DE3118999A1 - Bestimmungsmethode fuer vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) - Google Patents
Bestimmungsmethode fuer vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)Info
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Description
U.. --OMi- s.-^U. οι J Ί Ί WU IjU
Dipi.-Jng. feiner FJVSeyer-Roxlau .: —/. ■.-.:— .- . ■ μ ,
München 80 : . ": ' : : * ": - :* ; : ' ^'3/
Uiclle-Grahn-Str. 22, Tel, (089) 472947 .:."-- -- ..."^ "--ί :.
F.Hoffmann-La Roche & Co.Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
und
The Ideal/Wilson Medical Center, 33 Harrison Street, Johnson City, Broome County, USA
RAN 4093/55
Bestimmungsmethodo für Vitamin B,2
■^5 Frühe Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B.? (ebenfalls
als Cobalamin oder Cyanocobalamin bezeichnet) bedienten sich Bakterienspezies, wie Euglena gracius oder Lactobacillus
leichmannie, welchen die innerliche Fähigkeit zur Synthese von Vitamin B19 fehlt. Nach diesen mikrobiologischen
Methoden werden die Vitamin B.„-Spiegel in einer
Plasmaprobe eines Menschen bestimmt, wobei das Wachstum der Vitamin B1„-sensitiven Organismen in einem Vitamin B1 -freiem
Medium bestimmt wird, zu welchem eine bekannte Menge eines Plasmaprobenextraktes zugegeben wird. Da das
Wachstum der Vitamin B1„-sensitiven Organismen - innerhalb
gewisser Grenzen - proportional zur Vitamin B1„-Konzentration
im Medium ist, war es möglich, durch Messen geeigneter Wachstumsparameter, wie optische Dichte der Testlösung,
nach Inkubation während einer bestimmten Zeit und bei einer bestimmten Temperatur unter Vergleich dieses Parameters mit
Werten, die man mit Hilfe desselben Tests mit Proben enthaltend verschiedene, bekannte Konzentrationen an Vitamin
B««, die Konzentration des Vitamin B.„ in Plasmaprobenextrakt
zu bestimmen.
35
Klt/6.5.1981
»j ι ι
Diese mikrobiologische Bestimmung, obwohl sie selektiv und sensitiv ist, ist schwierig in der Durchführung, indem
sie sterile Techniken und dadurch hoch qualifizierte Techniker
verlangt. Darüber hinaus ist es schwierig, Kolonien der benötigten Vitamin B1„-sensitiven Mikroorganismen aufrechtzuerhalten.
Im weitern sind die Testergebnisse erst nach einigen Tagen erhältlich und zudem kann der Test bei
Patienten nicht durchgeführt werden, die Antibiotika oder andere Arzneimittel eingenommen haben. Nach der Entwicklung
der Radiorezeptorbestimmung wurden demnach die mikrobiologischen Methoden gestoppt und man wechselte zur bequemeren
Bestimmungsmethode.
Die Radiorezeptorbestimmung verwendet die kompetitive Bindungsinhibition durch Vitamin B1 2/ das in der Plasmaprobe
eines Patienten enthalten ist, zur Bindung bekannter Konzentrationen eines.radioaktiv markierten Vitamin B19-
57
Derivates, d.h. Co-Vitamin B1„, zu den Rezeptorstellen an einem Intrinsik-Faktor (IF)-Präparat. Die Intrinsik-Faktorpräparate wurden hergestellt aus den Mägen höherer Säugetiere, vorwiegend Schweine. Diese Präparate waren in dem Sinne unrein, dass sie mit erheblichen, wenn nicht sogar grösseren Mengen von R-Proteinen verunreinigt waren. Verschieden vom Intrinsink-Faktor, welcher Vitamin B17 in einer hoch selektiven Art bindet, haben die R-Proteine eine nicht spezifische Bindungscharakteristik und binden an die natürlichen Analogen von Vitamin B..-, welche dem Vitamin B1P strukturell sehr verwandt aber biologisch inaktiv sind.
Derivates, d.h. Co-Vitamin B1„, zu den Rezeptorstellen an einem Intrinsik-Faktor (IF)-Präparat. Die Intrinsik-Faktorpräparate wurden hergestellt aus den Mägen höherer Säugetiere, vorwiegend Schweine. Diese Präparate waren in dem Sinne unrein, dass sie mit erheblichen, wenn nicht sogar grösseren Mengen von R-Proteinen verunreinigt waren. Verschieden vom Intrinsink-Faktor, welcher Vitamin B17 in einer hoch selektiven Art bindet, haben die R-Proteine eine nicht spezifische Bindungscharakteristik und binden an die natürlichen Analogen von Vitamin B..-, welche dem Vitamin B1P strukturell sehr verwandt aber biologisch inaktiv sind.
