DE3116648A1 - Plasmids with a gene for cobalt resistance, microorganisms which contain such a plasmid transformed, process for the production of cobalt-resistant microorganisms and process for removing cobalt from cobalt-containing solutions - Google Patents
Plasmids with a gene for cobalt resistance, microorganisms which contain such a plasmid transformed, process for the production of cobalt-resistant microorganisms and process for removing cobalt from cobalt-containing solutionsInfo
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die ein Gen enthal-The invention relates to plasmids which contain a gene
ten, das für Kobalt-Resistenz kodiert und Mikroorganismen, die ein derartiges Plasmid transformiert enthalten. Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Kobalt-resistenten Mikroorganismen, ein Verfahren zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen und die Verwendung von Kobalt-resistenten Mikroorganismen zur Abtrennung von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen.th, which codes for cobalt resistance, and microorganisms, which are a contain such a plasmid transformed. The invention also provides a process for the production of cobalt-resistant microorganisms, a process for separating cobalt from solutions containing cobalt and the use of cobalt-resistant ones Microorganisms for the separation of cobalt from solutions containing cobalt.
Im allgemeinen sind Mikroorganismen, wie Bakterien, in einer Umgebung, die bestimmte Schwermetalle oder ihre Ionen enthält, nicht lebensfähig. Dies bedeutet, daß die Mikroorganismen in Lösungen, die solche Schwermetalle enthalten, nicht wachsen können, sondern absterben. Eines der Schwermetalle, gegen die Mikroorganismen in der Regel sensitiv sind, ist Kobalt bei einer Konzentration von = 1,5 mmol/l.In general, microorganisms, such as bacteria, are in an environment which contains certain heavy metals or their ions, is not viable. This means, that the microorganisms do not grow in solutions containing such heavy metals can, but die. One of the heavy metals that fight the microorganisms in are usually sensitive, cobalt is at a concentration of = 1.5 mmol / l.
Im Gegensatz zu dieser allgemein verbreiteten Eigenschaft von Mikroorganismen wurde bei einem bestimmten Bakterienstamm der Gattung Klebsiella (Aerobacter aerogenes; Proc.In contrast to this common property of microorganisms was found in a certain bacterial strain of the genus Klebsiella (Aerobacter aerogenes; Proc.
Soc. exp. Biol.-Med. 80 (1952), S. 626 - 632) eine Resistenz gegen Kobalt festgestellt; vgl. K.L. Williams u.Soc. exp. Biol.-Med. 80 (1952), pp. 626-632) a resistance to Cobalt found; see K.L. Williams et al.
P.C. Newell, Genetics 82 (1976), S. 287 bis 307. Dieser Kobalt-resistente Klebsiella-Stamm ist bei Kobaltkonzentrationen von 4 mmol/l noch lebens- und vermehrungsfähig. Er wird nachstehend stets als "resistenter Klebsiella-Stamm> bezeichnet. Bisher ist nicht bekannt, worauf die Resistenz dieser Bakterien gegen die Anwesenheit von Kobalt zurückzuführen ist.P.C. Newell, Genetics 82, pp. 287-307 (1976). This cobalt-resistant Klebsiella strain is still viable and capable of reproduction at cobalt concentrations of 4 mmol / l. In the following, it is always referred to as the "resistant Klebsiella strain". So far is not known what indicates the resistance of these bacteria to the presence of Cobalt is due.
Der resistente Klebsiella-Stamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsbezeichnung DSM 2081 hinterlegt.The resistant Klebsiella strain is in the German Collection of Microorganisms deposited under the deposit designation DSM 2081.
Resistenzen gegen Stoffe, wie Antibiotika oder Schwermetalle, in deren Gegenwart Mikroorganismen normalerweise nicht lebensfähig sind, können chromosomaler Natur sein, d.h. auf die Haupt-DNS des Mikroorganismus zurückgehen. Es kann aber auch ein sogenanntes Plasmid dafür verantwortlich sein, das ein Gen enthält, welches für die entsprechende Resistenz kodiert.Resistance to substances such as antibiotics or heavy metals in their The presence of microorganisms that are normally not viable can be chromosomal Being nature, i.e. going back to the main DNA of the microorganism. But it can a so-called plasmid, which contains a gene, may also be responsible for it coded for the corresponding resistance.
Plasmide sind subzelluläre, extrachromosomale, strukturell selbständige DNS-haltige Träger von Erb-Informationen, beispielsweise der Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum.Plasmids are subcellular, extrachromosomal, structurally independent DNA-containing carriers of hereditary information, for example the resistance to a certain antibiotic.
Plasmide verschiedener Art und mit verschiedenen Funktionen kommen neben der chromosomalen DNS in zahlreichen Bakterien vor. Ein Plasmid, das ein Gen aufweist, das für Resistenz gegen Kobalt kodiert, ist bisher nicht bekannt.Plasmids come of different types and with different functions in addition to the chromosomal DNA in numerous bacteria. A plasmid that contains a gene which codes for resistance to cobalt is not yet known.
Es wurde festgestellt, daß der resistente Klebsiella-Stamm das Kobalt, das in der ihn umgebenden Lösung gelöst ist, zur Ausfällung bringt. Die Ausfällung erfolgt in Form von Kobaltphosphat (CoP04) aus Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 6,50 bis 8,50. Unter der Bezeichnung "Kobalt" ist in diesem Zusammenhang stets die ionisierte Form des Metalls in ihrer zwei- oder dreiwertigen Oxidationsstufe zu verstehen. Die Ursache und der Mechanismus der Ausfällung der Kobalt-Ionen ist bisher nicht bekannt.The resistant Klebsiella strain was found to contain cobalt, which is dissolved in the solution surrounding it, causes precipitation. The precipitation takes place in the form of cobalt phosphate (CoP04) from solutions with a pH value of approx 6.50 to 8.50. In this context, the term "cobalt" is always used ionized form of the metal in its bivalent or trivalent oxidation state to understand. The cause and the mechanism of the precipitation of the cobalt ions is so far not known.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Plasmide bereitzustellen, die ein Gen enthalten, das für Kobalt-Resistenz kodiert.The invention is based on the object of providing plasmids, that contain a gene that codes for cobalt resistance.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mikroorganismen bereitzustellen, die ein in sie transformiertes Plasmid mit einem Gen enthalten, das für Kobalt-Resistenz kodiert.Another object of the invention is to remove microorganisms to provide which contain a plasmid with a gene transformed into them, that codes for cobalt resistance.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von Kobalt-resistenten Mikroorganismen zu schaffen.Another object of the invention is to provide a method for Create production of cobalt-resistant microorganisms.
