchengröße der ferromagnetischen Materialien ist im allgemeinen
größer als etwa 0,05 p. Eine Untergrenze wird durch die Notwendigkeit diktiert,
zu verhindern, daß ein wesentlicher Teil des ferromagnetischen Materials zu einem
nichtferromagnetischen Zustand oxidiert wird. Wenn
das Produkt
des ferromagnetischen Materials selbst ferromagnetisch ist, kann diese Untergrenze
in der Teilchengröße nioht anwendbar sein. Eine Obergrenze wird dadurch bestimmt,
daß es erwünscht ist, daß der Durchmesser der gebildeten Oxidteilchen wenigstens
etwa zehnmal der Durchmesser der ferromagnetischen Materialien ist, die im Inneren
disper--giert sind. So kann die Teilchengröße so groß wie etwa 0,5 mm sein, wobei
der Bereich von etwa 0,1 ptbis etwa 0,1 mm bevorzugt ist und Größen von etwa 0,5
pXbis etwa 50 pfnoch mehr bevorzugt sind.
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Die ferromagnetischen Materialien, die für die Erfindung verwendet
werden können, sind alle geeigneten Materialien mit ferromagnetischen Eigenschaften.
Beispiele solcher ferromagnetischen Materialien sind Nickel, verschiedene ferromagnetische
Stähle, wie Kohlenstoffstahl, Chromstahl, Wolframstahl, kaltgewalzter Stahl, Kobaltstahl,
ferromagnetische Legierungen, wie Ferroxdur, Oerstit, Permalloy, Hipernik, Ferroxcube,
Sinimax, Alnico, Hycomax, Remalloy, Hyflux und andere Legierungen, die im CRC-Handbook,
50. Auflage, E-124 bis E-129 aufgeführt sind, und Verbindungen, wie Magnetit, der
obigen Metalle, welche selbst ferromagnetisch sind.
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Solche ferromagnetischen Materialien liegen in einer Menge von etwa
1 bis etwa 40 Gewichts-%, bezogen auf das anorganische Oxid, vor.
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Das anorganische Oxid mit in seinem Inneren dispergierten ferromagnetischen
Teilchen wird mit einem Polyamin imprägniert und anschließend mit einem Überschuß
eines bifunktionellen Reagens vernetzt, um so daran hängende funktionelle Gruppen
zu bilden. Unter den Polyaminen, die mit Erfolg verwendet werden können, finden
sich Polyäthylenimin, Tetraäthylenpentamin, Äthylendiamin, Diäthyltriamin, Triäthylentetramin,
Pentaäthylenhexamin, Hexamethylendiamin und Phenylendiamin. Unter diesen Materialien
ist Polyäthylenimin besonders bevorzugt.
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Das bifunktionelle Reagens dient gleichzeitig zur Vernetzung
des
Polyamins, wobei es eine festhaftende Schicht ergibt, und zur Bildung daran hängender
funktioneller Gruppen, die anschließend mit einem Enzym reagieren können, um dieses
so an das Trägergrundmaterial zu binden. Unter den bifunktionellen Reagentien, die
verwendet werden können, finden sich Glutaraldehyd, Succindialdehyd, Terephthalaldehyd
und Toluoldiisocyanat, wobei Glutaraldehyd etwas bevorzugt ist.
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Immobilisierte Enzymsysteme resultieren aus der Kupplung oder Bindung
eines Enzyms an das Trägergrundmaterial. Daher umfassen solche immobilisierten Enzymsysteme
das Trägergrundmaterial mit dem daran gebundenen Enzym. Beispiele von Enzymen, die
verwendet werden können, sind Glucoseisomerase, Glucoamylase, Lactase, Cellulase,
Glucoseoxydase, Peroxydase, Ribonuclease, Urease, Histidinase, Trypsin, Papain,
Hexokinase, Chymotrypsin, Acylase, Invertase, Ficin, Lysozym, Protease, Pepsin,
Rennin, Xylanase, Betaamylase, Gammaamylase, Asparaginase, Cholesterinoxidase, Alkoholdehydrogenase,
Aminosäureoxidase, Collagenase, Arginase, Catalase und Deoxyribonuclease, wobei
diese Beispiele nur repräsentativ für die verwendbare Gruppe sind.
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Das Trägergrundmaterial nach der Erfindung kann hergestellt werden,
indem man zunächst das poröse hitzebeständige anorganische Oxid in Gegenwart einer
feinen Dispersion von ferromagnetischem Material bildet. Beispielsweise kann ein
Tonerdesol mit einer Suspension von ferromagnetischem Material der erwünschten Größe
und in einem solchen Verhältnis, daß man den erwünschten Prozentsatz an ferromagnetischem
Material bekommt, vermischt werden. Das Sol läßt man dann schnell gelieren, so daß
das feste Oxid um die dispergierten Teilchen von ferromagnetischen Materialien herum
gebildet wird, was dazu führt, daß die letzteren mehr oder weniger gleichmäßig in
dem gesamten Oxid dispergiert werden. Das Sol wird dann beispielsweise bei etwa
6500 C während etwa 2 Stunden unter Bedingungen calciniert, bei denen das ferromagnetische
Material nicht zu einem nichtferromagnetischen Zustand oxidiert wird. Wenn beispielsweise
Nickelteilchen
größer als etwa 2 pgverwendet werden, kann die Calcinierung
in Luft durchgeführt werden. Wenn jedoch Magnetit der gleichen Größe- verwendet
wird, muß die Calcinierung in einer inerten oder nicht oxidierenden Atmosphäre,
wie in Stickstoff, Wasserstoff, Argon usw. durchgeführt werden.
