DE3028248A1

DE3028248A1 - Emulgierte antigenzubereitung aus bacteroides nodosus und aluminiumadjuvans und ihre verwendung als impfstoff

Info

Publication number: DE3028248A1
Application number: DE19803028248
Authority: DE
Inventors: Charles Michael Thorley
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1979-07-27
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1981-02-19
Also published as: NL8004297A; ZA804525B; IT8049346A0; FR2462166A1; AU6074980A; NZ194448A; IT1128549B; CA1153310A; AU529322B2; FR2462166B1; BE884487A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE Postfach 860245 · 8000 München 86 3028248

Anwalts-Akte: 31 036 25. Ju//

THE WELLCOME FOUNDATION LTD.

18 3-19 3 EUSTON ROAD LONDON N.W.l / GROSSBRITANNIEN

Emulgierte Antigenzubereitung aus Bacteroides nodosus und Aluminiumadjuvans und ihre Verwendung als Impfstoff

P (089) 988272 Telegramme: « AAAAA * λ μ α Λ Bankkonten: Hypo-Bank München 4410122850

988273 BERGSTAPFPATElWMuMhM''' ö/U/ββ (BLZ 700200 U) Swift Code: HYPO DE MM

988274 TELEX: Bayen Vereinsbank München 453100 (BLZ 70020270) 983310 0524560BERGd ' Postscheck München 65343-808 (BLZ 70010080)

B e s chreibung

Die Erfindung betrifft Antigenzubereitungen, daraus gewonnene Impfstoffe, deren Herstellung sowie ihre Verwendung zur Verhinderung und Behandlung von Moderhinke (Fußfäule), insbesondere bei Schafen.

Moderhinke bei Schafen ist eine weitverbreitete ansteckende Krankheit, die das epidermale Gewebe des Fußes befällt und durch die synergistische Wirkung zweier gramnegativer anaerober Bakterien, nämlich Bacteroides nodosus (Fusiformis nodosus) und Fusobacterium necrophorum (Fusiformis necrophorum) verursacht wird. Die Erkrankung tritt nur auf, wenn diese beiden Organismen vorhanden sind.

F.necrophorum findet sich normalerweise im Verdauungstrakt und wird mit den Faeces ausgeschieden, so daß der Organismus gewöhnlich in der unmittelbaren Umgebung der Füße des Schafes vorhanden ist und an der Infektion partizipieren kann. B.nodosus andererseits ist nicht in der Lage, unter normalen Bedingungen mehr als einige Tage außerhalb der Moderhinke-Schädigungen zu überleben. Der infizierte Fuß ist sein einziges natürliches Habitat und B.nodosus wird folglich häufig als der spezifische Verursacher der Erkrankung beschrieben. Die Eliminierung von B.nodosus in einer Schafherde, die durch Heilung aller vorhandenen Moderhinkefälle oder durch die spezifische Vernichtung des Organismus erreicht werden könnte,

-/7

130008/0789

würde zur Ausrottung der Krankheit führen, da F.necrophorum in Abwesenheit von B.nodosus die Moderhinke nicht verursachen kann.

In der Vergangenheit wurde die Moderhinke durch Isolierung der erkrankten Tiere und anschließende Behandlung unter Kontrolle gehalten, was weitgehendes Abschälen der befallenen Fußflächen und äußerliche Anwendung von Desinfektionsmitteln oder äußerliche oder parenterale Verabreichung geeigneter Antibiotika einschloß. In jüngerer Zeit ermöglichte die erfolgreiche Großkultur von B.nodosus die Impfung von Schafen mit Vaccinen mit Emulsions- oder Aluminiumadjuvans, vgl. z.B. GB-PS 1 375 544. In vielen Fällen, in denen solche Vaccine verwendet wurden, wurde jedoch nur eine unvollständige Kontrolle der Krankheit erzielt, und es wurden intensive Anstrengungen unternommen, um den Grund des Versagens festzustellen und die Wirksamkeit der vorhandenen Vaccine zu verbessern.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine erfindungsgemäße Antigenzubereitung einen höheren Antikörpertiter und eine bessere Kontrolle der Erkrankungen ermöglicht, als die bisher verwendeten B.nodosus-Vaccine. Die Erfindung betrifft daher eine Antigenzubereitung aus einer 2-Phasen Wasser-in-Öl-Emulsion, die in der wässrigen Phase der Emulsion aus Bacteroides nodosus-Organismen gewonnenes oder daraus bestehendes Antigenmaterial sowie ein Aluminiumadjuvans enthält.

130008/0789

Das Antigenmaterial der Zubereitung kann einen immunogenen Extrakt der Organismen enthalten, vorzugsweise enthält es jedoch die ganzen abgetöteten Organismen in Form einer Anakultur (mit Formalin behandelte Ganzkulturen) oder aus der Kultur gewonnener Zellen. Es kann jeder immunogene Stamm oder Variante bzw. jede Kombination einer Anzahl von Stämmen und/ oder Varianten, die für einen oder mehrere B.nodosus Serotypen repräsentativ sind, verwendet werden. Zufriedenstellenden Schutz erhielt man insbesondere durch Verwendung von Organismen aus fimbrierten Kolonien, in denen die Organismen stark piliert sind (vgl. J.A. Short et al., J.appl.Bact. 1976, 4Ό, 301-315).

