DE3222084A1 - MONOCLONAL ANTIBODIES - Google Patents
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Description
BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, BayerwerkBAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk
Zentralbereich no ι ·Central area no ι ·
Patente, Marken und Lizenzen Dn/by-c *»*♦ Juni Monoklonale AntikörperPatents, trademarks and licenses Dn / by-c * »* ♦ June Monoclonal Antibodies
Die vorliegende Erfindung beschreibt generell neue Hybridom-Zellinien und im speziellen Hybridom-Ze!linien zur Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen mensch- ■ liehen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (PA II), Antikörper, die auf diese Weise produziert werden, präparative, therapeutische und diagnostische Anwendungen sowie pharmazeutische Zubereitungen, die diese Antikörper enthalten. The present invention generally describes new hybridoma cell lines and in the special hybridoma cell lines for Production of monoclonal antibodies against human ■ borrowed plasminogen activator of tissue type (PA II), antibodies, which are produced in this way, preparative, therapeutic and diagnostic uses as well pharmaceutical preparations containing these antibodies.
Die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen (Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) war der erste Hinweis für die Möglichkeit, kontinuierliche Zellinien zu erhalten, die einheitliche (sog. "monoklonale") Antikörper produzieren. - Seitdem sind zahlreiche Versuche unternommen worden, verschiedene Hybrid-Zellen (sog. "Hybridome") herzustellen und die Antikörper, die von ihnen gebildet werden, für unterschiedliche wissenschaftliche Untersuchungen einzusetzen (z.B.: Current Topics in Microbiology and Immunology, VoI 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. MeIchers, et al, Springer-Verlag (1978), sowieThe fusion of mouse myeloma cells with spleen cells from immunized mice (Kohler and Milstein, Nature 256 , 495-497 (1975)) was the first indication of the possibility of obtaining continuous cell lines which produce uniform (so-called "monoclonal") antibodies . - Since then, numerous attempts have been made to produce various hybrid cells (so-called "hybridomas") and to use the antibodies that are formed by them for various scientific investigations (eg: Current Topics in Microbiology and Immunology , Vol 81 - "Lymphocyte Hybridomas ", F. MeIchers, et al, Springer-Verlag (1978), as well as
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Referenzen darin; CJ. Barnstable et al., Cell 14, 9-20 (1978); P. Parham, W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. Aufl., Bd. 2, D.M. Wier, Herausgeber: Backwell, 1978, Kapitel 25, Chem. Eng. News, 15-17 (1979)).References in it; CJ. Barnstable et al., Cell 14: 9-20 (1978); P. Parham, WF Bodmer, Nature 276: 397-399 (1978); Handbook of Experimental Immunology , 3rd ed., Vol. 2, DM Wier, Editor: Backwell, 1978, Chapter 25, Chem. Eng. News, 15-17 (1979)).
Diese Arbeiten schildern die prinzipielle Technik zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridome.This work describes the basic technology for the production of monoclonal antibodies by hybridomas.
Monoklonale Antikörper gegen Histokompatibilitätsantigene, gegen Haptene, Protein und Enzyme sind bereits erzeugt worden. Es ist jedoch noch nichts bekannt über die Antikörperproduktion somatischer Zellhybride gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp.Monoclonal antibodies against histocompatibility antigens, against haptens, protein and enzymes have already been generated. However, nothing is known about yet somatic cell hybrid antibody production against human tissue-type plasminogen activator.
Der Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ist ein Enzym 15 des fibrinolytischen Systems, der Plasminogen zu Plasmin umwandelt, welches seinerseits Fibrin abbauen kann. Somit wirkt er thrombolytisch. Die drei genannten Proteine (Plasminogen, Plasmin, Fibrin) kommen im Blut vor. Plasminogenaktivator kann daher in der Therapie von Hyper-20 koagulationszuständen, speziell bei thromboembolischen Erkrankungen, von Nutzen sein.The tissue-type plasminogen activator is an enzyme of the fibrinolytic system that converts plasminogen to plasmin converts, which in turn can break down fibrin. Thus it has a thrombolytic effect. The three proteins mentioned (Plasminogen, plasmin, fibrin) occur in the blood. Plasminogen activator can therefore be used in the therapy of hyper-coagulation conditions, especially in thromboembolic Diseases, be of use.
Gegenwärtig werden Urokinase, die aus menschlichem Urin oder aus Nierenzellkulturen gewonnen wird, und Streptokinase, die aus Kulturfiltraten ß-hämolysierender Streptokokken isoliert wird als Fibrinolylikum verwendet. Beide sind jedoch in ihrer therapeutischen Verwendung nicht unproblematisch.Currently, urokinase, obtained from human urine or from kidney cell cultures, and streptokinase, those from culture filtrates ß-hemolyzing Streptococcus isolated is used as a fibrinolylic agent. However, both are in their therapeutic uses not unproblematic.
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Plasminogenaktivator vom Geweb'etyp kann von Urokinase und Streptokinase unterschieden werden. Für den Plasminogenaktivator vom Gewebetyp wurde ein Molekulargewicht von ca. 72 000 gefunden. Er wird von menschlichen Melanomzellen produziert und kann aus den entsprechenden Kulturüberstäriden nach der Methode von Rijken und Collen (JBC 256, 7035-7041 (1981)) isoliert werden.Plasminogen activator of the tissue type can be distinguished from urokinase and streptokinase. The tissue type plasminogen activator was found to have a molecular weight of about 72,000. It is produced by human melanoma cells and can be isolated from the corresponding culture hypersensitivities by the method of Rijken and Collen (JBC 256 , 7035-7041 (1981)).
