DE2931148A1 - METHOD FOR PRODUCING EPOXIES USING IMMOBILIZED MICROORGANISMS - Google Patents
METHOD FOR PRODUCING EPOXIES USING IMMOBILIZED MICROORGANISMSInfo
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- DE2931148A1 DE2931148A1 DE19792931148 DE2931148A DE2931148A1 DE 2931148 A1 DE2931148 A1 DE 2931148A1 DE 19792931148 DE19792931148 DE 19792931148 DE 2931148 A DE2931148 A DE 2931148A DE 2931148 A1 DE2931148 A1 DE 2931148A1
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Description
■DR. JOACHIM STEFFENS■ DR. JOACHIM STEFFENS
-3--3-
TElEFON1 (087) 87 25 51 TElEXi 529 830 iltffdPHONE 1 (087) 87 25 51 TElEXi 529 830 iltffd
31. Juli 1979July 31, 1979
Bio Research Center Company, Ltd.Bio Research Center Company , Ltd.
Verfahren zur Herstellung von Epoxiden unter Verwendung von immobilisierten MikroorganismenProcess for the production of epoxides using immobilized microorganisms
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung von Epoxiden unter Verwendung von Mikroorganismen. Im besonderen läßt man erfindungsgemäß immobilisierte Zellen von epoxiderzeugenden Mikroorganismen mit endständige Doppelbindungen aufweisenden Kohlenwasserstoffen in einem wäßrigen Medium reagieren/ um sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffe durch Umwandlung der Doppelbindungen in Epoxidbindüngen zu erzeugen.The invention relates generally to a method for producing epoxides using microorganisms. in the in particular, cells of epoxide-producing microorganisms with terminal double bonds that are immobilized according to the invention are left containing hydrocarbons in an aqueous medium react / around oxygen-containing hydrocarbons by converting the double bonds into epoxy bonds.
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Professional Repräsentativ before the European Patent Office PoitidiKfckonto Manchen Nr. W52O.$53'ftO«rVO VMMw $nch«n Nr. 905200 (BLZ 70020270)Professional Representative before the European Patent Office PoitidiKfckonto Manchen No. W52O. $ 53'ftO « r VO VMMw $ nch« n No. 905200 (BLZ 70020270)
Sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffe mit Epoxidbindungen sind wertvolle Ausgangsstoffe für Synthesen oder Zwischenprodukte für Polymere» wie Textilien oder Kunststoffe, sowie oberflächenaktive Mittel» Anstrichmittel, landwirtschaftliche Chemikalien» Arzneistoffe und Klebstoffe.Oxygenated hydrocarbons with epoxy bonds are valuable starting materials for syntheses or intermediate products for polymers such as textiles or plastics, as well Surfactants »Paints, Agricultural Chemicals» Drugs and Adhesives.
Bisher wurden nur wenige Arten solcher sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe, wie Äthylenoxid oder Propylenoxid, üblicherweise durch direkte Oxydation von Kohlenwasserstoffen mit Doppelbindungen hergestellt. Andere Epoxide, insbesondere jene mit langen Kohlenwasserstoffketten (wie die vorgenannten), wurden über das Halogenid oder durch indirekte Oxidation mit Peressigsäure erzeugt.So far, only a few species have become more oxygenated Hydrocarbons, such as ethylene oxide or propylene oxide, usually produced by direct oxidation of hydrocarbons with double bonds. Other epoxies, in particular those with long hydrocarbon chains (such as those mentioned above) have been made via the halide or by indirect Oxidation generated with peracetic acid.
Die Verwendung von Mikroorganismen zur Herstellung von Epoxiden aus Alkylenen ist in den ÜS-PSen 4 106 986 und 4 102 744 und in. der .XHi-OS 291163 beschrieben.The use of microorganisms for the production of epoxides from alkylenes is described in the ÜS-PS 4 106 986 and 4 102 744 and in .XHi-OS 291163.
Da Kohlenwasserstoffe mit Epoxidbindungen im allgemeinen explosiv sind, ist es zweckmäßig, sie unter mäßigen Bedingungen, beispielsweise bei milden Temperaturen und unter Atmosphärendruck, herzustellen.Because hydrocarbons with epoxy bonds in general are explosive, it is appropriate to use them under moderate conditions, for example at mild temperatures and below Atmospheric pressure.
Unter diesen Umständen besteht ein ausgeprägter Bedarf an einem Verfahren zur Herstellung von Kohlenwasserstoffen mit Epoxidbindungen unter milden Bedingungen; ein solches Verfahren, bei dem von einem immobilisierten Mikroorganismus Gebrauch gemacht wird, wird durch die Erfindung zur Verfügung gestellt.Under these circumstances, there is a strong need for a process for producing hydrocarbons with Epoxy bonds under mild conditions; one such method in which by an immobilized microorganism Use is provided by the invention.
Als Mikroorganismen, welche Doppelbindungen von Kohlenwasserstoffen in Epoxidbindungen umwandeln können, wurden in den vorgenannten Patentveröffentlichungen bereits mehrere Mikroorganismen der Genera Nocardia, Brevibacterium und Coryne- As microorganisms, which double bonds of hydrocarbons can convert into epoxy bonds, several microorganisms of the genera Nocardia, Brevibacterium and Coryne-
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; :;: 2931UB ; :;: 2931 UB
bacterium "beschrieben.bacterium ".
Naoh der herkömmlichen Methode wird ein Mikroorganismus der geeigneten Gattung mit einem beliebigen Kohlenwasserstoff nach der üblichen Methode kultiviert, oder man läßt ruhende Zellen des Mikroorganismus mit dem Kohlenwasserstoff reagieren. Da der als Substrat verwendete Kohlenwasserstoff nur eine minimale Wasserlöslichkeit aufweist, resultiert ein Zweiphasensystem, und die umwandlung der Doppelbindung des Kohlenwasserstoffs in eine Epoxidbindüng erfolgt nicht reibungslos . Beim herkömmlichen Verfahren erfordert ferner die Abtrennung der Reaktionsprodukte vom Rückstand des Substrats und der Zellen mehrere und komplizierte Trenn- und Reinigungsmaßnahmen. Häufig führt die Kompliziertheit der Behandlungsstufen dazu, daß der Mikroorganismus selbst oder seine Aktivität zerstört wird, wodurch die Wiederverwendung des Mikroorganismus oder die Anpassung des Systems an kontinuierliche Produktionsmethoden verhindert wird.According to the conventional method, the microorganism becomes the suitable genus with any hydrocarbon cultivated according to the usual method, or resting cells of the microorganism are allowed to react with the hydrocarbon. Because the hydrocarbon used as a substrate only Has minimal water solubility, the result is a two-phase system, and the conversion of the double bond of the Hydrocarbon in an epoxy bond does not occur smoothly . The conventional method also requires the separation of the reaction products from the residue of the substrate and the cells several and complicated separation and Cleaning measures. Often the complexity of the treatment steps leads to the fact that the microorganism itself or its activity is destroyed, thereby reusing the microorganism or adapting the system to continuous Production methods is prevented.
Außerdem kommt es bei einer Zunahme der Produkte während der Reaktion zu einer Produktinhibierung und anscheinend zu einem Abbruch der Reaktion, obwohl die Aktivität der Mikroorganismen immer nooh vorhanden ist. Um diesen Effekt zu verhindern, sollten die Produkte von Zeit zu Zeit oder kontinuierlich isoliert werden, damit die Konzentration der Produkte niedrig gehalten werden kann. Die Verunreinigung des Mediums mit Chemikalien, mit denen eine Auftrennung herbeigeführt werden soll, bewirkt ferner einen Abbau der epoxiderzeugenden Aktivität des Mikroorganismus. Die Verunreinigung stört außerdem die Temperatur- und pH-Kontrolle, was nicht vermieden werden kann, wenn dem Medium chemische Mittel einverleibt werden. Die Ausnutzung des Mikroorganismus wird dadurch beeinträchtigt.In addition, as the products increase during the reaction, product inhibition occurs and appears to occur a termination of the reaction, although the activity of the microorganisms nooh is always present. To prevent this effect, the products should be used from time to time or continuously isolated so that the concentration of the products can be kept low. The pollution the medium with chemicals, with which a separation is to be brought about, also causes a degradation of the epoxide-generating activity of the microorganism. The pollution also interferes with temperature and pH control, which cannot be avoided if the medium is chemical Means to be incorporated. The exploitation of the microorganism is impaired as a result.
