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Verfahren zur Herstellung von feinporigen Kollagen-
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schwämmen Die Erfindung betrifft die Herstellung von feinporigen Kollagenschwämmen.
Sie betrifft insbesondere ein Verfahren, bei dem man bestimmte, an sich bekannte
Verfahrensmaßnähmen in spezieller kontrollierter Weise durchführt.
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Die Herstellung von Kollagenfasergeflechten (Kollagenschwämmen) ist
aus zahlreichen Literaturstellen bekannt.
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So wird in der DE-OS 18 11 290 die Herstellung von Kollagenfasergeflechten
beschrieben, indem man Haut oder Sehnen von Tieren alkalisch oder sauer auf schließt
und mechanisch zerkleinert und -...gegebenenfalls nach Zugabe von Additiven, wie
Vernetzungsmitteln, Weichmachern oder Arzneimitteln - zu einem homogenen Kollagenbrei
aufschlämmt, den Kollagenbrei einfriert und dann entwässert. Aus
dieser
Offenlegungsschrift ist auch bekannt, die zerkleinerte Kollagenmasse zu schäumen
und den geschäumten Kollagenbrei einzufrieren, 1 bis 30 Tage zu lagern und dann
aufzutauen, worauf man die Hauptmenge des Wassers auspreßt und das ausgepreßte Kollagenfasergeflecht
bei Zimmertemperatur trocknet.
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Aus DE-OS 26 25 289 ist weiter bekannt, ein gereinigtes Kollagenmaterial
zur Herstellung von Kollagenfasergeflechten durch Gefriertrocknen zu entwässern.
Kollagenschäume werden gemäß DE-OS 17 17 118 dadurch gehalten, daß man eine durch
Aufschluß von Leimgallerten gewonnene Kollagenmasse mit Wasser bis zu einem Trockensubstanzgehalt
von 0,3 bis 4,0 g homogenisiert und die homogene Masse dann gefrieren läßt und anschließend
das Wasser entfernt.
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Es ist weiterhin bekannt, daß man Kollagenfasergeflechte auch dadurch
erhalten kann, daß man Kollagendispersionen einfriert und dann mit organischen,
mit Wasser mischbaren- Lösungsmitteln das Wasser schonend auswäscht. Schließlich
ist es auch bekannt, Vernetzungsmittel bei der Herstellung von Kollagenfasergeflechten
einzusetzen, um dadurch eine Stabilisierung zu erzielen.
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Bei den bekannten Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung
von Kollagenfasergeflechten ist die Ausbildung der Struktur im wesentlichen durch
die Art der Gefriertrocknung gegeben. Die Reproduzierbarkeit von Kollagenfasergeflechten
mit gleicher konstanter Struktur und gleicher Porosität ist dabei nicht gewährleistet.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde,
daß
zur Ausbildung von reproduzierbaren Sollagenfasergeflechten der Quellu;;ysgrad und
das Einfrier-Verfahren des gequollenen, zerkleinerten und homogenisierten Materials
eine ausschlaggebende Rolle spielen.
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Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Herstellung
von feinporigen Kollagenfasergeflechten zur Verfügung zu stellen, bei dem man reproduzierbar
aber mit einer großen beabsichtigten Variabilität feinporige Kollagenschwämme erhält,
die für zahlreiche medizinische Anwendungen geeignet sind.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1
gelöst.
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Die Unteransprüche beinhalten bevorzugte und /oder vorteilhafte Ausführungsformen
des beanspruchten Verfahrens Als Rohstoff zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Kollagenfasergeflechtes dienen Rinder- oder Schweinenäute oder Rinderachillessehnen.