Monoklonale Antikörper gegen den Plasminogenaktivator vom Gewebetyp sind in mehrerer Hinsicht von Interesse. So kann z.B. das bisherige dreistufige Reinigungsverfahren für den Plasminogenaktivator auf ein einstufiges vereinfacht werden durch Verwendung solcher Antikörper in einer Immunoadsorptionschromatographie.Monoclonal antibodies against the plasminogen activator tissue type are of interest in several respects. For example, the previous three-stage cleaning process for the plasminogen activator can be converted to a single-stage one can be simplified by using such antibodies in immunoadsorption chromatography.
Die vorliegende Erfindung stellt Hybridomzellinien zur Verfügung, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp synthetisieren und sezerriieren. Diese Hybridome werden nach der eingangs genannten Methode von Köhler und Milstein hergestellt. Nach der Immunisierung von Mäusen mit Plasminogenaktivator vom Gewebetyp werden die MilζzeIlen dieser Mäuse mit Zellen einer Maus-Myelomzellinie fusioniert; .die daraus resultierenden Hybridome wurden systematisch auf Antikörper untersucht, die selektiv mit dem Plasmino genaktivator vom Gewebetyp der an Mikrotiterplatten fixiert ist, reagieren. Auf diese Weise wurden Hybridome isoliert, die Antikörper gegen den Plasminogenaktivator produzieren. Einige dieser Antikörper reagieren ausschließlich mit Plasminogenaktivator vom Gewebetyp,The present invention provides hybridoma cell lines Available that synthesize highly specific monoclonal antibodies against tissue-type plasminogen activator and secrete. These hybridomas are produced by the Köhler and Milstein method mentioned at the beginning. After immunization of mice with tissue-type plasminogen activator, their spleens become Mice fused with cells of a mouse myeloma cell line; The resulting hybridomas were systematically examined for antibodies that were selectively produced with the Plasmino tissue type gene activator attached to microtiter plates react. In this way they became hybridomas that produce antibodies against the plasminogen activator. Some of these antibodies react exclusively with tissue-type plasminogen activator,
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während andere eine Kreuzreaktion mit Urokinase aufweisen. Die so produzierten Antikörper sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung. Sie sind monospezifisch für eine bestimmte antigene Determinante im Plasminogenaktivatormolekül. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Methoden zur Herstellung dieser Hybridome.while others cross-react with urokinase. The antibodies produced in this way are a further subject of the invention. They are monospecific for one certain antigenic determinants in the plasminogen activator molecule. The present invention further describes Methods for making these hybridomas.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können z.B. zur Bestimmung von Plasminogenaktivator in normalen und malignen Zellen, verwendet werden. Sie sind somit für diagnostische und prognostische Zwecke, z.B. zur Überprüfung des Tumorwachstums oder des funktioneilen Status normaler Zellen, einsetzbar.The antibodies according to the invention can be used, for example, to determine of plasminogen activator in normal and malignant cells. They are thus for diagnostic and prognostic purposes, e.g. to check tumor growth or the functional status of normal cells, applicable.
Die Herstellung der Hybridome umfaßt im allgemeinen die folgenden Schritte:The preparation of the hybridomas generally comprises the following steps:
A. Immunisierung von Mäusen mit dem menschlichen Plasminogenaktivator. Weibliche Balb/c-Mäuse -erwiesen sich hierzu als brauchbar, jedoch können auch andere Mäusestämme verwendet werden. Das Immunisierungsschema und die Konzentration an Plasminogenaktivator A. Immunization of mice with the human plasminogen activator. Female Balb / c mice have been shown to be useful for this purpose, but others can also Mouse strains can be used. The immunization regimen and the concentration of plasminogen activator
20 sollten so gewählt werden, daß hinreichende Mengen an Antigen stimulierten Lymphocyten gebildet werden. Drei Immunisierungen im Abstand von 14 Tagen mit 100 μg/Protein/Maus/Injektion mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung er-20 should be chosen so that sufficient amounts of antigen-stimulated lymphocytes are formed. Three immunizations 14 days apart with 100 μg / protein / mouse / injection with phosphate-buffered physiological saline solution
25 wiesen sich als effektiv.25 were found to be effective.
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B. Gewinnung der Milzen der immunisierten Mäuse und Herstellung einer Milzzellsuspension in einem geeigneten Medium. Ungefähr 1 ml Medium pro Milz •ist ausreichend. Die experimentellen TechnikenB. Obtaining the spleens of the immunized mice and Preparation of a spleen cell suspension in a suitable medium. Approximately 1 ml of medium per spleen •is sufficient. The experimental techniques
5 dazu sind bekannt.5 are known.
C. Fusion der suspendierten Milzzellen mit Maus-Myelom-, zellen einer geeigneten Zellinie (z.B. P 3 χ 68 Ag 8), indem man einen geeigneten Fusionspromotor (z.B. Polyethylenglykol) verwendet. Bevorzugte Fusionspromoter sind Polyethylenglykole vom mittleren Molekulargewicht zwischen 1 000 und 4 000 (z-B. kommerziell erhältliches PEG 1 000 etc.). Jedoch können auch andere bekannte Fusionspromotoren benutzt werden. Bevorzugt wird ein Verhältnis von etwa 10 MiIzzellen pro Myelomzelle. Ein Gesamtvolumen von etwaC. Fusion of the suspended spleen cells with mouse myeloma, cells of a suitable cell line (e.g. P 3 χ 68 Ag 8) by adding a suitable fusion promoter (e.g. Polyethylene glycol) is used. Preferred fusion promoters are medium molecular weight polyethylene glycols between 1,000 and 4,000 (e.g. commercially available PEG 1,000 etc.). However, you can other known fusion promoters can also be used. A ratio of about 10 microcells is preferred per myeloma cell. A total volume of about
8 0/5 - 1,0 ml Fusionsmedium ist ausreichend für 10 Milzzellen. Es sind viele Myelomzellinien aus Mäusen bekannt und erhältlich, z.B. von wissenschaftlichen Instituten oder von Zellhinterlegungsinstitutionen wie z.B. das SaIk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Die verwendete Zellinie soll vor-, zugsweise vom sog. "drug resistent"-Typ sein, so daß nicht fusionierte Myelomzellen in einem Selektionsmedium absterben, während Hybride überleben.8 0/5 - 1.0 ml fusion medium is sufficient for 10 Spleen cells. There are many mouse myeloma cell lines known and available, e.g. from scientific institutes or from cell deposit institutions such as the SaIk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. The cell line used should be preferably of the so-called "drug resistant" type, so that unfused myeloma cells in a selection medium die while hybrids survive.