Von dieser Verunreinigung des Intrinsink-Faktors mit
R-Proteinen wurde nicht angenommen, dass sie die Bestimmungs methode beeinflusst, da bekannt war, dass die natürlichen
Analogen von Vitamin B12 normalerweise im menschlichen Darm ·
vorhanden sind und man nicht glaubte, dass diese absorbiert und im Blutstrom und Gewebe vorhanden seien. Demgegenüber
wurde in einer Arbeit von Kolhouse et al., in The New
England' Journal of Medicine, Vol. 299, No. 15, Seiten 785-789 "(12. Oktober 1978) gezeigt, dass solche biologisch in-
BAD JORIGINAL
aktiven Analogen von Vitamin B1^ in der Tat natürlich im
menschlichen Blutstrom existieren. Diese Analogen wurden durch die kommerziell erhältlichen Radioligandverfahren für
Vitamin B19 als wahres Cobalamin gemessen, und es wurde
angenommen, dass dies der Grund für beobachtete Diskrepanzen sei, wonach Vitamin B._ Serumwerte gemäss Radioligandverfahren
wesentlich höher waren als diejenigen, die mit mikrobiologischen Verfahren gemessen wurden.
Die klinischen Implikationen dieser Diskrepanzen wurden von Cooper and Whitehead in derselben Nummer of The
New England Journal of Medicine, Seiten 816-818 in einem Artikel mit dem Titel "Evidence That Some Patients With
Pernicious Anemia Are Not Recognized By Radiodilution Assay For Cobalamin In Serum" beobachtet. Nachdem diese beiden
Arbeiten erschienen waren, setzte bei den Herstellern der kommerziell erhältlichen Vitamin B.„-Radioligandverfahren
intensive Arbeit ein, ihre Kits derart zu modifizieren, um diese schwerwiegenden Probleme zu lösen. Wie von Kubasik et
al. in Clin. Chem. 2§/5 , 598 (1980) beschrieben, gab es
zwei Hauptwege, um dieses Ziel zu erreichen:
1. Unwirksammachen der R-Proiein-Bindungsstellen: Dies
kann bewirkt werden durch Ueberfluten des IP-R-Protein-Kombinationsbinder
mit einem Analogen wie Cobinamid. Cobinamid bindet nicht an IF, bindet aber an die R-Proteine.
Falls Cobinamid in grossem Uoberschuss ( > als 100 mal) zugesetzt wird, unterdrückt es alle nicht-spezifischen
Cobalamin-Bindungsstellen.
2. Reinigen des IF; IF-Konzentrate können durch ausejedehnte
Behandlung mit proteoIytischen Enzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder bnidrn oder durch Af finitätschrom.itographii:=·
gereinigt wordon.
BAD ORIGINAL
Eine Evaluation dieser beiden Wege durch die Autoren führte zum Schluss, dass - obwohl der "Cobinamid"-blockierte
Binder verwendet werden kann - reines oder gereinigtes IF aus analytischen 'Gründen der bessere Binder sei. So
würden alle möglichen nicht-spezifischen Kffekte bedingt
durch andere BLnder eliminiert werden.
Die Kriterien, welche zur Etablierung der Reinheit von Intrinsik-Faktor-Präparaten verwendet wurden waren die
folgenden:
1. Die Bindung von bioaktivem Cobalamin wird vollständig inhibiert, wenn aktiver IF zuerst mit Antikörper
gegen IF inkubiert wird.
2. Vergleich der liin<k;r in Vorfahren, die bei sauren
und basischem pH in Gec/enwart von CobaJ amin-Analogen durchgeführt
werden. Ein gereinigtes IF-Präparat zeigt sehr geringes
Bindungsvermögen für Cobalamin bei saurem pH und die Bindung bei basischem pH wird durch die Gegenwart von
Cobalamin-Analogen wenig beeinflusst.
3. Gereinigtes IF misst "Cobinamid" (Cyanohydroxycobinamid)
nicht und dies sogar bei extrem hohen Konzentrationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Radioligandverfahren für Vitamin Β.« , welches dadurch
gekennzeichnet ist, dass als Instrinsik-Faktor-Präparat ein Kochsalzlösungs-Extrakt von Maus- oder Rattenmägen verwendet
wird. Solche Intrinsik-Faktoren von Mäusen oder Ratten sind - im Gegensatz zu Intrinsik-Faktor-Präparaten
von höheren Säugetieren, wie Schweinen - im wesentlichen frei von R-Proteinen. Die Verwendung von Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor-Präparaten
in einem Radioligandverfahren für Vitamin B19 verdeckt Cobalamin-Mängel in der zu bestimmenden
Person nicht, da diese Intrinsik-Faktor-Präparate spezifisch für wahres Cobalamin sind. Im weitern wird durch
BAD ORIGINAL
die Verwendung von Maus oder Ratten Intrinsik-Faktor die
Notwendigkeit der uneffizienten, zeitaufwendigen und teuren Reinigung/ z.B. durch Affinitätschromatographie, für
Intrinsik-Faktor-Präparate anderer Säugetiere zur Entfernung von R-Proteinen vermieden. Nach einem weitern
Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die grösste Effizienz der Bestimmungsmethode erhalten wird,
wenn die Extraktion der Serun.probe mit Cyanidpuffer bei pH 4,5 erfolgt und wenn das Rad.oligandverfahren bei pH 7,2
durchgeführt wird.