Frisch isolierte B.nodosus-Organismen, die auf festen Medien gezüchtet werden, sind stark piliert, und bei der Ausführung der Erfindung sollten die Wachstumsbedingungen in Flüssigkulturen so gewählt werden, daß die maximale Pilierung sichergestellt ist, um so die Wirksamkeit der resultierenden Vaccine zu fördern. Unter den hier beschriebenen stark pilierten B.nodosus-Organismen versteht man Organismen, die pro Organismus mindestens 20 PiIi, vorzugsweise über 100 PiIi besitzen. Für maximale Wirksamkeit sollten die Antigenzubereitungen und die daraus gewonnenen Vaccine vollständig aus stark pilierten B.nodosus-Varianten bestehen, praktisch erhält man jedoch ausreichenden Schutz, wenn 90% der Organismen stark pilierte Varianten sind. Die stark pilierte Varian-

-/9

130008/0789

te von Stamm CSIRO Nr. 19 8 (Wellcome Laboratories Culture No 6476) (registriert bei American Type Culture Collection am 19.7.19 79 unter Nr. 3145) ist besonders wertvoll. Vorzugsweise wird Schutz gegen homologe Infektion geboten (d.h. Infektion mit einem oder mehreren Serotypen, die Homologe des bzw. der B.nodosus Serotypen der Zubereitung sind), da der Schutz gegen heterologe Infektion schwächer ist. Eine Infektion mit Organismen, die für mehr als einen B.nodosus Serotyp repräsentativ sind, wird daher vorzugsweise mit einer Zubereitung bekämpft, die mehr als einen Stamm enthält, wobei diese sämtliche Serotypen der InfektionsOrganismen enthalten.

Die in den erfindungsgemäßen Zubereitungen zu verwendenden B.nodosus-Organismen können mit jedem bekannten Verfahren gezüchtet oder kultiviert werden, z.B. mit dem in GB-PS 1 375 544 beschriebenen; ferner mit den von Short et al. (siehe oben) beschriebenen Verfahren, mit denen stark pilierte Organismen erzeugt werden.

Das Aluminiumadjuvans fördert von sich aus die Antikörperreaktion auf das Antigenmaterial und kann aus den bekannten Stoffen wie Kalialaun, Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat gewählt werden. Besonders bevorzugt werden thixotrope ß-Typ Aluminiumhydroxidgele, die in Abwesenheit von Elektrolyten positiv geladen sind. Ein solches Gel ist z.B. "Alhydrogel" (Handeslbezeichnung). Vorzugsweise enthalten die

-/10

130008/0789

Zubereitungen 0,2 5 bis 4,0 Vol.% des Aluminiumadjuvans.

Die Emulsion hat eine einzige kontinuierliche ölphase und eine einzige dispergierte wässrige Phase (d.h., es handelt sich um eine 2-Phasen Wasser-in-öl-Emulsion), und sie kann unter Verwendung von einem oder mehreren Emulgiermitteln und einem Öl hergestellt werden. Selbstverständlich müssen die in die Zubereitungen aufzunehmenden Emulgiermittel nichttoxisch und mit den Antigenkomponenten des Impfstoffs verträglich sein. Vorzugsweise sind sie nicht-ionisch, so daß eine geringere Tendenz besteht, daß sie durch Komponenten der Antigenzubereitung ausgefällt werden, als wenn ein kationisches oder anionisches Emulgiermittel verwendet wird. Bei Verwendung eines nicht-ionischen Emulgiermittels ist auch die Gefahr einer Denaturierung des Antigenproteins geringer. Kombination, Menge und Verhältnis der Emulgiermittel sollten bei Aufnahme in d.en Impfstoff so gewählt werden, daß sie eine maximale Förderung der Antigenwirksamkeit und der Stabilität der Emulsion bewirken, und vorzugsweise sollten ein lipophiles und ein hydrophiles Emulgiermittel vorhanden sein.

Bei den lipophilen Emulgiermitteln handelt es sich vorzugsweise um nicht-ionische Surfaktanten mit einem niedrigen hydrophilen-lipophilen Gleichgewicht (HLB) zwischen 8 und 20 (William C. Griffin, "Calculation of HLB values of non-ionic surfactants", Journal of the Society of Cosmetic Chemists

-/11

130008/0789

(1954) Vol. 5, S. 24-9-256; Osipow, Surface Chemistry, ACS Monograph 153, S.295-314, Reinhold, 1962). Dies ist die Obergrenze der HLB-Werte von Emulgiermitteln, die am besten für die Aufnahme in die ölphase geeignet sind; eine optimale Grenze der HLB-Werte liegt bei 2 bis 6. Zu den geeigneten lipophilen Emulgiermitteln gehören Di- und Triester mehrwertiger Alkohole und Fettsäuren, oxidierte fette öle, und partielle Ester von gewöhnlichen Fettsäuren, z.B. Palmitin-, Laurin-, Stearin- und Oleinsäuren mit Hexitolanhydriden, die von Sorbitol oder Mannitol gewonnen werden. Spezifische Emulgiermittel sind z.B. Mannitan- und Sorbitanfettsäureester wie Mannidmonooleat (Arlacel A, HLB 4.3), Sorbitanmonooleat (Arlacel 80, HLB 4.3), Sorbitanmonopalmitat (Arlacel 40, HLB 6.7), Sorbitanmonostearat (Arlacel 60, HLB 4.7), und Sorbitansesquioleat (Arlacel C, HLB 3.7).