Am häufigsten werden gegen 8-Azaguanin-resistente Zellinien, welchen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase fehlt, und die deshalb in einem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) nicht wachstumsfähig sind, benutzt.Cell lines resistant to 8-azaguanine, which contain the enzyme hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase, are most common is missing, and is therefore in a HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, Thymidine) are not capable of growth.
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Vorzugsweise soll die verwendete Myelomzellinie auch vom "non-secreting"-Typ sein, damit sie nicht selbst Antikörper oder H- bzw. L-Ketten von Immunglobulinen bildet. In gewissen Fällen jedoch können 5 sekretierende Myelomzellen von Vorteil sein.Preferably the myeloma cell line used should also be of the "non-secreting" type so that they do not have antibodies or H or L chains of immunoglobulins themselves forms. In certain cases, however, secreting myeloma cells can be beneficial.
D. Verdünnung und Kultivierung in Einzelgefässen derD. Dilution and cultivation in individual vessels of the
nicht fusionierten Milzzellen, der nicht fusionierten Myelomzellen und der fusionierten Zellen in einem Selektivmedium, in dem die nicht fusionierten Myelom-unfused spleen cells, the unfused myeloma cells and the fused cells in one Selective medium in which the unfused myeloma
10 zellen sich nicht vermehren, so daß die nicht fusionierten Zellen absterben (ca. 1-2 Wochen). Die einzelnen fusionierten Zellen werden isoliert, indem das Volumen des Verdünnungsmittels so eingestellt wird, daß eine bestimmte Zahl von Zellen (etwa 1-4) in das10 cells do not multiply, so that they did not fuse Cells die off (approx. 1-2 weeks). The individual fused cells are isolated by adding the Volume of the diluent is adjusted so that a certain number of cells (about 1-4) in the
15 einzelne Gefäß (z.B. jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte) kommt. Das Medium (z.B.. HAT-Medium) verhindert, daß die resistente (z.B. gegen 8-Azaguanin) nicht-fusionierte Myelomzellinie auswächst; sie stirbt damit ab. Die nicht fusionierten MiIz-15 individual vessels (e.g. each well of a microtiter plate). The medium (e.g. HAT medium) prevents the resistant (e.g. against 8-azaguanine) unfused myeloma cell line grows out; it dies with it. The non-merged MiIz-
zellen haben nur eine begrenzte Zahl, von Teilungszyklen; deshalb sterben auch diese Zellen nach einer gewissen Zeit (etwa 1-2 Wochen). Die fusionierten Zellen hingegen vermehren sich weiterhin, da sie von den elterlichen Myelomzellen das permanente Wachstum und von der elterlichen Milzzelle die Fähigkeit, das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase zu synthetisieren, ererbt haben und somit im Selektionsmedium überleben können.cells have only a limited number of cycles of division; therefore these cells also die afterwards a certain time (about 1-2 weeks). The fused cells, however, continue to multiply, since it is the permanent growth of the parental myeloma cells and of the parental spleen cell the ability to use the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase to synthesize, have inherited and thus can survive in the selection medium.
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E. Überprüfung auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator in jedem Gefäß.E. Check for the presence of antibodies to plasminogen activator in each tube.
F. Selektion (z.B. durch limitierte Verdünnung) und Klonierung der Hybridome, die den gewünschten Anti-F. Selection (e.g. by limited dilution) and cloning of the hybridomas that have the desired anti-
5 körper produzieren.5 bodies produce.
Ist einmal das gewünschte Hybridom selektioniert und kloniert worden, kann man den Antikörper auf zwei verschiedenen Wegen produzieren. Monoklonale Antikörper von sehr hoher Reinheit erhält man, wenn man die Hybridome in einem geeigneten Medium über eine gewisse Zeit kultiviert und den Antikörper aus dem überstand gewinnt. Ein geeignetes Medium und die optimale Kulturdauer sind einfach zu bestimmen. Diese in-vitro-Technik liefert monoklonale Antikörper, die nur mit geringenOnce the desired hybridoma has been selected and has been cloned, the antibody can be produced in two different ways. Monoclonal antibodies of very high purity is obtained if the hybridomas cultivated in a suitable medium for a certain time and the antibody from the supernatant wins. A suitable medium and the optimal culture time are easy to determine. This in vitro technique delivers monoclonal antibodies with only low levels
15 Mengen von Proteinen aus dem heterologen Serum (z.B. foetalem Kälberserum) verunreinigt sind.15 quantities of proteins from the heterologous serum (e.g. fetal calf serum) are contaminated.