Maus- und Ratten-Intrinsik-Faktor-Präparate zeigen die
Eigenschaften von reinem Intrinsik-Faktor ohne das Reinigungsverfahren notwendig sind. So werden die Intrinsik-Faktor-Präparate,
welche gemass vorliegender Erfindung verwendet werden, bei der Bindung an bioaktives Cobalamin
zu mehr als 98% inhibiert, wenn sie vorher mit Antikörper
zu Intrinsik-Faktor inkubiert worden sind. Die Zugabe von 10 000 pg Cobinamid zu einer Probe führt nicht zu einer
beobachtbaren Inhibition der Bindung von wahrem Cobalamin, wenn beim Verfahren Ratten- oder Maus-Intrinsik-Faktor
verwendet wird. Schliesslich erhält man durch Gelchromatographie von Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor, welcher mit
radioaktivwmarkiertem B.„ markiert ist, einen einzigen
scharfen Peak entsprechend einem offensichtlichen Molekulargewicht
von ungefähr 55 000. Dieser Peak wird durch Vorinkubation
mit Antikörper gegen Intrinsik-Faktor meistens vollständig inhibiert.
Die Maus- und Ratten-Intrinsik-Fatkor-Präparate können von Maus- oder Rattenmägen nach an sich bekannten Verfahren
erhalten werden. So z.B. können Maus- oder Rattenmägen in kalter Kochsalzlösung homogenisiert werden, und
der Ueberstand kann durch Zentrifugation oder Filtration von der überbleibenden Gewebemasse entfernt werden. Es ist
erwünscht, dass der erhaltene Kochsalzlösungs-Extrakt mit wässriger, verdünnter Base, wie Alkalihydroxyd, vorzugsweise
Natriumhydroxyd, auf pH 10 qjestellt wird, um all-
BAD ORIGiNAL
- V
fälliges Pepsin, welches im Magen vorhanden und in den Extrakt
übergegangen ist, zu inaktivieren. Pepsin kann zur Verringerung des Intrinsik-Faktors führen, wenn es nicht
durch Denaturierung in basischer Lösung inaktiviert wird.
Eine repräsentative Herstellung von Maus-Intrinsik-Faktor
ist anschliessend beschrieben:
1 Teil (150 g) von sauberen, kleingeschnittenen Mäusemägen wird mit 4 Teilen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(pH 7,2) während 5 Minuten bei 4° in einem Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wird während 30 Minuten
bei 4°C und 30 000 g zentrifugiert. Der Ueberstand wird dekantiert und mit IN Natriumhydroxyd auf pH 10 gestellt.
Nach 20-minütigem Rühren wird der pH mit IN SaIzsäure
auf pH 5,0 gestellt. Zur Entfernung von Prezipitat wird erneut während 3 0 Minuten bei 30 000 g zentrifugiert.
Der Ueberstand wird mit IN Natriumhydroxyd auf pH 7,2 gestellt.
Der Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor kann bei jedem bekannten Standard-Radioligandverfahren für Vitamin B1„
verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
Vitamin B1„-Bestimmung mit Maus-Intrinsik-Faktor
A. Extraktion von endogenem Cobalamin aus Serum:
1. 0,5 ml Serum werden in ein 12 ml-"red-top"-Vacutainerrohrchen
pipettiert.
2. Nach Zugabe von 4,5 ml Cyanidpuffer wird gut gemischt.
3. Das Röhrchen wird mit dem Originalstopfen verschlossen,
und der Stopfen wird mit einer Blutentnahmenadel durchstos.'ien. Aus Lüftungszwcckon wird die Nadel im Stopfen
belassen.
4. Das Röhrchen wird während 30 Minuten in ein Wasserbad gestellt.
BAD ORIGINAL
5. Das Röhrchen wird durch Einstellen in ein Eis/-Wasserbad
gekühlt.
6. ils wird rasch in einem Vortex-Mischer gemischt.
Vollständiges Mischen ist entscheidend.
7. Die Nadel wird entfernt und das Röhrchen während 20 Minuten bei 15 000 χ G zentrifugiert.
8. Die entsprechenden Kontrollseren werden nach einer ähnlichen Methode extrahiert.
B1 Wiederauffindungskontrolle des Extraktionsverfahrens:
1. 0,5 ml Serum werden in ein 12 ml "red-top"-Vacutainerröhrchen pipettiert.
