DE3115515A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-glutamisaeure - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-glutamisaeure

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DE3115515A1 DE19813115515 DE3115515A DE3115515A1 DE 3115515 A1 DE3115515 A1 DE 3115515A1 DE 19813115515 DE19813115515 DE 19813115515 DE 3115515 A DE3115515 A DE 3115515A DE 3115515 A1 DE3115515 A1 DE 3115515A1
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Description

311551b
L-Glutaminsäure bildende bakterielle Wildstämme sind insbesondere aus den Genera Brevibacterium und Corynebacterium bekannt. Um die L-Glutaminsäure-Produktivität dieser bekannten Wildstämme zu erhöhen, wird eine künstliche Mutation durchgeführt. Beispiele für derartige künstliche Mutanten sind gegen S-2-Aminoäthylcystein resistente Mutanten von Brevibacterium (JP-OS 126 877/1975), gegen Fluorcitronensäure, Ketomalonsäure, a-Araino-ß-hydroxyvaleriansäufe, DL-Threoninhydroxamat, 2-Amino-3-phosphopropionsäure oder 5-Aminolävulinsäure resistente Mutanten von Brevibacterium und Corynebacterium (JP-OS 89 045/1979), gegen Lysozym empfindliche Mutanten von Brevibacterium und Corynebactorium (JP-OS 122 794/1979), Mutanten von Brevibacterium und Corynebacterium mit reduzierter Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität (JP-OS 21 762/1980), gegen Glutaminsäure oder Glutaminsäure-Analoge resistente Mutanten von Brevibacterium oder Corynebacterium (JP-OS 21 763/1980) und gegen 2,6-Pyridindicarbonsäure resistente Mutanten von Brevibacterium (JP-OS 21 764/1980).
Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, die Ausbeuten an L-Glutaminsäure durch künstliche Mutation zu erhöhen. Es besteht daher ein Bedürfnis für neue Mikroorganismen, die die Produktion von L-Glutaminsäure in hoher Ausbeute ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Glutaminsäure in hoher Ausbeute.
Jl I OO i Q
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) in einem Kulturmedium einen L-Glutaminsaure bildenden Mikroorganismus züchtet, der dadurch erhältlich ist, daß
■ man in einen Empfänger-Mikroorganismenstamm des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium ein Hybridplasmid einführt, in das ein DNA-Fragment insertiert worden ist, das aus einem L-Glutaminsäure bildenden Bakterium■des · Genus Brevibacterium und Corynebacterium erhalten wurde, und . ·
b) die in dem Kulturmedium angereicherte L-Glutaminsäure gewinnt.
Der zum Aufbau des erfindungsgemäßen L-Glutaminsäure-Bildnors verwendete DNA-Donor ist ein L-Glutaminsäure bildendes Bakterium des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium. Beispiele für Wildstämme derartiger L-Glutaminsäure bildender Bakterien sind:
Brevibacterium divaricatum ■ ATCC 14020 Brevibacterium flavum ■ ATCC 13826 Brevibacterium immariophilum ' "' ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825·
■ Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
• Corynebacterium acetoaeidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Cornyebacterium callunae · ATCC 15991
■Corynebacterium lilium · ATCC 15990 Cornyebacterium melassecola . ATCC 17965
Corynebacterium glutamicum ■ ' ATCC 13032
Künstliche Mutanten, die sich von diesen Wildstämmen ableiten, können selbstverständlich als DNA-Donoren verwendet
werden, wenn sie zur Bildung von L-Glutaminsäure befähigt sind. Bessere Ergebnisse werden dann erzielt, wenn man ein Bakterium mit höherer L-Glutaminsäure-Produktivität als DNA-Donor verwendet.
Die Empfängerorganismen sind Wild- oder Mutantenstämme des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium. Vorzugsweise verwendet man eine L-Glutaminsäure benötigende Mutante, um die zur Bildung von L-Glutaminsäure transformierten Hybridklone zu selektieren. Wild- oder Mutantenstämme mit höherer L-Glutaminsäure-Produktivität sind als Empfänger bevorzugt. Wenn eine L-Glutaminsäure benötigende Mutante als Empfängerorganismus verwendet wird, leitet sich diese Mutante vorzugsweise von einem Stamm mit höherer L-Glutaminsäure-Produktivität ab.