Die in den Zubereitungen zu verwendenden hydrophilen Emulgiermittel sollten vorzugsweise einen HLB-Wert zwischen etwa 9 und 20, optimal zwischen 11 und 18 haben. Geeignete Stoffgruppen sind Polyglycolfettsäureester, modifizierte Polyoxyethylenfettsäureester, Polyoxyethylen-Polyolfettsäureester, Polyoxypropylenfettalkoholäther und Polypropylenglycolfettsäureester. Eine besonders brauchbare Stoffgruppe sind Polyoxyalkylenderivate von mehrwertigen Alkoholfettsäureestern, wie die Polyoxyethylenderivate von partiellen Estern der Laurin-, Palmitin-, Stearin- und Oleinsäuren

mit Hexitolanhydriden. Beispiele für Emulgiermittel sind:

130008/0789

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaureat (Tween 20, HLB 16.7), Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat (Tween 40, HLB 15.6), Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonostearat (Tween 60, HLB 1H.9), Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat (Tween 80, HLB 15), Polyoxyethylen-(20)-sorbitantrioleat (Tween 85, HLB 11.0) und Polyoxyethylen-(8)-laureat (G 2127, HLB 12.8).

In den erfindungsgemäßen Zubereitungen kann jedes nicht-toxische Pflanzen- oder Mineralöl verwendet werden, das mit dem Antigenmaterial verträglich ist. Mineralöle pharmazeutischer Qualität werden besonders bevorzugt, da sie im allgemeinen eine wesentlich stabilere Emulsion und eine geringere Gewebeirritation erzeugen. Leichte flüssige Paraffinöle (Bayol F und Drakeol No 6R) ergaben zufriedenstellende Emulsionen und Zubereitungen.

Die Flüssigkeit der wässrigen Phase kann aus dem Kulturmedium oder, wenn die Zellen extrahiert oder aus der Kultur gewonnen werden, aus wässriger Salzlösung oder Wasser bestehen.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können mit jedem bekannten Verfahren zur Herstellung von Emulsionen biologischer Materialien zubereitet werden, z.B. durch kräftiges Verrühren eines wässrigen Antigen/Aluminiumadjuvans-Gemisches mit dem Öl und dem bzw. den Emulgiermitteln. Das wässrige Antigen/ Aluminiumadjuvans-Gemisch wird hergestellt, indem man die

-/13

130008/0789

B.nodosus-Organismen z.B. mit Formalin inaktiviert, die Kultur oder Anakultur mit einem der bekannten Verfahren auf etwa 30%, jedoch nicht weniger als 10% des Volumens der ursprünglichen Kultur konzentriert und dem wässrigen Antigen das Aluminiumadjuvans zugibt. Das Aluminiumadjuvans kann nach dem Konzentrieren zugegeben werden, es kann aber auch für das Konzentrationsverfahren selbst ein Aluminiumadjuvans verwendet werden. Ein Beispiel für das erstere Verfahren ist die Präcipitation am isoelektrischen Punkt, ein Beispiel für das zweite Verfahren die Co-Präcipitation mit einem Ausflockungsmittel.

Die Präcipitation am isoelektrischen Punkt ist besonders für Antigenmaterial geeignet, das stark pilierte B.nodosus-Organismen enthält. Bei diesem Verfahren wird der pH der Kultur oder Anakultur durch Säurezugabe auf etwa den isoelektrischen Punkt der Zellen abgesenkt, obwohl auch ein niedrigerer pH verwendet werden kann. Geeignete Säuren können aus Mineralsäuren wie Salzsäure, Phosphor- und insbesondere Schwefelsäure, sowie starken organischen Säuren wie Essig- oder Milchsäure gewählt werden. Der pH liegt zweckmäßig unter 6,0, vorzugsweise unter 5,6, am besten zwischen 4,8 und 5,2. Bei einem pH unter 4,8 sollte die Präcipitation vollständig sein, je nach dem verwendeten Antigenmaterial kann jedoch eine Schädigung des Antigens eintreten. Nach Absenken des pH sollte die Temperatur der Kultur oder Anakultur auf 4 bis 12 C gesenkt werden.