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Ziel der Erfindung ist es, die der herkömmlichen Methode anhaftenden Probleme mit Hilfe einer neuen Methode zur vorteilhaften Herstellung von Epoxiden unter Verwendung von Mikroorganismen zu lösen.The aim of the invention is to take advantage of the problems inherent in the conventional method with the aid of a new method Solve production of epoxides using microorganisms.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird ein Mikroorganismus in einem immobilisierten Zustand verwendet, die Umwandlung der Doppelbindung des Kohlenwasserstoffsubstrats in eine Epoxidbindung erfolgt reibungslos und gleichzeitig, und das produzierte Epoxid kann leioht vom Mikroorganismus und Reaktionsmedium abgetrennt werden.In the method according to the invention, a microorganism is in an immobilized state, the conversion of the double bond of the hydrocarbon substrate into a Epoxy binding occurs smoothly and simultaneously, and the epoxy produced can be borrowed from the microorganism and Reaction medium are separated.
Die als Substrat verwendeten Kohlenwasserstoffe mit Doppelbindungen sind Kohlenwasserstoffe mit mindestens einer dem Molekülende benachbarten Doppelbindung und können ein geringes, mittleres oder höheres Molekulargewicht aufweisen. Spezielle Beispiele für geeignete Kohlenwasserstoffe sind Äthylen, Propylen, 1-Buten, 1-Decen, 1-Undecen und 1,15-Hexadekadien. The hydrocarbons with double bonds used as a substrate are hydrocarbons with at least one double bond adjacent to the end of the molecule and can have a low, have medium or higher molecular weight. Specific examples of suitable hydrocarbons are Ethylene, propylene, 1-butene, 1-decene, 1-undecene and 1,15-hexadecadiene.
Als Mikroorganismus eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren jene Mikroorganismen, welche eine Doppelbindung eines Kohlenwasserstoffs unter aeroben Bedingungen in eine Epoxidbindung umwandeln können. Daher sind jene Mikroorganismen, welche bekanntermaßen eine solche Fähigkeit besitzen, z.B. Nocardia corallina, Corynebacterium alkanum, Oorynebacterium hydrocarboclastus, Nocardia butanica» Nocardia paraffinica, Brevibacterium butanicum oder Brevibacterium ketoglutamicum, erfindungsgemäss verwendbar.As a microorganism are suitable for the invention Process those microorganisms that have a double bond of a hydrocarbon can convert into an epoxy bond under aerobic conditions. Therefore, those microorganisms which are known to have such an ability e.g. Nocardia corallina, Corynebacterium alkanum, Oorynebacterium hydrocarboclastus, Nocardia butanica » Nocardia paraffinica, Brevibacterium butanicum or Brevibacterium ketoglutamicum, usable according to the invention.
Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen sind aus "The Journal of General Microbiology" 10(3)» 107 (1967). den JA-ASen 46-41588 und 47-48673 und der JA-OS 52-75127 ersichtlich. In Tabelle I sind diese Eigenschaften zusammengestellt. 0300 10/0673The microbiological properties of these microorganisms are from "The Journal of General Microbiology" 10 (3) »107 (1967). the JA-ASs 46-41588 and 47-48673 and the JA-OS 52-75127 can be seen. In Table I, these properties are summarized. 0300 10/0673
TABELLE I
Nocardia corallina TABLE I.
Nocardia corallina
A) Morphologie A) morphology
Form - stabförmig; Zellen verlängern sich und eine multizellulärartige Mycelform wird beobachtet. Die Zellen werden durch zerkleinerung bzw. Fragmentation in lochterzellen zerteilt.Shape - rod-shaped; Cells elongate and become multicellular Mycelial shape is observed. The cells are broken up or fragmented into hole cells divided.
Größe - (0,6 bis O,3)x(2 bis 20) μια Motilität - nicht-motilSize - (0.6 to 0.3) x (2 to 20) μια Motility - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endosporenbildend Gram-Stamm - positivEndospore Formation - non-endospore formation Gram strain - positive
Säurebeständigkeit - nicht-säurebeständig.Acid Resistance - Not Acid Resistant.
B) Kulturmerkmale B) cultural features
Nähragar-Plattenkultur - gutes Wachstum. Kunde Form, glatt, wellige Form um den gesamten Umfang. Protuberanzen. Korallenfarbe in nassem Licht. Wird allmählich stärker.Nutrient agar plate culture - good growth. Customer shape, smooth, wavy shape around the entire circumference. Prominences. Coral color in wet light. Gradually getting stronger.
Nähragar-Schrägkultur - gutes Wachstum. Faden- bzw. Garnform, glatt. Korallenfarbe in nassem Licht. Keine Farbänderungen des Kulturmediums werden festgestellt. Nutrient agar slant - good growth. Thread or yarn shape, smooth. Coral color in wet light. No color changes of the culture medium are found.
Nährbrühen-Flüssigkultur - Oberflächenwachstum in Form einer weißen Membran. Keine Trübung. Es entstehen Fällungen. Nutrient broth liquid culture - surface growth in the form of a white membrane. No cloudiness. Precipitations arise.
C) Physiologische Charakteristika
Optimale Temperatur - 20 bis 350C
optimaler pH-Wert - 6,0 bis 8,0
Sauerstoffbedarf - aerob
Schwefelwasserstoff - Spurenmenge erzeugt Indol - negativC) Physiological characteristics
Optimal temperature - 20 to 35 0 C
optimal pH - 6.0 to 8.0
Oxygen demand - aerobic
Hydrogen sulfide - trace amount creates indole - negative
0300 10/06730300 10/0673
2931H8 g 2931H8 g
Stärke - nicht zersetzt
Nitratreduktion - reduziert
Katalasetest - positiv
Urease - negativ
V.P.-Test - negativStarch - not decomposed
Nitrate reduction - reduced
Catalase test - positive
Urease - negative
VP test - negative
Zuckerverwertung - Glucose» Fructose» Mannose» Rohrzucker (Sucrose)» Sorbit» Glycerin.Sugar utilization - glucose »fructose» mannose »cane sugar (Sucrose) »Sorbitol» Glycerin.
Norcardia butanicaNorcardia butanica
A) MorphologieA) morphology
Form - stabförmig; Zellen verlängern sich und eine multizellulärartige Mycelform wird festgestellt. Die Zellen werden durch Fragmentation in Tochterzellen zerteilt. Größe - (0,5 bis O,75)x(2,5 bis 16) um Motilität - nicht-motilShape - rod-shaped; Cells elongate and become multicellular Mycelium shape is determined. The cells are divided into daughter cells by fragmentation. Size - (0.5 to 0.75) x (2.5 to 16) µm Motility - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endosporenbildend
Gram-Stamm - positiv
Säurebeständigkeit - säurebeständig.Endospore - non-endospore Gram strain - positive
Acid Resistance - Acid Resistant.
B) Kulturmerkmale B) cultural features
Nähragar-Plattenkultur - Wachstum erfolgt ziemlich langsam. Runde Form, faltige Form, Nabelform, kein Glanz. Farbe matt-rot. Wird opak.Nutrient Agar Plate Culture - Growth is fairly slow. Round shape, wrinkled shape, navel shape, no shine. Color matt red. Becomes opaque.
Nähragar-Schrägkultur - Wachstum ist geringfügig. Fadenbzw. Garnform, kein Glanz» Farbe ist matt-rot.Nutrient Agar Slant - Little growth. Thread or Yarn shape, no shine »Color is dull red.