Um die L-Glutaminsäure-Produktivität des Empfängerorganismus oder des Ausgangsstamms der L-Glutaminsäure benötigenden Mutante zu erhöhen, kann dem L-Glutaminsäure bildenden Bakterium durch Mutation ein Nährstoffbedarf, z.B. für L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Prolin, L-Arginin, L-Methionin, L-Histidin, L-Leucin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Alanin, L-Serin, Glycin, Xanthin, Hypoxanthin, Adenin oder Guanin, verliehen werden. Die L-Glutaminsäure-Produktivität kann auch dadurch erhöht werden, daß man dem L-Glutaminsäure bildenden Bakterium Empfindlichkeit gegen erhöhto Temperatur oder PolyoxysorbitnnmonopalmitaI oder Resistenz gegen Monofluoressigsäure, Ketomalonsäure, Guanidin, Sulfaguanidin, 2-Thiazolalanin oder Fluorphenylalanin verleiht.
Die chromosomale DNA wird aus dem DNA-Donor auf bekannte· Weise extrahiert und mit einer Restriktionsendonuclease behandelt {Biochem. Biophys. Acta, Bd. 383: S. 457 (1975)). Es können verschiedene Arten von Restriktionsendonucleasen verwendet werden, wenn der Abbau partiell erfolgt. Erfindungs-
Ol lüü I J
gemäß sind jedoch Hind III, Bei I, Xba I und Xma I für den Abbau besonders bevorzugt.
Als Vektor-DNA kann eine aus dem L-Glutaminsäure bildenden Bakterium des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium extrahierte Plasmid- oder Phagen-DNA oder ein Derivat des Plas mids oder Phagens verwendet werden. Die Vektor-DNA wird «'bi'nf eil Ik mit RenLriktionsendonuclease behemdelt. Bevorzugte Restriktionsendonucleasen sind Hind III, Bei I, Xba I und Xma I.
Die abgebaute ch'romosomale und die Vektor-DNA werden einer Ligationsreaktion mit Ligase unterworfen. Die Rekombination der DNA zur Herstellung des rekombinanten Plasmids kann dadurch erfolgen, daß man Desoxyadenylsäure und Thymidylsäure oder Desoxyguanylsäure und Desoxycytidylsäure mit Terminaltransferase in das chromosomale DNA-Fragment und die gespaltene Vektor-DNA einführt und das modifizierte chromosomale DNA-Fragment sowie die gespaltene DNA einer Wärmebehandlung (Ringschluß) unterwirft.
Die so erhaltene Hybrid-DNA kann mit Hilfe üblicher Transformationsmethoden in den Empfängerorganismus eingeführt werden und die Empfängerorganismen werden' dann eine Weile wachsen gelassen, damit sich die transformierten Eigenschaften des Transformanten stabilisieren. Der gewünschte Transformant kann durch Screening des Klons selektiviert werden, das die charakteristischen Eigenschaften für die L-Glutaminsäure-Synthese und/oder die charakteristischen Eigenschaften des Vektors aufweist.
Die so erhaltenen L-Glutaminsäure bildenden Bakterien können nach üblichen Methoden gezüchtet werden, um L-Glutaminsäure herzustellen, z.B. bei einem pH von 6 bis 8 und einer Temperatur von 30 bis 37°C. Die Züchtung kann solange fortgesetzt werden, bis die Bildung von L-Glutaminsäure im wesentlichen aufgehört hat.
Es werden übliche Kulturmedien angewandt, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische. Ionen und gegebenenfalls organische Spurennährstoffe enthalten. Als Kohlenstoffquellen eignen sich z.B. Glucose, Saccharose und Rohmaterialien, die diese Kohlenhydrate enthalten {z.B. Stärkehydrolysat und Melassen), organische Säuren, wie Essigsäure, und Alkohole, wie Äthanol. Als Stickstof fquellen eignen sich 7. .B. gasförmiges Ammoniak, wäßriges Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden höhere Ausbeuten an L-Glutaminsäure erzielt als in bekannten Verfahren und außerdem läßt sich die L-Glutaminsäure leicht gewinnen, da die Kulturbrühe kaum Aminosäure-Nebenprodukte enthält.