-/14

130008/078S

30282Α8

Die Co-Präcipitation unter Verwendung eines Ausflockungsmittels kann erreicht werden, wenn man eine sterile Lösung des Ausflockungsmittels zu der Anakultur gibt und den pH z.B. mit Alkali so einstellt, daß man eine optimale Präcipitation erhält. Nach dem Absetzenlassen in der Kälte (etwa 2 Tage oder mehr) wird die klare überstehende Flüssigkeit entfernt, wodurch eine Konzentration von Zellen und eiweißhaltigem Material (einschließlich PiIi) in der Anakultur bewirkt wird. Obwohl eventuell etwas Ausflockungsmittel mit dem Überstand entfernt wird, ist die zur Ausfällung verwendete Menge vorzugsweise zu beschränken, denn je größer sie ist, umso mehr erscheint davon im Präcipitat (Zellkonzentrat) und umso mehr Irritation wird von dem späteren Impfstoff erzeugt. Geeignete Ausflockungsmittel sind u.a. Sulphate, Chloride und unlösliche Hydroxide mit mehrwertigen Kationen, sowie polyanionische Polymere wie Natriumcarboxymethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Für die vorliegende Erfindung ist Kalialaun besonders geeignet, da dieses auch die Funktion des Aluminiumadjuvans ausüben kann. Es wurde gefunden, daß bei Zugabe von 1 Volumen 10% Gew./Vol. Kalialaun zu 7 Volumen Anakultur (1,25% Gew./Vol. Alaun insgesamt) und bei Einstellung des pH auf 5,4 sich ein Präcipitat mit geeigneten Eigenschaften und eine klare überstehende Flüssigkeit entwickeln. Je höher der pH (z.B. 5,8, 6,H), umso langer ist die Zeit bis zur vollständigen Klärung des Oberstandes. Je geringer die Alaunkonzentration, umso länger ist die Klärungszeit. Auch die Präcipitatmasse hängt von der dem

-/15

130008/0789

System zugegebenen Alaunmenge ab; so ergibt die Zugabe von 1 Volumen 10% Gew./Vol. Alaun zu 11 Volumen Anakultur (0,83% Alaun Gew./Vol. insgesamt) ein kaum zureichendes Präcipitat mit einer unangenehm langen Niederschlagszeit, während die Zugabe von 1 Volumen Alaun zu 4 Volumen Anakultur (2,0% Alaun Gew./Vol.) ein sehr umfangreiches Präcipitat ergibt, das sich ohne Zentrifugieren nicht ausreichend gut absetzt, um für die Zellgewinnung brauchbar zu sein. Auf ähnliche Weise bleibt die gereinigte Aluminiumhydroxidsubstanz "Alhydrogel" (Handelsbezeichnung) bei der Zugabe zu B.nodosus Anakulturen lange Zeit in der dispergierten Phase, so daß die Gewinnung von absorbierten Zeilen/Protein durch Zentrifugieren erfolgen muß.

Ein weiteres Verfahren zur Konzentration der Kultur oder Anakultur ist neben dem Zentrifugieren die Ultra-FiItration, und jedes dieser beiden Verfahren kann zusammen mit der Präcipitation am isoelektrischen Punkt bzw. der Co-Präcipitation angewandt werden. Ist in dem Antigenmaterial mehr als ein B.nodosus Serotyp enthalten, wird ein wässriges Antigen/ Aluminiumadjuvans-Gemisch wie oben beschrieben für jeden Stamm bzw. jede Variante hergestellt, dann werden vor der Emulgierung etwa gleiche Mengen jedes Gemisches miteinander vermischt. Vorzugsweise stellt man die Emulsion her, indem man das öl mit dem lipophilen Emulgiermittel und die wässrige Antigen/Aluminiumkomponente mit dem hydrophilen Emulgiermittel

-/16

130008/0789

mischt und dann Öl und wässrige Phasen kombiniert. Vorzugsweise wird die wässrige Phase langsam und unter Rühren zu der Ölphase gegeben, um jede Tendenz zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Emulsion so klein wie möglich zu halten. Feinere Dispergierungen der wässrigen Phase erhält man durch Homogenisieren oder Mahlen in einer Kolloidmühle; dieses Verfahren kann durchgeführt werden, bis keine weitere Verringerung der Partikelgröße mehr eintritt.

Das optimale Verhältnis der öl-zur Wasserphase in einem Impfstoff ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, so z.B. der Konzentration des Antigenmaterials in der wässrigen Phase, der gewünschten Viskosität des Impfstoffs, sowie der Antigenwirksamkeit des Antigenmaterials. Vorzugsweise macht die wässrige Phase nicht mehr als 60% und nicht weniger als 10% des Gesamtvolumens der Emulsion aus. Ein größerer Wasseranteil ist wegen erhöhter Viskosität und Instabilität der Emulsion unerwünscht, während ein Anteil von weniger als 10% die Incorporation einer ausreichenden Antigenmenge erschwert, ohne daß man unannehmbar große Dosisvolumen benötigt. Es wurde gefunden, daß man zufriedenstellende Impfstoffe erhält, wenn die wässrige Phase 20 bis 50 Vol.% des gesamten Impfstoffs ausmacht. Wird ein großer Wasseranteil von z.B. über 40% benötigt, dann sind Vorkehrungen zur Verhinderung der Bildung einer Öl-inWasser-Emulsion und der Instabilität der Emulsion zu treffen. Es wurde gefunden, daß solche Emulsionen, die Polyoxyehtylen-

-/17

130008/0789

(20)-sorbitantrioleat enthalten, durch die Zugabe von Falba stabilisiert werden können. Es ist dies ein Stabilisator, der Bienenwachs-Paraffinöl verschiedener Viskositäten und aus Lanolin extrahierte Oxycholesterine enthält.