Um eine wesentlich höhere Konzentration an monoklonalen Antikörpern mit nur wenig geringerer Reinheit herzustellen, kann man das ausgewählte Hybridom einer MausTo have a much higher concentration of monoclonal The selected hybridoma of a mouse can be used to produce antibodies with only slightly lower purity
20 ~ vorzugsweise einer syngenen oder semisyngenen -20 ~ preferably a syngeneic or semi-syngeneic -
injizieren. Dies führt in der Maus nach einer gewissen Inkubationszeit zur Bildung eines Tumors, der hohe Antikörperkonzentrationen
(5 - 20 mg/ml) im Blut und im
peritonealen Exsudat (Ascites) des Wirtstieres frei-inject. After a certain incubation time, this leads to the formation of a tumor in the mouse, which has high antibody concentrations (5 - 20 mg / ml) in the blood and in the
free peritoneal exudate (ascites) of the host animal
25 setzt. Wenn auch diese Mäuse normale Antikörper in Blut und Ascites haben, so kommen diese doch nur in25 places. Even if these mice have normal antibodies in the blood and ascites, these only come in
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einer Konzentration von ca. 5 % der monoklonalen Antikörper vor. Der so gewonnene monoklonale Antikörper hata concentration of approx. 5% of the monoclonal antibodies before. The monoclonal antibody thus obtained has
3 einen hohen Titer (er ist aktiv in Verdünnungen von 10 oder darunter), und das Verhältnis zwischen spezifischen und nicht-spezifischem Immunglobulin beträgt etwa 20:1.3 has a high titer (it is active in dilutions of 10 or below), and the ratio between specific and non-specific immunoglobulin is about 20: 1.
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Plasminogenaktivator wurde aus Melanomzellkulturüberständen nach der Methode von Rijken und Colien (JBC 256, 7035 - 7041 (1981)) hergestellt.Plasminogen activator was produced from melanoma cell culture supernatants by the method of Rijken and Colien (JBC 256, 7035-7041 (1981)).
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden subcutan mit 100 μg Plasminogenaktivator in komplettem Freund'sehen Adjuvans immunisiert. Die Tiere wurden subcutan mit 100 μg Plasminogenaktivator nach 14, 28 und 42 Tagen geboostert. Die Milzen wurden zur Zellfusion am 53. Tag entnommen. Vier Tage vor Entnahme der Milzen erhielten die Tiere nochmals 30 μg Plasminogenaktivator täglich i.p.Female Balb / c mice were administered subcutaneously with 100 μg of plasminogen activator in complete friend's view adjuvant immunized. The animals were administered subcutaneously with 100 μg of plasminogen activator boosted after 14, 28 and 42 days. The spleens were removed for cell fusion on day 53. Four days before the spleens were removed, the animals received a further 30 μg of plasminogen activator i.p. daily.
Aus den entnommenen Milzen wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, indem die Organe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepreßt wurden. Die Zellen wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), das mit 4,5 g/l Glucose, 1 000 Einh./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war, überführt. Die Zellen wurden dreimal mit DMEM gewaschen und dann in gewünschter Konzentration im selben Medium resuspendiert.Single cell suspensions were prepared from the removed spleens by passing the organs through a stainless steel sieve Steel were pressed. The cells were in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), which was prepared with 4.5 g / l glucose, 1000 units / ml penicillin and 100 μg / ml Streptomycin was supplemented, transferred. The cells were washed three times with DMEM and then in desired Concentration resuspended in the same medium.
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Im allgemeinen wurden etwa 10 Zellen pro Milz gewonnen.8th
Generally about 10 cells were obtained per spleen.
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Die hier verwendete Myelomze!linie X 6 3-Ag 8-653 ist ein Subklon der Mäusemyelomzellinie P 3-X 63-Ag 8. Die Zelllinie exprimiert keine schweren oder leichten Ketten vonThe myeloma cell line X 6 3-Ag 8-653 used here is a Subclone of the mouse myeloma cell line P 3-X 63-Ag 8. The cell line does not express heavy or light chains of
5 Immunglobulinen (J. Immunol. 123, 1548 - 1550 (1980 )).
Sie wurde von Dr. Lemke, Institut für Genetik der Universität Köln, zur Verfügung gestellt. Die Zellen sind
gegen 20 μg/ml 8-Azaguanin in einem Medium, das Hypoxanthin,
Aminopterin, Thymidin (HAT) enthält, resistent.5 immunoglobulins ( J. Immunol. 123 , 1548-1550 (1980)).
It was made by Dr. Lemke, Institute for Genetics at the University of Cologne. The cells are
resistant to 20 μg / ml 8-azaguanine in a medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine (HAT).
Sie wurden in DMEM, das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin, 1 000 Einh./ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 10 % foetalem Kälberserum supplementiert war (komplettes Medium) aufgezogen. Die Myelomzellen waren zum Zeitpunkt der Fusionierung in der logarithmischen Phase der Zellvermehrung.They were in DMEM containing 4.5 g / l glucose, 20 mM glutamine, 1,000 units / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin and 10% fetal calf serum was added (complete medium). The myeloma cells were at the time of fusion in the logarithmic phase of cell proliferation.