Beispiel 1 ■
(1) Herstellung von chromosomaler DNA, die die genetische Information für die L-Glutaminsäure-Bildung trägt
Brevibacterium lactofermentum Nr. 5116 (NRRL B-12405), eine temperaturempfindliche Mutante, die sich durch Induktion von dem Stamm Nr. 2256 (ATCC 13869) ableitet, wird 3 Stunden unter Schütteln bei 30°C in 1 Liter CMG-Medium gezüchtet, das 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Glucose und 0,5 g/dl NaCl enthält und einen pH von 7,2 aufweist. Die in der exponentiellen Wachstuxnsphase befindlichen Bakterienzellen werden geerntet. Bei der Extraktion von chromosomaler DNA nach der üblichen Phenolmethode werden 3,5 mg gereinigte DNA erhalten.
(2) Herstellung der Vektor-DNA
Als Vektor wird DNA aus dem Plasmid pAM 330 (MG 3 χ 106 DaI-ton) folgendermaßen hergestellt.
Der Stamm Brevibacterium lactofermentum Nr. 2256, der das Plasmid pAM 330 enthält, wird bei 300C in 1 Liter CMG-Mi.-dium
οι ι ο υ ι ü
— * 8 —■
gezüchtet. Nachdem die Inkubation die späte logarithmische Phase erreicht hat, werden die Zellen geerntet und durch Behandeln mit Lysozym und SDS lysiert. Das Lysat wird 30 Minuten bei 30 000 Xg zentrifugiert. Durch Konzentrieren des Überstands und Fraktionieren durch Agarose-Gelelektrophorese werden 74 ug der Plasmid-DNA erhalten.
(3) Insertieren des chromosomalen DNA-Fragments in den • Vektor'
Jeweils 10 μg der chromosomalen DNA werden '10, 30 bzw. 60 Minuten bei 37°C. mit den Restriktionsendonucleasen Hint III oder Bei I behandelt, um die DNA-Ketten zu spalten, worauf man 5 Minuten auf 65°C erwärmt. 1O ug der Vektor-DNA werden ebenfalls 1 Stunde bei 37 C mit den Restriktionsendonucleasen Hind III bzw. Bei I behandelt, um die DNA vollst
wärmt."
vollständig zu spalten, worauf man 5 Minuten auf 65°C er-
Die Lösung der abgebauten chromosomalen DNA und die Lösung der gespaltenen Vektor-DNA werden vermischt und 24 Stunden bei 10 C einer Ligationsreaktion der DNA-Fragmente mit T.-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP und Dithiothreitol unterworfen. Das Reaktionsgemisch wird dann 5 Minuten auf •65 C erhitzt und mit dem doppelten Volumen Äthanol versetzt. Die ausgefällte rekombinante DNA wird gewonnen".
(4) Genetische Transformation mit dejn Hybridplasmid, das die genetische Information für die Glutaminsäure-Bildung enthält
Glutaminsäure benötigende Stämme von Brevibacterium lactofermentüm Nr. 3 (NRRL B 12406) oder Nr. 4 (NRRL B 12407),' die sich von Brevibacterium lactofermentum Nr. 5516 durch N- Mathyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin-Mutagenese herleiten, .werden in 20 ml CMG bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Die
Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden geerntet und in einer 0,1 M MgCl^-Lösung und dann in einer 0,1 M CaCl^- Lösung in einem Eisbad suspendiert, wobei kompetente Zellen mit der Fähigkeit zur DNA-Aufnahme erhalten werden.