Die in den jeweiligen Phasen benötigte Emulgiermittelmenge hängt von einer Reihe von Faktoren, insbesondere von den HLB-Werten der Emulgiermittel und dem gewählten öl ab; schätzungsweise ergeben 2,5 bis 15 Vol.% eines lipophilen Emulgiermittels und 0,5 bis 10,0 Vol.% eines hydrophilen Emulgiermittels in den jeweiligen Phasen Impfstoffe mit den hier beschriebenen Eigenscnaften. Eine beträchtliche Steigerung der Antigenwirksamkeit der Antigene erhielt man, wenn die jeweiligen Emulgiermittel 5 bis 12 Vol.% der ölphase und 0,2 bis 7 Vol.% der wässrigen Phase darstellen.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zu einem zur Verabreichung geeigneten Impfstoff zubereitet werden, indem man die Zubereitungen in einer geeigneten Konzentration als steriles Präparat in einen Behälter einschließt.

Es ist notwendig, die Zubereitung nach dem Emulgieren zu sterilisieren oder die einzelnen Komponenten zuerst zu sterilisieren und dann unter sterilen Bedingungen zu emulgieren. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen bzw. ihre Komponenten können mit Hilfe von Hitze und Filtration, oder mit Gammabestrah-

lung ohne Verlust an Wirksamkeit oder Stabilität sterilisiert werden. -/18

130008/0789

Der fertige Impfstoff wird in sterile Behälter abgefüllt und versiegelt. Es ist erwünscht, daß der Impfstoff einen Bakteriostaten enthält, wie er im allgemeinen bei Impfstoffen aus abgetöteten Bakterien verwendet wird. Zu diesem Zweck kann in die wässrige Phase der Zubereitung 0,01% (Gew./Vol.) Thiomersal (Natriumethylmercurithiosalicylat) aufgenommen werden.

Zweckmaßigerweise enthält das fertige Impfstoffpräparat insgesamt 2,5x10 bis IxIO¹¹, am besten IxIO⁸ bis l,25xl0⁹ abgetötete Organismen pro ml des Präparats.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden den Tieren am besten durch subkutane, intramuskuläre oder intraperitcneals Injektion verabreicht. Es ist vorteilhaft, den Impfstoff an einer Stelle zu verabreichen, an der jede lokale Reaktion für den Züchter unbedenklich ist, so z.B. an der vorderen dorsalen Region des Halses oder am Unterkiefer. Der am meisten bevorzugte Dosie-

8 11 rungsbereich liegt zwischen 1x10 und 1x10 abgetöteten Orga-

8 10

nismen pro Dosis, insbesondere zwischen 1x10 und 1x10 , wobei die Dosis die Gesamtmenge des Antigenmaterials ist, das einem Tier, wie z.B. einem Schaf» auf ein Mal in einer geeigneten Flüssigkeitsmenge, z.B. 1 bis 2 ml, verabreicht wird. Die Impfstoffdosis kann einem Tier als Einzeldosis oder als eine Vielzahl von Teildosen gegeben werden, wobei diese letzteren über einen bestimmten Zeitraum oder durch gleichzeitige Injektionen an verschiedenen Stellen verabreicht werden können.

130008/0789

Ein geeigneter Immunisierungsplan kann eine einzige Injektion der ganzen Dosis oder zwei Injektionen vorsehen, von denen jede eine Teildosis enthält, und die gleichzeitig an verschiedenen Körperstellen des Tiers verabreicht werden. Der optimale Dosierungsplan variiert selbstverständlich je nach den für die Basis des Impfstoffs gewählten Stämmen der Organismen, der Gesamtzahl der verwendeten Organismen, der Art des Adjuvans und dem Verabreichungsweg. Es erwies sich als besonders günstig, einen Impfstoff, der 3x10 Organismen/ml enthielt, in einer einzigen 1 ml oder 2 ml Dosis subkutan zu verabreichen und nach mindestens 6, vorzugsweise 12 Wochen eine 2. Injektion mit gleichem Volumen, der gleichen Stärke und auf dem gleichen Weg folgen zu lassen. Auffrischungsdosen sollten direkt vor der voraussichtlichen saisonalen Ausbreitung der Moderhinke gegeben werden.

Ein erfindungsgemäßes Vaccin kann außer dem von B.nodosus gewonnenen Antigenmaterial auch Antigenmaterial enthalten, das von anderen Bakterien gewonnen wurde, die krankheitsverursachende Organismen z.B. in Schafen sind, so insbesondere von F.necrophorum und Clostridia. Eine besonders bevorzugte Kombination ist ein Mehrkomponenten-Impfstoff, der ein Präparat von einem oder mehreren Clostridia-Antigenen, wie in GB-PS 1 143 545 beschrieben, zusammen mit einer wie hier beschrieben hergestellten B.nodosus Antigenzubereitung enthält.

