DE3210579A1

DE3210579A1 - Verfahren zum aufbringen einer fluessigkeitsprobe auf ein nach einem trockenverfahren arbeitendes analysenelement

Info

Publication number: DE3210579A1
Application number: DE19823210579
Authority: DE
Inventors: Masao Kitajima; Asaji Asakashi Saitama Kondo
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1981-03-25
Filing date: 1982-03-23
Publication date: 1982-11-11
Also published as: GB2095404A; JPS57157139A; GB2095404B

Description

Verfahren zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe auf ein nach einem Trockenverfahren arbeitendes Analysenelement

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe auf nach Trockenverfahren arbeitende Analysenelemente und insbesondere ein Verfahren zum sicheren Auftragen einer Flüssigkeitsprobe auf ein trocken arbeitendes Analysenelement.

In neuerer Zeit werden verschiedene Arten von nach Trockenverfahren arbeitenden Analysenelemente für die
quantitative Analyse solcher Flüssigkeitsproben wie Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Serum, Harn, Speichel etc.), flüssiger Industrieabfälle, Reaktionsflussigkeiten, fermentierter Flüssigkeiten etc. verwendet.

Als nach Trockenverfahren arbeitende Analysenelemente
kennt man nicht nur die altbekannten filterpapierähnlichen Stoffe, die mit Farbreagentien getränkt sind, wie etwa die pH-Testpapiere, sondern auch filterpapierähnliche Analysenfolien und mehrschichtige Analysenfolien für die Analyse flüssiger Proben wie Blut, Harn etc..

Mehrschichtige Analysenfolien sind beispielsweise auf den Gebieten der chemischen Analyse, Immunanalyse etc. bekannt, und Einzelheiten hierzu sind beispielsweise in den US-PSen 3 992 158, 4 110 079 und 4 132 528, den JP-OSen 137 192/75, 40 191/76, 3 488/77, 131 786/77,

131 089/78, 29 700/79, 34 298/79, 90 859/80, 124 499/80 und 164 356/80, den japanischen Patentanmeldungen 124 514/79, 120 599/80, 140 532/80 und 144 849/80, der japanischen GBM-Anmeldung 120 229/80 sowie in "Clinical Chemistry", Vol. Z4, 1335-1350 (1978) beschrieben.

Derartige Analysenfolien des aus mehreren Schichten aufgebauten Typs sind im allgemeinen so beschaffen, daß eine die Reagentien, die für die Analyse erforderlich sind, enthaltende Reagensschicht, eine Reaktionsschicht zur Durchführung der für die Analyse nötigen Reaktion, eine Spreitungsschicht für eine gute Ausbreitung einer flüssigen Probe auf der Analysenfolie etc. auf einen Träger auflaminiert sind, und die praktische chemische Analyse unter Verwendung einer solchen mehrschichtigen Analysenfolie erfolgt mit Hilfe zweier grundlegender Arbeitsgänge, nämlich des Arbeitsganges des Aufbringens einer kleinen Menge einer Flüssigkeitsprobe auf die Folie, und des Arbeitsganges der Messung einer optischen Dichte, etwa einer Färbungsänderung oder Dichteänderung nach einer erforderlichen Behandlung. Unter diesen mehrschichtigen Analysenfolien ist ein mehrschichtiges, nach einem Trockenverfahren arbeitendes Analysenelement des integrierten Typs mit einer Spreitungsschicht als oberster Schicht im Vergleich zu anderen trocken arbeitenden Analysenelementen dadurch besonders ausgezeichnet, daß ein Meßergebnis mit einem hohen Grad quantitativer Genauigkeit auch dann erhalten wird, wenn die auf das Analysenelement aufgebrachten Mengen einer Flüssigkeitsprobe nicht streng konstant sind, was durch die einheitliche Ausbreitungswirkung aufgrund der Spreitungsschicht erreicht wird.

Eine einheitliche Ausbreitungswirkung in einem mehrschichtigen Analysenelement des integrierten Typs bewirkt, daß die Menge der aufgetragenen Flüssigkeitsprobe einer Ausbreitungsfläche der Flüssigkeitsprobe in der Oberflächenebene des Analysenelements proportional ist. Mit anderen Worten ist die Menge einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe, die auf die Flächeneinheit der Reaktionsschicht gelangt, welche das Reaktionssy-

stem zur Bestimmung des in der untersuchten Probe nachzuweisenden Stoffes enthält, immer annähernd konstant, wodurch die Konzentration des in der zu untersuchenden Probe enthaltenen, nachzuweisenden Stoffes einen konstanten Wert auch dann annimmt, wenn die auf das Analysenelement aufgetragene Probenmenge der Flüssigkeit sich innerhalb eines gewissen Bereichs ändert, und durch diese Änderungen nicht beeinflußt wird. Infolge der kombinierten Wirkung in dem Analysenelement wird
der mittels des trocken arbeitenden Analysenelements erreichbare Grad der Genauigkeit der quantitativen Analyse in hohem Maße verbessert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein besonders wirksames und vorteilhaftes Verfahren zum Probenauftrag auf ein derartiges mehrschichtiges Analysenelement des unitären Typs.

Zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe auf ein Trockenanalysenelement, das nicht ein solches aus mehreren Schichten vom integrierten Typ ist und das ein Filterpapier als Träger besitzt und etwa durch ein pH-Testpapier repräsentiert wird, gibt es im allgemeinen die Verfahren des Eintauchens des Analysenelements in eine große Menge einer Flussigkeitsprobe und das Verfahren, bei dem eine Maximalmenge an Flüssigkeit (Flüssigkeits-Sättigungsmenge), die von dem Analysenelement aufgenommen werden kann, mit diesem in beliebiger, nicht-quantitativer Weise in Berührung gebracht wird, beispielsweise in der Form, daß ein Stück des Analysenelements mit einer kleinen Menge der Flüssigkeitsprobe in Berührung gebracht wird, etwa einem Tropfen, der an einem Glasstab oder auf einer Platte (z.B. einem Stück Kunststoff oder einem Experimentierlöffel) gesammelt wurde. Bei einer sogenannten klinischen Analyse, bei der Blut

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oder Harn die zu untersuchenden Flüssigkeiten sind, gelangt seit langer Zeit ein Verfahren zur Durchführung, bei dem die in Watte, Gaze, einem Applikator, einem Stück Filterpapier etc. absorbierte Flüssigkeitsprobe auf das nach dem Trockenverfahren arbeitende Analysenelement aufgebracht wird; der Zweck dieses Verfahrens ist wegen der Eigenart des zu analysierenden Materials jedoch nicht das Aufbringen der Flüssigkeitsprobe in einer quantitativ definierten Menge, sondern das Auftragen der oben erwähnten Sättigungsmenge der Flüssigkeitsprobe auf das Analysenelement, d.h. nur die Zufuhr der Flüssigkeitsprobe in einer empirischen Menge innerhalb eines gewissen Bereichs.

Andererseits beträgt die bei einem nach einem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelement für eine quantitative Analyse oder Bestimmung gewöhnlich eingesetzte Menge einer Flüssigkeitsprobe etwa 1 bis 50 μΐ, und es ist schwierig, unter Einsatz der oben beschriebenen Mittel eine annähernd definierte Menge einer Flüssigkeitsprobe auf das Analysenelement aufzutragen.

Aus diesem Grunde werden in den Fällen, in denen bis zu einem gewissen Grade ein quantitatives Auftragen erforderlich ist, eine Meßpipette, eine Kapillarpipette, verschiedene Arten von Mikropipetten und Mikrospritzen verwendet. Spezielle Vorrichtungen zum Dispensieren von Proben, die im einzelnen dazu befähigt sind, jeweils eine konstante Menge eines Flüssigkeitstropfens zu bilden, sind in der JP-OS 99 066/76 und der US-PS 4 041 995 offenbart.

Bei den vorgenannten Methoden der Flüssigkeitszufuhr gibt es jedoch insofern Probleme, als die bei dem Verfahren verwendete Kapillarpipette oder Mikropipette

selbst teuer ist und außerdem ein zusätzlicher Arbeitsgang des Abmessens der Menge der Flüssigkeitsprobe notwendig ist. Weiterhin erfordert es bei diesen Verfahren eine lange Zeit, die Flüssigkeitsprobe auf dem Analysenelement auszubreiten, da die Flüssigkeitsprobe dem Analysenelement in Form eines Flüssigkeitstropfens zugeführt wird; dabei tritt häufig eine konzentrische chromatographische Erscheinung (Bindungsphänomen; linking phenomenon) auf, wie auch beim Auftragen einer

hochviskosen Flüssigkeitsprobe wie etwa Voll-Blut, und es besteht die Gefahr, daß Probleme in bezug auf den quantitativen Charakter und die Reproduzierbarkeit der Messung eines zu bestimmenden Stoffes dadurch verursacht werden, daß die Probe sich nicht gleichförmig

oder überhaupt nicht ausbreitet .

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb in erster Linie ein Verfahren zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe, das in der Lage ist, die aufgezeigten Probleme zu lösen.

Das heißt, ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe, das es gestattet, einen nachzuweisenden Stoff quantitativ und mit guter Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse zu bestimmen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daneben ein Verfahren zum Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe mittels eines einfachen Arbeitsganges (beispielsweise ohne die Notwendigkeit einer Meßoperation) unter Verwendung billiger Hilfsmittel.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein einfacheres und billigeres Verfahren zum Aufbringen

einer Flüssigkeitsprobe für die Probenahme einer hochviskosen Flüssigkeit wie Voll-Blut, hochviskoses hämolytisches Blut, eine wäßrige Lösung mit verminderter Fließfähigkeit, eine hochviskose Emulsion etc., bei
denen die Gefahr besteht, daß sie bei den bekannten Bestimmungsverfahren wie oben beschrieben zu einem großen Fehler Anlaß geben.