Die Suspension der kompetenten Zellen wird mit der in Stufe (3) erhaltenen DNA, welche die Hybridplasmid-DNA enthält, versetzt. Die Suspension wird 30 Minuten in einem Eisbad gehalten, dann 2 Minuten auf 42 C erwärmt und dann wieder 30 Minuten in einem Eisbad stehengelassen. Die Zellen, in die auf diese Weise die Hybridplasmid-DNA eingeschleust wurde, werden in ein L-Medium überimpft und das Medium wird 3 Stunden bei 37 C geschüttelt, um die Transformationsreaktion zu vervollständigen, Die Zellen werden dann geerntet, gewaschen und resuspendiert. Ein kleiner Teil der Zellsuspension wird auf einer Agarplatte ausgestrichen, die 20 g Glucose, 10 g (NH4J2SO4, 2,5 g Harnstoff, 1 g KH3PO4, 0,4 g MgSO4-TH2O, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 0,01 g PeSO..7H9O, O,O1 g MnSO.. 4H„0 und 20 g Agar pro Liter enthält und einen pH von 7,2 aufweist. Die Platte wird bei 37°C inkubiert. Nach 4tägiger Inkubation werden alle erschienenen Kolonien aufgenommen, gereinigt und isoliert.
Die Stämme, die durch die Transformation zur Bildung von L-Glutaminsäure befähigt wurden, werden als Transformanten aufgenommen. Unter den Transformanten werden als die besten L-Glutaminsäurebildner
AJ 11561 (FERM-P 5469) (NRRL B-12408) und AJ 11562 (FERM-P 5470) (NRRL B-12409) selektiert. AJ 11561 wird aus dem Empfängerorganismus Nr. 3 unter Ver--Wendung von Hind III und AJ 11562 wird aus dem Empfängerorganismus Nr. 4 unter Verwendung von Bei I erhnlLcn.
O \ I 0 D
(r)) Pr<>duk t ion von L-GlutaminsSure mit den Jiorg-cf>_t el 1 ten Glutaminsäure bildenden Stämmen
Die L-Glutaminsäure-Produktion von AJ 11561 und AJ 11562 wird zum Vergleich der DNA-Donoren und Empfängerorganismen folgendermaßen getestet.
Das Fermentationsmedium enthält 3.,6 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Harnstoff, 0,1 g KH2PO4/ 0,1 g/ai MgSO4.7H2O, 3 ml/dl Sojahydrolysat ("Mieki"), 100 μg/l Thiamin.HCl, 3 pg/1 Biotin, 1 mg/dl FeSO4^H3O, 1 mg/dl MnSO4 - 4H2O und 2,5 g/dl CaCO- (getrennt sterilisiert) und weist einen pH von 7,0 auf. 20 ml des Fermentationsmediums werden in 500 ml-Kolben eingebracht und mit einer mit dem Inoculum des Testorganismus gefüllten ölse angeimpft, worauf man die Züchtung 48. Stunden bei 310C durchführt. . ;
Die Menge an L-Glutaminsäure in dem Überstand der Fermentationsbrühe wird durch enzymatischen Assay bestimmt.
Tabelle I
Getesteter Mikroorganismus .L-Glutaminsäure-menge (mg/dl)
• Brevibacterium lactofermentum Nr. 5116 550
Brevibacterium lactofermentum Nr. 3 · 0
Brevibacterium lactofermentum Nr. 4 0
Brevibacterium lactofermentum AJ 11561 ' 980
Brevibacterium lactofermentum AJ 11562 900
311551b
Beispiel 2
(1) Herstellung von chromosomaler DNA, die die genetische Information für die L-Glutaminsäure-Bildung trägt
Corynebacterium.glutamicum Nr. 5707 (NRRL B-I2410), eine gegen Ketomalonsäure resistente und durch Induktion von Corynebacterium glutamicum AJ 11560 (FERM-P 5485; NRRL B-12415) abgeleitete Mutante, wird 3 Stunden bei 30°C unter Schütteln in 1 Liter CMG-Medium gezüchtet, das 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Glucose und 0,5 g/dl NaCl enthält und einen pH von 7,2 aufweist. Die Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden geerntet. Durch Extraktion der chromosomalen DNA nach der üblichen Phenolmethode werden 4,0 mg gereinigte DNA erhalten.
