DE3108386A1 - Kontinuierliches verfahren zur herstellung von aethanol mittels zellen-recycling - Google Patents
Kontinuierliches verfahren zur herstellung von aethanol mittels zellen-recyclingInfo
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Description
Patentanwälte Dip't.-lHs. H.-WEicKM-jtNNf-DiPL.-PHYS. Dr. K. Ftncke
Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
Dr.Ing. H.Liska 3100386
8000 MÜNCHEN 86, DEN H/SM/Hl POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
UNISEARCH LIMITED,
221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, Australien
Kontinuierliches Verfahren zur. Herstellung von Äthanol mittels Zellen-Recycling
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol (Alkohol) unter Verwendung des Bakteriums Zymomonas
mobilis.
Es ist bekannt, das Bakterium Zymomonas mobilis zur Herstellung
von Äthanol zu verwenden, und dieses Bakterium wird zur Herstellung
von Palmwein und anderen alkoholischen Getränken in tropischen Ländern verwendet. Es ist weiterhin bekannt, daß die Herstellung
von Äthanol unter Verwendung dieses Bakteriums theoretisch gewisse Vorteile hat verglichen mit Hefen, welche üblicherweise zur
Herstellung von Alkohol durch Vergärung von Zuckern, Stärken und anderen Kohlenhydrat-Substraten verwendet werden. Diese Vorteile
schließen die Tatsache mit ein, daß Zymomonas mobilis verglichen
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mit Hefen weniger Biomasse erzeugt, was zurückzuführen ist auf die für das Wachstum zur Verfügung stehende geringere
Energie/ die dem Entner-Doudoroff-Weg zu eigen ist, welchen das Bakterium beschreitet, und der nur 1 Mol ATP pro Mol
metabolisierter Glucose liefert, zum Unterschied zu dem glycolytischen Weg, der von den Hefen beschritten wird, und
der 2 Mol ATP pro Mol Glucose liefert. Ein weiterer potentieller Vorteil ist es, daß Zymomonas mobilis anaerob wächst.
Die Erfinder haben nun gefunden, daß die Äthanolproduktion stark erhöht werden kann, wenn man Zymomonas mobilis unter
Zellen-Recycling kontinuierlich kultiviert. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß eine kontinuierliche Kultur
von Zymomonas mobilis unter Zellen-Recycling nicht mit den Schwierigkeiten behaftet ist, welche eine kontinuierliche
Kultur von üblichen Hefen unter Zellen-Recycling zeigt. Diese Schwierigkeiten beinhalten die Notwendigkeit der Verwendung
von sterilem Sauerstoff, um die Ertragskraft der Hefezellen bei hohen Hefekonzentrationen zu erhalten, und die
Wahrscheinlichkeit der Kontamination durch unerwünschte Bakterien während des verlängerten Zeitraums der kontinuierlichen
Arbeitsweise.
Für die Vergärung mit Zymomonas mobilis unter Verwendung einer
kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling, mit der man außerdem, verglichen mit anderen Zymomonas mobilis-Vergärungstechniken
und mit der Hefegärung eine"höhere Äthanolproduktion erreicht, ist zur Erhaltung der Ertragskraft bei hohen
Zellenkonzentrationen Sauerstoff nicht erforderlich. Weiterhin wurde gefunden, daß aufgrund der höheren Geschwindigkeiten
der Zuckeraufnähme und der erhöhten Äthanoltoleranz im
Vergleich zu Hefen während verlängerter Zeiträume der kontinuierlichen Arbeitsweise keine Kontaminierung erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel-
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lung von Äthanol aus einem ein vergärbares Kohlenhydrat enthaltenden Medium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man Zymomonas mobilis im Kulturboden kontinuierlich kultiviert,
einen Teil des Kulturbodens kontinuierlich oder periodisch abführt und durch einen frischen Kulturboden
ersetzt, von dem abgeführten Teil des Kulturbodens die darin enthaltenen Zellen von Zymomonas mobilis abtrennt,
diese Zellen in den Kulturboden zurückführt, und das in dem Teil des Kulturbodens, von dem die Zellen abgetrennt
wurden, enthaltene Äthanol gewinnt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 2O°C bis 5O°C durchgeführt, insbesondere
bei 2 5 bis 40°C, und bei einem pH-Wert zwischen 3,7 und 8, insbesondere zwischen 4,5 und 6,5. Das Medium enthält vorzugsweise 100 bis.400 g/l eines vergärbaren Kohlenhydrats,
und insbesondere 150 bis 300 g/l.