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Nach der Herstellung des Oxids mit in seinem gesamten Inneren dispergierten
ferromagnetischen Teilchen wird die Herstellung des Trägergrundmaterials vervollständigt,
wie in der US-PS 4 141 857 beschrieben ist.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung
und nicht zu deren Beschränkung.
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Beispiels 1 Das poröse hitzebeständige anorganische Oxid, das dispergierte
Teilchen von ferromagnetischen Materialien enthält, wurde nach der Öltropfmethode
gemäß der US-PS 2 620 314 hergestellt. Das Tonerdesol wurde durch Umsetzung von
Aluminiumpellets mit 99,9-%iger Reinheit mit Chlorwasserstoffsäure und entionisiertem
Wasser hergestellt, wobei ein Material mit einem Verhältnis von Aluminium zu Chlor
von 1,35 und mit einem Gehalt von 12,62 Gewichts-% Aluminium erhalten wurde. 500
ml Sol, 500 ml 28-gewichtsprozentige Hexamethylentetraminlösung und 16' g Magnetit
(Fe3O4) mit einer mittleren Teilchengröße von 0,7 wurden miteinander vermischt.
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Tröpfchen eines Durchmessers von 1/16" wurden gebildet und durch eine
8 Fuß-Öl säule bei 95" C geschickt. Die Kugeln wurden in einem rostfreien Stahlbecher
aufgefangen, mit einem heißen Ölbad überdeckt und in einen Ofen von 1000 C während
19 Stunden gegeben. Sodann wurden sie in einen Waschturm überführt, und 5 Gallonen
l-%iger wäßriger Ammoniaklösung wurden bei 950 C über die Kugeln während 6 Stunden
geleitet. Die Kugeln wurden dann mit 5 Gallonen 0,01 %iger wäßriger Ammoniaklösung
während 7 Stunden gewaschen und 4 Stunden bei 1200 C getrocknet.
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Dieses Material wurde unter Stickstoff bei 650" C während einer Stunde
calciniert, wobei das resultierende Material magnetisch war. Wenn das Material jedoch
in Luft bei 650 bis 6600 C während etwa 1,5 Stunden calciniert wurde, war fast nichts
von dem Material magnetisch.
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Beispiel 2 Nickelhaltige Tonerde wurde nach einem ähnlichen Verfahren
wie dem obigen hergestellt. Es wurden 600 ml eines Sols (Verhältnis von Aluminium
zu Chlor 1,62 bei 12 Gewichts-E Aluminium), 600 ml 28-gewichtsprozentiger Hexamethylentetraminlösung
und 18 g Nickelpulver mit einer mittleren Teilchengröße von 1,4 pmlverwendet. Die
Calcinierung erfolgte in einer Stickstoff-Wasserstoffatmosphäre (etwa 90 % Stickstoff)
bei 6000 C während einer Stunde und 650" C während 1/4 Stunde mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 1/Min. Das so hergestellte Material war magnetisch. Ähnliche Calcinierungen
unter Stickstoff und in Luft ergaben auch magnetisches Material. Selbst wenn die
Calcinierung unter Luft bei 6500 C während 3,5 Stunden durchgeführt wurde, blieb
die Probe magnetisch.
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Beispiel 3 Eine Probe von Nickel in Tonerde, die wie in Beispiel 2
hergestellt und unter 90-%igem Stickstoff-Wasserstoff calciniert worden war, wurde
zermahlen und auf eine Maschengröße (US-Siebreihe) von 25/35 gesiebt. Eine Probe
von 1 g wurde mit 7.0 ml 1,5-%iger Polyäthyleniminlösung während einer Stunde unter
Vakuum behandelt. Das resultierende mit Polyamin imprägnierte Material wurde in
einem Buchner-Trichter getrocknet, dann ließ man es weiter über Nacht auf Filterpapier
trocknen. Eine Probe von 0,5 g des getrockneten Feststoffes wurde mit 5 ml 1-%iger
Glutaraldehydlösung unter gelegentlichem Mischen behandelt. Die Flüssigkeit wurde
dekantiert und der Feststoff erschöpfend mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis
für die Waschflüssigkeiten der Fuch-
sin-Aldehydtest negativ war.
Der resultierende Feststoff wurde mit etwa 10 ml einer Lösung, die etwa 1700 internationalie
Einheiten Glucoseisomerase enthielt, etwa 18 Stunden geschüttelt. Überschüssige
Enzymlösung wurde dekantiert, und das immobilisierte Enzymsystem wurde gut mit entionisiertem
Wasser gewaschen, um anhaftendes, aber ungebundenes Enzym zu entfernen. Das so hergestellte
Material wurde in einem Reaktorfließsystem unter Verwendung von 45-%iger Fructose
als Beschickungsmaterial mit einem Gehalt von 5 mM Magnesiumsulfat bei pH 8,0 analysiert.
Die Analyse des Auslaufes durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie hinsichtlich
des Glucosegehaltes zeigte eine Aktivität von 961 internationalen Einheiten je Gramm.
Immobilisierte Glucoseisomerase, die auf Tonerde von 25/35 Maschen (US-Siebreihe)
in jeder Beziehung ähnlich, jedoch ohne Einlagerung von Nickel hergestellt wurde,
zeigte Aktivitäten von etwa 1000 Einheiten je Gramm. Somit zeigte die immobilisierte
Glucoseisomerase vergleichbare Aktivitäten auf dem magnetischen und auf dem nichtmagnetischen
Träger.