Schließlich ist eine weitere Aufgabe der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen, darin einfacher und wirtschaftlicher Weise die Abtrennung dieses Metalls aus technischen, kobalthaltigen Lösungen, beispielsweise Abwässern Kobalt-verarbeitender Betriebe oder aus Laugen der Kobaltgewinnung aus Erzen ermöglicht.Finally, another object of the invention is to provide one Process for separating cobalt from solutions containing cobalt, it is simpler and economically the separation of this metal from technical, cobalt-containing Solutions, for example wastewater from cobalt-processing plants or from alkalis enables cobalt extraction from ores.
Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.These objects are achieved by the invention. The invention relates to the subject matter characterized in the claims.
Mit vorliegender Erfindung werden erstmals Plasmide bereitgestellt, die ein Gen enthalten, das für Kobalt-Resistenz kodiert. Diese Plasmide wurden aus dem resistenten Klebsiella-Stamm isoliert und gewonnen. Die Plasmide können nach in der Zellbiologie üblichen Methoden in beliebige andere Mikroorganismen transformiert werden. Diese Mikroorganismen werden dabei ebenfalls resistent gegen Kobalt. Ferner kann aus den Plasmiden nach üblichen Methoden der Gentechnik das Gen, das für Kobalt-resistenz kodiert, herausgeschnitten und in ein anderes Plasmid kloniert werden, das dann ebenfalls in der Lage ist, einem Mikroorganismus, in den es transformiert wird, Resistenz gegen Kobalt zu verleihen.With the present invention plasmids are provided for the first time, that contain a gene that codes for cobalt resistance. These plasmids were made from the resistant Klebsiella strain isolated and obtained. The plasmids can after transformed into any other microorganisms common in cell biology methods will. These microorganisms also become resistant to cobalt. Further the gene that is responsible for cobalt resistance can be obtained from the plasmids using conventional genetic engineering methods encoded, cut out and cloned into another plasmid, which then is also able to attack a microorganism into which it is transformed, To give resistance to cobalt.
Gegenstand der Erfindung sind sowohl die aus dem resistenten Klebsiella-Stamm gewonnenen Plasmide mit dem Gen für Kobalt-Resistenz, als auch die vorstehend genannten "anderen Plasmide", die das Kobalt-Resistenzgen kloniert enthalten.The invention relates to both those from the resistant Klebsiella strain obtained plasmids with the gene for cobalt resistance, as well as those mentioned above "other plasmids" that contain the cobalt resistance gene cloned.
Letztere werden nachstehend anhand von Beispielen im einzelnen erläutert.The latter are explained in detail below using examples.
Aus dem Kobalt-resistenten Stamm der Gattung Klebsiella konnten zwei getrennte Plasmide isoliert werden, die beide einzeln den Mikroorganismen, in die sie transformiert werden, Kobalt-Resistenz verleihen können. Dies bedeutet, daß jedes der beiden Plasmide ein Gen enthält, das für Kobalt-Resistenz kodiert.From the cobalt-resistant strain of the genus Klebsiella, two were found separate plasmids are isolated, both individually representing the microorganisms in which they are transformed, can impart cobalt resistance. This means that each of the two plasmids contains a gene that codes for cobalt resistance.
Eines der beiden Plasmide, (nachstehend als großes Plasmid" bezeichnet) hat ein Molekulargewicht von etwa 50 x 106 Daltons.One of the two plasmids (hereinafter referred to as "large plasmid") has a molecular weight of approximately 50 x 106 Daltons.
Verschiedene Restriktions-Enzyme ergeben bei der Verdauung eine verhältnismäßig hohe Anzahl von Schnittstellen und eine entsprechende Zahl von Fragmenten. Die nachstehend angegebenen Werte für die Anzahl der Fragmente sind Mindestwerte, d.h. die genannte Anzahl von Fragmenten wird nach der Verdauung mit dem entsprechenden Restriktions-Enzym bei der Gel-Elektrophorese mit Sicherheit beobachtet. Dabei kann aber nicht ausgeschlossen werden, daß jeweils noch ein oder einige nur schwach in Erscheinung tretende Fragmente vorhanden sind.Various restriction enzymes give a proportionate digestion high number of interfaces and a corresponding number of fragments. The below The values given for the number of fragments are minimum values, i.e. the stated Number of fragments is determined after digestion with the appropriate restriction enzyme observed with certainty on gel electrophoresis. But this cannot be ruled out that one or a few fragments that only appear weakly in each case available.
Das große Plasmid ergibt bei der Verdauung mit folgenden Restriktionsenzymen folgende Mindestanzahl von Fragmenten Eco RI 11 Hind III 15 Pst I 18 BAM HI o Sal I 11 Das zweite Plasmid (nachstehend als "kleines Plasmid" bezeichnet) weist ein Molekulargewicht von etwa 3,6 x 106 Daltons auf. Es ergibt bei der Verdauung mit den vorstehend genannten Restriktionsenzymen die fqlgende Mindestanzahl von Fragmenten: Eco RI o Hind III O Pst I 2 BAM HI 1 Sal I O Die vorstehend charakterisierten Plasmide der Erfindung können durch Isolierung aus dem resistenten Klebsiella-Stamm gewonnen werden. Diese Isolierung der Plasmide kann nach den in der Zellbiologie zu diesem Zweck üblichen Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine Kulturlösung- der Bakterien zentrifugiert, um die Zellen von der Lösung abzutrennen. Die Zellen werden in gepufferter Sucroselösung suspendiert und sodann mit Lysozym aufgebrochen. Danach wird zum Abfangen der Magnesiumionen EDTA zugesetzt und anschließend, nach einer Inkubationszeit eine gepufferte Triton-Lösung (nichtionisches Detergens). Das Gemisch wird hierauf erneut zentrifugiert und die überstehende Lösung wird bis auf das sehr viskose Material abdekantiert. Dieser Überstand wird sodann mit kristallinem CsCl und Äthidiumbromid versetzt. Danach wird das Gemisch erneut zentrifugiert. Die unter dem Einfluß der Beschleunigung als Funktion ihrer molekularen Dichte verschieden stark gewanderten Banden werden durch Belichtung mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht. Die Bande, die die gewünschte DNS, beispielsweise das gesuchte Plasmid, enthält, kann mit Hilfe einer Injektionsnadel seitlich aus dem Rohr entnommen werden.The large plasmid gives on digestion with the following restriction enzymes following minimum number of fragments Eco RI 11 Hind III 15 Pst I 18 BAM HI o Sal I 11 The second plasmid (hereinafter referred to as "small plasmid") has a Molecular weight of about 3.6 x 106 Daltons. It helps with digestion the abovementioned restriction enzymes the following minimum number of fragments: Eco RI o Hind III O Pst I 2 BAM HI 1 Sal I O The above characterized Plasmids of the invention can be isolated from the resistant Klebsiella strain be won. This isolation of the plasmids can be carried out according to the methods used in cell biology customary methods for this purpose can be carried out. For example, a Culture solution - the bacteria are centrifuged to separate the cells from the solution. The cells are suspended in buffered sucrose solution and then with lysozyme broken up. Then EDTA is added to intercept the magnesium ions and then, after an incubation period a buffered Triton solution (non-ionic detergent). The mixture is then centrifuged again and the supernatant solution is until decanted onto the very viscous material. This supernatant is then with crystalline CsCl and ethidium bromide added. The mixture is then centrifuged again. Which vary under the influence of acceleration as a function of their molecular density heavily migrated bands become visible through exposure to long-wave UV light made. The band that contains the desired DNA, for example the plasmid sought, can be removed from the side of the tube using an injection needle.