Diese Ausgangsmaterialien werden in bekannter Weise vorbehandelt. Rinder-oder Schweinehäute
werden, wie dies auch in der Lederindustrie üblich ist, durch Weichen, Aschern,
Enthaaren, Entfleischen und Spalten vorbehandelt und dann in bekannter Weise durch
Einwirkung von Säuren, Alkali, Wasserstoffperoxid und/oder proteolytischen Enzymen
aufgeschlossen. Dieser Aufscifuß der noch zur Vorbehandlung des Kollagenrohstoffes
gezählt wird, dient dazu, das Kollagen von allen Begleitstoffen zu befreien und
so sauber zu erhalten, daß im wesentlichen keine störenden Begleitstoffe mehr vorhanden
sind. Dies bedeutet, daß Begleitproteine (wie Albumine oder Globuline), Glykosaminglykane,
Proteoglykane und Fette, die
dem tierischen Ausgangsmaterial noch
anhaften, entfernt werden. Dabei erfolgt die chemische Behandlung intensiver und
gründlicher, als dies in der Lederindustrie üblich ist, weil das ollagenmaterial
anschließend für die Verwendung für chirurgische und kosmetische Zwecke weiterbehandelt
wird. Durch die Säurebehandlung werden im wesentlichen säurelösliche Begleitstoffe
entfernt und gleichzeitig die Struktur des nativen Kollagens aufgelockert.
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Ein Maß für die chemische Reinigung ist die Bestimmung des Amid-Stickstoffes.
Druch die Reinigung wird der Wert um etwa 0,3 bis 0,5 m mol/g gesenkt und zwar auf
den Wert von 2,0 bis 4,0 m mol/g.
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Die chemische Vorbehandlung wird grundsätzlich mit solchen Reagentien
durchgeführt, die sich entweder vollständig entfernen lassen und/oder nicht toxisch
sind.
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Deshalb wird man nur solche Reagentienverwenden, die selbst frei von
störenden Verunreinigungen sind. Für die Säurebehandlung hat sich Salzsäure bewährt,
so daß man grundsätzlich hierfür Salzsäure verwendet.
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Die analytische Beurteilung des Ergebnisses der chemischen Vorbehandlung
besteht im wesentlichen in der Erfassung von 2 Faktoren: a) Reinigungsgrad (Reife)
des Kollagens und b) Quellungsgrad des Kollagens Der Reinigungsgrad wird durch übliche
analytische Verfahren festgestellt. Von ganz wesentlicher Bedeutung ist der Quellungsgrad
des Kollagens. Die Vorbehandlung, d.h. der Aufschluß des Kollagens muß so vorgenommen
werden, daß das Kollagen eine Quellbarkeit aufweist, die der Aufnahme von650 bis
800 Gew.% Wasser entspricht. Bei einem pH 3, wie er sich beim Aufschluß mit Hol
einstellt, muß das Kollagen die 6- bis 8-fache Menge Wasser, bezogen auf sein Gewicht,aufnehmen.
Eine
maximale Quellung mit HCl wird zwar bei einem pH von 2,0 erzielt,
jedoch stti,5t man üblicIler Weise den Quellungswert bei dem pH-Wert von 3,0, weil
das mit HCl aufgeschlossene Material diesen p-Wert aufweist.
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Die Quellung des Kollagens ist von einer Reihe von Faktoren abhängig
und wird durch diese beeinflußt: Junges Bindegewebe, also Material von jungen Tieren
quillt stärker als das von alten Tieren. Neben der chemischen Vorbehandlung bei
der Reinigung und dem Aufschluß des Materials spielt hierbei auch die dabei durchgeführte
mechanische Behandlung eine große Rolle.
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Ein stark chemisch vorbehandeltes Material quillt stärker als ein
weniger stark vorbehandeltes Material und ein zerkleinertes Material quillt stärker
als ein nicht zerkleinertes Material.
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Wie schon erwähnt, ist die Quellbarkeit auch von dem pH-Wert und der
Reife des Kollagens abhängig.
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Die Quellung des Kollagens wird zweckmäßig nach der sogenannten Kubelka-Methode
bestimmt (KUBELKA, K: Das Kollagengewebe der Haut (tschech.) BRATISLAVA 1961), wobei
die Abnahme der Menge einer vorgelegten Quellflüssigkeit ermittelt wird.
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Das mit einer wässrigen Säure oder mit wässrigen Alkali angequollene
Kollagen wird anschließend mechanisch zerkleinert. Diese Zerkleinerung kann beispielsweise
durch ein- oder mehrmaliges Zerkleinern mit einem Fleischwolf erfolyen. Eine zu
starke Zerkleinerung, d.h.