Es wurde gefunden, daß die im Vorstehenden genannten Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung in wirksamer

Weise mittels des folgenden Verfahrens verwirklicht werden können, nämlich mittels des Verfahrens zum Aufbringen einer kleine Menge einer Flüssigkeitsprobe auf ein nach einem Trockenverfahren arbeitendes Analysenelement, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Ar-

beitsgang eines Analysenverfahrens unter Verwendung eines trocken arbeitenden Analysenelements mit einer porösen Schicht als der äußersten Schicht eine kleine Menge einer ein nachzuweisendes Material enthaltenden Flüssigkeitsprobe in einem Flüssigkeitsträger zurück-

gehalten wird und dann die Flüssigkeitsprobe auf die poröse Schicht des trocken arbeitenden Analysenelements in der Weise aufgebracht wird, daß mindestens ein Teil des Flüssigkeitsträgers mit der porösen Schicht in Berührung gebracht wird.

Die Bezeichnung Flüssigkeitsträger bezeichnet einen Träger, der die Fähigkeit besitzt, eine Flüssigkeit leicht zu absorbieren und sie eine gewisse Zeit festzuhalten, die ausreicht, um die absorbierte Flüssigkeit auf die poröse Schicht des nach einem Trockenverfahren

arbeitenden Analysenelements aufzubringen, mit anderen Worten die Fähigkeit, von einem Ort zu einem anderen zu transportieren, zu "tragen". Der Begriff "Träger" wird in diesem Sinne verwendet.

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Fig. 1 ist eine schematische Schnittansicht einer Ausführungsform des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Flüssigkeitsträgers.

Fig. 2 ist eine schematische Schnittansicht einer Ausführungsform der nach einem Trockenverfahren arbeitenden mehrschichtigen Analysenfolie, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Fig. 3 ist eine Draufsicht auf die poröse Schicht einer Analysenfolie, auf die eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht wurde.

Fig. 4 ist eine schematische Schnittansicht einer anderen Ausführungsform des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Flüssigkeitsträgers.

Fig. 5 ist eine Draufsicht auf eine andere Ausführungsform der porösen Schicht einer Analysenfolie, auf die eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht wurde.

Fig. 6 ist eine schematische Schnittansicht einer weiteren Ausführungsform des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Flüssigkeitsträgers.

Fig. 7 ist eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der porösen Schicht einer Analysenfolie, auf die eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht wurde.

Fig. 8 ist eine schematische Schnittansicht noch einer weiteren Ausführungsform des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Flüssigkeitsträgers.

Fig. 9 ist eine Draufsicht auf noch eine weitere Ausführungsform der porösen Schicht einer Analysenfolie, auf die eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht wurde.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß beim Auftragen einer Flüssigkeitsprobe auf die Oberfläche eines nach einem Trockenverfahrens arbeitenden Analysenelements mittels des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, beispielsweise eines Verfahrens, bei dem eine kleine Menge einer Flüssigkeitsprobe auf das Analysenelement in der Weise aufgebracht wird, daß ein Träger, der die Flüssigkeitsprobe eingeschlossen oder 'absorbiert enthält, mit dem Analysenelement in Berührung gebracht wird, oder eines Verfahrens der übertragung der Flüssigkeitsprobe von dem Träger auf das Analysenelement, die Flüssigkeitsprobe gleichmäßig auf das Analysenelement übertragen werden kann und ein Analysenergebnis sehr hoher Genauigkeit erhalten wird.

So kann nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine hochviskose Flüssigkeitsprobe wie VoIl-Blut, deren gleichmäßiges Auftragen und Ausbreiten mittels der konventionellen Verfahren nur schwierig zu erreichen ist, in wirksamer Weise aufgebracht werden, und die Nachweisfähigkeit und die Genauigkeit des Analysenverfahrens unter Verwendung eines nach einem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelements können in hohem Maße verbessert werden.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird nunmehr an einer Ausführungsform, die in den beigefügten Zeichnungen Fig. 1 bis Fig. 3 dargestellt ist, praktisch erläutert. Eine kleine Menge einer Flüssigkeitsprobe, dia den nachzuweisenden Stoff enthält, wird in einem Flüssigkeitsträger zurückgehalten, der, wie in

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- Ii -

Fig. 1 dargestellt ist, aus einem stabähnlichen kleinen Stück 1 und einem Flüssigkeitsträgermaterial 2 zusammengesetzt ist. Dann wird der die Flüssigkeitsprobe enthaltende Flüssigkeitsträger in Berührung gebracht mit der porösen Schicht 3 einer mehrschichtigen Analysenfolie, die auf einem Träger 6 nacheinander aufgetragen eine reagenshaltige Schicht 5, eine isolierende Schicht 4 und eine poröse Schicht 3 besitzt, wodurch die Flüssigkeitsprobe der porösen Schicht zugeführt wird. Die die so aufgebrachte Flüssigkeitsprobe enthaltende mehrschichtige Analysenfolie ist in Fig. 3 dargestellt. Danach wird, nach Vornahme einer erforderlichen Behandlung, die Bestimmung des zu untersuchenden Stoffes durch Messung der Farbänderung, der Änderung der optischen Dichte etc. durchgeführt.