Wenn die vorstehend charakterisierten Plasmide der Erfindung in einen Mikroorganismus, beispielsweise in Bakterien transformiert werden, dann wird der betreffende Mikroorganismus gegen Kobalt resistent. Diese Erscheinung wird bei der Transformation eines jeden der beiden vorstehend beschriebenen Plasmide einzeln, sowie auch bei der Transformation der beiden Plasmide zusammen beobachtet.When the above characterized plasmids of the invention in a Microorganism, for example transformed into bacteria, then the the microorganism in question is resistant to cobalt. This phenomenon is the Transformation of each of the two plasmids described above individually, as well as observed during the transformation of the two plasmids together.
Durch die Transformation mindestens eines der Plasmide der Erfindung mit dem Gen, das für Kobalt-Resistenz kodiert, können Mikroorganismen unterschiedlichster Art gegen Kobalt resistent gemacht werden, beispielsweise Bakterien der Gattungen E. coli, Pseudomonas und Bacillus, sowie Hefen.By transforming at least one of the plasmids of the invention With the gene that codes for cobalt resistance, microorganisms can be very diverse Species can be made resistant to cobalt, for example bacteria of the genera E. coli, Pseudomonas and Bacillus, and yeasts.
Resistenz gegen Kobalt bedeutet dabei, daß die Mikroorganismen, die das in sie transformierte Plasmid enthalten, bei einer Kobaltkonzentration von mindestens 4 mmol/l noch lebens- und vermehrungsfähig sind.Resistance to cobalt means that the microorganisms that contain the plasmid transformed into them, at a cobalt concentration of at least 4 mmol / l are still viable and capable of reproduction.
Die Transformation der Plasmide der Erfindung, die ein für Kobalt-Resistenz kodierendes Gen enthalten, in einen Mikroorganismus kann nach den in der Zellbiologie zu diesem Zweck üblichen Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Zellwand des Mikroorganismus durch Zugabe eines Calciumsalzes durchlässig gemacht werden. Darauf wird das Plasmid der Kulturlösung des Mikroorganismus zugesetzt. Es wandert sodann durch die durchlässige Zellwand in die Mikroorgahismen-Zellen ein.Transformation of the plasmids of the invention, one for cobalt resistance The coding gene contained in a microorganism can be found in cell biology customary methods for this purpose can be carried out. For example, the cell wall of the microorganism can be made permeable by adding a calcium salt. The plasmid is then added to the culture solution of the microorganism. It wanders then through the permeable cell wall into the microorganism cells.
Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung von Kobalt-resistenten Mikroorganismen durch Transformation mindestens eines der vorstehend charakterisierten Plasmide, sowie die Mikroorganismen, die ein in sie transformiertes Plasmid mit einem Gen enthalten, das für Kobalt-Resistenz kodiert, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.The method described above for making cobalt-resistant Microorganisms by transforming at least one of those characterized above Plasmids, as well as the microorganisms that a plasmid transformed into them with a gene that codes for cobalt resistance are also included the invention.
Es wurde festgestellt, daß die Eigenschaften des resistenten Klebsiella-StammesKobalt aus Kobaltionen enthaltenden Lösungen aus zufällen, auch bei den Mikroorganismen der Erfindung auftritt, in die mindestens eines der Plasmide der Erfindung transformiert wurde, und die damit ihrerseits resistent gegen Kobalt gemacht wurden.It was found that the properties of the resistant Klebsiella strain Cobalt from solutions containing cobalt ions from coincidences, including microorganisms of the invention occurs into which at least one of the plasmids of the invention is transformed and which in turn were made resistant to cobalt.
Die Eigenschaft der Kobalt-resistenten Mikroorganismen, das Kobalt aus der sie umgebenden Lösung auszufällen, eröffnet in einem weiteren Aspekt der Erfindung einen neuen Weg zur Abtrennung von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen. Ein gegen Kobalt resistenter Mikroorganismus (entweder der resistente Klebsiella-Stamm oder ein Mikroorganismus, in den mindestens eines der Plasmide der Erfindung transformiert wurde) wird in eine Kobaltionen enthaltende Lösung eingebracht. Die Kobaltionen fallen in der Folge davon in Form von Kobaltphosphat aus der Lösung aus und können, beispielsweise durch Filtration, abgetrennt werden.The property of cobalt-resistant microorganisms, cobalt to precipitate out of the solution surrounding them opens up a further aspect of the Invention of a new way of separating cobalt from solutions containing cobalt. A cobalt-resistant microorganism (either the resistant strain of Klebsiella or a microorganism into which at least one of the plasmids of the invention is transformed was) is in introduced a solution containing cobalt ions. The cobalt ions then fall out of the solution in the form of cobalt phosphate and can be separated off, for example by filtration.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus, der ein Plasmid enthält, das für Kobalt-Resistenz kodiert, in die Lösung einbringt, wobei das Kobalt ausfällt, und die ausgefällte Kobaltverbindung aus der Lösung abtrennt. Für dieses Verfahren kann sowohl der resistente Klebsiella-Stamm, als auch ein anderer Mikroorganismus der Erfindung verwendet werden, in den mindestens eines der Plasmide der Erfindung, die ein Gen enthalten, das für Kobalt-Resistenz kodiert, transformiert wurde.The invention therefore also relates to a method for separating of cobalt from solutions containing cobalt, which is characterized in that one a microorganism that contains a plasmid that codes for cobalt resistance, introduced into the solution, precipitating the cobalt, and the precipitated cobalt compound separates from the solution. Both the resistant Klebsiella strain, as well as another microorganism of the invention can be used in the at least one of the plasmids of the invention containing a gene for cobalt resistance encoded, transformed.