Die Milzzellsuspensionen wurden zu den Myelomzellen in DMEM ohne Serum in einem Verhältnis von 10:1 zugegeben und 10 Minuten bei 200 g in Bechern mit rundem Boden zentrifugiert. Nach Absetzen d/s Sediments wurde das überstehende Medium vorsichtig dekantiert. Die Sedimente wurden mit 2 ml einer Lösung von PoIyethylenglykol vom MG 2 000 (verdünnt auf 30 % w/w mit DMEM, pH 7,6) 1 Minuten bei 370C inkubiert. Daraufhin wurden 20 ml DMEM zugegeben, worauf die Zellen über einige Minuten vorsichtig resuspendiert wurden. Sie wurden dann nochmals 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiertThe spleen cell suspensions were added to the myeloma cells in DMEM without serum in a ratio of 10: 1 and centrifuged for 10 minutes at 200 g in round-bottom beakers. After the sediment had settled down, the supernatant medium was carefully decanted. The sediments were incubated at 37 ° C. for 1 minute with 2 ml of a solution of polyethylene glycol of MW 2000 (diluted to 30% w / w with DMEM, pH 7.6). Then 20 ml of DMEM were added and the cells were carefully resuspended for a few minutes. They were then centrifuged again for 5 minutes at 200 g
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und nun in komplettem Medium so resuspendiert, daß man eine Konzentration von 10 Zellen/ml erhielt, worauf, sie in 1 ml-Anteilen auf Costar-Platten verteilt wurden.and now resuspended in complete medium so that a concentration of 10 cells / ml was obtained, whereupon, they were distributed in 1 ml portions on Costar plates.
Nach der Zellfusion wurden die Zellen in HAT-MediumAfter the cell fusion, the cells were placed in HAT medium
(Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) bei 370C mit 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre kultiviert. Nach einigen Wochen wurden 100 μΐ der überstände aus den Hybridom-Zellkulturen auf Anti-Plasminogenaktivator-Aktivi-(Hypoxanthine, aminopterin, thymidine) cultivated at 37 0 C with 5% CO 2 in a humid atmosphere. After a few weeks, 100 μΐ of the supernatants from the hybridoma cell cultures were activated for anti-plasminogen activator
^q tat geprüft.^ q did checked.
Diejenigen Hybridom-Zellinien, die positive Resultate im Anti-Plasminogenaktivator-Test zeigten, wurden zum Klonieren ausgewählt. Dabei wurden die Hybridome einer Doppel-Verdünnungs-Klonierungstechnik unterworfen, beiThose hybridoma cell lines which showed positive results in the anti-plasminogen activator test were used for the Clone selected. The hybridomas were subjected to a double-dilution cloning technique, at
15 der in 96 Mikrptitervertiefungen bei einer errechneten Verdünnung von 0,5 Zellen/Vertiefung ausgesät wurden, wobei 10 Mäuse-Thymocyten als "Feeder-Zellen" dienten. Die nach diesem Klonierungsverfahren noch Antikörper produzierenden Zellen wurden vermehrt, eingefroren und15 of the 96 micron wells in one calculated At a dilution of 0.5 cells / well, 10 mouse thymocytes were used as "feeder cells". The cells still producing antibodies after this cloning process were multiplied, frozen and
in flüssigem Stickstoff im komplettem Medium, das 25 % foetales Kälberserum sowie 7,5 % Dimethylsulfoxid enth ie11, aufbewahrt.in liquid nitrogen in the complete medium, the 25% fetal calf serum and 7.5% dimethyl sulfoxide contains ie11, kept.
100 μΐ Kulturüberstand wurden den Zellkulturen entnommen 25 und auf Mikrotitervertiefungen gegeben, an die Plasmino-100 μl culture supernatant were removed from the cell cultures 25 and placed in microtiter wells to the plasmino-
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It» * www It »* www
genaktivator (5 μg/ml) 3 Stunden lang bei Raumtemperaturgene activator (5 μg / ml) for 3 hours at room temperature
fixiert worden war/ und die daraufhin mit Wasser er-had been fixed / and which was then
1 25 schöpfend gewaschen worden waren. J-(Ziegen)-Anti-1 25 had been scooped up. J (goat) anti
4 Maus-Immunglobulin (8 - 10 χ 10 cpm) wurde darauf hinzugefügt; danach wurden die Platten 3 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Proben in einem LKB-Gammazähler gezählt. Tabelle 1 zeigt einige repräsentative Beispiele von Hybridomen, die Antikörper gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp sezernieren. 4 mouse immunoglobulin (8-10 χ 10 cpm) was added added; then the plates were incubated for 3 hours at room temperature. After washing again with distilled water, the samples were counted in an LKB gamma counter. Table 1 shows some representative ones Examples of hybridomas secreting antibodies to human tissue-type plasminogen activator.
Die gleichen Hybridome wurden Mäusen, die mit 0,5 ml Pristan vorbehandelt waren, intrape.ritoneal injiziert, um Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit 10-15 Tage 15 danach zu gewinnen. Die Antikörperaktivität wurde bestimmt wie oben beschrieben. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, erstrecken sich die Antikörpertiter der Ascitesflüssigkeiten über einen Bereich von 10 bis 3 χ 10The same hybridomas were given to mice with 0.5 ml Pristane were pretreated, injected intrape.ritoneal to ascites fluid containing antibodies 10-15 days 15 to win after that. The antibody activity was determined as described above. As shown in Table 1, the antibody titers of the ascites fluids range over a range of 10 to 3 χ 10
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11 Tabelle 1Table 1
Titer der Aktivitäten von Antikörpern in Hybridomüberständen gegen menschlichen Gewebeplasnujnogen-Titer of the activities of antibodies in hybridoma supernatants against human tissue plasnujnogenic
125 "^ aktivator, gemessen in ( J)-anti-Maus-IgG-Bindungstest.125 "^ activator as measured in (J) anti-mouse IgG binding test.
Vom Kulturüberstand Nummer gebundenes (12SJ)-Anti^Ig (cpm) χ 10J (12SJ) -Anti ^ Ig (cpm) bound by the culture supernatant number 10 J
körpertiter
(reziprok)Anti-ascites
body titre
(reciprocal)
gebundenes (125J)-
Anti^Ig (cpm)
χ 10From the culture supernatant
bound (125J) -
Anti ^ Ig (cpm)
χ 10
körpertiter
(reziprok)Anti-ascites
body titre
(reciprocal)
Tabelle 1 (Portsetzung) Table 1 (port setting)
Titer der Aktivitäten von Antikörpern in Eybridomüberständen gegen msnschlichen Gewebeplasminogen-Titer of the activities of antibodies in eybridoma supernatants against human tissue plasminogen
125 aktivator, gemessen in ( J)-AntirMau3-IgG-Bindungstest.125 activator, measured in (J) -AntirMau3-IgG binding test.