Die Flüssigkeitsprobe, die mit Hilfe des .bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten nach einem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelements analysiert werden kann, ist im allgemeinen eine wäßrige Lösung, eine wäßrige Dispersion oder eine wasserhaltige Flüssigkeit; gegebenenfalls kann aber das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch zur Analyse eines speziellen Bestandteils in Erdöl wie Rohöl etc. oder von nicht-wäßrigen Lösungen oder Extrakten herangezogen werden, wie sie bei verschiedenen Arbeitsstufen industrieller Verfahren anfallen. Weiterhin können vorzugsweise auch hochviskose Flüssigkeiten wie beispielsweise Voll-Blut, eine hochviskose Lösung von hämolytischem Blut oder eine wäßrige Lösung oder Emulsion mit verminderter Fließfähigkeit gemäß der Erfindung analysiert werden.

Für den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Flüssigkeitsträger können sämtliche Materialien, die eine

einen nachzuweisenden Stoff enthaltende Flüssigkeitsprobe festzuhalten oder zu absorbieren vermögen, mit Erfolg verwendet werden.

Als für den Träger verwendete Materialien (flüssigkeitsabsorbierende Materialien) in Betracht kommen quellfähige Materialien, poröse Stoffe, schwammartige Stoffe, wasserabsorbierende Stoffe etc.. Praktische Beispiele für solche Materialien sind Watte, Schwamm, textiles Material, Gaze, Papier (allgemeines Filterpapier, Filterpapier für die Chromatographie, synthetisches Papier etc.), poröses Material aus natürlichen oder synthetischen Harzen, Glaswolle, Gelatine, Polyacrylamid, Agarose etc. .

Diese Materialien können als Flüssigkeitsträger so verwendet werden, wie sie sind, oder der Flüssigkeitsträger kann dadurch hergestellt werden, daß ein solches Material an einem Holz- oder Kunststoff-Stück befestigt wird. Beispielsweise wird bevorzugt ein Flüssigkeitsträger verwendet, der durch Befestigen von Wattebällchen, Schwamm, einem textlien Material wie z.B. Gaze etc., einem Papier wie Filterpapier oder einem kleinen Stück eines schwammigen porösen Materials an einem kleinen stabähnlichen Stück oder einem Streifen Kunststoff-Folie hergestellt wurde.

Die Form des erfindungsgemäß verwendeten Flüssigkeitsträgers unterliegt keiner speziellen Beschränkung, jedoch ist es gemäß der vorliegenden Erfindung notwendig, daß ein Teil des Flüssigkeitsträgers mit dem nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelement zumindest in Form einer glatten Fläche in Berührung gebracht wird. Es wird deshalb bevorzugt, daß der mit dem Analysenelement in Berührung zu bringende Teil des Flüssig-

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keitsträgers entweder eine gekrümmte Fläche oder eine ebene Fläche besitzt, die keine zu starke Unebenheiten in der Oberfläche enthält, bzw. daß jedoch mindestens der irtit dem Analysenelement in Berührung zu bringende
Teil des Trägers eine gekrümmte Fläche mit nur geringen Unausgeglichenheiten oder eine ebene Oberfläche bildet, die zumindest eine solche Form, Flexibilität und sonstige Beschaffenheit besitzt, daß sie bereits unter dem Einfluß einer geringen Kraft verformt wird.

Praktische Beispiele für solche Flüssigkeitsträger sind in den Zeichnungen Fig. 4, Fig. 6 und Fig. 8 dargestellt.

Fig. 4 ist eine schematische Schnittansicht einer Ausführungsform des Flüssigkeitsträgers der vorliegenden

Erfindung, der aus einem Stabstück 9 und einem daran befestigten flussigkeitsabsorbierenden Material 10 zusammengesetzt ist. Fig. 6 ist eine schematische Schnittansicht einer weiteren Ausführungsform des Flüssigkeitsträgers, der aus einem stabähnlichen Stück 14

und einem daran befestigten flussigkeitsabsorbierenden Material 15 zusammengesetzt ist. Fig. 8 ist eine schematische Schnittansicht noch einer anderen Ausführungsform des Flüssigkeitsträgers, der aus einem stabähnlichen Stück 19 und einem daran befestigten flüssigkeitsabsorbierenden Material 20 aufgebaut ist. Die Zustände der nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelemente, nachdem diese mit den eine Flüssigkeitsprobe zurückhaltenden bzw. enthaltenden Flüssigkeitsträgern in Berührung gebracht wurden, sind in den Zeichnungen

Fig. 5, Fig. 7 bzw. Fig. 9 dargestellt. Auf diesen Zeichnungen sind die Berührungsflächen der nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelemente mit den Flüssigkeitsträgern durch die Zahlen 12, 17 bzw. 22 und

die Ausbreitungsflächen der Flüssigkeitsproben durch die Zahlen 13, 18 bzw. 23 bezeichnet.

