-
-
1. Seppo Kolehmainen,
-
Route 2, Box 66X, Riveredge Drive, Titusville, Florida 32780, USA
2 Veikko Tarkkanen, KriJgersberglaan 25, 6371 CA Schaesberg, Niederlande Verfahren
und Vorrichtung zum Messen der Lumineszenz von Proben Die Erfindung betrifft das
automatische Transportieren, Verarbeiten und Messen der Chemilumineszenz und Biolumineszenz
von Substanzen.
-
Die Biolumineszenz und die Chemilumineszenz sind für viele Arten von
Messungen von Substanzen verwendet worden (F. Gorus und E. Schram, Clin. Chem. 25:
512-5, 1979), zur Messung der Lebensfähigkeit von Zellen (P. Tarkkanen, R. Driesch
und H. Greiling, Fresenius Z. Anal. Chem. 290: 180-181, 1978) und für die Mengenbestimmung
bzw. Quantifikation von Antigen-Antikörper-Komplexen (B. Velan und M. Halmann, Immonu
Chemistry 15: 331-33, 1978).
-
Normalerweise werden die Messungen der Bio- und Chemilumineszenz mittels
von Hand bedienten Instrumenten durchgeführt, obwohl zum Zwecke der Automation auch
Durchflußsysteme verwendet worden sind. Ein in Segmente aufgeteiltes Durchflußsystem
gibt Luftbläschen einzelnen Proben zu und vermischt die Muster mit Reagenzien (H.H.
Johnston, C.J. Mitchell und G.D.W. Curtis, 210-214, in Rapid Methods and Automation
in Microbiology -
herausgegeben von H.H. Johnston und S.W.B. Newsom;
Learned Information (Europe) Ltd., Oxford, 1976), während bei der sogenannten Flow-InJection
-Analyse (FIA) homogene Proben in Kapillarien bewegt werden.
-
Bestimmte nichthomogene Proben wie Zellenproben und biologische Flüssigkeiten
(Blut, Urin, Milch) sind nicht einfach mittels Durchflußsystemen zu untersuchen,
weil sich Probleme durch Ausfällen bzw. Abscheiden von Zellen, Proteinen, Fettkügelchen
und anderen Partikeln in den Röhren und Kapillaren ergeben.
-
Daher ist die Messung derartiger Proben zuverlässiger, wenn sie einzeln
behandelt oder bei allen Stufen der Analyse in einzelnen Behältnissen gehalten werden.
-
Eine automatische Lumineszenz-Messung einzelner bzw.
-
voneinander getrennter Proben ist mittels eines Flüssigkeits-Szintillationszählers
möglich, wenn man eine spezielle Modifikation vornimmt, um automatisch Reagenzien
abzugeben (vergleiche R.H. Hammerstedt, Anal.
-
Biochem. 52:449-455, 1973), oder mittels eines Instrumentes, das ein
lichttransparentes Filter für die Aufnahme von Proben und Reagenzien verwendet.
-
Flüssigkeits-Szintillationszähler (LSC) sind kostspielig, großvolumig
und für Lumineszenz-Messungen nicht optimal.
-
Die schwerwiegendsten Nachteile eines Flüssigkeits-Szintillationszählers
sind, daß die Größe der einzelnen zu untersuchenden Proben groß (von 2-10 ml) ist,
daß der dynamische Bereich nur 2 bis 3 Dekaden umfaßt und daß die Zeitverzögerung,
bevor die einzelne Probe vom Transportmechanismus in die Messposition gelangt, 20
Sekunden beträgt. Auch sind diese Zähler nur umständlich für eine automatische Probenverarbeitung
verwendbar, weil eine automatische InJektion von Reagenzien und Inkubation bei einer
bestimmten Temperatur nicht ohne bedeutende Abänderungen der ursprünglichen Konstruktion
möglich sind.