Nährbrühen-Flüssigkultur - Oberflächenwachstum in Form einer Membran. Nahezu keine Trübung. Keine Fällungen entstehen.Nutrient broth liquid culture - surface growth in the form of a membrane. Almost no cloudiness. No felling develop.
Nährgelatine-Stichkultur - Wachstum ist im oberen Teil besser als im unteren Teil. Keine Verflüssigung.Nutrient gelatin stab culture - growth is better in the upper part than the lower part. No liquefaction.
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O) Physiologische Charakteristika O) Physiological characteristics
Optimale Temperatur - 25 "bis 350OOptimal temperature - 25 "to 35 0 O
optimaler pH-Wert - 6,0 bis 8,0optimal pH - 6.0 to 8.0
Sauerstoffbedarf - aerobOxygen demand - aerobic
Lackmusmilch - keine Änderung oder alkalisch Schwefelwasserstoff - erzeugtLitmus milk - no change or alkaline hydrogen sulfide - produces
Indol - negativIndole - negative
Stärke - nicht zersetztStarch - not decomposed
Nitratreduktion - reduziertNitrate reduction - reduced
Katalasetest - positivCatalase test - positive
Urease - negativUrease - negative
V.P.-Test - negativV.P. test - negative
Zuckerverwertung - Glucose» Fructose, Arabinose, Mannose,Sugar utilization - glucose »fructose, arabinose, mannose,
Sucrose, Galactose, Xylose, Mannit,Sucrose, galactose, xylose, mannitol,
Sorbit.Sorbitol.
A) Morphologie A) morphology
Form - stabförmig; Zellen verlängern sich und eine multizellulärartige Mycelform wird beobachtet. Zellen werden durch Fragmentation in Tochterzellen zerteilt.Shape - rod-shaped; Cells elongate and become multicellular Mycelial shape is observed. Cells are broken up into daughter cells by fragmentation.
Größe - (0,5 bis O,75)x(2,5 bis 16) pm Motilität - nicht-motilSize - (0.5 to 0.75) x (2.5 to 16) pm Motility - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endosporenbildend
Gram-Stamm — positiv
Säurebeständigkeit - säurebeständig.Endospore - non-endospore Gram strain - positive
Acid Resistance - Acid Resistant.
B) Kulturmerkmale -B) Cultural Features -
Nähragar-Plattenkultur - Wachstum erfolgt ziemlich langsam, fiunde Form, faltige Form, wellige Form, Nabelform. Kein Glanz. Farbe ist gelblich-rot. Wird opak.Nutrient agar plate culture - growth is quite slow, Fiound shape, wrinkled shape, wavy shape, umbilical shape. No shine. Color is yellowish red. Becomes opaque.
- '- 030010/0673- '- 030010/0673
Nähragar-Schrägkultur - Wachstum ist geringfügig. Fadenbzw. Garnform. Kein Glanz. Farbe ist gelblich-rot.Nutrient Agar Slant - Little growth. Thread or Yarn shape. No shine. Color is yellowish red.
Nährbrühen-Flüssigkultur - Oberflächenwachstum in Form einer Membran. Nahezu keine Trübung. Keine Fällungen entstehen. Nutrient broth liquid culture - surface growth in the form of a membrane. Almost no cloudiness. No precipitations occur.
Nährgelatine-Stichkultur - Wachstum ist im oberen Teil besser als im unteren Teil. Keine Verflüssigung.Nutrient gelatin stab culture - growth is in the upper part better than the lower part. No liquefaction.
C) Physiologische CharakteristikaC) Physiological characteristics
Optimale Temperatur - 25 bis 350C optimaler pH-Wert - 6>0 bis 8,0
Sauerstoffbedarf - aerobOptimal temperature - 25 to 35 0 C optimal pH value - 6> 0 to 8.0
Oxygen demand - aerobic
Lackmusmilch - keine Änderung oder alkalisch Schwefelwasserstoff - erzeugt
Indol - negativ
Stärke - nicht zersetzt
Nitratreduktion - reduziert
Kätalasetest - positiv
Urease - negativ
V.P.-Test - negativLitmus milk - no change or alkaline hydrogen sulfide - produces
Indole - negative
Starch - not decomposed
Nitrate reduction - reduced
Katalase test - positive
Urease - negative
VP test - negative
Zuckerverwertung - Glucose, Fructose, Mannose, Sucrose,Sugar utilization - glucose, fructose, mannose, sucrose,
Mannit, Sorbit.Mannitol, sorbitol.
Oorynebacterium alkanum A) Morphologie Oorynebacterium alkanum A) Morphology
Form - im allgemeinen kurze Stäbe, Verzweigung wird beobachtet. Shape - generally short rods, branching is observed.
Größe - (0,5 bis O,6)x(2 bis 5) μΐη Motilität■- nicht-motilSize - (0.5 to 0.6) x (2 to 5) μΐη Motility ■ - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endοsporenbildend Gram-Stamm - positivEndospore formation - non-endospore forming Gram strain - positive
Säurebeständigkeit - nicht-säurebeständig.Acid Resistance - Not Acid Resistant.
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B) KuIturmerkmale B) Cultural characteristics
Nähragar-Plattenkultur - mäßiges Wachstum. Runde 3?orm, glatt» Halblinsenform um den gesamten Umfang. GeIbgrau unter nassem Licht. Wird opak.Nutrient agar plate culture - growth moderate. Round 3? Orm, smooth »semi-lens shape around the entire circumference. Yellow gray under wet light. Becomes opaque.
Nähragär-Schrägkultur - mäi3iges Wachstum. Faden- bzw. Garnform. Unter nassem Licht, glatt und gelblich-graue Farbe.Nutrient agar slant - moderate growth. Thread resp. Yarn shape. Under wet light, smooth and yellowish-gray in color.
Nährbrühen-Flüssigkultur - Oberflächenwachstum ist schwach. Es erfolgt eine mäßige Trübung.Nutrient Broth Liquid Culture - Surface growth is weak. There is a moderate cloudiness.
Nährgelatine-Stichkultur - Wachstum ist im oberen Teil geringfügig. Keine Verflüssigung.Nutrient gelatin stab culture - growth is slight in the upper part. No liquefaction.
0) Physiologische Charakterlstika 0) Physiological Characteristics
Optimale Temperatur - 25 bis 350C
optimaler pH-Wert - 5»0 bis 9fO Sauerstoffbedarf - aerob
Lackmusmilch - keine Änderung oder alkalisch Schwefelwasserstoff - erzeugt Indol «- negativ
Stärke - nicht zersetzt Nitratreduktion - reduziert Katalasetest - positiv
Urease - negativ
V.P.-Test - negativ Zuokerverwertung - Glucose, !Fructose, Mannose, Sucrose,Optimal temperature - 25 to 35 0 C optimal pH value - 5 »0 to 9fO oxygen demand - aerobic litmus milk - no change or alkaline hydrogen sulfide - produces indole« - negative
Starch - not decomposed, nitrate reduction - reduced catalase test - positive urease - negative
VP test - negative sugar utilization - glucose,! Fructose, mannose, sucrose,
Lactose, Mannit, Sorbit.Lactose, mannitol, sorbitol.
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A) Morphologie A) morphology
Form - stabförmig» langgestreckt» Verzweigung; hat Lipidkorn» Fragmentation zu 3 μηι.Shape - rod-shaped »elongated» branching; has lipid grain » Fragmentation to 3 μm.
Größe - (0,4 bis 0,6)x(3 bis 20) [w Motilität - nicht-motilSize - (0.4 to 0.6) x (3 to 20) [w motility - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endosporenbildend Gram-Stamm - positivEndospore - non-endospore Gram strain - positive
Säurebeständigkeit - nicht-säurebeständig.Acid Resistance - Not Acid Resistant.