Die bevorzugten Kohlenhydrate zur Verwendung als vergärbare Substrate im Kulturboden umfassen neben Glucose einfache
Zucker, wie z.B. Fructose, Lactose und Sucrose, Stärke und Stärkehydrolysate, und Cellulose-Rohmaterialien. Es ist
festzustellen, daß wahrscheinlich nicht jeder Stamm von Zymomonas mobilis alle diese Substrate vergärt, und deshalb
sollte für einen bestimmten Stamm ein geeignetes, vergärbares Substrat ausgewählt werden.
Vorzugsweise wird im Verfahren ein Zymomonas mobilis-Stamm
verwendet, der eine hohe spezifische Äthanol-Produktivität besitzt, eine hohe spezifische Glucoseaufnahmegeschwindigkeit
und eine hohe Alkoholtoleranz. Ein besonders geeigneter
Organismus ist CP4 aus der Sortenkultursainmlung (Type Culture Collection) von:
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Dr. J. De Ley
Laboratorium für Mikrobiologie Ledeganckstraat 35,
B - 900 Gent
Belgien
Es wurde auch gefunden, daß Mutanten dieses Stammes für die Durchführung des Verfahrens besonders geeignet sind und
ein breiteres Spektrum der damit vergärbaren Substrate als CP4 selbst besitzen können. Die Mutanten-Stämme können durch
Mutationen eines Stammes, z.B. unter Verwendung von Ü.V.Strahlung oder von Nitrosoguanidin, erhalten werden. Gewünschte.
Eigenschaften können in die Zymomonas mobilis-Stämme auch eingeführt werden durch Plasmaübertragung (plasmid transfer)
von anderen Bakterien, z.B. unter Verwendung von Membranfilter-Abquetsch-Techniken
(membrane filter mating techniques).
Die Abtrennung der Zellen aus dem abgeführten Teil des Kulturbodens
kann auf irgendeine geeignete Weise erfolgen. Die Zellen können z.B. unter Verwendung eines Querstrom-Mikrofiltrations-Membran-Systems
(cross-flow microfiltration membrane system) abgetrennt werden, vorzugsweise unter Verwendung
einer Membran mit einer Porengröße in der Größenordnung von 0,6 Mikron.
Alternativ können die Zellen in einer Zentrifuge oder in Hydroclon-Serien (series of hydroclones) abgetrennt werden.
Wenn flockenartige Zymomonas mobilis-Zellenverwendet werden,
können diese vom Kulturboden abgetrennt werden, indem man sie in einem Absetzgefäß oder in Hydroclon-Serien absetzen
läßt.
Die Zymomonas mobilis-Stämme, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, wurden in der Amerikanischen Sorten-Kultur
Sammlung (American Type Culture Collection), 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt
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und wurden mit den folgenden Hinterlegungsnummern und Daten gekennzeichnet:
Spezifikation ATCC-Hinterlegungs- Hinterlegungs-Nummer
" Datum
26.Februar 1981 26.Februar 1981
26.Februar 1981
CP 4 | 31821 |
ZM481 | 51823 |
ZM4O1 | 31822 |
Beispiele |
In den folgenden Beispielen wurde das Bakterium Zymomonas mobilis in einem Gärungsmedium kultiviert, welches die
folgenden Nährstoffkonzentrationen enthielt:
100-300 g/l Glucose
5 g /1 Hefeextrakt
1 g /1 (NH4)2SO4
1 g /1 KH2PO4
0,5 g/l MgSO4.7H2O
5 g /1 Hefeextrakt
1 g /1 (NH4)2SO4
1 g /1 KH2PO4
0,5 g/l MgSO4.7H2O
Die Kulturen der verschiedenen Zymomonas mobilis-Stämme wurden
durch wöchentliches Aufbringen auf frische Agar-Platten (agar slants), welche 20 g Glucose, 10 g Hefeextrakt und
20 g Agar enthielten, bei einem pH-Wert von 5,0 und Lagerung bei Raumtemperatur aufrechterhalten.
Das kontinuierliche Gärungssystem wurde bei einer Temperatur von 30 C und einem pH-Wert von 5,0 in einem 1 1-Gärgefäß
belassen. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 N NaOH gesteuert.