2. 100 ul 57Co-Cyanocobalamin (ungefähr 14 000 CPM)
werden zugeführt.
3. 4,4 ml Cyanidpuffer werden zugegeben und es wird
gut gemischt.
4. Es wird wie in den Schritten 3 bis 7 gemäss Extrak
tionsverfahren vorgegangen.
5. Der Ueberstand wird in entsprechend markierte Vacutainerröhrchen gegeben. Es ist wichtig, dass der
Niederschlag und der Ueberstand in identischen Röhrchen sind. Beide Röhrchen, das eine enthaltend den Niederschlag
und das andere enthaltend den Ueberstand werden aufbewährt.
6. Eine Wiederauffindungskontrolle ist ebenfalls für
die Kontroliseren erforderlich.
C. Ligandverfahren
1. Es werden im Doppel Standardröhrchen durch Mischen
von Arbeitsstandard und Puffer wie folgt hergestellt:
ORIGINAL
10 | Standarfpuffer | 3118999 | |
1100 μΐ | Arbeitsstandard | ||
ndard | 1100 | 0 μΐ | |
O | 1100 | 5 | |
5 | 1075 | 10 | |
10 | 1050 | 25 | |
25 | 1025 | 50 | |
50 | 1000 | 75 | |
75 | 950 | 100 | |
100 | 1100 | 150 | |
150 | 1100 | 0 | |
"NSB" | 0 | ||
"Total" | |||
2. 1,0 ml des klaren Ueberstandes des Serumextraktes wird in jedes der 12 χ 75 ml Polystyrolröhrchen gegeben.
3.Zu jedem Extrakt werden 100 μΐ Phosphathydroxydlösung
gegeben.
4. Zu allen Röhrchen werden 100 μΐ Co-B-12 gegeben.
5. Der Inhalt der Röhrchen wird gründlich gemischt.
6. Zu allen Röhrchen mit Ausnahme von "nicht-spezi-
fische Bindung" (NSB) und "Total" werden 200 μΐ von Maus-IF
(1:1000 in 0,5 ml Phosphatpuffer vom pH 7,2). Von 11NSB"
und "Total" werden 200 bzw. 400 ml 0,5 ml Phosphatpuffer
vom pH 7,2 gegeben.
7. Es wird im Vortex-Mischer gemischt.
8. Die Röhrchen werden während 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
9. Zu allen Röhrchen mit Ausnahme von "Total" werden 200 μΐ Albumin-beschichtete Aktivkohle gegeben. Während des
Pipettierens muss die Aktivkohle konstant gemischt werden.
10. Jedes Röhrchen wird erneut kurz im Vortex-Mischer gemischt.
11. Die Röhrchen werden während 20 Minuten bei 1500 χ G zentrifugiert.
12. Die Ueberstände werden in geeignet marktierte
Röhrchen gegeben und in einen Gammazähler gebracht.
a. "Total"
b. 11NSB"
c. 1O1 St.indard
BAD ORIGINAL
■·'■ - 3118993 - sr"-
Reaqentien:
Cyanidpuffer 0,2 ml pH 4,6
CH3COO Na .3H2O
B. CH3COOH 11,5 gm/1
CH3COO Na .3H2O
B. CH3COOH 11,5 gm/1
A. CH3COO Na .3H2O 27,2 gm/1
480 ml A und 520 ml B werden gemischt. Falls nötig wird der pH auf 4,6 gestellt. 1 ml 0,4% KCN (40 mg/10 cc
H„O) werden zugefügt.
Acetatpuffer:
0,1 m pH 4,6 werden mit Phosphat/Hydroxydlösung auf pH 7,2 gestellt.
■J5 Phosphatpuffer 0,5 m pH 7,2:
A. Na3HPO 35,5 gm/500 cc
B. Na2HPO4-H2O 34,5 gm/500 cc
Der pH wird auf 7,2 gestellt.
Phosphat/Hydroxydpuffer:
3,8 g NaOH werden in 100 cc Puffer vom pH 7,2 gelöst. ml Acetat-CN-Extraktionspuffer werden mit 1 ml PO./OH
auf pH 7-7,2 titriert und der Extraktionspuffer wird mit Natriumhydroxyd oder Phosphatpuffer falls nötig eingestellt.
Radioaktives B19: Amersham Searle (10 uCo/ml)
75 μΐ werden in 10 cc verdünnt und mit Phosphatpuffer,
0,5 m auf pH 7,2 gestellt.
Standard Vitamin B1?:
Vitamin B17 wurde von Parke-Davis (Betalin) erhalten
(100 ug Cyanocobalamin pro ml):
Man verdünnt 1:1000 zu niner Konzentration von 0,1 ug/
ml in 0,5M Phosphatpuffer von pH 7,2.