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Verkürzung der Fasern ist nicht zweckmäßig, deshalb erfolgt die mechanische
Zerklinerung vorzugsweise bis -zu einem durchschnittlichen Duechmesser von ca. 6mm.
Anstelle
eines Fleischwolfes könnten auch andere Zerkleinerungsvorrichtungen,vie
Zahnscheibenmühlen verwendet werden.
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Das zerkleinerte Material wird anschließend mit Wasser auf einen Verdünnungsgrad
von ca. 2,0 Gew.% Trockengehalt verdünnt. Ein Trockengehalt zwischen 1 bis 3 %,
insbesondere 1,3 bis 2,6 % ist möglich, wobei jedoch die besten Werte bei der weiteren
Herstellung von feinporigen Kollagenfasergeflechten mit einem Trockengehalt von
ca. 2 % erzielt werden.
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Das verdünnte, zerkleinerte und gequollene Material kann anschließend,je
nach dem vorgesehenen Verwendungszweck, noch weiter homogenisiert werden, z. B.
in einer Kolloidmühle.
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Anschließend wird das geyebenenfalls in einer Kolloidmühle homogenisierte
Material eingefroren. Das Einfrieren muß dabei unter genau kontrollierten Bedingungen
durchgeführt werden, wobei insbesondere die Einfrierungszeit genau einzuhalten ist.
Diese beträgt eine halbe bis vier Stunden und vorzugsweise eineinhalb bis zweieinhalb
Stunden bei einem Material einer Dicke von 2,5 cm. Man kann das Einfrieren mit Hilfe
von Sole oder einem geeigneten Froster durchführen.
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Langsames Einfrieren oder Gefrieren bei verhältnismäßig hohen Temperaturen
ergibt gröbere Eiskristalle und eine grobe innere Struktur. Kurzes Gefrieren führt
zu einem feinkristallinen Produkt mit sehr feinen Poren. Je nach der beabsichtigten
Verwendung des Ma-
Materials für bestimmte chirurgische bzw. prothetische
oder kosmetische Zwecke werden die Einfrierbedingungen ausgewählt.
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Das gefrorene Produkt wird anschließend zur Stabilisierung der Struktur
entwässert. Diese Entwässerung kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden und
hängt im wesentlichen auch davon ab, ob und in welchem Umfang zuvor gegebenenfalls
chemische Vernetzungs- und Stabilisierungsmittel zugegeben worden sind. Auf diese
Vernetzungsmittel wird später noch hingewiesen werden. Sind chemische Vernetzungsmittel
verwendet worden, so erfolgt die Entwässerung nicht durch Gefriertrocknung. Vielmehr
wird nach einer Konditionierungszeit des gefrorenen Produktes das Material aufgetaut
und das Wasser abgequetscht. Nicht durch chemische Vernetzungsmittel stabilisierte
Produkte werden zweckmäßiger Weise durch Gefriertrocknung in an sich bekannter Weise
entwässert und stabilisiert.
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Bisher sind die Grundmaßnahmen, die für die Herstellung von feinporigen
Kollagenfasergeflechten eine Rolle spielen, beschrieben worden, wobei die Betonung
darauf lag, daß der Quellungsgrad in spezieller Weise eingestellt wird und auch
das Gefrieren des Produktes in spezieller überwachter Weise erfolgt.
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Um feinporige Kollagenfasergeflechte den speziellen Verwendungszwecken
anztlpassen, sind nun eine Reihe von, zum Teil an sich bekannten, Maßnahmen möglich
oder erforderlich: Zur Herstellung von Knochenersatzmaterialien kann man dem Kollagenmaterial
die für den Knochenersatz wichtigen Zusätze zusetzen, beispielsweise Calciumphosphat
und Hydroxyapatit.
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Diese Zumischung erfolgt nach dem Homogenisieren aber vor dem Gefrieren.
Dabei müssen die Knochenersatzmaterialien im alkalischen Bereich hergestellt werden
Dazu werden zwei Vorgäng durchgeführt: a) Beim isoelektrischen Punkt des Materials
werden die für den Knochenersatz wichtigen Zusätze zugemischt.