B) Kulturmerkmale B) cultural features
Nähragar-Plattenkultur - gutes Wachstum. Runde bis Blumenform. Faltige Formen, Protoberanzen. Wellige Formen um den gesamten Umfang. Unter Proteinlicht Farbe hellgelborange . Nutrient agar plate culture - good growth. Round to flower shape. Wrinkled shapes, protuberances. Wavy shapes around the entire scope. Color light yellow-orange under protein light.
Nähragar-Schrägkultur - mäßiges Wachstum. Faden- bzw. Garnform, glatte bis faltige Form. Unter Proteinlicht Farbe hellgelb-braun. Keine Farbänderungen des Kulturmediums werden beobachtet. Nutrient agar slant - moderate growth. Thread resp. Yarn shape, smooth to wrinkled shape. Color light yellow-brown under protein light. No color changes of the culture medium are observed.
Nährbrühe-Flüssigkultur - mäßiges Oberflächenwachstum, Membranform. Es erfolgt eine gewisse !Trübung. Fällungen entstehen.Nutrient broth liquid culture - moderate surface growth, membrane shape. There is a certain clouding. Precipitations develop.
Nährgelatine-Stichkultur - Wachstum ist im oberen Teil besser als im unteren Teil. Keine Verflüssigung.Nutrient gelatin stab culture - growth is better in the upper part than the lower part. No liquefaction.
C) Physiologische Charakteristika C) Physiological characteristics
Optimale Temperatur - 25 bis 350C Sauerstoffbedarf - keinerOptimal temperature - 25 to 35 0 C Oxygen demand - none
Lackmusmilch - keine Änderung oder alkalisch Indol - negativLitmus milk - no change or alkaline indole - negative
Nitratreduktion - reduziertNitrate reduction - reduced
030010/0673030010/0673
- 44- -- 44- -
Katalasetest - positivCatalase test - positive
Zuckerverwertung - Glucose» Fructose, Laotöse» Raffinose,Sugar utilization - glucose »fructose, laotose» raffinose,
Inosit» Glycerin.Inositol »glycerin.
A) MorphologieA) morphology
Form im allgemeinen stabförmig, abbrechende (snapping) Zerteilung wird beobachtet.Shape generally rod-shaped, snapping Fragmentation is observed.
Größe -(O,5)x(3,O bis 6,0) μπιSize - (O, 5) x (3, O to 6.0) μπι
Motilität - nicht-motilMotility - non-motile
Endosporenbildung - nicht-endosporenbildend Gram-Stamm - positivEndospore Formation - non-endospore formation Gram strain - positive
Säurebeständigkeit - nicht-säurebeständig.Acid Resistance - Not Acid Resistant.
B) Kulturmerkmale B) cultural features
Nähragar-Plattenkultur - gutes Wachstum. Runde Form, glatt, Protuberanzen um den gesamten Umfang. Hellbraune Farbe. Wird unter schwachem Licht opak.Nutrient agar plate culture - good growth. Round shape, smooth, prominences around the entire circumference. Light brown Colour. Becomes opaque in low light.
Nähragar-Schrägkultur - gutes Wachstum. Spitze und dünne (spiny) Form. Unter schwachem Licht butterartige Konsistenz und hellbraune Farbe. Im Kulturmedium werden keine Änderungen beobachtet.Nutrient agar slant - good growth. Pointy and thin (spiny) shape. Buttery consistency and light brown color under low light. There are no changes in the culture medium observed.
Nährbrühe-Flüssigkultur - Oberflächenwachstum in Membranform. Nahezu keine Trübung. Fällungen entstehen nicht.Nutrient broth liquid culture - surface growth in membrane form. Almost no cloudiness. Precipitations do not occur.
Nährgelatine-Stichkultur - Wachstum ist im oberen Teil besser als im unteren Teil. Keine Verflüssigung.Nutrient gelatin stab culture - growth is in the upper part better than the lower part. No liquefaction.
0) Physiologische Oharakteristika 0) Physiological characteristics
Optimale Temperatur - 25 bis 250C
optimaler pH-Wert - 6,0 bis 9,0Optimal temperature - 25 to 25 0 C
optimal pH - 6.0 to 9.0
030010/0673030010/0673
Sauerstoffbedarf - aerobOxygen demand - aerobic
Lackmusmilch - keine Änderung oder alkalisch.
Schwefelwasserstoff - wird erzeugt Indol - negativ
Stärke - nicht zersetzt
Nitratreduktion - reduziert
Katalasetest - positiv
Urease - negativ
V.P.-Test - negativLitmus milk - no change or alkaline. Hydrogen sulfide - is produced indole - negative
Starch - not decomposed
Nitrate reduction - reduced
Catalase test - positive
Urease - negative
VP test - negative
Zuckerverwertung - Glucose, Fructose» Arabinose» Mannose»Sugar utilization - glucose, fructose »arabinose» mannose »
Sucrose» Xylose» Mannit» Sorbit.Sucrose »Xylose» Mannitol »Sorbitol.
Alle vorgenannten Mikroorganismen wurden beim Fermentation Research Institute» Agency of Industrial Science and Technology» Japan und bei der American Type Culture Collection hinterlegt.All of the aforementioned microorganisms have been obtained from the Fermentation Research Institute "Agency of Industrial Science and Technology »Japan and deposited with the American Type Culture Collection.
Corynebacteriüm alkanüm : ATCC 21194- FERM P 4598Corynebacterium alkane : ATCC 21194- FERM P 4598
Corynebacterium hydrocarboclastas ATCC 15108 PEBM P 4599Corynebacterium hydrocarboclastas ATCC 15108 PEBM P 4599
Nocardia butanica ATCC 21197 FERM P 4602Nocardia butanica ATCC 21197 FERM P 4602
Nocardia corallina ATCC 31338 FERM P 4094Nocardia corallina ATCC 31338 FERM P 4094
Nocardia paraffinica ATCC 21198 FERM P 4603Nocardia paraffinica ATCC 21198 FERM P 4603
Brevibacterium butanicum ATCC 21196 FERM P 4600Brevibacterium butanicum ATCC 21196 FERM P 4600
Brevibacterium ketoglutamicum ATCG 15587 FERM P 4601Brevibacterium ketoglutamicum ATCG 15587 FERM P 4601
Erfindungsgemäß werden die zu verwendenden Mikroorganismen vorher immobilisiert» so daß sie in immobilisierter Form eingesetzt werden können.The microorganisms to be used are according to the invention previously immobilized »so that they can be used in immobilized form.
Zur Immobilisierung der Mikroorganismen kann jede beliebige bekannte Immobilisierungsmethode dienen» beispielsweise die physikalische Adsorption» lorienbindung, Vernetzung oder Einhüllung bzw. Einkapselung. Die für die Immobilisierung der Zeilen eingesetzten Materialien können beliebige Substanzen sein,Any desired can be used to immobilize the microorganisms Well-known immobilization methods are used, for example, physical adsorption, loric binding, cross-linking or encasing or encapsulation. The one used for immobilizing the rows The materials used can be any substances,
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welche die Zellen zurückhalten, indem sie die Zellen im wesentlichen in einem bestimmten Raum festsetzen, ohne die Fähigkeit des Mikroorganismus zur Epoxidbildung zu beeinträchtigen. which hold back the cells by essentially removing the cells set in a certain space without affecting the ability of the microorganism to form epoxides.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet man als Monomere Acrylamide, wie Acrylamid, Methacrylamid oder Mischungen davon. Der Mikroorganismus wird zuvor kultiviert und dann zur Herstellung einer Zellensuspension mit Puffer verdünnt. Die Immobilisierung der Zellen wird durch Polymerisation der gewünschten Monomeren in Gegenwart der zubereiteten Suspension durchgeführt.According to a preferred embodiment of the invention, the monomers used are acrylamides, such as acrylamide, Methacrylamide or mixtures thereof. The microorganism is cultivated beforehand and then diluted with buffer to produce a cell suspension. The immobilization of the Cells is carried out by polymerizing the desired monomers in the presence of the prepared suspension.