-/20

130008/0789

Die Erfindung betrifft also

a) eine Antxgenzubereitung, die eine 2-Phasen Wasser-in-öl-Emulsion enthält, in der von Bacteroides nodosus-Organismen gewonnenes oder daraus bestehendes Antigenmaterial sowie ein Aluminiumadjuvans in der wässrigen Phase der Emulsion enthalten sind.

b) Ein Verfahren zur Herstellung einer Antxgenzubereitung gemäß a), dadurch gekennzeichnet, daß ein wässriges Medium, welches von B.nodosus-Organismen gewonnenes oder daraus bestehendes Antigenmaterial und ein Aluminiumadjuvans enthält, mit einem öl emulgiert wird.

c) Ein Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er ein steriles Präparat einer unter a) definierten Zubereitung enthält.

d) Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung einer Moderhinkeinfektion bei Schafen, dadurch gekennzeichnet, daß den Schafen eine wirksame, nicht-toxische Dosis eines Impfstoffs gemäß c) oben verabreicht wird.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Referenzbeispiel 1 Wachstum von Organismen

B.nodosus (Stamm CSIRO 19 8) Organismen aus ausgesäten Kulturen wurden in Medium inocculiert (vgl. Thorley, CM. (1976) J.Appl.Bact. 40, 301-309, Seite 302), das in Flaschen mit

-/21

130008/0789

Schraubverschluß enthalten war, und die Luft wurde durch ein Gemisch aus 10% Kohlendioxid und 90% Stickstoff verdrängt. Die Kulturen wurden 20 bis 40 h bei 37 ⁰C gehalten, und die Organismen durch Zugabe von Formalin (0,5 Gew.%) abgetötet. Untersuchung der Organismen unter dem Elektronenmikroskop ergab, daß mindestens 90% stark piliert (>100 PiIi pro Organismus ) waren.

Beispiel 2
Antigenzubereitung

3200 ml einer mit Formalin behandelten Anakultur stark pilierter B.nodosus-Organismen, die wie in Beispiel 1 beschrieben ge wonnen wurde, wurde mit 320 ml einer wässrigen Lösung (10% Gew./Vol.) von Kalialaun behandelt, und der pH des Gemisches wurde durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid (40% Gew./ Vol.) auf 6,2 eingestellt. Nachdem das Gemisch 24 Stunden bei 4 C gehalten wurde, wurde die überstehende Flüssigkeit über den ausgefällten Organismen entfernt, bis das Volumen auf 1200 ml reduziert war.

30 ml Tween 80 (40 Vol.%ige wässrige Lösung) und 1,2 ml Thiomersal (10%ige wässrige Lösung) wurden zugegeben und das Gemisch mit 2,8 1 eines Gemisches aus Arlacel A (10 Vol.%) und Marcol (90 Vol.%) emulgiert.

-/22

130008/0789

Beispiele 3 bis 6 Antigenzubereitungen

Stark pilierte B.nodosus-Organismen wurden mittels Präcipitation am isoelektrischen Punkt gesammelt, indem man die Anakulturen mit einer ausreichenden Menge verdünnter wässriger Schwefelsäure behandelte, um den pH auf 5,0 abzusenken. Nach 3-tägigem Stehen bei 16 bis 20 ⁰C wurden die Organismen 9- bis 10-fach durch Abschütten von 133,7 1 Überstand konzentriert. Die Organismen wurden für die Herstellung von Impfstoffrezepturen der Beispiel 3 bis 6, Tabelle I, verwendet.

In jedem Fall wurde die konzentrierte Anakultur (Spalte 3) mit wässriger Natriumchloridlösung verdünnt und dem wässrigen Gemisch wurde Thiomersal (Spalte 7) zugegeben, um vor der Emulgierung mit dem Öl (Spalte 8) eine Konzentration von 0,01 % Gew./Vol. zu erhalten. In den Beispielen 4 bis 6 wurde der pH nach der Zugabe des hydrophilen Emulgiermittels eingestellt.

Beispiel 7
Antigenzubereitung

Mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde eine weitere Zubereitung unter Verwendung von stark pilierten B.nodosus-Organismen (wie in Beispiel 1 gewonnen) hergestellt. Näheres vergleiche Tabelle I.

1 30008/0789

LO	4
O
O
O	5
00
O	6
00	7
(D

Tabelle I

Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3 Spalte 4 Spalte 5 Spalte 6 Spalte 7 Spalte 8

Beisp. Anakultur Konzen- Verdünnung Zugabe pH Hydrophi- Wässriges "Öl"-Vol. Nr. (Volumen, tration m.wässriger von eingestellt les Emul- Gesamtvo- (1) ml) (-fach) Natriumchlo- Alumini- auf giermittel lumen (I)

ridlösung umadjuvans (0,9% Gew. /VoI.)

3 200

200 300 500

6 1

10	700	ml	Kalialaun (154 ml; 10% Gew. /VoI.)	6,1
10	644	ml	AH (210 ml)	6,1
9,2	1,7	1	AH (500 ml)	6,1
9,2	1,5	1	AH (500 ml)	6,1
3			Kalialaun (1,2 1; 10% Gew. /VoI.)	6,2

T80	1,054	2,459
(13,3 ml)
T80	1,054	2,459
(13,3 ml)
T80	2,5	2,5
(62,5 ml)
T80	2,5	2,5
(62,5 ml)
T80	3,078	7,0
(75 ml)

Anmerkungen: T80 Sorbitanmonooleat ("Tween 80")-Lösung (40 Vol.%) AH: Thixotropes 3-Typ Aluminiumhydroxidgel ("Alhydrogel")

"Öl": Dieses enthält ein Gemisch aus Mannidmonooleat ("Arlacel A") ,

(10 Vol.%) und "Marcol" (90 Vol.%) ^

Beispiel 8 Impfstoffe

Die in den Beispielen 3 bis 7 beschriebenen Zubereitungen können in sterile 1, 2 oder 10 ml Ampullen abgefüllt, versiegelt und mit Gammabestrahlung sterilisiert werden.