Als 'tkobalthaltige Lösungen" sind dabei alle Lösungen zu verstehen, aus denen eine Kobaltgewinnung von technischem Interesse sein kann. Insbesondere kommen dabei natürlich Lösungen in Frage, die Kobalt nur in geringer Konzentration -gegebenenfalls neben anderen Metallen in größerer Menge -enthalten, so daß die Gewinnung mit herkömmlichen Verfahren unwirtschaftlich ist. Beispiele für derartige Lösungen sind die Abwässer von Kobalt-verarbeitenden Betrieben, beispielsweise-der Glasindustrie, sowie Lösungen, die beim Auslaugen von Erzen erhalten werden, die nur geringen Kobaltgehalt aufweisen.All solutions are to be understood as 'cobalt-containing solutions' from which cobalt extraction may be of technical interest. In particular Of course, solutions that contain cobalt only in low concentrations are possible -possibly in addition to other metals in larger quantities -contained, so that the Extraction using conventional methods is uneconomical. Examples of such Solutions are the wastewater from cobalt-processing plants, for example-der Glass industry, as well as solutions obtained by leaching ores that only have a low cobalt content.
In diesem Verfahren der Erfindung wird der Kobalt-resistente Mikroorganismus in die kobalthaltige Lösung, beispielsweise das kobalthaltige Abwasser einer Glasfäbrik, eingebracht. Die Kobaltionen werden als dreiwertiges Kobaltphosphat aus der Lösung selektiv ausgefällt. Das Kobaltphosphat kann beispielsweise durch Filtrieren abgetrennt und zur Gewinnung des Metalls aufgearbeitet oder einer sonstigen Verwendung zugeführt werden. Die Ausfällung des Kobalts aus den kobalthaltigen Lösungen kann bei einem pH-Wert von etwa 3,50 bis 8,50, vorzugsweise 6,50 bis 7,50 durchgeführt werden. Die Temperatur ist nicht besonders kritisch. Bevorzugt ist eine Temperatur, bei der der verwendete Mikroorganismus gute Wachstumsbedingungen hat, d.h. eine Temperatur von etwa 15 bis 400C, Die Kobaltkonzentration der Lösung, aus der das Kobalt durch einen Kobalt-resistenten Mikroorganismus ausgefällt werden soll, richtet sich nach der Lebensfähigkeit des Mikroorganismus. Sie kann üblicherweise mindestens etwa 4 mmol/l betragen.In this method of the invention, the cobalt-resistant microorganism is used in the cobalt-containing solution, for example the cobalt-containing wastewater from a glass factory, brought in. The cobalt ions are released from the solution as trivalent cobalt phosphate selectively failed. The cobalt phosphate can be separated off, for example, by filtration and reconditioned for the extraction of the metal or put to another use will. The precipitation of the cobalt from the cobalt-containing solutions can take place at a pH value from about 3.50 to 8.50, preferably 6.50 to 7.50. The temperature is not particularly critical. Preferred is a temperature at which the used Microorganism has good growth conditions, i.e. a temperature of around 15 up to 400C, the cobalt concentration of the solution that makes up the cobalt through a cobalt-resistant The microorganism to be precipitated depends on the viability of the Microorganism. It can usually be at least about 4 mmol / l.
Innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen ist aus bestimmten Gründen, die nachstehend erläutert werden, die Verwendung bestimmter Mikroorganismen stärker bevorzugt als die Verwendung von anderen Mikroorganismen. Beispielsweise ist die Verwendung des resistenten Klebsiella-Stammes wirtschaftlich nicht besonders günstig, da sich Bakterien der Gattung Klebsiella nicht durch besonders hervorragende Lebens- und Wachstumsfähigkeit in technischen Lösungen auszeichnen, die Schwermetallionen enthalten. Bevorzugt ist aus diesem Grund die Verwendung eines Mikroorganismus, dessen gute Wachstumsfähigkeit in derartigen Lösungen, beispielsweise in Abwässern, bekannt ist. Spezielle Beispiele für solche Mikroorganismen sind nicht pathogene Stämme der Gattung Pseudomonas.Within the method according to the invention for separating cobalt from solutions containing cobalt is for certain reasons discussed below the use of certain microorganisms are more preferred than the use from other microorganisms. For example, the use of the resistant Klebsiella strain economically not particularly favorable, since bacteria of the genus Klebsiella not by particularly excellent viability and growth ability in technical Identify solutions that contain heavy metal ions. Is preferred from this Reason the use of a microorganism whose good growth ability in such Solutions, for example in wastewater, is known. Specific examples of such Microorganisms are non-pathogenic strains of the genus Pseudomonas.
Bevorzugt ist aus diesem Grunde demnach eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen, bei dem ein unter dem vorstehend genannten Gesichtspunkt geeigneter Mikroorganismus verwendet wird, in den mindestens eines der Plasmide der Erfindung mit dem Kobalt-Resistenzgen transformiert wurde.For this reason, an embodiment of the invention is therefore preferred Process for the separation of cobalt from solutions containing cobalt, in which an under microorganism suitable for the aforementioned point of view is used, transformed into at least one of the plasmids of the invention with the cobalt resistance gene became.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Abtrennen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen kann in einer weiteren Ausführungsform noch weiter ausgestaltet und unter folgendem Gesichtspunkt verbessert werden.The inventive method for separating cobalt from cobalt-containing Solutions can be further developed in a further embodiment and under can be improved from the following point of view.