Durch Verdünnen der obiqen Lösung auf 1:1000 in 0,5 m
Phosphatpuffer vom pH 7,2 stellt man Arbeitsstandard
(1 ng/ml) her.
Albuminpuffer:
2 ml 22%iges Rinderaibumm werden mit 15 ml 0,5 m
Phosphatpuffer vom pH 7,2 verdünnt.
Phosphatpuffer vom pH 7,2 verdünnt.
Maus-Intrinsik-Faktor:
Mausemagenextrakt wird mit 0,5 m Phosphat-Albumin-Puffer
vom pH 7,2 auf 1:1000 verdünnt.
Handberechnungen:
"15 1. Prozentsatz-Bindung = cpm Ueberstand (e) - cpm NSB χ 100
cpm Total
2. Prozent der Bindung wird gegen pg B19 pro Röhrchen auf
Millimeterpapier aufgetragen, das Unbekannte gegen die
Standardkurve abgelesen und mit 10 multipliziert = pg/ml
Serum.
Serum.
3. Das Wiederauffinden wird wie folgt berechnet:
Wiederauffindung = cpm Ueberstand
cpm Niederschlag (f) + cmp Ueberstand (g)
Das obige Verfahren verwendet spezifisch Maus-Intrinsik-Faktor, doch kann ein analoges Vorgehen verwendet
werden für Ratten-Intrinsik-Faktor oder für einen Intrinsik-Faktor
von anderen Säugetieren, deren Magen frei von endogenen R-Proteinen ist. In ähnlicher Weise ist die oben erwähnte
Bestimmung mit Co durchgeführt worden, doch ist es möglich, auch ein anderes geeignetes markiertes Cyano-
125
cobalamin, wie z.B. J-markiertes Cyanocobalamin in einer an sich bekannten Wc-ise 7.11 verwenden.
cobalamin, wie z.B. J-markiertes Cyanocobalamin in einer an sich bekannten Wc-ise 7.11 verwenden.
BAD
Die Affinität des Maus-Intrinsik-Faktors für Cobalamj_n
wurde bestimmt, indem man 200 μΐ der Primärverdünnung des
Mäusemagenextraktes ins Reaktionsröhrchen gab, wobei gefunden wurde, dass diese Primärverdünnung in der Lage war,
50% einer Spur des radioaktiv markierten Liganden zu
binden. Diese Menge von Mäusemagenextrakt (MSE) wurde für alle anschliessenden Experimente verwendet. Inkubation vor-
57
schiedenor Mengen von Co-Cobalamin mit einer konstanten Menge von Intrinsik-Faktor erlaubt Bestimmungen der Affir.itätskonstante (K) bei pH 7,2 und beträgt 1,21 χ 10" Liter pro Mol.
schiedenor Mengen von Co-Cobalamin mit einer konstanten Menge von Intrinsik-Faktor erlaubt Bestimmungen der Affir.itätskonstante (K) bei pH 7,2 und beträgt 1,21 χ 10" Liter pro Mol.
Die Titrationsdaten wurden bestätigt durch Reaktion einer bekannten Menge von Intrinsik-Faktor, 200 μΐ der
-|5 Primärverdünnung mit verschiedenen Konzentrationen von
Co-Cyanocobalamin mit dem Zweck, die optimale Menge an
Radioligand zu bestimmen, welche im Bestimmungsverfahren verwendet werden soll. 100 ml Arbeitslösung enthaltend
45 pg radioaktives Cyanocobalamin wurden als optimal bestimmt. Mit dem im obenerwähnten Verfahren verwendeten
Materialien ergibt diese Menge an Co-Cyanocobalamin ungefähr 14 000 cpm in dem "Total"-Röhrchen.
Standardkurven für das Inhibitionsverfahren zur Verwendung
in der Bestimmung von Vitamin B1„ in klinischen
Proben können vom oben beschriebenen Verfahren abweichen. Die Konzentrationen vom Standard, die zur Schaffung von
Standardkurven verwendet werden, sollten mit den Mengen an Vitamin B1„ korrespondieren, die üblicherweise in
klinischen Proben gefunden werden. Die endgültigen Reaktionsbedingungen sind: Intrinsik-Faktor, 200 μΐ Primärverdünnung,
radioaktiver Ligand, 100 μΐ Arbeitsverdünnung, 30 Minuten Zeil;, pH 7,2 und nicht radioaktiver Standard,
50-150 pg pro Röhrchen oder das Aequivalente von 50 bis 1500 pg von Vitamin B12 pro ml Serum.
AO i'l^ BAD ORIGINAL
Dass Intrinsik-Faktor (frei von R-Proteinen ) aus Extrakten von Mäusemäcjen gewonnen werden kann, wird durch
verschiedene experimentelle Beobachtungen bestätigt. Wenn radioaktiv markiertes Cobalamin mit MSE unter den oben
erwähnten Bedingungen inkubiert wird und das Gemisch in einer mit Sephadex G-150 gepackten Kolonne getrennt wird,
eluiert der radioaktive Komplex als eine einzige Linie mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 54 900. In derselben
Kolonne eluiert der Komplex Radiocobalamin-R-Proteine (menschlicher Speichel oder Konzentrat von Schweinemagenextrakt)
mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 101 000.