Die erfindungsgemäß verwendeten immobilisierten Zellen können in einer beliebigen Form, z.B. in einer membranartigen, plattenartigen, rohrartigen, körnigen oder stabartigen Form, vorliegen.The immobilized cells used according to the invention can be in any form, e.g. in a membrane-like, plate-like, tubular, granular or rod-like shape.
Man lässt die vorgenannten immobilisierten Zellen reagieren, indem man sie mit einem eine endständige Doppelbindung aufweisenden Kohlenwasserstoff in einem wäßrigen Medium, welches die üblichen, für die Umwandlung notwendigen anorganischen Salze enthält, in Berührung bringt. Beispielsweise wird ein Reaktionsgefäß, in welches das Medium und die immobilisierten Zellen gegeben wurden, evakuiert und ein als Substrat fungierender Kohlenwasserstoff mit endständiger Doppelbindung wird hinzugefügt. Wenn man den Kohlenwasserstoff in das Gefäß als Gas einspeist, werden bezüglich des Partialdrucks des Kohlenwasserstoffs spezielle Bedingungen aufrechterhalten. Die bevorzugte Reaktionstemperatur beträgt etwa 300O, was für das Wachstum von Mikroorganismen optimal ist. Die Reaktionszeit von 24 bis 72 Stunden ist ebenfalls für das Mikroorganismenwachstum optimal. Der pH-Wert wird ebenfalls auf den optimalen Wert für den zu verwendendenThe aforementioned immobilized cells are allowed to react by contacting them with a hydrocarbon having a terminal double bond in an aqueous medium which contains the usual inorganic salts necessary for the conversion. For example, a reaction vessel into which the medium and the immobilized cells have been placed is evacuated and a hydrocarbon with a terminal double bond functioning as a substrate is added. When the hydrocarbon is fed into the vessel as a gas, specific conditions are maintained with respect to the partial pressure of the hydrocarbon. The preferred reaction temperature is about 30 ° C., which is optimal for the growth of microorganisms. The reaction time of 24 to 72 hours is also ideal for microorganism growth. The pH is also set to the optimal value for the one to be used
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Mikroorganismus eingestellt. Wenn man als Reaktionsgefäß eine Kolonne verwendet, durch welche man die Flüssigkeit hindurchlaufen läßt, kann man entweder eine kontinuierliche oder diskontinuierliche Umsetzung durchführen.Microorganism set. If you use a column as a reaction vessel through which you pass the liquid can pass through, you can either carry out a continuous or discontinuous reaction.
Erfindungsgemäß können die Reaktionsprodukte leicht durch übliche Fest/Flüssig-Trennung abgetrennt werden, und die immobilisierten Zellen können wiederholt verwendet werden.According to the invention, the reaction products can easily be separated off by conventional solid / liquid separation, and the immobilized cells can be used repeatedly.
Bei wiederholtem Einsatz der immobilisierten Zellen sinkt die epoxidbildende Wirkung der Zellen ab, wenn die Wiederholung mehrmals vorgenommen wird, obwohl die Aktivität zuweilen in den frühen Wiederholungsstufen ansteigt. Wenn die Wirkung der Zellen erschöpft ist, kann man die wiederholt verwendeten Zellen in einem geeignete, für das Mikroorganismenwachstum notwendige Nährstoffe enthaltenden Medium kul-^ tivieren, um die Aktivität der Mikroorganismen aufzubessern *With repeated use of the immobilized cells, the epoxide-forming effect of the cells decreases when the repetition done multiple times, although activity sometimes increases in the early repetition levels. If the Effect of the cells is exhausted, one can use the repeatedly used cells in a suitable, for the microorganism growth necessary nutrients containing medium kul- ^ stimulate to improve the activity of the microorganisms *
Man kann die epoxidbildende Wirkung der immobilisierten Zellen aufrechterhalten, indem man dem Medium vor der Reaktion die passende, für das Mikroorganismenwachstum erforderliche Stickstoff quelle einverleibt. Ferner kann man die epoxidbildende Aktivität der immobilisierten Zellen erhöhen, indem man den Mikroorganismus zuvor in einem Nährstoffe für das Mikroorganismenwachstum enthaltenden Medium kultiviert. One can maintain the epoxide-forming effect of the immobilized cells by adding the medium before the reaction incorporates the appropriate nitrogen source required for microorganism growth. You can also use the Increase epoxide-forming activity of the immobilized cells by previously putting the microorganism in a nutrient cultured for medium containing microorganism growth.
Beispiele für Alkene, welche nach dem erfindungsgemässen Verfahren in die entsprechenden, ebenfalls benannten Epoxide umgewandelt werden können, sind:Examples of alkenes, which according to the invention Processes that can be converted into the corresponding, also named epoxides are:
Äthylen - Äthylenoxid
Propylen - Propylenqxid _Ethylene - ethylene oxide
Propylene - propylene oxide _
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45—45—
1-Buten - 1-Epoxybutan
1,3-Butadien - 1,3-Diepoxybutan
3»3-Dimethyl-1-buten - 3»3-Dimethyl-i-epoxybutan
1,9-Dekadien - 1,9-Diepoxydekan1-butene - 1-epoxybutane
1,3-butadiene - 1,3-diepoxybutane
3 »3-dimethyl-1-butene - 3» 3-dimethyl-i-epoxybutane 1,9-decadiene - 1,9-diepoxy-decane
3,4-Dimethyl-4-äthyl-1 -hexen - 3»4-Dimethyl-4-äthyl-1 -epoxyhexen 3,4-dimethyl-4-ethyl-1-hexene - 3 »4-dimethyl-4-ethyl-1-epoxyhexene
1-Dodekan - 1-Epoxydodekan und1-dodecane - 1-epoxy dodecane and
1,15-Hexadekadien - 1,15-Diepoxyhexadekan.1,15-hexadiene - 1,15-diepoxyhexadiene.
Somit kann erfindungsgemäß eine große Vielzahl von assimilierbaren Kohlenstoff quellen als Substrat für den immobilisierten Mikroorganismus dienen. Zu den bevorzugten Kohlenstoff quellen gehören jedoch die a-01efine mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und die α,α-Diene mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen. Thus, a wide variety of assimilable Carbon swells serve as a substrate for the immobilized microorganism. Among the preferred carbon however, sources include the α-olefins with 2 to 20 carbon atoms and the α, α-dienes having 4 to 20 carbon atoms.
Zusammen mit den Olefinen können weitere Kohlenstoffquellen als Komponenten des Mediums hinzugefügt werden, da die nach üblichen Methoden schwierige Abtrennung der Komponenten leicht durchführbar ist, wenn a-Olefine, a,<**- Diene oder ein Gemisch davon zu Epoxiden umgewandelt werden. Außerdem kann die Auftrennung von Paraffinkohlenwasserstoffen und α-Olefinen durch Umsetzung mit dem Mikroorganismus, wie die Erfindung zeigt, vorgenommen werden.Along with the olefins, other carbon sources can be added as components of the medium, since the difficult separation of the components by customary methods is easily feasible if a-olefins, a, <** - Serves or a mixture thereof can be converted to epoxides. In addition, the separation of paraffin hydrocarbons and α-olefins by reaction with the microorganism, as the invention shows, can be made.
Einem die genannten Kohlenstoffquellen enthaltenden Medium werden Stickstoffquellen und anorganische Salze einverleibt, wonach der vorgenannte immobilisierte Mikroorganismus im Medium durch Bewegen oder Schütteln unter aeroben Bedingungen kultiviert wird.A medium containing the carbon sources mentioned nitrogen sources and inorganic salts are incorporated, after which the aforementioned immobilized microorganism in the medium by agitation or shaking under aerobic conditions Conditions is cultivated.