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b) Anschließend wird der pH-Wert auf den gewünschten Grad eingestellt.
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Eine Mischung für die Knochenersatzherstellung kann zum Beispiel 10
bis 70 % Calciumphosphat enthalten.
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Die optimale Quellung bei einem solchen Produkt verläuft bei pH-Werten
von 9,5 bis 11,5, wobei der Amidstickstoffgehalt des Kollagenrohstoffes bei 0,30
bis 0,40 Gew.% liegen soll. Bei der Herstellung von Knochenersatzmaterial erfolgt
die Stabilisierung der Struktur zweckmäßiger Weise durch Gefriertrocknung.
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Weiterhin ist es möglich, vor dem Einfrieren der Kollagenmasse Textilfasern
beizumischen. Dies kann zum Beispiel erfolgen, um dem fertigen Kollagenfasergeflechten
einen besseren Sprung oder eine höhere Festigkeit zu vermitteln. Geeignete Fasern
sind beispielsweise solche, wie sie auch schon für synthetische Nahtmaterialien
verwendet worden sind und auch solche, die bisher vorwiegend für textile oder industrielle
Zwecke eingesetzt wurden. Genannt werden können hier beispielsweise Fasern aus Polyester,
Polyamiden, Polyvinylalkohol, Wolle, Baumwolle, Zellstoff und Viskose. Die Länge
der Fasern ist sehr variabel. Sie kann zwischen etwa 3 bis 50 mm liegen. Die Menge
, bezogen auf das Trockengewicht der Kollagenfasern1 beträgt im allgemeinen etwa
10 bis 60 Gew.%.
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Die Zusammenmischung der Fasern erfolgt beim isoelektrischen Punkt
des Materials. Anschließend wird dann der pH-Wert auf den gewünschten Grad eingestellt.
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Vor dem Einfrieren können dem l{ollagenmaterial eine Reihe von Zusatzstoffen
zugegeben werden. Hier sind besonders Vernetzungsmittel zu erwähnen. Weil die meisten
Vernetzungsmittel physiologisch nicht unbedenklich sind, kommen hierfür im wesentlichen
nur spezielle Produkte in Frage. Hierzu gehören insbesondere aliphatische Diisocyanate,
die mit den Aminogruppen unter Harnstoffgruppenbildung reagieren und physiologisch
unbedenklich sind. Durch die Art und die Menge des verwendeten Diisocianats kann
man die physiologischen Eigenschaften des Endproduktes erheblich beeinflussen.
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Die Verwendung von Diisocianaten als Vernetzungsmittel ist grundsätzlich
bekannt. Bekannt ist auch, daß man bei der Verwendung von Diisocyanaten nichtionogene
Emulgatoren verwenden muß.
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Weitere geeignete Vernetzungsmittel sind solche, die schon bei der
Herstellung von Blutplasma verwendet wurden, nämlich Glyoxal und Succinylanhydrid.
Glyoxal wird zweckmäßiger Weise in Mengen von 6 bis 10 % bezogen auf den Trockengehalt
des Kollagenproduktes,angewendet und im sauren pH (etwa 2,5 bis 4,0) eingemischt.
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Ein derartig vernetztes Produkt wird zweckmäßiger Weise etwa 3 bis
12 Tage eingefroren, wobei im eingefrorenen Zustand die Vernetzungsreaktion langsam
abläuft.
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Wird Succinylanhydrid als..ernetzungsmittel verwendet, so beträgt
die Menge hierbei vorzugsweise etwa 5 bis 30 %, bezogen auf das Trockengewicht des
Kollagenmaterials. Auch in diesem Fall wird das Produkt nach dem Einfrieren längere
Zeit, zum Beispiel eine Woche oder länger stehen gelassen, wobei die Vernetzungsrealction
dann abläuft.
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Die genau verwendet IIcnge des Vernetzungsmittels steht im Zusammenhang
mit der Art des Vernetzungsmittels und der beabsichtigten Verwendung des Kollagenfasergeflechtes.