Vom Kulturüberstand Nuircter gebundenes (125J)-Anti-Ig (cpm)(125J) -Anti-Ig bound by the culture supernatant Nuircter (cpm)
Ascites-Antikörpertiter (reziprok)Ascites antibody titer (reciprocal)
Nuniner Vom Kulturüberstand
gebundenes. (125J)-Anti-Ig (cpm)Nuniner from the culture supernatant
bound. (125J) anti-Ig (cpm)
Ascites-Antikörpertiter (reziprok)Ascites antibody titer (reciprocal)
108 G, 12108 G, 12
109 F 6
124 D 8109 F 6
124 D 8
5,32
3,34
9,765.32
3.34
9.76
1 χ ΙΟΙ χ 10 1 χ 10( 1 χ ΙΟΙ χ 10 1 χ 10 (
1 χ 10 3 χ 104 3 χ ΙΟ6 1 χ 10 3 χ 10 4 3 χ ΙΟ 6
125 3125 3
cpm von ( J)-Ziegen-Anti-=-Maus-IgG χ 10 , das von an Mikrotiterplatten fixiertem Plasminogenaktivatorcpm of (J) goat anti - = - mouse IgG χ 10, that of plasminogen activator fixed on microtiter plates
gebunden wird. Die Ausgangsvolumina der Proben betrugen 100 μΐ. ι t j is bound. The initial volumes of the samples were 100 μΐ. ι t j
* · ■cc««** · ■ cc «« *
Charakterisierung der von den klonierten Hybridomen produzierten ImmunglobulineCharacterization of the immunoglobulins produced by the cloned hybridomas
Die Klassen und Unterklassen der von den Hybridklonen produzierten Antikörper wurden analysiert. Der jeweilige Antikörper wurde aus den Kulturüberständen durch Fällung mit Ammoniumsulfat (40 %ige Sättigung) angereichert und partiell gereinigt. Unter Verwendung von klassenspezifischen Anti-Maus-Immunglobulin-Antiseren wurden die jeweiligen Immunglobulinklassen in Ouchterlony GeI-diffusionstest bestimmt. Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, gehören die meisten Antikörper gegen den Plasminogenaktivator zur IgM- oder IgG--Klasse; nur einer ist vomThe classes and subclasses of antibodies produced by the hybrid clones were analyzed. The respective Antibody was enriched from the culture supernatants by precipitation with ammonium sulfate (40% saturation) and partially cleaned. Using class-specific anti-mouse immunoglobulin antisera, the respective immunoglobulin classes in the Ouchterlony gel diffusion test certainly. As shown in Table 2, most of the antibodies against the plasminogen activator belong to IgM or IgG class; only one is from
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ro Tabelle 2ro table 2
> (Charakterisierung von itonoklonalen Antikörpern gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ^ durch Isotypieanalyse > (Characterization of itonoclonal antibodies against human plasminogen activator of the tissue type ^ by isotype analysis
IgG1 1^b IgM K Zellinie IgG1 I^2b IgM K IgG 1 1 ^ b IgM K cell line IgG 1 I ^ 2b IgM K
+ + 160 P 9 ++ + 160 P 9 +
+ + 164 G 6 + ++ + 164 G 6 + +
+ + 167 E 9 ++ + 167 E 9 +
+ 180 G 8 + ++180 G 8 ++
+ 191 B. 12 + ++ 191 B. 12 + +
+198 + ,+198 +,
+ 206 G 5 + + do+ 206 G 5 + + do
+ + 211 + ++ + 211 + +
+ 219 C 10 ++ 219 C 10 +
+ + 239 E 8 ++ + 239 E 8 +
+ 243 D 8 + ! + 243 D 8 + !
+ + 245 D 8 + ++ + 245 D 8 + +
+ · + 251 G 9 + +++ 251 G 9 ++
+ 260 D 12 + '+ 260 D 12 + '
+ 265 E 9 + ++ 265 E 9 + +
+ + 267 ++ + 267 +
-1 ZellinieUl
- 1 cell line
Tabelle 2 (Fortsetzung) Charakterisierung von inönoklonalen Antikörpern gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp durch Isotypieanalyse Table 2 (continued) Characterization of inonoclonal antibodies against human tissue-type plasminogen activator by isotype analysis
ZellinieCell line
IgM KIgM K
IgM KIgM K
100 E.11 106 E 9100 E.11 106 E 9
108 G 12108 G 12
109 F 6109 F 6
110 D 7 124 D 8 131 B 11 135 C 11 137 G 7110 D 7 124 D 8 131 B 11 135 C 11 137 G 7
Hemmung der Plasminogenaktivator-Aktivität durch Antikörper gegen Plasminogenaktivator.Inhibition of plasminogen activator activity by antibodies against plasminogen activator.