Die praktische Formgebung solcher Flüssigkeitsträger kann in verschiedener Weise erfolgen; z.B. können sie in ebener Form wie Papier, in Stabform und Kugelform ausgeführt sein. Praktische Beispiele sind ein sogenannter Applikator, der aus einem dünnen Stab besteht, an dessen Spitze ein Wattebällchen befestigt ist, ein Mal- oder Zeichenpinsel, ein Stäbchen etc.. Unter den Applikatoren gibt es einen aus einem metallischen Stift bestehenden Applikator, um dessen schraubenförmiges Ende Watte gewickelt ist, oder einen Einweg-Applikator mit einem dünnen Kern aus Holz oder Papier, um dessen Endteil Watte gewickelt ist; ein Einweg-Applikator wird besonders im Falle des Einsatzes des nach einem Trokkenverfahren arbeitenden Analysenelements bei einem klinischen Test bevorzugt. Das Ende eines solchen Applikators besitzt gewöhnlich sphäroidale oder Spindelform· Ein solcher Applikator kann in vielen Fällen so benutzt werden, wie er ist, jedoch ist es manchmal vorteilhaft, sein Ende in der Weise zurechtzuschneiden, daß die Berührungsfläche mit dem nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelement in passender Weise angeglichen wird.

Beim Einsatz des erfindungsgemäß verwendeten Flüssigkeitsträgers für die Analyse einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe wird der flüssigkeitsabsorbierende Träger vorzugsweise vorher einer hydrophil machenden Behandlung unterworfen; eine solche Behandlung kann in verschiedener Weise erfolgen, um die Durchlässigkeit des Trägers für die Flüssigkeitsprobe zu verbessern, wodurch die Probenahme und das Aufbringen der aus einer

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wasserhaltigen Lösung bestehenden Probe in wirksamerer Weise durchgeführt werden kann.

Um die Oberfläche des Flüssigkeitsträgers hydrophil zu machen, gibt es ein Verfahren des Waschens des Trägers mit Wasser, ein Verfahren des Imprägnierens des Trägers mit einem oberflächenaktiven Mittel wie einem anionischen, kationischen oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, ein Verfahren der chemischen Oberflächenbehandlung des Trägers mit einer Säure, einem Alka-Ii etc. sowie ein Verfahren des Imprägnierens des Trägers mit einer hydrophilen oder hygroskopischen Verbindung wie Glycerin, Polyethylenglycol etc.. Auch physikalisch-chemische Behandlungsverfahren wie eine Glimmentladungs-Behandlung , Coronaentladungs-Behandlung,

Flammenbehandlung, UV-Behandlung, Wärmebehandlung etc. können mit Erfolg dazu benutzt werden, den Träger hydrophil zu machen.

Bei der Auswahl der Materialien und Behandlungsmethoden ist besonders zu beachten, daß die Konzentration des in einer Flüssigkeitsprobe nachzuweisenden Stoffes während des Einschlußvorgangs der Flüssigkeitsprobe in dem Flüssigkeitsträger sich nicht ändert. Aus diesem Grunde wird ein flüssigkeitsabsorbierendes Material mit Porenstruktur gegenüber einem adsorptiven oder quellfähigen Material bevorzugt, bei welch letzterem die Gefahr gegeben ist, daß es die Zusammensetzung der darin eingeschlossenen Flüssigkeitsprobe verändert.

Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hängt die optimale Arbeitsweise, mittels derer der
Flüssigkeitsträger mit der porösen obersten Schicht des nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelements in Berührung gebracht wird, von der Form des Flüssig-

keitsträgers, der Viskosität der Flüssigkeitsprobe und der Art des verwendeten, nach dem Trockenverfahren arbeitenden Analysenelements ab.

Wenn beispielsweise ein trocken arbeitendes Analysenelement eine aus einem Membranfilter, aus Papier, aus einem faserförmigen Material oder Textilmaterial bestehende Spreitungsschicht besitzt, wird zur Erzielung besserer Meßergebnisse vorzugsweise so verfahren, daß durch die Berührung des Flüssigkeitsträgers mit der
Spreitungsschicht während einer Zeitspanne von etwa 0,1 bis 10 s, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 5 s, ein kreisförmiges Teilstück einer Flüssigkeitsprobe mit einem Durchmesser von 2 bis 50 mm, vorzugsweise von etwa 5 bis 20 mm, erhalten wird.