In diesen Versuchen wurde das Zellen-Recycling unter Verwendung eines Querstrom-Mikrofiltrations-Membran-Systems, welches
eine "Millipore"-Membran BD mit einer nominalen Porengröße von
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0,6 Mikron enthielt, durchgeführt. Diese Membran hielt
alle Zellen zurück und der durch die Membran gehende Durchfluß war frei von Zellen und enthielt die gleiche
Äthanolkonzentration wie der Inhalt des Gärbottichs (fermenter).
Die Figur 1 zeigt die Anordnung des Fermenters und des Zellen-Recycling-Systems. In dieser Figur bedeutet 10 den
Gärbottich, der mit dem Rührer 11 versehen ist. Der Nährboden
wird in den Fermenter 10 durch die Leitung 12 eingebracht
und durch die Leitung 13 zu einer Pumpe 14 abgeführt und von dort zu einem Tangentialfluß-Mikrofilter
15. Der Durchsatz durch das Filter 15 wird über die Leitung 16 zur Lagerung abgeführt, bevor das Äthanol daraus gewonnen
wird, während das zurückgehaltene Zellenkonzentrat über die Leitung 17 in den Fermenter 10 zurückgeführt wird. Eine
Überflußleitung 18 ist vorgesehen.
Die Tabelle I zeigt die stark verbesserte maximale Äthanol-Produktivität
von drei mittels Zellen-Recycling kontinuierlich kultivierten Zymomonas mobilis-Stämmen im Vergleich zu
zwei Stämmen der Hefe Saccharomyces Cerevisiae.
Organismus | Glucose Konz. (g/i) |
Äthanol Konz. (g/i) |
Maximale Produktivität (g/i/h) |
S. Cerevisiae (ATCC 4126) |
100 | 43 | 29 |
S. Cerevisiae (NRRL Y-132) |
150 | 61 | 32 |
Z. Mobilis (ATCC 10988) |
100 | 45 | 120 |
Z. Mobilis (CP4) |
140 | 65 | 200 |
Z. Mobilis (ZM481) |
180 | 85 | 85 ' |
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Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die kontinuierlichen Kulturen von Zymomonas mobilis mittels Zellen-Recycling
Produktivitäten ergeben können, welche 200 bis 300 % höher sind als die für unter ähnlichen Bedingungen ausgeführten
Hefegärungen. Das bedeutet, daß die Größe der Gärbottiche zur Herstellung von Äthanol in einem entsprechenden Ausmaß
verringert werden kann.
Der Organismus Zymomonas mobilis ZM481 wurde aus dem Stamm
CP4 wie folgt erhalten:
Der Stamm CP4 wurde statisch bei 30 C bis zur exponentiellen
Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 /ug/ml zugefügt und die
Kultur 30 min bei 300C inkubiert. Die Zellen wurden dann
zweimal mit salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und nochmals
über Nacht bei 30 C gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf Böden aufgebracht, die 10 % (v/v) Äthanol enthielten.
Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 30 C bildeten sich Mutantenkolonien in einer Häufigkeit von ca. 10 ,
und diese wurden auf einem ähnlichen Medium gareinigt und dann
auf ihre Wachstums- und Äthanolproduktionsgeschwindigkeiten mit 100, 200 und 250 g/l Glucose bei 30°C in Röhrchen getestet.
Die Kultur, welche in der kürzesten Zeit das meiste Äthanol produzierte, wurde als ZM4 8 bezeichnet.
Eine zweite ähnliche Mutagenese wurde"mit dem Stamm ZM48
durchgeführt, aber die Zellen wurden mit 15 % (v/v) Äthanol überzogen. Der Mutant, der in der kürzesten Zeit das meiste
Äthanol produzierte, wurde als ZM481 bezeichnet, und wurde
als ein Äthanol—toleranter Stamm in der Sortenkultursammlung
(Type Culture Collection) in der School of Biotechnology, University of New South Wales, Sydney, New South Wales,
Australia, aufbewahrt.
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Die Verwendung von flockenartigen Zymomonas mobilis-Stämmen
im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft. Tabelle II vergleicht die Verwendung eines flockenartigen
Stammes von Zymomonas mobilis unter Verwendung einer Absetzsäule
mit einem flockenartigen Stamm von Saccharomyces Cerevisiae,
In der folgenden Tabelle werden die mit einem flockenartigen
Zymomonas mobilis-Stamm erhaltenen Ergebnisse verglichen mit den Ergebnissen für einen flockenartigen Stamm von
Saccharomyces Cerevisiae.