Corynebacterium glutamicum AJ 11560 ist ein für die Zwecke der Erfindung neu isolierter Stamm. Dieser Stamm wird der Sektion III des in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Ausgabe, 1974) beschriebenen Genus Corynebacterium zugeordnet. In dem Manual finden sich jedoch keine taxonomischen Charakteristika der.zur Sektion III gehörenden Spezies, sondern nur deren Namen. Es wird daher auf alle in dem Manual genannten Originalberichte hinsichtlich Sektion III Bezug genommen. AG 11560 wird mit dem in Bull. Agr. Chem. Soc. Japan, Bd. 22, S. 176 - 185 (1958) und J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 13, S. 279 - 301 (1967) beschriebenen Corynebacterium glutamicum identifiziert..
(2) Herstellung der Vektor-DNA
Als Vektor wird DNA aus dem Plasmid pAM 286 (MG 3 χ 106 DaI-ton) folgendermaßen hergestellt:
I I ν/ W ι
Der Stamm Corynebacterium glutamicum AJ 11560, der das Plasmid pAM286 enthält, wird bei 30°C in 1 Liter CMG-Medium gezüchtet. Nachdem die Inkubation die späte logarithmische Phase erreicht hat, werden die Zellen geerntet und durch Behandeln mit Lysozym und SDS lysiert. Das Lysat wird 30 Minuten bei 30 000 Xg zentrifugiert, worauf man den überstand konzentriert und durch Fraktionieren mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese 60 ug der Plasmid-DNA erhält.
(3) Insertieren des chromosomalen DNA-Fragments .in den Vektor
Jeweils 10 ng der chromosomalen DNA werden 10, 30 bzw. 60 Minuten" bei' 37 C mit den Restriktionsendo,nucleasen Hind III oder Xma I behandelt, um die DNA-Ketten zu spalten, worauf man 5 Minuten auf 65 C erhitzt. 10 μ9 der Vektor-DNA werden ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit den Restriktionsendonucleasen Hind III oder Xma I behandelt, um die DNA vollständig zu spalten, worauf man 5 Minuten auf 65 C erhitzt.
Die Lösung der abgebauten chromosomalen DNA und die Lösung der gespaltenen Vektor-DNA werden dann vermischt und 24 Stunden bei 10 C einer Ligationsreaktion der DNA-Fragmente mit T.-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP und Dithiothreitol unterworfen. Das Reaktionsgemisch wird dann 5 Minuten auf 65 C erhitzt und mit dem doppelten Volumen Äthanol versetzt. •Die ausgefällte rekombinante DNA wird gewonnen.
(4) Genetische Transformation mit dem Hybridplasmid, das die genetische Information für die Glutaminsäure-Bildung ent-
L-Glutaminsäure benötigende Stämme von Corynebacterium glutamicum Nr. 12 (NRRL B-12411) und Nr. 26 (NRRL B-12412), die sich von Corynebacterium glutamicum Nr. 5707 durch
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311 5 ϋ Ί b
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N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin-Mutagenese herleiten, werden bei 30°C in 20 ml CMG-Medium unter Schütteln gezüchtet, Die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden geerntet und in 0,1 M MgCl2-Lösung und dann in 0,1 M CaCl2-Lösung in einem Eisbad suspendiert, wobei kompontente Zellen mit der Fähigkeit zur DNA-Aufnähme erhalten werden.
Die Suspension der kompetenten Zellen wird mit der in Stufe (3) erhaltenen DNA, die die Hybridplasmid-DNA enthält, versetzt. Die Suspension Wird 30 Minuten in einem Eisbad gehalten, dann 2 Minuten auf 42°C erwärmt und wieder 30 Minuten in einem Ei-sbad stehengelassen. Die Zellen, die die Hybridplasmid-DNA enthalten, werden in L-Medium inoculiert und das Medium wird 3 Stunden bei 37°C geschüttelt, um die Transformationsreaktion zu vervollständigen. Die Zellen werden geerntet, gewaschen und resuspendiert. Nach dem Verdünnen des Reaktxonsgemischs wird die Zellsuspension auf einer Agarplatte ausgestrichen, die 20 g Glucose, 10 g (NH.)„SO., 2,5 g Harnstoff, 1 g KH3PO4, 0,4 g MgSO4^H3O, 50 \ig Biotin, 20 ng Thiamin-hydrochlorid, 0,01 g FeSO4.7H2O, 0,01 g MnSO..4H0O und 20 g Agar pro Liter enthält und einen pH von 7,0 aufweist. Die Platte wird bei 37 C inkubiert. Nach 4tägiger Inkubation werden alle auftretenden Kolonien aufgenommen, gereinigt und isoliert.