Die beiden Plasmide mit dem Gen, das für Kobalt-Resistenz kodiert, die aus dem resistenten Klebsiella-Stamm isoliert wurden, kommen nur in verhältnismäßig geringer Kopienzahl in den Mikroorganismen vor. Das große Plasmid hat eine Kopienzahl von etwa 2 t das das kleine eine von etwa 4 bis 5. Infolge dieser niedrigen Kopien zahl ist die Kapazität der Mikroorganismen, die diese Plasmide enthalten, zur Ausfällung von Kobalt nicht besonders groß. Obwohl ihre Verwendung zur Abtrennung. von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen möglich ist urid Kobalt damit aus Lösungen gewonnen werden kann, deren Aufarbeitung zur Abtrennung des Kobalts mit herkömmlichen Verfahren nicht lohnend ist, wäre vom wirtschaftlichen Standpunkt doch eine gröBere Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen bei der Abtrennung von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen wünschenswert.The two plasmids with the gene that codes for cobalt resistance, those isolated from the resistant Klebsiella strain come only in proportion low copy number in the microorganisms. The large plasmid has a copy number from about 2 t that the small one from about 4 to 5. As a result of these low copies number is the capacity of the microorganisms that contain these plasmids to precipitate of cobalt not particularly large. Although their use for separation. of cobalt possible from solutions containing cobalt, urid cobalt is thus obtained from solutions can be worked up to remove the cobalt using conventional methods is not worthwhile, from an economic point of view, a greater efficiency would be of the microorganisms in the separation of cobalt from cobalt-containing solutions is desirable.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren, bei dem das Gen, das für Kobalt-Resistenz kodiert, aus den vorstehend beschriebenen Plasmiden der Erfindung entnommen und in ein anderes, geeignetes Plasmid kloniert wird, und dieses dabei erhaltene, neue Plasmid in einen geeigneten Mikroorganismus. transformiert wird.The invention therefore also provides a method in which the Gene coding for cobalt resistance from the plasmids described above of the invention and cloned into another suitable plasmid, and this new plasmid obtained in this way into a suitable microorganism. transformed will.
In dieser Ausführungsfqrm der Erfindung wird eines der Plasmide, die das für Kobalt-Resistenz kodierende Gen enthalten, mit einem Restriktionsenzym in geeigneter Weise geschnitten und das Fragment, das das gewünschte Gen aufweist, mit in der Gentechnologie üblichen Methoden gewonnen. Sodann wird das Fragment in ein geeignetes anderes Plasmid kloniert, wobei wiederum die. in der Gentechnologie für diesen Zweck üblichen Methoden angewendet werden.In this embodiment of the invention, one of the plasmids that contain the gene coding for cobalt resistance, with a restriction enzyme in cut in a suitable manner and the fragment which has the desired gene, obtained using methods commonly used in genetic engineering. Then the fragment in cloned another suitable plasmid, again using the. in genetic engineering methods customary for this purpose can be used.
In dieser Ausfthrungsform der Erfindung stammt das Gen, das für Kobalt-Resigtenz kodiert, aus einem der beiden Plasmide der Erfindung, die aus dem resistenten Xlebsiella-Stamm gewonnen wurden. Wegen seiner geringeren Größe wird aus praktischen Gründen vorzugsweise das kleine Plasmid verwendet.In this embodiment of the invention, the gene for cobalt resistance is derived encoded from one of the two plasmids of the invention derived from the resistant Xlebsiella strain were won. Because of its smaller size, it becomes practical establish preferably the small plasmid is used.
In einer Ausführungsform wird das Plasmid in einem Verdauungspuffer gelöst und mit Bam HI verdaut. Dieses Restriktionsenzym schneidet das kleine Plasmid nur an einer Stelle, d.h. der Plasmidring wird geöffnet und das Plasmid erhält eine lineare Form. Danach wird das geöffnete Plasmid in Legierungspuffer mit einem geeigneten anderen Plasmid legiert, das ebenfalls mit Bam HI verdaut wurde. In einer anderen Ausführungsform kann das kleine Plasmid auch mit Pst I geschnitten werden. Dabei entstehen zwei Fragmente, die für die Klonierung in das gewünschte andere Plasmid verwendet werden. In analoger Weise kann auch das große Plasmid mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut werden und die erhaltenen Fragmente in ein geeignetes anderes Plasmid kloniert werden.In one embodiment, the plasmid is in a digestion buffer dissolved and digested with Bam HI. This restriction enzyme cuts the small plasmid only in one place, i.e. the plasmid ring is opened and the plasmid receives a linear shape. Then the opened plasmid is in alloy buffer with a suitable alloyed with another plasmid, which was also digested with Bam HI. In another In the embodiment, the small plasmid can also be cut with Pst I. Included two fragments arise that are necessary for cloning into the desired other plasmid be used. In an analogous manner, the large plasmid can also be treated with suitable restriction enzymes are digested and the fragments obtained are cloned into another suitable plasmid will.
In den beiden zuletzt genannten Ausführungsformen, in denen ein Gemisch von Klonierungsprodukten erhalten wird, werden diese in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert.In the last two embodiments mentioned, in which a mixture is obtained from cloning products, these are converted into a suitable microorganism transformed.
Die Kobalt-resistenten Transformanten werden sodann nach in der Gen-Technologie üblichen Verfahren selektioniert.The cobalt-resistant transformants are then used in gene technology usual procedures selected.
Als "geeignetes anderes Plasmid" wird ein Plasmid ausgewählt, das Eigenschaften aufweist, die es als besonders geeignet für die erfindungsgemäße Bestimmung erscheinen lassen, d.h., daß nach der Transformierung des neuen, klonierten Plasmids in einen Mikroorganismus eine hohe Kapazität dieses Mikroorganismus zum Ausfällen von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen erreicht wird. Im Hinblick auf dieses Ziel soll das andere Plasmid insbesondere ein Plasmid mit hoher Kopienzahl sein. Dies bedeutet, daß das Plasmid in den Mikroorganismus-Zellen, in die es transfqrmiert wird, in hoher Kopienzahl vorliegt. Eine höhere Kopienzahl des Plasmids führt nämlich zu einer höheren Kapazität des Mikroorganismus bei der Ausfällung des Kobalts. Dies ist ein Hinweis darauf, daß das Plasmi-d mit dem Kobalt-Resistenzgen eine Rolle bei der Aus- fällung des Kobalts aus den kobalthaltigen Lösungen spielt.A plasmid is selected as "suitable other plasmid" which Has properties that make it particularly suitable for the determination according to the invention appear, i.e. that after transforming the new, cloned plasmid in a microorganism a high capacity of this microorganism to precipitate of cobalt is achieved from solutions containing cobalt. With that in mind in particular, the other plasmid should be a high copy number plasmid. this means that the plasmid is present in the microorganism cells into which it is transformed is available in large numbers of copies. A higher copy number of the plasmid leads namely to a higher capacity of the microorganism in the precipitation of the cobalt. this is an indication that the plasmi-d with the cobalt resistance gene plays a role at the exit precipitation of the cobalt from the cobalt-containing solutions plays.
Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl ist beispielsweise das bekannte pBR 322.A high copy number plasmid is, for example, the well-known pBR 322.