Die Bildung des Komplexes Radiocobalamin und Mäuse- -|5 Intrinsik-Faktor wird durch Vorinkubation des MSE mit Humananti-Intrinsik-Faktor-Antikörper
vollständig inhibiert. Die Daten werden in Tabelle 1 wiedergegeben:
Inhibition von Mäuse-Intrinsik-Faktor -Co-Cobalamin
Reaktion durch menschliche Anti-Intrinsik-Faktor-Äntikö'rper
Intrinsik-Faktor- Menschlicher
Zubereitung Speichel
Total Cobalamin im Reaktionsgemisch (ng) 15 15
(a) (b) (a) (b) Cobalamin gebunden durch
Binder allein (ng) 8,1 8,0 5,2 5,3
Cobalamin gebunden nach
Vorinkubation mit Anti- 0,6 0,8 5,8 6,0
körper (ng) 0,5 0,7 6,2 6,2
Cobalamin gebunden durch 0,8 0,6 Antiserum allein (ng) 0,6 0,6
Inhibition durch Antiserum (a) = 9 7,5%
98,8%
Antiserum (b) = 98,8%
97,5%
" 4S
Wenn 15 ng Radiocoba Larnin mit der entsprechenden Menge
von MSE inkubiert werden, werden 8,1 ng des Liganden gebunden.
Vorinkubation mit zwei verschiedenen Antikörpern bewirkt eine im wesentlichen vollständige Inhibition der
Bindung. Im Gegensatz dazu zeigt Vorinkubation von menschlichem Speichel mit Anti-Intrinsik-Faktor-Antikörper
dass die Bildung des Komplexes R-Proteine -Co-Cobalamir durch den Antikörper nicht inhibiert wird.
Wenn das mit Antikörper vorinkubierte Gemisch Intrinsik-Faktor/Radiocobalamin wie vorher beschrieben
durch eine Sephadex G-150-Kolonne gegeben wird, zeigt sich
dass die Linie beim offensichtlichen Molekulargewicht von 54 900 vollständig verschwunden ist.
Cobinamid ist wertvoll als ein Modell für die biologisch
inaktiven Vitamin B.„-Analoge. Die Fähigkeit der
Analogen die Bindung von echtem B17 an Maus-Intrinsik-Faktor
zu inhibieren, kann durch Zugabe verschiedener Mengen von Cobinamid zu den Reaktionsröhrchen enthaltend
MSE oder menschlichem Speichel und Co-Cobalamin studie-t
werden. Die Reaktionsbedingungen sind wie oben erwähnt. Die Zahlen zeigen, dass 643 738 Pjcogramm an Cobinamid
notwendig sind, um dasselbe Ausmass an Inhibition (50%)
zu erreichen wie 60 Picogramm Cobalamin, was eine berechnete
Kreuzreaktion von weniger als 0,1 bei pH 7,2 anzeigt. Wenn die Experimente bei pH 4,5 durchgeführt werden, sind die
Zahlen 49,1 pg/ml Cobalamin und 7 355 pg/ml Cobinamid für
eine berechnete Kreuzreaktion von 0,66%.
Wenn anstelle von MSE menschlicher Speichel im gleichen Experiment verwendet wird, sind die Ergebnisse in scharfem
Gegensatz. In einem solchen Experiment bewirken 112 pg Cobinamid dasselbe Ausmass an Inhibition (50%) wie 58,9 pg
Vitamin B.„ oder eine berechnete Kreuzreaktion von 52,6%.
Dass die Inhibition kompotitiv ist, kann aus dem ähnlich'.-n
und nahezu parallel verlaufenden Anstiegen der Inhibitionskurven geschlossen werden, speziell im Experiment mit men-
BAD ORIGINAL
schlichem Speichel.
Weitere Daten aus denen hervorgeht, dass Cobinamid nicht in der Lage ist, die Reaktion von Maus-Intrinsik-Faktor
mit Cobalamin zu hindern, geht aas Tabelle 2 hervor, wo die Resultate gezeigt werden, wenn 10 000 pg Cobinamid
zu einem Kontrollröhrchen gegeben werden, mit dem das ganze Verfahren durchgeführt wird.