Tabelle | II | Äthanol Konz. (g/i) - |
Maximale Produktivität (g/l/h) |
|
Organismus | Glucose Konz. (g/i) |
43 | 29 | |
S. Cerevisiae | 100 | |||
(ATCC 4126) | 45 | 51 | ||
Z. Mobilis | 100 | |||
(ZM4O1) |
Die flockenartige Mutante ZM401 wurde wie folgt isoliert: eine Kultur des Stammes CP4 wurde in einem reichen Medium,
IM (20 g/l Glucose, 10 g/l Hefeextrakt, 2 g/l KH2PO4)
sLatisch bei 30 C bis zur exponentiellen Wachstumsphase
gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin (NTG) bis zu.einer Endkonzentrabion von 50 /ug/ml zugefügt und die Kultur
1 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal in salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen, und statisch über Nacht
in RM bei 30 C inkubiert. Nach dieser Zeit waren am Boden der Flasche einige kleine körnige Flocken sichtbar. Das
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überstehende Medium mit der Mehrheit der Zellen wurde vorsichtig entfernt, und frischen Medium zugefügt. Nach alle
24 h wiederholter Tochterkultivierung (subculturing) während 7 Tagen in der gleichen Weise wurde eine offensichtlich reine
Kultur von körnigen Flocken erhalten. Diese Kultur wurde an RM-Platten zweimal abgestrichen, um sie durch Einzelkolonie-Isolation
(single colony isolation) weiter zu reinigen. Eine Einzelkolonie wurde dann in flüssigem Medium nochmals
getestet, und war noch flockenartig. Sie wurde als der flockenartige Stamm gewählt und als ZM4O1 bezeichnet.
Aus der Tabelle geht hervor, daß ZM4O1 in bezug auf erhöhte
Produktivitäten gegenüber Stämmen von flockenartiger Hefe erhebliche Vorteile besitzt.
Die Tabelle III zeigt die stark erhöhte Äthanolproduktivität bei Verwendung einer kontinuierlichen Kultur mit
Zellen-Recycling von Zymomonas mobilis (ATCC 10988), verglichen
mit der Ansatzkultur und kontinuierlichen Kultur ohne Zellen-Recycling des gleichen Organismus, alle in einem
Medium, das 100 g/l Glucose enthält.
Tabelle III
Kultivierungsart Äthanol-Produktivität
Kultivierungsart Äthanol-Produktivität
(g/l/h)
Ansatz 5
kontinuierlich ' "11
kontinuierlich mit Zellen-Recycling 120
Es ist ersichtlich, daß zwischen der kontinuierlichen Kultur des Organismus und der kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling
eine 10-fache Erhöhung in der Äthanolproduktivität liegt.
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Leerseite
Claims (7)
- Patentanwälte Dirt..-lNck jHXJWkÜskiäaän;: Dipl.-Phys. Dr. K. FinckeDipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Hober Dr. Ing. H. Liska8000 MÜNCHEN 86, DEN-K POSTFACH 860 820 DH/SM/Hl MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/2228974UN-ISEARCH LIMITED,221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, AustralienKontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Äthanol mittels Zellen-RecyclingPatentansprücheVerfahren zur Herstellung von Äthanol aus einem ein vergärbares Kohlenhyärat enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man Zymomonas mobilis im Kulturboden kontinuierlich kultiviert, einen Teil des" Kulturbodens kontinuierlich oder periodisch abführt und durch einen frischen Kulturboden ersetzt, von dem abgeführten Teil des Kulturbodens die darin enthaltenen Zellen von Zymomonas mobilis abtrennt, diese Zellen in den Kulturboden zurückführt, und das in dem Teil des Kulturbodens, von dem die Zellen abgetrennt wurden, enthaltene Äthanol gewinnt.130064/0633
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vergärbare Kohlenhydrat ausgewählt ist aus der Gruppe Glucose, Fructose und Sucrose.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zymomonas mobilis-Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe CP4, ZM481 und ZM4O1.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bi.s 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von dem abgeführten Teil des Kulturbodens durch Filtration abgetrennt werden.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen flockenartig sind und von dem abgeführten Teil des Kulturbodens in einem Absetzgefäß abgetrennt werden.
- 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kulturboden bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 C gehalten wird.
- 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturbodens zwischen 3,7 und 8 gehalten wird.130064/0633
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