Die vorliegende Erfindung wird hinsichtlich Einzelheiten der praktischen Ausführung anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

55	000	I	.E.
25	000	I	.E.
	5	g
	200	g

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Beispiel 1

Eine durchsichtige Folie aus Polyethylenterephthalat (PET) mit einer Dicke von 185 μΐη, die mit einer haftvermittelnden Gelatine-Schicht überzogen war, wurde mit einer Reagensschicht zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in Blut, die die folgende Zusammensetzung besaß, beschichtet, so daß die trockene Schicht etwa 15 μπι dick war, und dann getrocknet.

Glucoseoxidase
10 Peroxidase

1,7-Dihydroxynaphthalin 4-Aminoantipyrin-Gelatine Nonion HS 210 (ein Polyoxy-

ethylen-nonylphenylether, 15 ein oberflächenaktives

Mittel, hergestellt von
der Nippon Oils and Fats
Co., Ltd.) 2 g

Auf die so hergestellte Schicht wurde gleichmäßig eine
Beschichtungsmasse aus Diacetylcellulose, Triacetylcellulose, Titanoxid, Aceton, Methylenchlorid und Wasser aufgetragen und dann getrocknet, wodurch ein mehrschichtiges Analysenelement zur Bestimmung von Glucose mit einer isotropen und porösen Spreitungschicht erhalten wurde.

Zur Vorprüfung der Färbung wurde auf das so hergestellte mehrschichtige Analysenelement zur Glucose-Bestimmung eine Probe mittels einer Mikropipette aufgetüpfelt. Bei Verwendung von Serum als Flüssigkeitsprobe
wurden eine gute Ausbreitung und eine gleichmäßige Färbung beobachtet; wenn jedoch Voll-Blut als Flüssig-

keitsprobe verwendet wurde, bildete das Blut einen Flüssigkeitstropfen auf der Spreitungsschicht und breitete sich weder aus, noch erzeugte es eine Färbung. In einigen Fällen breitete sich das Blut in unregelmäßiger Weise aus und erzeugte dabei auch eine Färbung, jedoch war diese Färbung sehr minderwertig und infolgedessen für die Analyse nicht geeignet.

Dann wurde das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung praktiziert. Das heißt, ein Watte-Applikator (hergestellt von der Firma Sherry Seihin Honpo K.K.) mit einem auf etwa 5 mm Durchmesser zurechtgeschnittenem Ende wurde mit Rinderserum getränkt, und das Serum wurde in der Weise auf das vorbeschriebene Analysenelement aufgebracht, daß der Applikator mit der Spreitungsschicht in Berührung gebracht wurde, wodurch ein gutes und einheitliches, kreisförmiges gefärbtes Teilstück erhalten wurde. Beim anschließenden Aufbringen von Rinder-Vollblut anstatt des Rinderserums in der gleichen Weise verkleinerte sich das kreisförmige Teilstück der Ausbreitung des Blutes auf etwa 2/3 desjenigen, das mit dem Serum erhalten wurde, jedoch wurde ein gutes und einheitliches, kreisförmiges gefärbtes Teilstück erhalten.

Beispiel 2

Eine durchsichtige Folie aus Polyethylenterephthalat mit einer Dicke von 185 μπι, die mit einer haftvermittelnden Gelatine-Schicht überzogen war, wurde mit einer Reagensschicht zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in Blut, die die folgende Zusammensetzung besaß, beschichtet, so daß die trockene Schicht etwa 15 μπι dick war, und dann getrocknet.

55	000	I	.E
25	000	I	.E
	5	g
	5	g
	200	g

Glucoseoxidase

Peroxidase

1,7-Dihydroxynaphthalin

4-Aminoantipyrin 5 Gelatine

Nonion HS 210 (ein Polyoxy-

ethylen-nonylphenylether, ein oberflächenaktives Mittel, hergestellt von 10 der Nippon Oils and Fats

Co., Ltd.)

Auf diese Schicht wurde eine lichtabschirmende Schicht aus 8 Gew.-Teilen Titandioxid-Pulver dispergiert in 1 Gew.-Teil Gelatine mit einer Dicke der trockenen
Schicht von etwa 15 μκι und dann getrocknet.

Weiterhin wurde eine Haftvermittler-Schicht aus Gelatine, die 0,2 % Nonion HS 210 enthielt, auf die lichtabschirmende Schicht mit einer Dicke der trockenen Schicht von 5 μπι aufgebracht und dann getrocknet.