Beispiel 9 Wirksamkeit

In diesem Experiment wurden 4 Gruppen von je 5 Schafen subkutan am Unterkiefer mit 2 ml wie in Beispiel 2 hergestelltem Impfstoff (Impfstoff A) sowie 3 anderen Impfstoffen (B, C und D) geimpft. 6 Wochen später wurde allen Schafen eine zweite Impfstoffdosis verabreicht, die in jeder Beziehung der ersten gleich war, und fünf Schafe aus jeder der Impfstoffgruppen wurden infiziert, indem eine Lebendkultur des ImpfstoffStammes direkt auf jeden (prädisponierten) Fuß aufgebracht wurde. Anschließend wurde jede Gruppe von 5 Schafen in monatlichen Abständen infiziert, so daß die letzte Infizierung 12 Wochen nach der 2. Impfung stattfand. 3 Wochen nach jeder Infizierung wurden die Füße auf das klinische Bild der Moderhinke untersucht. Ein Ergebnis von 1 oder mehr mit unterlaufener Moderhinke befallenen Füßen oder schwerer Zwischenzehendermatitis an zwei oder mehr Füßen von 2 oder mehr der 5 Tiere wurde als Versagen des Impfstoffes wegen unzureichendem Schutz eingestuft, und dieser Impfstoff wurde nicht mehr weiter getestet.

-/25

130008/0789

Die 4 experimentellen Impfstoffe A, B, C und D wurden parallel im Vergleich mit einer nicht-geimpften Kontrollgruppe von Schafen getestet, um die Virulenz der Infektionskultur zu prüfen. Es wurden 5 Gruppen von 4x5 Schafen verwendet. Blutproben wurden nach 0 und 6 Wochen und zum Zeitpunkt der Fußuntersuchung entnommen. Es wurden Agglutinationstiter bestimmt und geometrische Mittelwerttiter gefunden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Der erfindungsgemäße pilierte Alaun/Öl-Impfstoff A war demnach der einzige, der bei der vierten Infizierung Schafen Schutz gewährte. 2 Wochen nach der Fußuntersuchung waren die Fußschäden bei dem einen Schaf dieser Impfstoffgruppe, das infiziert worden war, abgeheilt, während die Erkrankung bei den 5 Kontrollschafen so schwer wie zuvor war.

Ferner wurde ein deutlicher Unterschied zwischen den Serumagglutinationstitern von Schafen, die mit Impfstoff A immunisiert worden waren, und solchen, die andere Impfstoffe erhielten, festgestellt.

Infektion 2 war unbrauchbar, da 3 Kontrollschafe nicht erkrankten. Infektion 4 war sehr stark, die Kontrollschafe waren bei einer vorläufigen Untersuchung 10 Tage nach der Infizierung ernsthaft infiziert.

-/26

130008/0789

Tabelle II

Infektion 1

Infektion 2

Infektion 3

Infektion 4

Impfstoff

Befallene Befallene Befallene Befallene Schafe Titer Schafe Titer Schafe Titer Schafe Titer

	A Piliert (m.Alaun/ Öl-Adjuvans)	0/5	59	020	0/5
	B Nicht piliert (m.Alaun/ Öl-Adjuvans)	0/5	33	630	0/5
I 300Oi	C Piliert (Öl-Adju vans )	0/5	11	880	1/5
Ϊ/0789	D Nicht piliert (m. Öl-Ad- j uvans)	0/5	11	890	1/5
	Nicht- geimpfte Tiere	5/5		80	2/5

124 ooo

17 800

8 900

7 759

0/5 40 960 1/5 13 510

2/5 3 880 nicht getestet

1/5 13 490 4/6

560

1/5 1 940 6/6 320
4/5 80 5/5 160

K) OO K)

Dieses Experiment hat erstmals die Möglichkeit aufgewiesen, Schafe durch Impfung gegen Moderhinke für einen Zeitraum von 12 Wochen nach Verabreichung der letzten Dosis zu schützen.

Die Impfstoffe B, C und D waren mit folgenden Ausnahmen mit Impfstoff A identisch:

Impfstoff B: Die Organismen waren nicht virulent und genetisch nicht piliert, d.h. sie besaßen pro Bakterium nicht
mehr als 20 PiIi.

Impfstoff C: Das Aluminiumadjuvans entfiel.

Impfstoff D: Das Aluminiumadjuvans entfiel und die Organismen waren wie in Impfstoff B nicht piliert.