-
Das aus der US-PS 3 940 250 bekannte, ein lichttransparentes Filter
verwendende Instrument ist nur für zu filternde Proben bestimmt, und es ist nur
für kleinvolumige Proben und-Reagenzien zu benutzen. Auch kann mit ihm stets nur
eine Analyse zu einer Zeit durchgeführt werden.
-
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum
Messen bzw. Untersuchen von Proben mittels Lumineszenz zu schaffen, welche die vorstehend
genannten Nachteile vermeiden.
-
Zur Lösung dieser Aufgabe sind erfindungsgemäß einzelne voneinander
getrennte Proben in Vertiefungen eines lichtrefklektierenden Bandes oder einer lichtreflektierenden
Folie enthalten, die automatisch transportiert und verarbeitet werden und bei denen
die Chemilumineszenz und/oder Biolumineszenz gemessen wird.
-
In der Zeichnung sind Ausführungsbeispiele einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung zum Messen der Lumineszenz von Proben schematisch dargestellt, und zwar
zeigt Fig. 1 eine Gesamtansicht einer Vorrichtung zum Messen der Lumineszenz einzelner
Proben, Fig. 2 einen Querschnitt durch die Einrichtung zum Erzeugen von Vertiefungen
oder Aufnahmen in einem Band für die Proben in gegenüber Fig. 1 vergrößertem Maßstab,
Fig. 3 einen Teilschnitt durch eine gegenüber Fig. 1 abgeänderte Ausführungsform
der Vorrichtung zum Messen der Lumineszenz einer Reihe von Proben von oben und
Fig.
4 einen Querschnitt ähnlich wie in Fig. 3 einer weiteren abgewandelten Ausführungsform
der Vorrichtung.
-
Die Grundlagen der Erfindung sind aus der schematischen Darstellung
gemäß Fig. 1 zu entnehmen. Zur Aufnahme upd zum Transport der Proben ist ein beispielsweise
aus Aluminiumfolie bestehendes nicht transparentes, reflektierendes Band 5 vorgesehen,
in welches mittels eines Stempels in Form eines Rades 4 (Patrize) Vertiefungen 5
eingedrückt werden, indem die vorstehenden Teile des Rades 4 die über das Rad laufende
Folie in als Matrizen dienende Vertiefungen eines weiteren Rades 3 drücken. Das
Band 5 kann auch aus verformbarem Kunststoff wie Polyvenylchlorid bestehen.
-
Die für die Proben bestimmten Aufnahmen oder Vertiefungen 5a sind
vorzugsweise halbkugelförmig, können Jedoch auch konisch sein oder die Form eines
konischen Zylinders aufweisen, wenn sie mit einem Tiefziehstempel erzeugt werden.
Der Durchmesser der Vertiefungen 5a kann von 2 mm bis mehrere cm wie bis 5 cm variieren,
was von der Art der zu untersuchenden Proben und dem Reagenzsystem abhängt. Bei
konischer Ausbildung kann die Tiefe zwischen 1 und 25 mm liegen. Kleine Vertiefungen
sind vorzuziehen, weil dadurch Kosten für Reagenzien einzusparen sind und pro Längeneinheit
des Bandes mehr Proben untergebracht werden können. Die Aufnahmen oder Vertiefungen
5a sind im Band 5 derart angebracht, daß der Abstand zwischen den Kanten zweier
aufeinander folgende Vertiefungen wenigstens 1 mm beträgt und vorzugsweise kleiner
als 20 mm ist. Die Dicke des Bandes 5 kann inerhalb weiter Grenzen liegen, Jedoch
sind Dicken von 0,01 bis 0,5 mm bevorzugt.
-
Es können zwei Arten von Probengrößen zweckmäßig sein.
-
Eine Probengröße ist sehr klein (1 bis 10 /ul) für immunologische
Tests wie HLA-Gewebetests, während für allgemeinere Fälle die Probengröße zwischen
100 und 500 /ul liegt. Es sind Jedoch auch Probengrößen bis zu mehreren Millilitern
möglich.