Eine weitere günstige Eigenschaft des anderen Plasmids besteht darin, daß es selbst transferierbar ist. Dies bedeutet, daß das Plasmid, in das das Fragment mit dem für Kobalt-Resistenz kodierenden Gen kloniert wird, in der Lage sein soll, aus einer Zelle heraus und in eine andere Zelle einzuwandern.Another beneficial property of the other plasmid is that that it is itself transferable. This means that the plasmid in which the fragment is cloned with the gene coding for cobalt resistance, should be able to to migrate out of one cell and into another cell.
Ein spezielles Beispiel für ein Plasmid, das die vorstehend genannten Eigenschaften aufweist und somit zur Klonierung des Fragments mit dem Kobalt-Resistenz erzeugenden Gen besonders geeignet ist, ist das Plasmid RP 4. Ebenfalls geeignet sind dessen Derivate; vgl. M. Bagdasarian u. Mitarb., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, K.N. Timmis und A. Puhler, Herausgeber1 Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979.A specific example of a plasmid containing the above Has properties and thus for cloning the fragment with the cobalt resistance The gene generating the gene is particularly suitable, the plasmid RP 4 is also suitable are its derivatives; See M. Bagdasarian et al, Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, K.N. Timmis and A. Puhler, editors1 Elsevier / North-Holland Biomedical Press 1979.
In dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird-sodann das "andere Plasmid", das nun das für Kobalt-Resistenz kodierende Gen enthält, in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert. Hierbei ist unter "geeigneter Mikroorganismus" wiederum ein Mikroorganismus zu verstehen, der aufgrund seiner Eigenschaften für den in dieser Ausführungsform der Erfindung angestrebten Zweck besonders geeignet ist. Bevorzugt verwendete Mikroorganismen sollen demnach, wie bereits erwähnt, in der Lage sein, in den kobalthaltigen technischen Lösungen, aus denen die Ausfällung und Gewinnung von Kobalt beabsichtigt ist, lebens- und vermehrungsfähig zu sein unter der Voraussetzung, daß sie mindestens ein Plasmid mit einem für Kobalt-Resistenz kodierenden Gen enthalten. Ein spezielles Beispiel für Mikroorganismen, die diese Anforderungen erfüllen,sind nicht-pathogene Stämme der Gattung Pseudomonas.In this preferred embodiment of the invention, then that "Another plasmid", which now contains the gene coding for cobalt resistance, into one transformed into a suitable microorganism. Here is under "suitable microorganism" in turn to understand a microorganism, which due to its properties for particularly suitable for the purpose sought in this embodiment of the invention is. Preferably used microorganisms should therefore, as already mentioned, in be able to work in the cobalt-containing technical solutions that make up the precipitation and extraction of cobalt is intended to be viable and capable of reproduction provided that they have at least one plasmid with one for cobalt resistance coding gene included. A specific example of microorganisms that this Meet requirements are non-pathogenic strains of the genus Pseudomonas.
Diese transformierten Mikroorganismen können in der vorstehend beschriebenen Weise zur Abtrennung von Kobalt aus kobalthaltigen Lösungen verwendet werden.These transformed microorganisms can be used in the above-described Way to be used for the separation of cobalt from cobalt-containing solutions.
Die beiliegende Figur zeigt die Ergebnisse der Gel-Elektrophorese der Verdauungsprodukte von Gemischen des großen und des kleinen Plasmids der Erfindung mit verschiedenen Restriktionsenzymen. Die auf der Figur gezeigten Auftragsschächte enthalten von rechts nach links: Der erste Auftragsschacht eine ungeschnittene Probe; die obere Bande entspricht dem großen und die untere, etwa in mittlerer Höhe der Figur befindliche Bande entspricht dem kleinen Plasmid, in der supercoiled Form.The accompanying figure shows the results of gel electrophoresis the digestion products of mixtures of the large and small plasmids of the invention with various restriction enzymes. The application chutes shown on the figure contain from right to left: the first application chute an uncut sample; the upper band corresponds to the large one and the lower one, roughly in the middle of the The band in the figure corresponds to the small plasmid, in the supercoiled form.
Der zweite und dritte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte mit Eco RI; es wird nur das große Plasmid geschnitten.The second and third jobs dig up the bands of digestive products with Eco RI; only the large plasmid is cut.
Der vierte und fünfte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte von T5-DNA, verdaut mit Hind III bzw. von M13-DNA, verdaut mit Hae III als Molekulargewichtsmarker.The fourth and fifth jobs get rid of the digestive product bands of T5-DNA, digested with Hind III or of M13-DNA, digested with Hae III as molecular weight markers.
Der sechste und siebte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte mit Hind III; es wird nur das große Plasmid geschnitten.The sixth and seventh order chutes the bands of digestive products with Hind III; only the large plasmid is cut.
Der achte und neunte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte mit Pst I; es wird sowohl das große als auch das kleine Plasmid geschnitten.The eighth and ninth jobs chute the bands of digestive products with Pst I; both the large and the small plasmid are cut.
Der zehnte Auftragsschacht erneut den gleichen Molekulargewichtsmarker wie das vierte Röhrchen.The tenth hopper again uses the same molecular weight marker like the fourth tube.
Der elfte und zwölfte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte mit Bam HI; es wird nur das kleine Plasmid einmal geschnitten.The eleventh and twelfth jobs get rid of the gangs of digestive products with Bam HI; only the small plasmid is cut once.
Der dreizehnte und vierzehnte Auftrags schacht die Banden der Verdauungsprodukte mit Sal I; es wird nur das große Plasmid geschnitten.The thirteenth and fourteenth orders clear the bands of digestive products with Sal I; only the large plasmid is cut.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.