' Die auf diese Weise hergestellte beschichtete Folie wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,2 % eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, Nonion HS 210, gleichmäßig benetzt und dann dicht mit einer Spreitungsschicht aus einem Mikrofilter (FM 120, hergestellt von der Fuji Photo Film Co., Ltd.) laminiert, wodurch eine mehrschichtige Analysenfolie zur Glucose-Bestimmung erhalten wurde. Diese Analysenfolie wurde anschließend in quadratische Stücke mit einer Fläche von 15 mm χ 15 mm geschnitten, und jedes der quadratischen

Stücke wurde in einem Kunststoff-Rähmchen mit einer

Fläche von 24 mm χ 28 mm und einem kreisförmigen Ausschnitt in der Mitte mit einem Durchmesser von 10 mm befestigt, wodurch ein mehrschichtiges Analysendiapositiv für die Glucose-Bestimmung erhalten wurde.

Ein Flüssigkeitsträger-Stäbchen wurde durch Zurechtschneiden des Endstücks eines Watte-Applikators (hergestellt von Cherry Seihin Honpo K.K.), bei dem Watte um die Spitze eines feinen Holzstäbchens gewickelt ist, auf einen Durchmesser von 6 mm hergestellt. Dieses Stäbchen wurde mit Rinder-Vollblut, das mit Heparin/NaF behandelt worden war, getränkt und mit der Spreitungsschicht des im Vorstehenden beschriebenen mehrschichtigen Analysendiapositivs in Berührung gebracht, wodurch Blut milde auf die Schicht aufgetüpfelt wurde. Als das Voll-Blut sich gleichmäßig unter Bildung einer kreisförmigen Ausbreitungsfläche von 10 mm Durchmesser ausgebreitet hatte, wurde das Auftupfein beendet, und nach 6-minütiger Inkubation bei 37⁰C wurde die Intensität der Färbung, entsprechend der Menge Glucose in dem Blut, in Reflexion unter Benutzung von Licht der Wellenlänge 500 nm durch den PET-Folienträger hindurch gemessen. Die Reflexionsdichte betrug 0,387.

Das Auftupfein, die Inkubation und die Photometrie wurden nach der oben angegebenen Arbeitsweise 20 mal wiederholt. Die Untersuchung der Reproduzierbarkeit auf der Grundlage der einzelnen erhaltenen Reflexionsdichten ergab einen Mittelwert der optischen Reflexionsdichte von 0,3 83 mit einer Standardabweichung von 0,0084 und einem Variationskoeffizienten (CV) von 2,2 %, was eine gute Reproduzierbarkeit anzeigte.

Weiterhin wurden zur Herstellung von 4 Arten von Blutproben mit verschiedenen Glucose-Konzentrationen kleine

9 WVVDI VVfTW ψ

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Mengen Glucose-Pulver dem Rinder-Vollblut zugesetzt. Nach dem Abtrennen von Blutplasma aus jeder der Proben wurden die Konzentrationen der Glucose in jedem Blut mit Hilfe eines Verfahrens unter Verwendung einer Sauerstoff-Elektrode (unter Einsatz eines YSI 205, hergestellt von der Yellow Spring Instrument Co., Ltd.) gemessen. Dann wurde, in gleicher Weise wie oben beschrieben, jede der Vollblut-Proben auf das mehrschichtige Analysendiapositiv zur Glucose-Bestimmung getüpfeit, und nach 6-minütigem Inkubieren bei 37°C wurden die Reflexionsdichten gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Test	Analysenwert	Reflexions
Nr.	mg/dl	dichte
1	78	0,384
2	137	0,528
3	221	0,731
4	341	1,020
5	411	1,148

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, ist das Verfahren zur Bestimmung von Glucose in Blut gut geeignet.

Anschließend wurde die Glucose-Bestimmung mittels eines konventionellen Verfahrens durchgeführt.

Hierzu wurde die Blutprobe unter Benutzung einer 10 μΐ-Mikropipette auf das gleiche mehrschichtige Analysendiapositiv zur Glucose-Bestimmung aufgetüpfelt, und nach Inkubation wie oben wurde die Dichte gemessen. In diesem Falle war die Ausbreitung des Blutes sehr unbe-

ständig, und die Färbungen waren unregelmäßig. Bei 20-facher Wiederholung der Messung betrugen der Mittelwert der Dichte (x) 0,318, die Standardabweichung 0,0308 und der Variationskoeffizient 9,7 %, was die sehr viel schlechtere Reproduzierbarkeit zeigt.

Beispiel 3

Ein mehrschichtiges Analysendiapositiv zur Glucose-Bestimmung wurde durch Auflaminieren eines Baumwolltextilgewebes (Baumwollpopeline # 80, hergestellt von der Nisshin Spinning Co., Ltd.) auf die in gleicher Weise wie in Beispiel 2 hergestellte Folie zur Glucose-Bestimmung hergestellt.

Ein Watte-Applikator, dessen Spitze nicht zurechtgeschnitten war, wurde mit Rinder-Vollblut, wie es in Beispiel 2 verwendet wurde, getränkt und mit der Spreitungsschicht des Analysendiapositivs in Berührung gebracht, um die Blutprobe auf letzteres aufzubringen, und nach 6-minütiger Inkubation bei 37 ⁰C wurde die Dichte gemessen. Die Reproduzierbarkeit bei der Wiederholung war gut, und der Variationskoeffizient betrug 2,6 %.