Beispiel 10

Wirksamkeit der Impfstoffe

In diesem Experiment wurden Impfstoffe aus den in den Beispielen 3 bis 7 beschriebenen Zubereitungen mit Impfstoffen verglichen, die als Adjuvans nur Alaun enthielten (Impfstoffe F und G). Moderhinke-freie Schafe wurden entweder mit einer einzigen Dosis eines Impfstoffes der Beispiele 3 bis 7 oder in 6 Wochen Abstand mit 2 Dosen der Impfstoffe F oder G behandelt. In bestimmten Abständen nach der Impfung wurden Gruppen der geimpften Schafe mit nichtgeimpften Kontrollen in Bezug auf ihre Infektionsresistenz gegen künstliche Infizierung mit
einer B.nodosus-Lebendkultur gemäß Beispiel 9 verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III enthalten.

-/28

130008/0789

	3	Impfstoff dosis	Tabelle III	nach Impfung Schafe)	Wochen
	4	(ml)	Infektion (befallene	12 Wochen 15	_
	5	1	8 Wochen	0/4	-
	6	1	1/5	0/5	0/5
Impfstoff	7	2	0/5	-	0/5
Beisp.	7	1	-	-	-
Beisp.		1	0/5	1/5	-
Beisp.		2	0/5	0/5	-
Beisp.	Kontrollen	2x2	U/H	-	-
Beisp.		2x2	4/5	-	4/5
Beisp.	0	4/5	5/5
F	4/5
G

Ende der Beschreibung

1 30008/0789

Claims

Patentansprüche

1. Antigenzubereitung, die eine Emulsion enthält, in der aus Bacteroides nodosus-Organismen gewonnenes oder daraus bestehendes Antigenmaterial enthalten ist, dadurch gekennzeichnet , daß die Emulsion eine 2-Phasen Wasser-in-Öl-Emulsion ist, die das Antigenmaterial und ein Aluminium-Adjuvans in der wässrigen Phase der Emulsion enthält.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die B.nodosus-Organismen, wie beschrieben, stark piliert sind.

3. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die B.nodosus-Organismen die stark pilierte Variante des bei ATCC unter Nr. 314-5 registrierten Stammes enthalten.

U. Zubereitung nach einem der /orhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Aluminiumadjuvans aus Kalialaun, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat gewählt wird.

130008/0789

P (089) 988272 Telegramme: Bankkonten: Hype-Bank München 4410122850

988274 TELEX: Bayet Vereinsbank München 453100 (BLZ 70020270) 3310 05 24 560 BERG d Postscheck München 653 43-808 (BLZ 700100 80)

5. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Aluminiumadjuvans aus Kalialaun und thixotropen β-Typ Aluminiumhydroxidgelen gewählt wird.

6. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsion ein nicht-ionisches Emulgiermittel enthält.

7. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsion ein lipophiles Emulgiermittel enthält.

8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das lipophile Emulgiermittel ein Mannitan- oder Sorbitanfettsäureester ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß das lipophile Emulgiermittel Mannid-Monooleat ist.

10. Zubereitung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das lipophile Emulgiermittel mit 5 bis 12 Vol.% der ölphase der Emulsion vorliegt.

130008/0789

11. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsion ein hydrophiles Emulgiermittel enthält.

12. Zubereitung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das hydrophile Emulgiermittel ein Polyoxyalkylenderivat eines mehrwertigen Alkohol-Fettsäureesters ist.

13. Zubereitung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , daß das hydrophile Emulgiermittel Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat ist.

14. Zubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Emulgiermittel mit 0,2 bis 7 Vol.% der wässrigen Phase der Emulsion vorliegt.

15. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die ölphase der Emulsion ein Mineralöl enthält.

16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß das öl ein flüssiges Paraffinöl ist.

130008/0789

-H-

17. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Phase mit 10 bis 60 Vol.% der Emulsion vorliegt.

18. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Phase mit 20 bis 50 Vol.% der Zubereitung vorliegt.

19. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, da

durch gekennzeichnet, daß das Anti-

7 11 genmaterial mit 2,5x10 bis 1x10 B.] pro ml der Zubereitung vorhanden ist.

7 11 genmaterial mit 2,5x10 bis 1x10 B.nodosus-Organismen

20. Impfstoff mit einem sterilen Präparat einer Antigenzubereitung, die eine Emulsion enthält, in der von Bacteroides nodosus-Organismen gewonnenes oder daraus bestehendes Antigenmaterial enthalten ist, dadurch gekennzeichnet , daß die Emulsion eine 2-Phasen Wasser-in-Öl-Emulsion ist, die das Antigenmaterial und ein Aluminiumadjuvans in der wässrigen Phase der Emulsion enthält.

21. Impfstoff nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß die wässrige Phase der Emulsion einen Bakteriostaten einschließt.

22. Verfahren zur Herstellung einer Antigenzubereitung nach

einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem das von B.nodosus-

130008/0789

Organismen gewonnene oder daraus bestehende Antigenmaterial in einem wässrigen Medium dispergiert, und das wässrige Medium mit einem Öl emulgiert wird, dadurch gekennzeichnet , daß ein Aluminiumadjuvans in diesem wässrigen Medium vorhanden ist.

23. Impfstoff nach Anspruch 20 oder 21 zur Prophylaxe oder Behandlung einer Moderhinke-Infektion bei einem Schaf.

-/6

130008/0789