Plasminogenaktivator ist eine Protease, die Plasminogen in Plasmin überführt. Die Aktivität von.Plasminogenaktivatoren kann mit der Pibrinplattentechnik gemessen werden. Dabei wird Plasminogen, das in Fibrin inkorporiert ist, durch den Plasminogenaktivator aktiviert. Der Effekt von Anti-Plasminogenaktivator-Antikörpern - entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen - wurde im Fibrinplattentest bestimmt. Tabelle 3 zeigt, daß 6 Antikörper von 34 die fibrinolytische Reaktion in diesem Testsystem hemmen. Die sechs aktiven Antikörper unterscheiden sich quantitativ in ihren inhibitorischen Eigenschaften. Eine additive Hemmung im Fibrinplattentest wird beobachtet, wenn zwei Antikörper gemischt werden. Das ist ein Hinweis darauf, daß .die beiden Antikörper gegen unterschiedliche antigene Determinanten gerichtet sind.Plasminogen activator is a protease called plasminogen converted into plasmin. The activity of plasminogen activators can be measured with the pibrin plate technique. Plasminogen, which is incorporated into fibrin, is thereby used is activated by the plasminogen activator. The effect of anti-plasminogen activator antibodies - either individually or in various combinations - was determined in the fibrin plate test. Table 3 shows that 6 antibodies of 34 inhibit the fibrinolytic response in this test system. The six active antibodies differentiate quantitatively in their inhibitory properties. An additive inhibition in the fibrin plate test is observed when two antibodies are mixed. This is an indication that the two antibodies are directed against different antigenic determinants.
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t* t * Tabelle 3Table 3
Φ Φ
jp Heitinung von Plasminogenaktivator vom Gewebetyp im Fibrinplattentest durch Mischungen von Antikörpernjp Measurement of plasminogen activator of the tissue type in the fibrin plate test by mixtures of antibodies
to gegen Plasminogenaktivatorto against plasminogen activator
—* ■ .- * ■.
131 B 11 282 B 8 206 G 5 33 B 12 137 G 7 299 G 12 73 E131 B 11 282 B 8 206 G 5 33 B 12 137 G 7 299 G 12 73 E.
13.1 B 11 65 % 100 % 100 % 91 % 86 % 79 % 72 %13.1 B 11 65% 100% 100% 91% 86% 79 % 72%
282 B 8 100 % 97 % 100 % 80 % 65 % 52 % 45 %282 B 8 100% 97% 100% 80% 65% 52% 45%
206 G 5 100 % 100 % 65 % 62 % 65 % 65 % 55 %206 G 5 100% 100% 65% 62% 65% 65% 55%
33 B 12 91 % 80 % 62 % 30 % 45 % 30 % 30 %33 B 12 91% 80% 62% 30% 45% 30% 30%
137 G 7 86 % 65 % 65 % 45 % 22 % 30 % 20 %137 G 7 86% 65% 65% 45% 22% 30% 20%
299 G 12 79 % 52 % 65 % 30 % 30 % 14 % 14 %299 G 12 79% 52% 65% 30% 30% 14% 14%
73 E 10 72 % 45 % 55 % 30 % 20 % 14 % 0 %73 E 10 72% 45% 55% 30% 20% 14% 0%
Verdünnung der Antikörper: 10"2 Dilution of the antibodies: 10 " 2
Kreuzreaktion der Antikörper gegen den-menschlichen Plasminogenaktivator vom .Gewebetyp mit UrokinaseCross reaction of the antibodies against the human plasminogen activator vom .Gewebetyp with urokinase
Urokinase, eine Protease/ die entweder aus menschlichemUrokinase, a protease / derived from either human
(R)
Urin (z.B. Ukidan von Serono) oder aus Gewebekultur-(R)
Urine (e.g. Ukidan from Serono) or from tissue culture
(R)(R)
überständen (z.B. Abbokinase von Abbott) gewonnensupernatants (e.g. Abbokinase from Abbott) obtained
wird, vermag Plasminogen in ähnlicher Weise wie Plasminogenaktivator. vom Gewebetyp zu Plasmin umzuwandeln. Aus diesem Grunde wurden die Antikörper auf ihre Kreuzreaktivität.mit Urokinase der.beiden obengenannten Typen untersucht. In Tabelle 4 wird gezeigt, daß 5 von 35- Antikörpern allein gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp gerichtet sind, während die 30 anderen Antikörperis capable of plasminogen in a similar way to plasminogen activator. convert from tissue type to plasmin. For this reason, the antibodies were tested for their cross-reactivity Investigated urokinase of the two types mentioned above. In Table 4 it is shown that 5 out of 35 antibodies are directed against tissue-type plasminogen activator alone, while the other 30 antibodies
(Ό)(Ό)
auch mit· Ukidan v ', und darunter 10 mit Abbokinase 15 reagieren.also react with · Ukidan v ', and below that 10 with Abbokinase 15.