Beispiel 4

Anstelle des in Beispiel 3 verwendeten Applikators wurde ein Flüssigkeitsträger-Stäbchen in der Weise hergestellt, daß um das Endstück eines Holzstäbchens von 100 mm Länge und 3 mm Durchmesser Gaze gewickelt wurde, so daß deren Durchmesser 3 mm betrug. Nach dem Impräg-

nieren des Träger-Stäbchens mit Rinderblut wurde das Stäbchen mit der Spreitungsschicht des mehrschichtigen Analysendiapositivs zur Glucose-Bestimmung, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, in Berührung gebracht, um
das Blut auf die Schicht aufzubringen, und die Dichte wurde wie in Beispiel 2 gemessen. Bei der Prüfung der Reproduzierbarkeit in Wiederholungsversuchen wie in Beispiel 2 betrug der Variationskoeffizient 3,1 %.

Beispiel 5

Ein Flüssigkeitsträger-Stäbchen wurde in der Weise hergestellt, daß ein Streifen aus Chromatographie-Papier (# 533, hergestellt von Toyo Roshi K.K.) von 3 mm Breite um das Endstück eines HolzStäbchens wie in Beispiel 3 gewickelt wurde. Unter Benutzung dieses Stäbchens

wurde Rinder-Vollblut auf die Spreitungsschicht des mehrschichtigen Analysendiapositivs zur Glucose-Bestimmung wie in Beispiel 3 aufgetüpfelt. Bei dem nachfolgenden Färbevorgang wurde ein gut gleichmäßig gefärbtes Teilstück erhalten.

Beispiel 6

Ein applikatorähnliches Material mit einer Endstück-Länge von etwa 5 mm wurde in der Weise hergestellt, daß ein hochgradig hygroskopisches Gewebe (Handelsbezeichnung Kimwipe) unter Verwendung eines Baumwollgarns um
das Ende eines Holz Stäbchens wie in Beispiel 4 gewickelt wurde. Beim Auftupfein von Rinder-Vollblut unter Benutzung des applikatorähnlichen Materials und

anschließender Durchführung des Farbtests wie in Beispiel 3 wurde eine gute gleichmäßige Färbung beobachtet.

Beispiel 7

Ein Flüssigkeitsträger-Stäbchen wurde in der Weise hergestellt, daß ein Stück dickes Filterpapier (5 mm χ 5 mm) für die qualitative Analyse mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf einen Kunststoffstreifen von 0,5 mm Dicke, 5 mm Breite und 100 mm Länge aufgeklebt wurde. Beim Auftupfein von Rinder-Vollblut unter Benutzung des Flüssigkeitsträger-Stäbchens und anschließender Durchführung des Farbtests wie in Beispiel 3 wurde eine gute gleichmäßige Färbung beobachtet.

IS

Leerseite

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EISHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELTING WERNER

PATENTANWÄLTE

Fuji PhOtO Film CO., Ltd. DrHng. von Kreisler t1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln

Kanagawa, Japan Dr.-Ing.X W. Eishold, Bad Soden

Dr. J. F. Fues, Köln
DipL-Chem. Alefc von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Kellet Köln
DipL-lng. G. Salting, Köln
Dr. H.-K. Werner, Köln

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

D-5000 KÖLN 1

22. März 1982

W/GF 719

Patentansprüche

Verfahren zum Aufbringen einer kleinen Menge einer Flüssigkeitsprobe auf ein nach einem Trockenverfahren arbeitendes Analysenelement, dadurch gekennzeichnet, daß als Arbeitsgang eines Analysenverfahrens unter Verwendung eines trocken arbeitenden Analysenelements mit. einer porösen Schicht als der äußersten Schicht eine kleine Menge einer ein nachzuweisendes Material enthaltenden Flüssigkeitsprobe in einem Flüssigkeitsträger zurückgehalten wird und dann die Flüssigkeitsprobe auf die poröse Schicht des trocken arbeitenden Analysenelements in der Weise aufgebracht wird, daß mindestens ein Teil des Flüssigkeitsträgers mit der porösen Schicht in Berührung gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Flüssigkeitsträger aus einem kleinen stabähnlichen Stück oder Streifen und einem an der Spitze desselben

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gehalterten flüssigkeitsabsorbierenden Material zusammengesetzt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigkeitsträgermaterial Watte, Schwamm, textiles Material, Filterpapier oder ein natürliches oder synthetisches Harz ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigkeitsträgermaterial Glaswolle, Gelatine, Polyacrylamid, Agarose oder Gaze ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nach einem Trockenverfahren arbeitende Analysenelement einen Träger mit mindestens einer Reagensschicht, einer lichtabschirmenden Schicht und einer porösen Spreitungsschicht umfaßt.