-
Von einer Rolle 1 läuft das nicht transparente Band 5 über eine Leitrolle
2 zum ziels Matrize dienenden Rad 3, wo durch das Zusammenwirken mit dem als Patrize
dienenden Rad 4 Vertiefungen 5a in das Band 5 eingeformt werden.
-
Eine in einem Behälter 6a wie eine Ampulle, ein Röhrchen oder eine
Schale befindliche Probe 6 wird mittels einer automatischen Probentransporteinrichtung
7a in die einzelnen Vertiefungen 5a des Bandes 5 eingefüllt.
-
Die Probentransporteinrichtung 7a umfaßt einen Verdünner 7b und ein
Röhrchen 7c. Das Röhrchen 7c ist aus der in Fig. 1 in vollen Linien dargestellten
Position, in welcher es in den Behälter 6a eintaucht, in die gestrichelt dargestellte
Position verstellbar, in welcher es über einer Vertiefung 5a endet. Der Verdünner
7b enthält ein Reinigungsmittel oder ein geeignetes Reagenz, mit dem die aus dem
Behälter 6a kommende Probe aus dem Röhrchen 7c in die Vertiefung 5a abgegeben wird,
wobei gleichzeitig das Röhrchen 7c gereinigt wird, so daß es die nächste Probe aufnehmen
kann, ohne dieselbe zu verunreinigen. Einzelheiten der Probentransporteinrichtung
7a sind hier nicht beschrieben, da sie zum Stand der Technik gehören.
-
Außerdem sind Zugeber 8 und 9 für Reagenzien vorgesehen. Jeder dieser
Zugeber 8 und 9 gibt ein abgemessenes Volumen eines entsprechenden Reagenzes mit
der richtigen Energie zu, um die betreffende Probe
und das Reagenz
miteinander zu vermischen. Im Bereich 10 findet eine Inkubations oder chemische
Reaktion statt, welche abgeschlossen ist, bevor ein weiteres Reagenz (Lumineszenzreagenz)mittels
eines Zugebers 11 in die Probe eingegeben wird. Die Intensität des von den einzelnen
Proben ausgesandten Lichtes wird mittels eines Lichtdetektors 12 gemessen, der sich
in einem Gehäuse 13 befindet und gegen von außen kommendes Licht mittels einer Blende
14 geschützt wird, wenn das Gehäuse 13 angehoben wird, um das Band 5 weiter zu transportieren.
-
Wird das Gehäuse 13 auf eine eine Probe enthaltende Vertiefung 5a
abgesenkt, bildet ein O-Ring 15 eine lichtdichte Abdeckung, wie Fig. 1 zeigt. Nunmehr
wird die Blende 14 von der Vorderseite des Lichtdetektors 12 zurückgezogen. Von
dem Lichtdetektor 12 ausgesandter elektrischer Strom oder von ihm kommende elektrische
Impulse werden von einem Verstärker 16 und einer Zeit-Zähl-Integrier-Steuerschaltung
17 verarbeitet. Bekannte gedruckte Schaltkreise, Mikroprozessoren und Mikrokomputer
können als Steuerschaltung 17 benutzt werden. Die Intensität und Menge der gemessenen
bzw. untersuchten Substanz kann über einen Analogausgang mit einem Anzeiger oder
einem Oszilloskop 18 oder digital mit einer Digitalanzeige oder einem Digitaldrucker
19 aufgezeichnet werden.
-
Die Steuerschaltung 17 synchronisiert die schrittweise Bewegung des
Bandes 5, das Eingeben der Proben 6 in die Vertiefungen 5a mittels der Probentransporteinrichtung
7a und der Zugeber 8, 9 und 11 und auch die Bewegungen des Gehäuses 13 und der Blende
14. Ein Rad 21 bewegt das nicht transparente Band 5 schrittweise und synchronisiert
mit den Rädern 3 und 4 vorwärts. Das Band 5 wird auf einer Rolle 22 gesammelt,
während
die Proben 6 als Abfall 24 in einen Behälter 23 tropfen. Energie wird der gesamten
Vorrichtung durch eine Leitung 25 zugeführt.