Die dem Medium einverleibten Stickstoffquellen können beliebige Substanzen sein, welche der Mikroorganismus assimilieren kann, beispielsweise Ammoniumphosphat, Ammonium-The nitrogen sources incorporated in the medium can be any substance which the microorganism assimilates can, for example ammonium phosphate, ammonium
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Chlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff, wäßriges Ammoniak und/oder verschiedene Arten von Aminosäuren. Eine Art der genannten Substanzen reicht aus, jedoch kann man auch eine Kombination von mehr als zwei dieser Substanzen verwenden.Chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, aqueous Ammonia and / or various types of amino acids. One type of the substances mentioned is sufficient, but one can also use a combination of more than two of these substances.
Als anorganische Salze eignen sich Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Ei sen (U)-sulfat und/oder Calciumchlorid.Suitable inorganic salts are potassium phosphate, sodium phosphate, Magnesium sulfate, manganese sulfate, iron (U) sulfate and / or calcium chloride.
Nährstoffe, wie Vitamine oder Hefeextrakt, können dem Medium zur Förderung des Wachstums des Mikroorganismus einverleibt werden.Nutrients such as vitamins or yeast extract can be incorporated into the medium to promote the growth of the microorganism will.
Die Erfindung soll nun unter Bezugnahme auf die bevorzugte Ausführungsform näher erläutert werden. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen zusammen mit den darin erläuterten Zeichnungen einige erfindungsgemäße Durchführungsarten. Die Beispiele sollen jedoch keine Beschränkungen oder kritisohe Parameter des erfindungsgemäßen Verfahrens wiedergeben. The invention will now be explained in more detail with reference to the preferred embodiment. The following Examples, together with the drawings explained therein, illustrate some modes of implementation according to the invention. However, the examples are not intended to be limiting or critical Reproduce parameters of the method according to the invention.
1) Herstellung der Zellensuspension 1) Preparation of the cell suspension
100 ml eines Mediums, das aus einem Gemisch von 10 g Rindfleischextraktpulver, 10 g bakteriologischem Pepton, 5 g NaCl und 10 g Glucose in genügend entionisiertem Wasser zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter besteht, werden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und thermisch sterilisiert. Das Medium wird dann mit drei ösen von Nocardia corallina (ATCC 31338) beimpft und der Ansatz wird100 ml of a medium consisting of a mixture of 10 g of beef extract powder, 10 g bacteriological peptone, 5 g NaCl and 10 g glucose in enough deionized water for Make up to a total volume of 1 liter, are placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and thermally sterilized. The medium is then inoculated with three loops of Nocardia corallina (ATCC 31338) and the approach is
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1.6 Stunden "bei 3O0C unter Schütteln kultiviert. Die erzeugten Zellen werden zweimal mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und dann mit 0,01 m Phosphatpuffer zur Herstellung einer Zellensuspension mit einer Konzentration von 40 mg/ml (Trockengewicht) verdünnt.1.6 hours "cultured at 3O 0 C with shaking. The cells produced are washed twice with 0.01 M phosphate buffer and then diluted with 0.01 M phosphate buffer to prepare a cell suspension having a concentration of 40 mg / ml (dry weight).
2) Herstellung von immobilisierten Zellen 2) Preparation of immobilized cells
Komponentecomponent
Acrylamid und N,N'-MethylenbisacrylamidAcrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide
N, H ι HT', H · -Tetramethyläthylendiamid N, H ι HT ', H · -Tetramethylethylenediamide
AmmoniumpersulfatAmmonium persulfate
In der vorgenannten Weise hergestellte ZellensuspensionCell suspension prepared in the aforementioned manner
Konzentration MengeConcentration crowd
20 $> in 0,01 m Phos- 2 ml phatpuffer-LÖsung20 $> in 0.01 m phos- 2 ml phate buffer solution
2 i» in 0,01 m
Phosphatpuffer-Lö
sung2 i » in 0.01 m
Phosphate buffer solution
8 # in 0,01 m Phosphatpuff er-LÖ sung8 # in 0.01 m phosphate puff ER SOLUTION
50 μΐ50 μΐ
50 μΐ50 μΐ
1,9 ml1.9 ml
Die vorgenannten Lösungen und Suspensionen werden in den angegebenen Anteilen in einem Prüfrohr vermischt. Die Gemische werden dann 5 Minuten unter vermindertem Druck entgast. Die Polymerisation wird 30 Minuten bei O0C durchgeführt. Das erhaltene Polymere wird zu. einem Würfel mit einer Kantenlänge von 3 mm geschnitten. Der Polymerwürfel wird zweimal mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen, um die immobilisierten Zellen (19 mg .trockene Zellen/1 ml immobilisierte Zellen) für die Reaktion zu präparieren.The aforementioned solutions and suspensions are mixed in the specified proportions in a test tube. The mixtures are then degassed under reduced pressure for 5 minutes. The polymerization is carried out at 0 ° C. for 30 minutes. The polymer obtained becomes too. cut a cube with an edge length of 3 mm. The polymer cube is washed twice with 0.01 M phosphate buffer in order to prepare the immobilized cells (19 mg dry cells / 1 ml immobilized cells) for the reaction.
Herstellung von Propylenoxid ' Production of propylene oxide '
Die in der vorgenannten Weise hergestellten immobilisierten Zellen werden mit Propylen nach einem im folgenden naher erläuterten Verfahren unter Verwendung des Mediums A und desThe immobilized cells produced in the aforementioned manner are treated with propylene according to one of the methods explained in more detail below Method using medium A and the
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ZlTZlT
Mediums B reagieren gelassen:Medium B allowed to react:
Medium AMedium A
In mehrere 500 ml-Erlenmeyer-Kolben werden jeweils 20 ml des Mediums A und 4 ml von immobilisierten Zellen gegeben, welche analog dem vorgenannten Verfahren hergestellt wurden, wobei als Monomerlösungen 20 #ige Lösungen mit verschiedenen Anteilen an Acrylamid und N,N1-Methylenbisacrylamid (95 bis 75 Gew.-# Acrylamid und 5 bis 25 Gew.-# N,N1-Methylenbisacrylamid) verwendet wurden. Die Kolben werden jeweils bei einem verminderten Druck von 510 mm Hg entgast und mit Propylengas bis zu einem Partialdruek von 15O mm Hg gefüllt. Das Medium wird dann bei 300C 150mal pro Minute hin- und hergeschüttelt bzw. -gerüttelt. Nach 72 Stunden wird das Medium durch Dekantieren abgetrennt. Die gaschromatographische Analyse der Konzentration des Propylenoxids im Vergleich zur Konzentration des N,N'-Methylenbisaorylamids wird inIn several 500 ml Erlenmeyer flasks, 20 ml of medium A and 4 ml of immobilized cells, which were prepared analogously to the above-mentioned process, are placed in each case, with 20 # solutions with various proportions of acrylamide and N, N 1 -methylene bisacrylamide as monomer solutions (95 to 75 wt. # Acrylamide and 5 to 25 wt. # N, N 1 -ethylene bisacrylamide) were used. The flasks are each degassed at a reduced pressure of 510 mm Hg and filled with propylene gas to a partial pressure of 150 mm Hg. The medium is then back at 30 0 C 150 times per minute and hergeschüttelt or -gerüttelt. After 72 hours the medium is separated off by decanting. The gas chromatographic analysis of the concentration of propylene oxide compared to the concentration of N, N'-methylenebisaorylamids is shown in
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Figur 1 durch die offenen Kreise Q) veranschaulicht. Die für die Reaktion verwendeten immobilisierten Zellen werden dann mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und in mehrere saubere Erlenmeyer-Kolben gegeben, in welchen 20 ml des Mediums A und Propylengas bis zu einem Partialdruck des Propylene von 150 mm Hg vorgelegt wurden. Die Reaktion wird wiederum bei 300O unter Hin- und Herschütteln (i50mal/Min.) ablaufen gelassen, wonach das Medium durch Dekantieren abgetrennt wird. Die durch gaschromatographische Analyse der Produkte bestimmte Propylenoxidkonzentration ist in Pigur 1 gegen die Konzentration des Ν,Ν1-Methylenbisacrylamids aufgetragen und wird durch die Vierecke (Rhomben) /\ wiedergegeben. Eine Betrachtung der Daten ergibt, daß die Propylenoxidkonzentration durch Verändern der Konzentration des !!,N'-Methylenbisacrylamids über den bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms gezeigten Bereich nicht beeinflußt wird. .Figure 1 illustrated by the open circles Q). The immobilized cells used for the reaction are then washed with 0.01 M phosphate buffer and placed in several clean Erlenmeyer flasks in which 20 ml of medium A and propylene gas were placed up to a partial pressure of the propylene of 150 mm Hg. The reaction is again allowed to proceed at 30 0 O under gently shake (i50mal / min.), After which the medium is separated by decantation. The propylene oxide concentration determined by gas chromatographic analysis of the products is plotted in Pigur 1 against the concentration of Ν, Ν 1 -methylene bisacrylamide and is represented by the rectangles (rhombuses) / \. Examination of the data reveals that the propylene oxide concentration is not affected by changing the concentration of the !!, N'-methylenebisacrylamide over the range shown in the preparation of the immobilized enzyme. .