AJ 11566 (FERM-P 5486; NRRL B-12413) wird aus Nr. 12 unter Verwendung von Hind III und AJ 11567 (FERM-P 5487; NRRL B-12414) wird aus Nr. 26 unter Verwendung von Xma I erhalten.
(5) Produktion von L-Glutaminsäure mit den hergestellten '. Glutaminsäure bildenden Stämmen
Die in Stufe (4) erhaltenen Transformanten werden auf .ihre L-Glutaminsäure-Produktivität getestet. Der DNA-Donorst.amm Nr. 5707 und die Empfängerstämme werden zum Vergleich auf dieselbe Weise gezüchtet.
\J \J \ \J
Das Kulturmedium enthält 3,6 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Harnstoff, 0,1 g KH2PO4, 0,1 g/dl MgSO4^H3O, 3 ml/dl Sojahydro-Iysat ("Mieki"), 100 μg/l Thiamin.HCl, 3 μg/l Biotin, 1 mg/dl FeSO4.7H2O, 1 mg/dl MnSO4.4H2O und 2,5 g/dl CaCO3 (getrennt sterilisiert) und weist einen pH von 7,0 auf.
20 ml des Fermentationsmediums werden in 500 ml-Kolben eingebracht und mit einer mit dem Inoculum des Testorganismus gefüllten öse angeimpft, worauf man die Züchtung 48 Stunden bei 31 c durchführt. Die Mengen an L-Glutaminsäure in dem Überstand der Fermentationsbrühe werden durch enzymatischen Assay bestimmt.
Tabelle II
Getesteter Mikroorganismus L-Glutaminsäuremenge (mg/dl)
Corynebacterium glutamicum Nr. 5707 600
Corynebacterium glutamicum Nr. 1 2 ' .. 0 "
Corynebacterium glutamicum Nr. 26 0
Corynebacterium glutamicum AJ 11566 1010
Corynebacterium glutamicum AJ 11567 ·. ■ 1000

Claims (6)

PA". fNTANWÄLTE SCH1FF v> FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK MARIAHILFPLATZ 2*3, MÖNCHEN 3O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÜNCHEN 65 AJINOMOTO CO., INC. 16. April 1981 DEA-13 558 " Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure " Patentansprüche
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) einen L-Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus, der erhältlich ist durch Einführen eines Hybridplasmids, in das ein DNA-Fragment insertiert worden ist, welches aus einem L-Glutaminsäure bildenden Bakterium des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium erhalten wurde, in einen Empfänger-Mikroorganismenstamm des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium, in einem Kulturmedium züchtet und
b) die in dem Kulturmedium angereicherte L-Glutaminsäure gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment erhalten wurde durch Behandeln von chromosomaler DNA mit einer Restriktionsendonuclease aus der Gruppe Hind III, Bei I, Xba I und Xma I.
ό I 100 IO
3. Verfahren nach Anspruch .1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Empfänger-Mikroorganismenstamm Brevibacterium divaricatum·, Brevibacterium flavum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium saccharolyticum,- Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola oder Corynebacterium glutamicum verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Glutaminsäure bildendes ■Bakterium Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saceharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Cornyebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetogluta-.micum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium lilium, Cornyebacterium melassecola oder Corynebacterium glutamicum verwendet. ·
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Glutaminsäure bildendes Bakterium eine gegen Ketomalonsäure resistente Mutante verwendet.
6.· Verfahren nach einem der Ansprüche 1.bis'5, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Glutaminsäure bildendes Bakterium eine gegen erhöhte Temperatur empfindliche • Mutante verwendet.
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