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Kreuzreaktionen der Antikörper gegen Plasminogenaktivator mit UrokinaseCross reactions of the antibodies against plasminogen activator with urokinase
Zeillinie Line
Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:Reactivity of antibodies against plasminogen activator with:
(R)(R)
Plasminogen-Plasminogen
7 C 6 +7 C 6 +
22 D 12 +22 D 12 +
31 C 10 +31 C 10 +
33 B 12 +33 B 12 +
34 C 4 + 46 D 10 + 50 F 8 + 57 H 11 + 71 C 12 + 73 E 10 + 77 G 7 + 86 E 6 +34 C 4 + 46 D 10 + 50 F 8 + 57 H 11 + 71 C 12 + 73 E 10 + 77 G 7 + 86 E 6 +
MG = MolgewichtMG = molecular weight
Ukidan (Urokinase MG 54000Ukidan (urokinase MG 54000
Abbokinase (UrokinaseAbbokinase (urokinase
MG 33000MG 33000
ZeIl-.linie Line
0 00 0
0 0 00 0 0
0 0 Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:0 0 Reactivity of antibodies against plasminogen activator with:
(R)
Plasminogen Ukidan Abbokinase(R)
Plasminogen Ukidan Abbokinase
(Uro- (Urokinase kinase(Uro- (urokinase kinase
MG MGMG MG
54000 3300054000 33000
135 C 137 G 164 G 167 E 180 G 206 G 239 E 243 D 245 D 251 G 260 D 12 + 265 E 9 +135 C 137 G 164 G 167 E 180 G 206 G 239 E 243 D 245 D 251 G 260 D 12 + 265 E 9 +
0 0 0 0 0 +0 0 0 0 0 +
·* tv** Tv *
tr1 Tabelle 4 (Fortsetzung)tr 1 table 4 (continued)
Kreuzreaktionen der Antikörper gegen Plasminogenaktivator mit UrokinaseCross reactions of the antibodies against plasminogen activator with urokinase
ÜkidaniR) Abbokinase(R) Ükidan iR) Abbokinase (R)
Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:Reactivity of antibodies against plasminogen activator with:
Zeil- Plasmdnogen-Zeil- plasmidnogen-
linie (Oro- (Urokinaseline (Oro- (urokinase
kinasekinase
MG MG 54000 33000MG MG 54000 33000
Plasminogenaktivator mit:Reactivity of antibodies against
Plasminogen activator with:
(Uro- (Urokinase
kinase
MG MG
54000 33000Plasminogen Ukidan Abbokinase
(Uro- (urokinase
kinase
MG MG
54000 33000
linieCell
line
86 E 6
90 C 10
100 E 1186 E 6
90 C 10
100 E 11
108 G 12108 G 12
109 F 6
124 D 8
131 B 11109 F 6
124 D 8
131 B 11
0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0
MG = MolgewichtMG = molecular weight
CO K) N) N) O OOCO K) N) N) O OO
Diese Kreuzreaktivität der Antikörper könnte auf gemeinsame Strukturelemente zwischen dem Plasminogenaktivator vom Gewebetyp und Urokinase zurückzuführen sein, aber auch auf eine Verunreinigung dieses Proteins mit Uro-This cross-reactivity of the antibodies could be due to common Structural elements between the tissue-type plasminogen activator and urokinase can be attributed, however also for a contamination of this protein with uro-
kinase. Um zu entscheiden, welche der beiden Interpretationen die wahrscheinlichere ist, wurde.Plasminogenaktivator vom Gewebetyp mittels Immunadsorptionschromatographie hergestellt, wobei ein monoklonaler Antikörper verwendet wurde, der ausschließlich mitkinase. To decide which of the two interpretations the more likely one was. plasminogen activator of the tissue type prepared by immunosorbent chromatography, a monoclonal Antibody used exclusively with
10 diesem Protein reagiert. Der so gereinigte Plasminogenaktivator wurde dann als Antigen für das Testsystem verwendet. Der Bindungstest zeigte, daß auch dieser Plasminogenaktivator mit allen.Antikörpern reagierte. Dieses Experiment macht deutlich, daß zwischen Plasminogen-10 this protein reacts. The thus purified plasminogen activator was then used as the antigen for the test system. The binding test showed that this plasminogen activator too reacted with all antibodies. This experiment makes it clear that between plasminogen
aktivator vom Gewebetyp und Urokinase Kreuzreaktionen auftreten; somit haben beide Enzyme gemeinsame antigene Determinanten.Tissue-type activator and urokinase cross-reactions appear; thus both enzymes share antigenic determinants.
Reinigung und Konzentrierung von Plasminogenaktivator vom Gewebetyp durch Immunadsorptionschromatographie.Purification and concentration of plasminogen activator tissue type by immunoadsorption chromatography.
Diejenigen Antikörper, die ausschließlich mit humanem Plasminogenaktivator vom Gewebetyp reagieren - nämlich 131, 206 und 282 - wurden kovalent anSepharoseThose antibodies that react exclusively with human tissue-type plasminogen activator - viz 131, 206 and 282 - were covalently attached to Sepharose
(R)
4 B* in einer Konzentration von 10 mg Protein pro ml
Gel nach dem Verfahren von S.C. March, J. Parikh, P..Cuatrecasas, Anal., Bichem. 60, 149 (1974) gebunden.(R)
4 B * in a concentration of 10 mg protein per ml gel according to the method of SC March, J. Parikh, P. Cuatrecasas, Anal., Bichem. 60, 149 (1974) bound.
Le A 21 751Le A 21 751
- 34 -- 34 -
Die Bindungskapazität der Säule für Plasminogenaktivator wurde mit 0,5 bis 1/5 mg/ml Gel bestimmt. Die enzymatische Aktivität des so gereinigten Materials war mehr als 1 000-fach gegenüber der Ausgangslösung konzentriert. Das Elektrophoresemuster des auf diese Art gereinigten Plasminogenaktivators war identisch mit dem von Material/ das auf konventionelle Weise gereinigt worden war. Die Ausbeute an Plasminogenaktivator bei der Immunadsorptionschromatographie lag bei bis zu 90 % im Vergleich zu ca. 40 % für die konventionelle Methode.The binding capacity of the column for plasminogen activator was determined to be 0.5 to 1/5 mg / ml gel. The enzymatic The activity of the material thus purified was concentrated more than 1,000 times that of the starting solution. The electrophoresis pattern of the plasminogen activator purified in this way was identical to that of material / that has been cleaned in a conventional manner. The yield of plasminogen activator at the immunoadsorption chromatography was up to 90% compared to approx. 40% for the conventional method.
Le A 21 751Le A 21 751
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1983
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- 1983-06-11 JP JP10357783A patent/JPS595121A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| FR2528451A1 (en) | 1983-12-16 |
| GB8316001D0 (en) | 1983-07-13 |
| GB2122219A (en) | 1984-01-11 |
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