:0 Tabelle 2
Kreuzreaktion von Cobinamid mit Cobalamid im Ligand-Maus-Intrinsik-Faktor-Verfahren
Auffindung von 10 000 pg von Cobinamid als Cobalamin
pq/ml
9 5 0
10 5
24
24
Durchschnittliches Auffinden 8,5 pg/ml Kreuzreaktion 0,085%
Die verbesserte Bestimmungsmethode gemäss vorliegender
Erfindung ist von genügender Empfindlichkeit, dass 5 pg von Cobalamin in Reaktionsröhrchen von 0 mit statistischer
Signifikanz unterschieden werden können, was einer Grenze der Sensibilität für die klinische Bestimmung von 50 pg/ml
entspricht. Sensitivitatsdaten dieser Bestimmung sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tag | B/Bö % | |
15 | ||
1 | 98 | |
2 | 99 | |
4 | 101 | |
20 | 7 | 98 |
8 | 99 | |
9 | 97 | |
10 | 104 | |
11 | 101 | |
25 | 15 | 95 |
3118993
'MabelIe
Sensitivität des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligandverfahren
für Serum-Cobalamin
Gebundene "Counts" pro Minute
0 | 50 | pg/ml |
6514 | 5657 | |
6130 | 5715. | |
6274 | 5791 | |
6252 | 5827 |
Durchschnitt 6307 5
t = 6,128 ρ = < 0.01
Diese Bestimmung wurde wiederholt durchgeführt, um die Abweichungen von Bestimmung zu Bestimmung zu ermitteln.
Die Resultate dieser Experimente sind in Tabelle 4 zusammengefasst, 20
Reproduzierbarkeit | des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligand- | Probe Cobalamin, pg/ml | 249,7 | |
verfahren bei Serum-Cobalamin | 11 | 243,3 | ||
Probe | Cobalamin, pg/ml | 12 | 266,6 | |
1 | 252,4 | 13 | 246,6 | |
2 | 263,1 | 14 | 263,9 | |
3 | 255,2 | 15 | 241,0 | |
4 | 241,0 | 16 | 241,6 | |
5 | 263,5 | 17 | 256,0 | |
6 | 289,3 | 18 | 247,7 | |
7 | 263,4 | 19 | 248,0 | |
8 | 272,3 | 20 | ||
9 | 271,8 | 254,26 | ||
10 | 242,9 | 10,68 | ||
Durchschnitt | 4,2% | |||
Standardabweichung | ||||
Variantskoeffizient | ||||
AB
Tag-zu-Tag-Abweichungen und so die Genauigkeit des Tests' wird durch die in Tabelle 5 angegebenen Zahlen
reflektiert.
Tag-zu-Tag-Reproduktion des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligandverfahrens für Serum-CobalamLn*
Probe 1
Extraktion Wiederauf-
Resultate
in pg/ml
Probe 2
Extraktion Resultate Wiederauf- in pg/ml
0 | findung % | 4 20 | Probe | findung % | 709 | |
1 | 86 | 505 | Probe | 86 | 696 | |
2 | 86 | 435 | 86 | 677 | ||
5 3 | 86 | 428 | 86 | 648 | ||
4 | 87 | 88 | 686 + 24 | |||
86,2 | 86,4 | Durchschnitts | ||||
Durchschn. | Durchschn. | resultat | ||||
Wiederauf | Wiederauf | |||||
findung | findung | |||||
444 + 34 | 1 = 7,7% | |||||
Durchschnitts | 2 = 3,5% | |||||
resultat | ||||||
Variantskoeffizient | ||||||
* Alle Extraktionen bei 4,6 und alle Bestimmungen bei pH 7,2
Das Wiederauffinden von Cobalamin, welches zu natürlichen
Serumproben gegeben wurde, nach der erfindungsgemassen
Bestimmungsmethode zeigt die Genaugikeit, welche durch diese Bestimmungsmethode erreicht wird. Die Resultate
solcher Experimente sind in Tabelle 6 angegeben.
3118939
Mau | ...» | ~ - i/r - | Cobalamin, | ben | Endogenes Cobalaiü | in | welches zu normalem | 93 | |
1% | menschlicham Serum gegeben wurde | 103 | |||||||
Wie | Tabelle) ( | Theoretisch | Gefunden | 2 52 pg/ml | 95 | ||||
i-lntrinsik-Fakt" | Hinzu | 352 | 345 | Wi ed er au ffi ndung | |||||
PH 7, | lege | 452 | 458 | in % | 97 | ||||
lerauffLndung von | 10 100 | 652 | 632 | ||||||
5 | r-Cobal an in-Verf ahren | 200 | Durchschnitt. | ||||||
2 | 400 | Wiederauffinden | |||||||
■ EH 4,5
100 482 492 110
200 582 569 94
400 782 759 94
Durchschnitt.
Wiederauffinden 9 9,33
Eir Testkit, welches für d.is verbesserte Radioligan lverfahren
gemäss vorliegander Erf; ndung verwendet werden kann, erthält einzelne Fläschchen enthaltene genügende
Mengen von Reagentien. Solch ein ^estkit enthält:
1. Ein Fläschchen mit radical·tiv markierter Cyanocobalamin-Lösung,
vorzugsweise C'o-Cyanocobalamin. 2. Ein Fläschchen mit Maus- cder Ratten-Intrinsik-Faktor
in gepui ferter Lösung.