-
Das Band 5 mit den Vertiefungen 5a wird von einem aus Metall bestehenden
Block 27 (Fig. 3) geführt und abgestützt, wobei der Block 27 in Längsrichtung verlaufende
Nuten 28 enthält, die ein etwas größeren duerschnitt als die Vertiefungen 5a haben,
in der Form Jedoch den Vertiefungen 5a entsprechen. Dieser Block 27 gestattet es,
daß eine lichtdichte Abdichtung zwischen dem Lichtdetektor 12 und einer Vertiefung
5a erzielt wird und die Proben 6 während der Inkubation auf eine konstante Temperatur
aufgeheizt werden. Zu diesem Zweck wird der O-Ring 15 zwischen dem Gehäuse 13 und
dem auf dem Block 27 aufliegenden Band 5 zusammengepreßt.
-
Fig. 2 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform der Einrichtung zum
Erzeugen der für die Aufnahme der Proben 6 bestimmten Vertiefungen 5a des nicht
transparenten Bandes 5. Diese Einrichtung hat einen Stempel 26 mit einem konvexen
Kopfende 26a und einen Amboß 30, der eine konkave Ausnehmung 30a enthält. Der Stempel
26 ersetzt das Rad 4 der Ausführungsform aus Fig. 1 und wird von der Steuerschaltung
17 so gesteuert, daß er synchron mit den anderen Bewegungsvorgängen der Vorrichtung
auf und ab geht. Das Kopfende 26a des Stempels 26 kann kugelförmig, konisch oder
als leicht konisch abgestumpfe Stange ausgebildet sein, während der Amboß 30 spiegelbildlich
ausgebildet ist, damit zur Aufnahme von Proben bestimmte Vertiefungen 5a mit halbkugelförmlger,
konischer oder zylindrischer Gestalt erzeugt werden.
-
Fig. 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel für eine mit mehreren Detektoren
arbeitende Vorrichtung, welche mit einem aus Aluminium bestehenden Band 5 und Nuten
28 zusammenarbeitet, welche die zur Aufnahme von Proben bestimmten Vertiefungen
5a und das Band 5 tragen. Das nicht transparente Band 5 mit den in seinen Vertiefungen
5a befindlichen Proben 31 wird von dem aus Metall oder Kunststoff bestehenden Block
27 abgestützt, dessen Nuten 28 etwas weiter als die Vertiefungen 5a sind. Bei dieser
mehrere Detektoren aufweisenden Vorrichtung wird die Lichtintensität Jeder einzelnen
in einer Reihe paralleler Proben befindlichen Probe mit einem eigenen Detektor 32
gemessen. Das von Jedem Detektor 32 gelieferte Signal bzw. die entsprechenden Impulse
werden mittels eines Verstärkers 33 verstärkt und in die zur Datensteuerung und
Datenverarbeitung bestimmte Steuerschaltung 17 eingespeist. In Fig. 3 sind als Festkörper
ausgebildete Detektoren 32 (Silikon-Photodioden) dargestellt, die Jeweils in einem
Gehäuse 13 untergebracht sind, wobei die Gehäuse 13 nebeneinander aufgereiht sind
Fig. 3 zeigt auch das Prinzip eines Mehrkanal-Instruments. Das Band 5 kann 2 bis
20 parallele Vertiefungen 5a zur Aufnahme von Proben aufweisen, wobei Jede dieser
Proben 31 mittels eines eigenen Lichtdetektors 32 gemessen wird, der eine Silikon-Photodiode
oder ein Photomultiplier sein kann. Jeder Detektor 32 hat einen eigenen Verstärker
33, wobei die gemessene Lichtintensität (als elektrischer Strom oder als Impulse)
für Jeden Detektor durch einzelne Leitungen 34 separat verarbeitet und aufgezeichnet
wird.