Die Vernetzungsmittel beeinflussen die physikalischen und chemischen Eigenschaften
und das Aussehen des fertigen Materials. Wichtig ist, daß die Vernetzungsreaktion
dem Quell zustand des zerfaserten Kollagens genau angepaßt wird. Die Vernetzungsreaktion
selbst soll nicht zu schnell verlaufen, um nicht eine vorzeitige Entquellung des
Kollagens und damit die Bildung von harten, folienartigen Gebilden zu bewirken.
Eine sehr langsam stattfindende Vernetzung, wie sie insbesondere bei tiefen Temperaturen
erfolgt, benötigt entsprechend längere Zeiten. Die Menge des Vernetzungsmittels
muß so gewählt werden, daß bei einer späteren Lagerung des Materials durch noch
nicht umgesetztes Vernetzungsmittel keine Nachvernetzung und damit keine unbeabsichtigte
Veränderung des Materials abläuft. Wie bereits erwähnt, werden die vernetzten Materialien
nicht gefriergetrocknet, sondern das Wasser wird mechanisch-abyequetscht.
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Die Vernetzungsmittel werden dem Kollagenbrei vor dem Einfrieren zusammen
mit kosmetischen Wirkstoffen, Parfümen oder pharmakologisch wirksamen Stoffen zugemischt.
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Besonders interessant ist die Wirkung verschiedener Emulgatoren, die
positiven Einfluß auf die Eigenschaften des Geflechtes haben. Dieser Einfluß kann
mit der Wirkung von Fettstoffen bei der Lederindustrieerzeugung verglichen werden.
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Kollagen wirkt im Körper wie ein Ionehaustauscher und bindet Elektrolyten,
Metabolite und ebenso Arzneimittel.
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Da diese Eigenschaften in dem fertigen fdinporigen Kollagenfaseryeflecht
erhalten bleiben,können die Geflechte vorteilhaft als Träger von Wirkstoffen verwendet
werden.
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Beispiel 1: 1.1. Rohstoff 50 kg Spalten aus Rinderhälsen nach einem
bei der Lederherstellung üblichen Verfahren geweicht, geäschert, entfleischt, enthaart
und gespalten. Das Trockengewicht des Materials beträgt 20 Gew.%.
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1.2. Alkalische Behandlung 110 1 Wasser, 0,8 1 NaOH (50 Gew.%); 0,3
kg H202 (35 Gew. er, langsam gerührt, Behandlungszeit 12 bis 24 h.
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1.3 Waschen 1 h in fließendem kalten Wasser.
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1.4. Analytische Kontrolle Amid-Stickstoff-Gehalt beträgt 0,43 m mol/g.
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1.5. Säure-Behandlung AnschlieBend 90*Iinutent1aschen in fließendem
kaltem Wasser, anschließende Behandlung im Gerberfaß: Kollagenmaterial, 5 kg HCl
(35 Gew.%), 30 kg Wasser; 6 h intensive Bewegung; die Spalten werden in ganzer Dicke
durchgesäuert. Anschließend 4 h in fließendem Wasser waschen. pH-Wert nach dem Waschen
3,0; Amid-Stickstoff 0,41 m mol/g. Quellung des Materials beträgt 714 % etwa 14
Gew.% Trockengewicht (nach der Kubelka-Methode bestimmt) 1. 6. Zerkleinerung Das
Material wird zuerst auf die Stücke 20 x 20 cm geschnitten und anschließend im Fleischwolf
zweimal gemahlen (Lochscheibe - 20 - 10 mm).
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1.7. Verdünnung Die ca. 14 Gew.%ige Masse wird mit destilliertem Wasser
auf die Konzentration 1,8 bis 2,2 Gew. % verdünnt. Anschließend folgt: die Homogenisierung
durch dreimaligen Durchlauf durch eine Kolloidmühle. Das Trockengewicht der Masse
wird genau auf 2,0 eingestellt. Der pH-Wert wird mit verdünnter EICl wieder auf
3,0 eingestellt.