3. Je ein Fläschchen mit Cob;lamin-Stardarc zwische ι
0 und 150 pg, "orzugsweise je ein Fläschchen mit 0, 5, 1),
25, 50, 75, 100 und 150 pg.
SoJ :h ein Testk.it kann woiheihin ein ocier mehrere
Flasche^'in mit den folgenden Reagan I ien enthalten:
bad original
(a) Cyanidpuffer pH 4,6
(b) Acetatpuffer pH 7,2
(c) Phosphatpuffer pH 7,2
(d) Phosphat/Hydroxydpuffer
(e) Albumin-be;schichteto Aktivkohle,
Claims (8)
1.J Radioligandverfahren zur Bestimmung von Vitamin
L -, bei dem eine Serumprobe oder eine Probe von Gewebeextrakt
mit einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Vitamin B1„ und einem Intrinsik-Faktor-Präparat gemischt
wird, das durch den Intrinsik-Faktor gebundene radioaktiv markierte Vitamin B1 „ von uncjebundenem radioaktiv markiertem
Vitamin B1 „ getrennt wird, die Menge an radioaktiv markiertem
Vitamin B12 in der gebundenen oder in der ungebundenem
Form bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen wird, die mit Proben von bekannten, unterschiedlichen Mengen von
Vitamin B17 erhalten wird, wobei die Menge an Vitamin B19
in der Probe bestimmt werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass als Intrinsik-Faktor ein Präparat verwendet wird, das
Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor enthält.
2. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Maus-Intrinsik-Faktor verwendet wird.
3. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die Serumextraktprobe durch Extraktion bei pH 4,5 erhalten wird und dass die Bestimmung bei pH 7,2
durchgeführt wird.
4. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte Vitamin B17
Co-Cyanocobalamin ist.
5. Testkit zur Durchführung eines Radioligandverfahrens
für Viamin B13, welches einzelne Fläschchen enthaltend eine
Lösung von radioaktiv markiertem Vitamin B1~, Lösungen von
Vitamin B12~Standard und von Intrinsik-Faktor-Präparat enthält,
dadurch gekennzeichnet, dass das Intrinsik-Faktor-Präparat Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor ist.
BAQ ORIGINAL
6. Testkit gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Intrinsik-Faktor-Präparat Maus-Intrinsik-Faktor
ist.
7. Testkit gemäss Anspruch 5, enthaltend zusätzlich ein Fläschchen mit -Cyanidextraktionspuf fer vom pH 4,5 und
ein Fläschchen mit Phosphatpuffer vom pH 7,2.
8. Radioligandverfhren für Vitamin B12, bei dem eine
Serum- oder Gewebe-Extraktprobe mit einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Vitamin B12 und einem Intrinsik-Faktor-Präparat
gemischt wird, das durch den Intrinsik-Faktor gebundene radioaktiv markierte Vitamin B12 vom ungebundenen
radioaktiv markiertem Vitamin B12 getrennt wird,
die Menge von radioaktiv markiertem B12 in der gebundenen
oder ungebundenen Form bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen wird, welche mit bekannten Proben enthaltend
verschiedene Mengen an Vitamin B12 erhalten wurde,
mit der die Menge an Vitamin B12 in der Probe bestimmt
werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass als Intrinsik-Faktor-Präparat
ein Extrakt von Säugetiergewebe verwendet wird, welches von R-Proteinen frei ist.
***
25
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/151,796 US4355018A (en) | 1980-05-21 | 1980-05-21 | Assay for vitamin B12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE3118999A1 true DE3118999A1 (de) | 1982-02-25 |
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Family Applications (1)
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DE3118999A Withdrawn DE3118999A1 (de) | 1980-05-21 | 1981-05-13 | Bestimmungsmethode fuer vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) |
Country Status (3)
Country | Link |
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US (1) | US4355018A (de) |
JP (1) | JPS5742855A (de) |
DE (1) | DE3118999A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6083857A (en) * | 1995-11-13 | 2000-07-04 | Helsa-Werke Helmut Sandler Gmbh & Co. Kg | Surface element |
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-
1980
- 1980-05-21 US US06/151,796 patent/US4355018A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-05-13 DE DE3118999A patent/DE3118999A1/de not_active Withdrawn
- 1981-05-20 JP JP56076388A patent/JPS5742855A/ja active Pending
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US6083857A (en) * | 1995-11-13 | 2000-07-04 | Helsa-Werke Helmut Sandler Gmbh & Co. Kg | Surface element |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4355018A (en) | 1982-10-19 |
JPS5742855A (en) | 1982-03-10 |
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