-
Fig. 4 zeigt eine mit mehreren Detektoren ausgerüstete Ausführungsform,
welche optische Fasern verwendet, um Licht einer Reihe von Photomultiplier-Detektoren
zuzuführen. Von den in den Vertiefungen 5a des re-
flektierenden
Bandes 5 befindlichen Proben 31 ausgesandtes Licht wird durch gebündelte optische
Fasern 36 Photomultiplier-Röhren 37 zugeführt. Die Enden 36a der optischen Fasern
36 sind nach außen mittels eines O-Ringes 38 abgedichtet, der gegen das auf dem
Block 27 liegende Band 5 gedrückt wird. Die optischen Fasern 36 liegen in einer
nicht transparenten Hülle 39, wobei sich die anderen Enden 36b an einer Photokathode
40 einer Photomultiplier-Röhre 41 befinden und mittels einzelner als Verschluß dienender
Blenden 42 zwischen den einzelnen Messungen abgedeckt werden. Diese Blenden 42 schützen
die Photomultiplier-Röhren 41 gegen von außen einfallendes Licht, wenn der Messkopf
43 gelastet wird, um das Band 5 vorzurücken, damit die nächste Reihe von Proben
31 an die Meßstelle gelangt.
-
Die Blenden 42 werden vor jedem Meßvorgang automatisch von den Photokathoden
40 zurückgezogen und nach jedem Meßvorgang automatisch in die Verschlußstellung
zurückbewegt. Der von Jedem Detektor 72 abgegebene elektrische Strom bzw. die abgegebenen
elektrischen Impulse werden mittels einzelner Leitungen 44 einem nicht gezeigten
Verstärker und einer für die Datenverarbeitung bestimmten Schaltung zugeleitet.
Die Photomultiplier-Röhren 41 sind in nebeneinander aufgereihten Gehäusen 45 untergebracht.
-
Es ist auch möglich, ein Bündel optischer Fasern 36 und einen einzigen
Detektor in Form einer Photomultiplier-Röhre 37 zu benutzen, um eine vollständige
Reihe von Proben 31 zu messen. Dabei wird dann das Bündel optischer Fasern 36 von
einer Probenstelle zur nächsten bewegt, bis alle Proben einer Reihe nacheinander
gemessen. worden sind. Nach dem Abtasten einer Reihe, wird das Band 5 vorbewegt,
um die nächste Probenreihe an die Meßstelle zu bringen. Das Bündel optischer Fasern
36 wird dann wieder von der ersten Vertiefung 5a
durch alle Positionen
der Reihe bewegt, um alle Proben 31 abzutasten. Dann wird das Band 5 wieder vorbewegt
und der nächste Meßvorgang eingeleitet usw.
-
Diese Vorrichtung kann benutzt werden, um Mengen von Substanzen oder
eine Anzahl lebender Zellen mittels Bio- und Chemilumineszenz-Reaktion zu messen.
-
Nachstehend wird ein spezielles Beispiel für die Messung somatischer
Zellen in Milch angegeben: Aus einem automatischen Probenwechsler wurde eine Milch-Probe
6 mit einem Volumen von 10 bis 100 /ul in eine Vertiefung 5a eingegeben. Nachdem
diese Probe unter den Zugeber 8 bewegt worden ist, wurden 10 bis 500 /ul eines Extraktions-Reagenz
in diese Probe eingegeben. Dieses Reagenz bestand aus 0,02 bis 0,5% wässriger Lösung
eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels der Art von ethoxyliertem Alkylphenol.
-
Während des Durchgangs der Probe durch den Inkubationsabschnitt 10
wurde ATP (Adenosin-Triphosphat) aus den somatischen Zellen der Milch (Leukozytis)
und epitelischen Zellen durch das Extraktions-Reagenz extrahiert. Als sich die Probe
unter dem Zugeber 11 befand, wurde ein Leuchtkäfer-Luziferin-Luziferase-Reagenz
in einer Menge von 10 bis 100 /ul in die vorbehandelte Probe eingegeben. Das Luziferin-Luziferase-Reagenz
bestand aus 0,01 iug/ml Luziferase-Enzymen, 10 -100 /ug/ml Luziferin, 0,5 bis 5
mM EDTA, 5 bis 20 mM Magnesiumsalz in einem 10 - 100 mM biochemischen Puffer (tris,
HEPES, MOPS, TES) mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8,2, Jedoch vorzugsweise 7,75.