Beispiel 1 Isolierung und Gewinnung der Plasmide Der resistente Klebsiella-Stamm wird in LB-Medium (Luria-Brühe; Zusammensetzung: 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 10 g Trypton in 1 Liter Wasser) gezüchtet. Sodann werden 100 ml der Zellkultur 5 Minuten bei einer Temperatur von OOC und 5000 U.p.M. zur Trennung der Zellen von der Kulturlösung zentrifugiert. Nach dem Abtrennen werden die Zellen bei Raumtemperatur in 3 ml einer 25prozentigen Sucroselösung in 0,05 mol/l Tris/HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die erhaltene Lösung wird hierauf mit 0,3 ml Lysozym-Lösung versetzt (10 mg/ml in 0,25 mol/l Tris/HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5). Die Lösung wird nun unter gelegentlichem leichten Schütteln 5 Minuten auf Eis inkubiert. Sodann wird 1,2 mi 0,25 mol/l EDTA vom pH-Wert 8,0 zugesetzt und erneut 5 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wird die Lösung mit 4,8 ml Triton-Lösung (nichtionisches Detergens) versetzt, die folgende Zusammensetzung aufweist: 10 ml 10 % Triton X-100, 50 ml 0,25 mol/l EDTA vom pH-Wert 8,0, 10 ml 1 mol/l Tris/HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 und 135 ml Wasser. Das erhaltene Gemisch wird nun 30 Minuten bei 17 000 U.p.M. zentrifugiert. Der überstand wird durch Abgießen in einen Zylinder abdekantiert, bis das sehr viskose Material erreicht ist. Dieses verbleibt in dem Gefäß. Anschließend wird die überstehende Lösung pro ml mit 1 g kristallines Cäsiumchlorid und 0,1 ml Äthidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird erneut 20 Stunden bei 55 000 U.p.M. zentrifugiert. Die in dem Cäsiumchloridgradienten je nach ihrer molekularen Dichte unterschiedlich gewanderten Banden werden durch Bestrahlung des Rohrs mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht. Die untere Bande enthält die supercoiled DNA. Sie kann mit einer Injektionsnadel seitlich aus dem Rohr entnommen werden. Example 1 Isolation and recovery of the plasmids The resistant Klebsiella strain is in LB medium (Luria broth; composition: 5 g NaCl, 5 g yeast extract and 10 g tryptone in 1 liter of water). Then 100 ml of the cell culture are 5 minutes at a temperature of OOC and 5000 r.p.m. to separate the cells from the culture solution centrifuged. After separation, the cells are in 3 ml of a at room temperature 25 percent sucrose solution dissolved in 0.05 mol / l Tris / HCl buffer with a pH of 7.5. The solution obtained is then mixed with 0.3 ml of lysozyme solution (10 mg / ml in 0.25 mol / l Tris / HCl buffer with a pH of 7.5). The solution is now taking the occasional Incubated on ice for 5 minutes gently shaking. Then 1.2 ml 0.25 mol / l EDTA of pH 8.0 added and incubated again for 5 minutes on ice. After that, the Solution with 4.8 ml of Triton solution (nonionic detergent) added, the following Composition comprises: 10 ml 10% Triton X-100, 50 ml 0.25 mol / l EDTA of the pH value 8.0, 10 ml of 1 mol / l Tris / HCl buffer with a pH of 8.0 and 135 ml of water. The received Mixture is now 30 minutes at 17,000 r.p.m. centrifuged. The supernatant will decanted by pouring into a cylinder until it reaches the very viscous material is. This remains in the vessel. Then the supernatant solution is per ml with 1 g crystalline cesium chloride and 0.1 ml ethidium bromide solution (10 mg / ml) offset. The resulting mixture is again heated to 55,000 r.p.m. for 20 hours. centrifuged. Those in the cesium chloride gradient differ depending on their molecular density Migrated bands are created by irradiating the tube with long-wave UV light made visible. The lower band contains the supercoiled DNA. You can with a The injection needle can be removed from the side of the tube.
Die entnommene Fraktion (Bande) wird hierauf dreimal mit dem gleichen Volumen Butanol, das mit Wasser gesättigt ist, leicht geschüttelt. Die wäßrige Phase wird anschließend gegen Tris/EDTA-Puffer vom pH-Wert 6,7 dialysiert. Sodann wird die Lösung einmal mit dem gleichen Volumen einer gepufferten Phenollösung (Tris/EDTA vom pH-Wert 7,6) behandelt und anschließenderneut gegen den gleichen Puffer dialysiert.The removed fraction (band) is then three times with the same Volume of butanol saturated with water, gently shaken. The aqueous phase is then dialyzed against Tris / EDTA buffer of pH 6.7. Then will the solution once with the same volume of a buffered phenol solution (Tris / EDTA of pH 7.6) and then dialyzed again against the same buffer.
Nach diesen Reinigungsstufen werden die Plasmide erhalten, die durch Gel-Elektrophorese oder in einem Sucrose-Gradienten aufgetrennt werden können. Dabei werden 0,05 mg des großen und 0,02 mg des kleinen Plasmids erhalten. Die Reinheit ist >95 %.After these purification steps, the plasmids are obtained which are caused by Gel electrophoresis or can be separated in a sucrose gradient. Included 0.05 mg of the large and 0.02 mg of the small plasmid are obtained. The purity is> 95%.
Beispiel 2 Transformierung der Plasmide in E. coli Die Transformierung erfolgt nach einer Modifizierung des Verfahrens von Cohen und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sci. Example 2 Transformation of the plasmids into E. coli The transformation is after a modification of the procedure of Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 69 (1972), S. 2110 bis 2114.USA 69 (1972), pp. 2110-2114.
Transformierbare, mit Calcium behandelte Zellen werden durch Züchten von E. coli in LB-Medium bei 370C bis zu einer Zelldichte von 6 x 108 Zellen/ml (optische Dichte 650 = 0;6) hergestellt. Die Kultur wird 10 Minuten bei OOC und 8000 U.p.M. zentrifugiert. Die Zellen werden von der überstehenden Lösung getrennt, einmal mit 0,5 Volumen 0,01 moi/l Kochsalzlösung gewaschen und danach in 0,5 Volumen einer 0,03 mol/l Calciumchloridlösung suspendiert. Die erhaltene Lösung wird 20 Minuten bei OOC inkubiert. Danach werden die Zellen durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 8000 U.p.M. und einer Temperatur von OOC von der Lösung abgetrennt und erneut in 0,1 Volumen 0,03 mol/l Calciumchloridlösung suspendiert. Diese Lösung wird zur Transformation verwendet.Transformable, calcium-treated cells are made by culture of E. coli in LB medium at 370C up to a cell density of 6 × 10 8 cells / ml (optical density 650 = 0; 6). The culture is 10 minutes at OOC and 8000 r.p.m. centrifuged. The cells are separated from the supernatant solution, Washed once with 0.5 volume of 0.01 mol / l saline solution and then in 0.5 volume suspended in a 0.03 mol / l calcium chloride solution. The resulting solution turns 20 Incubated minutes at OOC. Thereafter, the cells are centrifuged for 10 minutes at 8000 r.p.m. and a temperature of OOC from the solution and again suspended in 0.1 volume of 0.03 mol / l calcium chloride solution. This solution becomes the Transformation used.