Methode (b)Method (b)
In mehrere 500 ml-lrlenmeyer-Kolben werden jeweils 20 ml des Mediums B mit unterschiedlichem pH-Wert und 4 ml immobilisierte Zellen gegeben, welche nach der vorgenannten Methode unter Verwendung einer 20 #igen Lösung von 85 Gew.~?6 Acrylamid und 15 Gew.-jS N,H-Methylenbisacrylamid hergestellt wurden. Propylengas wird bis zu einem Partialdruck von 150 mm Hg zugegeben. Die speziellen pH-Werte des Mediums B betragen 6,0, 6,5» 7»0, 7»5 bzw. 8,0, was Brühen mit pH-Werten von 6,0, 6,5» 6»9» 7»3 bzw. 7»5 ergibt. Man läßt die Reaktion bei 300O unter Hin- und Hersohütteln (i50mal/ Min.) während 72 Stunden erfolgen, um Epoxid in der Lösung zu erzeugen. Das Medium wird dann durch Dekantieren abgetrennt. Die gaschromatographische Analyse des Produkts ist in Figur 2 gegen den pH-Wert des Mediums B aufgetragen und wird durch die offenen Kreise Q wiedergegeben. Die immo-20 ml of medium B with a different pH value and 4 ml of immobilized cells are placed in several 500 ml Irlenmeyer flasks, which are obtained by the aforementioned method using a 20% solution of 85% by weight of 6 acrylamide and 15% by weight .-jS N, H-methylenebisacrylamide. Propylene gas is added up to a partial pressure of 150 mm Hg. The special pH values of medium B are 6.0, 6.5 »7» 0, 7 »5 and 8.0, respectively, which results in broths with pH values of 6.0, 6.5» 6 »9» 7 »3 or 7» 5 results. The reaction was allowed at 30 0 O under way Hersohütteln (i50mal / min.) Take place for 72 hours, to produce epoxide in the solution. The medium is then separated off by decantation. The gas chromatographic analysis of the product is plotted against the pH of the medium B in FIG. 2 and is represented by the open circles Q. The immo-
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η". ■ .■■;■η ". ■. ■■; ■
bilisierten Zellen werden dann mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und. neuerlich in mehrere 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben» in welchen 20 ml des Mediums B mit derselben Konzentration und demselben pH-Wert vorgelegt wurden. Nach einer zweiten Reaktionsfolge von 72 Stunden wird das Medium abdekantiert, und die Konzentration des erzeugten Epoxide wird gaschromatographisch bestimmt. Die Konzentration des Propylenoxids ist in Figur 2 gegen den pH-Wert aufgetragen und wird durch die Rhomben /\ wiedergegeben. Die immobilisierten Zellen werden neuerlich mit Phosphatpuffer gewaschen. Dann wird ein drittes Mal eine Umsetzung unter Anwendung derselben Lösungen und Konzentrationen und derselben Sohüttelzeit durchgeführt. Die bei dieser Reaktionsfolge erzeugte Epoxidkonzentration wird bestimmt und wird in Figur 2 durch die Dreiecke Δ wiedergegeben.bilized cells are then buffered with 0.01 M phosphate washed and. again in several 500 ml Erlenmeyer flasks given »in which 20 ml of medium B with the same concentration and the same pH value were submitted. To a second reaction sequence of 72 hours, the medium is decanted and the concentration of the generated Epoxides are determined by gas chromatography. The concentration of the propylene oxide is plotted against the pH value in FIG. 2 and is represented by the rhombuses / \. The immobilized cells are washed again with phosphate buffer. Then a third time there is an implementation using the same solutions and concentrations and the same shaking time. The one in this sequence of reactions The epoxide concentration produced is determined and is shown in FIG. 2 by the triangles Δ.
Methode (c)Method (c)
Mehrere 4 ml-Blöcke von immobilisierten Zellen werden aus 5-, 10-, 15- und 20$igen wäßrigen Phosphatpufferlösungen eines Gemisches aus 85 Gew.-$ Acrylamid und 15 Gew.-9$ N,N1-Methylenbisacrylamid nach der vorstehend beschriebenen Methode zur Herstellung immobilisierter Zellen erzeugt (sämtliche anderen Komponenten sind gleich wie bei der allgemeinen Methode).Several 4 ml blocks of immobilized cells are prepared from 5, 10, 15 and 20% aqueous phosphate buffer solutions of a mixture of 85% by weight of acrylamide and 15% by weight of N, N 1 -methylene bisacrylamide according to the method described above Method for making immobilized cells is generated (all other components are the same as in the general method).
Mit Hilfe dieser immobilisierten Zellen in 20 ml des Mediums A und eines Propylengas-Partialdrucks von 150 mm Hg werden drei aufeinanderfolgende Reaktionen durchgeführt. Wie zuvor werden die Produkte bei jedem Test analysiert, und der jeweilige Polymerblock wird mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen.With the help of these immobilized cells in 20 ml of the medium A and a propylene gas partial pressure of 150 mm Hg three successive reactions are carried out. As before, the products are analyzed for each test and the respective polymer block is buffered with 0.01 M phosphate washed.
Die Resultate der drei Reaktionsfolgen sind in Figur 3 ge-The results of the three reaction sequences are shown in FIG.
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■ -ei- 43 ■ -ei- 43
gen die Monomerkonzentration aufgetragen. Die erste Reaktion wird durch die Kreise O » die zweite Reaktion durch die Rhomben <^> und die dritte Reaktion durch die Dreiecke Δ wiedergegeben. plotted against the monomer concentration. The first reaction is represented by the circles O », the second reaction by the rhombuses <^> and the third reaction by the triangles Δ.
Methode (d)Method (d)
Mehrere 4 ml-Blöcke von immobilisierten Zellen werden mit unterschiedlichen Zellenkonzentrationen von 2 bis 28,5 mg Zellen/ml nach der allgemeinen Methode hergestellt (sämtliche übrigen Komponenten sind gleich wie bei der allgemeinen Methode). Several 4 ml blocks of immobilized cells are prepared with different cell concentrations from 2 to 28.5 mg cells / ml according to the general method (all other components are the same as in the general method).