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1.8. Masseneinstellung Zu der gut homogenisierten Masse werden 600
g nichtionogener Emulgator zugemischt (z. B. ethoxyliertes Sóktylphenol von 9 bis
10 Alkoxypruppen) und anschließend 2,5 kg Hexamethylendiisocyanat, bezogen auf Trockensubstanz,
in die Suspension eingemischt und wegen Gelierungsgefahr innerhalb 10 Minuten in
die Formen einaebracht. Schichtenhöhe in den Formen 2,5 cm.
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1.9. Einfrieren Die gefüllten Formen werden nun mit Hilfe einer Sole
eingefroren (Einfrierungszeit 2 1/2 Stunden.) Temperatur der Sole - 15"C. Anschließend
wird das Material entformt 1. 10.Konditionieren Nach dem Einfrieren erfolgt eine
weitere Lagerung (Konditionierung) in einem Kühlraum. Temperatur - 50C, Zeit 7 Tage.
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1.51 . Auftauen und Waschen Nach der Beendigung des Konditionierens
werden die Schwämme in erwärmtem Wasser (etwa 30°C) aufgetaut. Es folgt das Abquetscllen
und Auswaschen mit fließendem Wasser. Dieser Vorgang wird 4 x wiederholt.
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1.12 Trocknung und Zurrichtung Nach dem Auswaschen werden die Schwämme
bei Raumtemperatur
getrocknet. Die geftrockneten Schwämme werden
auf die gewünschte Dicke gespalten, gestanzt und verpackt und sind als Verbandmaterial
für Wundbehandlung verwendbar.
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Dichte: 0,02 Beispiel 2: 50 kg Rinderhälse wurden gemäß Beispiel 1
chemisch und mechanisch behandelt, verdünnt und mit verdünnter Salzsäure auf den
pH-Wert 3,0 eingestellt. Das Trockengewicht der homogenisierten Masse beträgt genau
2,0; Amid-Stickstoff 0,39 m mol/g. Quellung des Materials beträgt 729 Gew.%.
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Die homogenisierte Kollagenmasse wird im Vacuumkessel entlüftet, in
Formen abgefüllt und in einem Solenbad bei Temperatur - 15°C eingefroren. Einfrierungszeit
beträgt 2 Stunden. Die auf diese Weise erhaltenen 2,5 cm dicken Kollagenplatten
werden anschließend gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Platten werden auf
die erwünschte Dicke gespalten, gestanzt und verpackt.
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Das Material kann als Hämostyptikum verwendet werden.
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Die Dichte dieses Schwammes ist vergleichbar mit dem Schwamm, der
im Beispiel 1 beschrieben wurde.
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Beispiel 3: 10 kg Spalten aus Rinderhälsen werden chemisch und mechanisch
gemäß Beispiel 1 behandelt, verdünnt und mit verdünnter Salzsäure auf den pH-Wert
eingestellt. Das Trockengewicht beträgt genau 2,0 %; Amid-Stickstoff 0,38; die Wasseraufnahme
des Materials beträgt 732 Ges.%.
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Die gut homogenicicrtc Masse wird nun mit 5 obiger Natronlauge auf
den pH-Wert 5,5 eingestellt. Nach kurzem Rühren trennen si.ch die entquollenen Kollagenfasern
von dem Quellwasser. Dann werden 60 Teile Calciumphosphat (auf Trockengewicht des
Kollagens gerechnet) in die Masse eingerührt. Der Rohstoff läßt sich gut homogenisieren.
Anschließend wird der pH-Wert langsam auf den Wert 11,5 eingestellt. Die Kollagenfasern
sind jetzt wieder voll angequollen. Der Brei wird durch einen Druchlauf durch die
Kolloidmühle homogenisiert. Die homogenisierte Kollagenmasse wird in Formen abgefüllt
und in einem Solenbad bei Temperatur von - 150C eingefroren.Die Einfrierungszeit
beträgt 150 Minuten und die Dicke der Schicht 2 1/2 cm. Ansch]ießend werden die
Platten gefriergetrocknet. Nach der Gefriertrocknung werden die Platten auf die
gewünschte Dicke gespalten, gestanzt, sterilisiert und verpackt.