Das Transformationsgemisch mit einem Volumen von 0,3 ml wird durch Vermischen von 1,0 ßg DNA (Plasmide) in 0,03 mol/l Calciumchloridiösung und 0,2 ml transformierbarer, mit Calcium behandelter Zellen erhalten. Das Gemisch wird 60 Minuten bei OOC inkubiert und danach 5 Minuten auf 420C erwärmt. Anschließend wird das Transformationsgemisch mit dem 10-fachen Volumen LB-Medium verdünnt und 3 Stunden bei 370C inkubiert.The transformation mixture with a volume of 0.3 ml is through Mix 1.0 ßg DNA (plasmids) in 0.03 mol / l calcium chloride solution and 0.2 ml of transformable calcium treated cells are obtained. The mixture will Incubated for 60 minutes at OOC and then warmed to 420C for 5 minutes. Afterward the transformation mixture is diluted with 10 times the volume of LB medium and Incubated for 3 hours at 370C.
Danach werden die Proben auf ein Agar-Medium mit oder ohne selektiven Druck aufgebracht. Die Platten werden mindestens 18 Stunden bei 37"C inkubiert. Es werden Kobalt-resistente E. coli-Kulturen erhalten, die in einer Kulturlösung mit einem Gehalt von 4 mmol/l Kobaltchlorid gut lebens- und vermehrungsfähig sind.Afterwards the samples are selective on an agar medium with or without Pressure applied. The plates are incubated at 37 ° C for at least 18 hours. Cobalt-resistant E. coli cultures are obtained which are in a culture solution with a content of 4 mmol / l cobalt chloride are viable and capable of reproduction.
In einem weiteren Versuch wird nach dem vorstehend angegebenen Verfahren nur das kleine Plasmid, das durch Gel-Elektrophorese von dem großen Plasmid getrennt wurde, in die transformierbaren E. coli-Zellen transformiert. Es werden ebenfalls Kulturen erhalten, die in Gegenwart von 4 mmol/l Kobaltchlorid normal lebens- und vermehrungsfähig sind.In a further experiment the procedure given above is used only the small plasmid separated from the large plasmid by gel electrophoresis was transformed into the transformable E. coli cells. There will be too Cultures are obtained which are normal for life and in the presence of 4 mmol / l cobalt chloride are capable of multiplying.
Beispiel 3 Klonierung des BAM HI-Verdaus des kleines Plasmids in mit BAM HI verdautes Plasmid pBR 322 Die DNA sowohl des kleinen Plasmids als auch des Plasmids pBR 322 werden unter den folgenden Bedingungen mit den Restriktionsenzym Bam HI verdaut DNA 10 iil (DNA-Konzentration: 0,1 ßg/ml) 10-fach konzentrierter Bam HI-Puffer * 5 Wl H2 0 33 Rl Bam HI Enzym 2 Al (Aktivität: 0,5 U/l) * Bam HI-Puffer enthält: Tris/HCl 10 mmol/l MgCl2 6 mmol/l NaCl 100 mmol/l B-Mercaptoäthanol 6 mmol/l Rinder-Serumalbumin 200 mmol/l pH-Wert 7,5 Jeweils 0,5 ßg des Bam HI-Verdaus des kleinen Plasmids und von pBR 322. werden mit 0,5 U T4-Ligase in Legierungspuffer aus 20 mmol/l Tris/HCL, 6 mmol/l .!gC12, 6 mmol/l ßiMercaptoäthanol und 1 mmol/l Adenosintriphosphat, pH-Wert 7,5, legiert. Das erhaltene Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Example 3 Cloning of the BAM HI digest of the small plasmid in plasmid pBR 322 digested with BAM HI. The DNA of both the small plasmid and of the plasmid pBR 322 are reacted with the restriction enzyme under the following conditions Bam HI digests DNA 10 iil (DNA concentration: 0.1 μg / ml) 10-fold more concentrated Bam HI buffer * 5 Wl H2 0 33 Rl Bam HI enzyme 2 Al (activity: 0.5 U / l) * Bam HI buffer contains: Tris / HCl 10 mmol / l MgCl2 6 mmol / l NaCl 100 mmol / l B-mercaptoethanol 6 mmol / l bovine serum albumin 200 mmol / l pH value 7.5 0.5 μg each of the Bam HI digestion of the small plasmid and of pBR 322. are mixed with 0.5 U of T4 ligase in alloying buffer from 20 mmol / l Tris / HCl, 6 mmol / l.! gC12, 6 mmol / l ßi-mercaptoethanol and 1 mmol / l Adenosine triphosphate, pH 7.5, alloyed. The resulting mixture is 2 hours incubated at room temperature.
Die Transformation der legierten DNA in E. coli wird nach dem von S.N. Cohen a.a.O. beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Transformanten werden in Agarplatten mit einem Gehalt von etwa 2,5 mmol/l Coli2 selektioniert.The transformation of the alloyed DNA into E. coli is carried out according to the S.N. Cohen op cit. The transformants obtained are selected in agar plates with a content of about 2.5 mmol / l Coli2.
Die Kobalt-resistenten Kolonien werden entnommen und bei 40C aufbewahrt.The cobalt-resistant colonies are removed and stored at 40C.
Beispiel 4 Abtrennung von Kobalt aus einer kobalthaltigen Lösung Es wird eine Lösung hergestellt, die neben den Komponenten des LB-Mediums folgende Metallsalze enthält: Com12 4 mmol/l FeCl2 1,5 mmol/l NiCl2 1,5 mmol/l In 1 1 dieser Lösung wird bei einer Temperatur von 370C eine gemäß Beispiel 2 hergestellte E. coli-Transformante eingebracht und 14 Stunden wachsen gelassen. Die Zelldichte beträgt danach etwa 4 x 109 Zellen/ml. Example 4 Separation of cobalt from a solution containing cobalt A solution is prepared which, in addition to the components of the LB medium, includes the following Metal salts contains: Com12 4 mmol / l FeCl2 1.5 mmol / l NiCl2 1.5 mmol / l in 1 1 of these Solution is at a temperature of 370C an E. coli transformant introduced and allowed to grow for 14 hours. The cell density amounts to then about 4 x 109 cells / ml.
Im Verlauf dieser Zeit scheidet sich rosa Kobaltphosphat aus der Lösung aus, das zusammen mit den Zellen von der überstehenden Lösung abgetrennt wird. Die Analyse des klaren überstandes zeigt, daß der Kobaltgehalt auf unter 0,2 mmol/l abgesunken ist.During this time, pink cobalt phosphate separates out of the solution which is separated from the supernatant solution together with the cells. the Analysis of the clear supernatant shows that the cobalt content is below 0.2 mmol / l has sunk.
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