-
Nachdem die Luziferin-Luziferase der Probe zugegeben worden ist, erzeugte
sie eine Lichtemission, welche der Konzentration von ATP und der Menge somatischer
Zellen in der Probe proportional war. Nachdem die Probe unter den Lichtdetektor
12 gebracht worden ist, wurde die Lichtintensität gemessen und in die Anzahl der
somatischen Zellen umgesetzt, indem der ablesbare Probenwert mit bekannten Standardwerten
mittels der Steuerschaltung 17 verglichen wurde. Die Ergebnisse wurden entweder
analog oder digital vom Oszilloskop 18 bzw. dem Drucker 19 aufgezeigt.
-
Die Erfindung bietet zahlreiche Vorteile gegenüber von Hand oder auch
automatisch zu bedienenden bekannten Instrumenten. Zu diesen Vorteilen gehört die
Einfachheit, Vielseitigkeit bei der Größe der Proben und der Verarbeitung der Proben,
eine große Geschwindlgkeit bei der Probenuntersuchung, hohe Meßgenauigkeit und die
Möglichkeit, einen einzigen oder auch mehrere Detektoren zu verwenden. Schließlich
gehört dazu auch die Möglichkeit, verschiedene unterschiedliche Analysen an Bruchteilen
derselben Probe gleichzeitig durchzuführen. Bekannte und handelsübliche Probenwechsler
können an diese Vorrichtung angeschlossen werden.
-
Die Mechaniken der Vorrichtung sind einfach und preiswert. Auch ist
die Benutzung dieser Vorrichtung wirtschaftlich, weil es überflüssig ist, Meßküvetten
oder Meßampullen zu benutzen'und weil der Verbrauch der Reagenzien bedeutend gegenüber
von Hand zu betätigenden Vorrichtungen gesenkt werden kann, weil man nur kleine
Volumen der Proben und damit auch nur kleine Mengen Reagenzien benötigt. Die Vorrichtung
kann extrem klein gebaut werden, weil man sehr genau arbeitende
automatische
Zugeber benutzen kann und man eine hohe Meßempfindlichkeit wegen optimaler optischer
Probengeometrie erhält. Wegen der geringen Größe der einzelnen Proben und dem einfachen
Aufbau der Vorrichtung können große Mengen von Proben auf kleinem Raum verarbeitet
bzw. untersucht werden. Die Vorrichtung kann für zahlreiche Arten von Analysen benutzt
werden, welche eine mehrfache Reagenzien-Zugabe, Zeitverzögerungen und eine Inkubation
bei konstanten Temperaturen ebenso wie ein schnelles Aufheizen der Proben erfordern.
-
Wie bereits oben erwähnt, kann das Band 5 entweder eine Reihe von
Vertiefungen 5a für Proben 6 zum Messen der Lumineszenz mit einem einzigen Lichtdetektor
oder aufeinander folgende Reihen von 2 bis 20 Proben oder mehr für gleichzeitige
Messung der Lumineszenz mit einer mehrere nebeneinander aufgereihte Detektoren in
einer der Anzahl der Proben einer Reihe entsprechenden Zahl aufweisen. Dabei können
auch mehr Proben in einer Reihe vorgesehen sein. Die Erfindung ermöglicht es, bis
zu 500 Proben pro Stunde mit einer einzigen Reihe von Vertiefungen und bis zu mehreren
tausend Proben pro Stunde mit einem mehrere Detektoren aufweisenden System zu verarbeiten
und zu messen. Mit dem mehrere Detektoren aufweisende System ist es möglich, gleichzeitig
verschiedene Parameter in unterschiedlichen Bruchteilen derselben Probe zu messen.
-
Leerseite