Unter Anwendung dieser immobilisierten Zellen in 20 ml des Mediums A und eines Propylengas-Partialdrucks von 150 mm Hg wird jeweils eine einzige Reaktion durchgeführt, wobei man die Umsetzung 10 Tage fortschreiten läßt und aus jedem Reaktionsgefäß einmal pro Tag gleichzeitig eine Probe entnimmt. Die Propyienoxidkonzentration wird gaschromatographisch bestimmt und in Figur 1 gegen die Zeit aufgetragen. 3?ür Figur 4 gilt folgende Symbollegende:Using these immobilized cells in 20 ml of medium A and a propylene gas partial pressure of 150 mm Hg, a single reaction is carried out each time, allowing the reaction to proceed for 10 days and simultaneously taking a sample from each reaction vessel once a day removes. The propylene oxide concentration is determined by gas chromatography and plotted against time in FIG. 3? The following symbol legend applies to Figure 4:
Symbol mg Konzentration der ' Zellen/ml immobilisierte Zellen Symbol mg concentration of cells / ml immobilized cells
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Nach der allgemeinen Methode von Beispiel 1 hergestellte immobilisierte Zellen werden in 20 ml des Mediums A mit 1-Buten "bei einem Partialdruck von 150 mm Hg kontaktiert. Das Gemisch wird dann bei 300C 24 Stunden 150mal/Min. geschüttelt. Die Zellenmasse wird hierauf abgetrennt, mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und in ein neues 20 ml-Volumen des Mediums A bei einem Partialdruck von 1-Buten übertragen. Diese Verfahrensweise wird 7 Tage lang wiederholt. Die Epoxidgehalte der Brühen werden jeweils gaschromatographisch bestimmt und sind in Tabelle II zusammengestellt. The mixture is then agitated at 30 0 C for 24 hours 150 times / min. According to the general method of Example 1 prepared immobilized cells are suspended in 20 ml of medium A with 1-butene "at a partial pressure of 150 mm Hg contacted.. The cell mass is then separated, washed with 0.01 M phosphate buffer and transferred to a new 20 ml volume of medium A at a partial pressure of 1-butene. This procedure is repeated for 7 days. The epoxide contents of the broths are determined by gas chromatography and are shown in the table II compiled.
(a) Das Verfahren von Beispiel 2 wird unter Verwendung von Propylen wiederholt, bis die 24-stündige Umwandlung 0,145 g/Ltr. Umwandlung (10 Durchgänge) ergibt. Die Konzentration des Propylenoxids nach jedem Durchgang wird in 3?igur 5 durch die Kreise Q wiedergegeben. Nach(a) The procedure of Example 2 is repeated using propylene until the 24 hour conversion 0.145 g / ltr. Conversion (10 passes) results. The concentration of propylene oxide after each run is represented by the circles Q in figure 5. To
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--65·---65 -
dem elften Durchgang gibt man O,5 g Harnstoff zum Medium A und führt einen einzigen Durchgang von 24 Std. Dauer durch. Die immobilisierten Zellen werden dann mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und neuerlich nach einer 8 Tage/24 Std.-Sequenz umgesetzt. Die Propylenoxidkonzentration nach jedem 24-stündigen Durchgang wird bestimmt und in Tigur 5 durch die Dreiecke Δ wiedergegeben. for the eleventh pass, 0.5 g of urea is added to the medium A and performs a single round of 24 hours. The immobilized cells are then with Washed 0.01 m phosphate buffer and reacted again after an 8 day / 24 hour sequence. The propylene oxide concentration after each 24-hour run it is determined and represented in Tigur 5 by the triangles Δ.
(b) Das Verfahren von Beispiel 2 wird unter Verwendung von Propylen wiederholt, Tais die 24-stündige Umwandlung 0,145 g/lrfcro Umwandlung (10 Durchgänge) ergibt. Nach dem elften Durchgang wird das Wachstumsmedium von Beispiel 1(1) für einen 24 Std.-Durchgang verwendet. Die immobilisierten Zellen werden dann mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen und neuerlich 8 Tage bei einer 24 Std.-Sequenz umgesetzt. Die Propylenoxidkonzentration in der Brühe nach ;jedem 24 Std.-Durchgang wird gaschromatographisch bestimmt und in Figur 5 durch die Quadrate wiedergegeben.(b) The procedure of Example 2 is repeated using propylene, Tais the 24 hour conversion gives 0.145 g / lrfcr o conversion (10 passes). After the eleventh run, the growth medium of Example 1 (1) is used for a 24 hour run. The immobilized cells are then washed with 0.01 M phosphate buffer and reacted again for 8 days in a 24 hour sequence. The propylene oxide concentration in the broth after each 24 hour run is determined by gas chromatography and shown in FIG. 5 by the squares.
Proben von immobilisierten Zellen (19 mg/ml immobilisierte Zellen) werden nach der Methode von Beispiel 1(1) und (2) hergestellt.Samples of immobilized cells (19 mg / ml immobilized Cells) are produced according to the method of example 1 (1) and (2).
Probe 1 ist eine Vergleichsprobe.Sample 1 is a comparative sample.
Die Probe 2 wird im Medium A, das 0,5 g/Ltr. Harnstoff enthält, 24 Stunden kultiviert und mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen.The sample 2 is in the medium A, the 0.5 g / Ltr. Contains urea, cultured for 24 hours and with 0.01 M phosphate buffer washed.
Die Probe 3 wird im Medium A, das 0,5 g/Ltr, Harnstoff ent-Sample 3 is in medium A, which contains 0.5 g / Ltr, urea
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hält, 48 Stunden kultiviert und mit 0,01 m Phosphatpuffer gewaschen. Die drei Proben werden dann jeweils zur Umwandlung von Propylen in Propylenoxid in sieben aufeinanderfolgenden 24 Std.-Zyklen gemäß Beispiel 2 verwendet. Die Propylenoxidkonzentration in der Brühe nach jedem 24 Std.-Zyklus wird gaschromatographisch bestimmt. Die Resultate sind in Figur 6 dargestellt. Dabei repräsentieren die Kreise O die Vergleichswerte, die Dreiecke Z\ die Werte der Probe 2 und die Vierecke (Rhomben) <^N die Werte der Probe 3.holds, cultivated for 48 hours and with 0.01 M phosphate buffer washed. The three samples are then each used to convert propylene to propylene oxide in seven consecutive times 24 hour cycles according to example 2 used. The concentration of propylene oxide in the broth after every 24 hour cycle will be determined by gas chromatography. The results are in Figure 6 shown. The circles O represent the comparison values, the triangles Z \ the values of sample 2 and the squares (rhombuses) <^ N are the values of sample 3.
Immobilisierte Zellen von Corynebacterium hydrocarboclastus (ATGC 15108), Oorynebacterium alkanum (ATOO 21194)» Brevibacterium butanicum (ATCO 21196), Brevibacterium ketoglutamicum (ATCC 15587)» Nocardia butanica (ATCC 21197) und Nocardia paraffinica (ATCC 21198) (19 mg/1 ml immo- Immobilized cells of Corynebacterium hydrocarboclastus (ATGC 15108), Oorynebacterium alkanum (ATOO 21194) » Brevibacterium butanicum (ATCO 21196), Brevibacterium ketoglutamicum (ATCC 15587) »Nocardia butanica (ATCC 21197) and Nocardia paraffinica (ATCC 21198) (19 mg / 1 ml immo-
bilisierte Zellen) werden nach der in Beispiel 1(1) und (2) beschriebenen Methode hergestellt und im Medium Ä 72 Stunden bei 300C in Gegenwart von Propylen (150 mm Hg Partialdruck) kultiviert. Die erhaltene Brühe wird gaschromatographisch zur Bestimmung des erzeugten Propylenoxids analysiert. Tabelle III zeigt die Resultate.bilized cells) are produced according to the method described in Example 1 (1) and (2) and cultivated in the medium Ä 72 hours at 30 ° C. in the presence of propylene (150 mm Hg partial pressure). The resulting broth is analyzed by gas chromatography to determine the propylene oxide produced. Table III shows the results.
Zellen Propylenoxid in derCells propylene oxide in the
: - Brühe, mg/Liter: - Broth, mg / liter
Corynebacterium hydrocarboclastus 3,6Corynebacterium hydrocarboclastus 3.6
Gorynebacterium alkanum Spuren Brevibacterium butanicum 3,7Gorynebacterium alkanum traces Brevibacterium butanicum 3.7
Brevibacterium ketoglutamicum 5»7Brevibacterium ketoglutamicum 5 »7
Nocärdia butanica 115Nocardia butanica 115
Nocärdia paraffinica 106Nocardia paraffinica 106
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